Summary
הגידולים הטריים סרטן השד האנושי מאופיינים עם ספקטרוסקופיית קרינת והדמיה בעקבות פרוטוקולים טריים טיפול ברקמה. מיצוב הרקמה נלקח בחשבון כדי לאפשר אפיון יעיל תוך מתן ניתוח בזמן ליישומים בעתיד הפנימי.
Abstract
כתב יד זה מציג פרוטוקול להתמודד, לאפיין, ותמונה של גידולים השד האנושי באמצעות הדמיה קרינת פעמו טכניקות וספקטרוסקופיה. הפרוטוקול כרוך במצב שידור קרינת בשכיחות רגילה ובמצב השתקפות קרינת בזווית אלכסונית של 30 °. הנתונים הניסיוניים שנאספו מייצגים פולסים בתחום הזמן של השדה החשמלי. אות השדה החשמלי קרינת שהועבר דרך נקודה קבועה על הרקמה המעוברת מעובד, דרך מודל אנליטי, כדי לחלץ את השבירה המדד ואת מקדם הקליטה של הרקמה. ניצול סורק מנוע stepper, הדופק הנפלט קרינת משתקף מכל פיקסל על הגידול מתן תמונה מישורי של אזורים רקמה שונים. ניתן להציג את התמונה בזמן או בתחום התדרים. יתר על כן, הנתונים המחולצים של מדד השבירה ומקדם הקליטה בכל פיקסל מנוצלים כדי לספק תמונה של טומוגרפית של הגידול. הפרוטוקול ממחיש הבדלה ברורה בין רקמות סרטני ובריאות. מצד שני, לא הקפדה על הפרוטוקול יכול לגרום לתמונות רועש או לא מדויק עקב נוכחות של בועות אוויר ושרידי נוזלים על פני השטח של הגידול. הפרוטוקול מספק שיטה להערכת שוליים כירורגית של גידולים בשד.
Introduction
Terahertz (THz) הדמיה וספקטרוסקופיה כבר אזור גדל במהירות של מחקר בעשור האחרון. המשך הפיתוח של מקרן THz יעילה ועקבית יותר בטווח של 0.1 – 4 THz גרם ליישומים שלהם לצמוח באופן משמעותי1. אזור אחד שבו THz הראה הבטחה וצמיחה משמעותית הוא שדה ביו2. קרינת thz הוכח להיות יוננים בטוח ביולוגית ברמות הכוח בדרך כלל משמש לניתוח רקמות קבוע3. כתוצאה מכך, thz הדמיה ספקטרוסקופיית שימש לסווג ולהבדיל תכונות רקמה שונות כגון תוכן המים כדי לציין נזק לצרוב וריפוי4, שחמת הכבד5, סרטן ברקמות החפירה6,7. הערכת סרטן במיוחד מכסה מגוון רחב של יישומים קליניים וכירורגי פוטנציאליים, נחקר עבור סרטן של המוח8, כבד9, השחלות10, במערכת העיכול11, שד7,12,13,14,15,16,17,18,19.
יישומים THz עבור סרטן השד מתמקדים בעיקר על תמיכה בשימור ניתוח חזה, או כריתת גוש, באמצעות הערכת שוליים. המטרה של כריתת הגוש היא להסיר את הגידול ושכבה קטנה של רקמות בריאות שמסביב, בניגוד כריתה מלאה, אשר מסיר את השד כולו. השוליים הכירורגית של רקמת הראש מוערך אז באמצעות פתולוגיה פעם המדגם תוקן formalin, מנות, מוטבע פרפין, ו רכוב בתוך 4 יקרומטר – 5 יקרומטר פרוסות על שקופיות מיקרוסקופ. תהליך זה עשוי לגזול זמן רב ודורש הליך ניתוחי משני במועד מאוחר יותר, אם השוליים החיוביים צופים20. הקווים המנחים הנוכחיים של האגודה האמריקנית לאונקולוגיה הקרינה להגדיר זה שוליים חיוביים כשיש תאים סרטניים באמצעות הקרקע ברמת השטח דיו21. THz הדמיה לספיגה גבוהה רקמות מוגבל בעיקר הדמיה פני השטח עם כמה חדירה שונים המבוסס על סוג הרקמה, אשר מספיקה לפגוש את הצרכים הכירורגית של הערכת שוליים מהירה. ניתוח מהיר של תנאי שוליים במהלך ההגדרה הכירורגית יהיה ירידה משמעותית בעלויות הניתוח ושיעור הליך המעקב. עד כה, THz הוכיחה יעיל בהבחנה בין סרטן ורקמות בריאות ב-formalin קבוע, פרפין מוטבע (FFPE) רקמות, אבל חקירה נוספת נחוצה כדי לספק זיהוי אמין של סרטן ברקמות המפורחות טריים7.
פרוטוקול זה מפרט את השלבים לביצוע הדמיה THz וספקטרוסקופיה על דגימות הרקמה האנושית שהתקבלו מתוך biobank. Thz יישומים שנבנו על הרקמות הטריות סרטן השד האנושי השתמשו לעתים רחוקות במחקר שפורסם7,18,22,23, במיוחד על ידי קבוצות מחקר לא משולבים עם בית החולים. השימוש ברקמות הטריות הוא גם נדיר עבור יישומים סרטניים אחרים, עם רוב שאינם בשדיים סרטן האדם הדוגמאות שדווחו על סרטן המעי הגס24,25. אחת הסיבות לכך היא כי גושי רקמה FFPE הם הרבה יותר קל לגשת ולטפל יותר מאשר רקמת המגורש טרי אלא אם מערכת THz לשמש למחקר הוא חלק מזרימת העבודה כירורגית. באופן דומה, רוב המעבדה מסחרי THz מערכות אינם מוכנים להתמודד עם רקמה טרייה, ואלה שעושים עדיין בשלבים של שימוש בצמיחה קו התאים או רק התחילו להסתכל על רקמת הראש מדגמי בעלי חיים. כדי להחיל את THz על הגדרה התוך-אופרטיבית מחייב ששלבי הדמיה ואפיון יתפתחו לרקמות טריות מראש כך שהניתוח לא יפריע ליכולת לבצע פתולוגיה סטנדרטית. עבור יישומים שאינם נועדו באופן מיסודו להיות הפנים, האפיון של רקמה טרייה הוא עדיין צעד מאתגר שחייב להיות ממוען לעבוד לקראת יישומים vivo ובידול.
המטרה של עבודה זו היא לספק מנחה ליישום THz עבור רקמת החפירה הטרייה באמצעות מערכת THz מסחרית. הפרוטוקול פותחה על הדמיה thz ו ספקטרוסקופיית מערכת26 עבור גידולים בסרטן השד murine13,17,19 והורחב רקמת כירורגי אנושי התקבל מ biobanks7,18. בעוד הפרוטוקול נוצר עבור סרטן השד, מושגים אותם ניתן להחיל מערכות הדמיה דומה THz וסוגים אחרים של סרטן מוצק הגידול כי הם מטופלים עם ניתוח שבו הצלחה תלויה בהערכת שוליים27. בשל כמות קטנה יחסית של תוצאות THz שפורסמו על הרקמות הטריות, זוהי העבודה הראשונה לידיעת המחברים כדי להתמקד בפרוטוקול של טיפול ברקמה טרייה עבור הדמיה THz ואפיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה מלווה את כל הדרישות שנקבעו על ידי המחלקה לבריאות הסביבה ובטיחות באוניברסיטת ארקנסו.
1. הגדרת שטח טיפול ברקמה
- קחו מגש מתכת פלדת אל-חלד וכיסו אותו עם השק הביולוגי כמוצג באיור 1. כל טיפול ברקמות הביולוגי יבוצע בתוך אזור המגשים (כלומר, אזור טיפול ברקמה).
- הכנת פינצטה מעבדה, מגבונים רקמות, נייר מגבות, חבילת נייר סינון, בקבוקי צבע רקמה, בקבוק אקונומיקה, ובקבוק אתנול סביב המגש לגישה קלה כאשר נדרש. שמרו על משטח החומרים הביולוגי, מגבונים, וכפפות על המשטח החומרי להיפטר בסוף הפרוטוקול.
- מילוי שפופרת צנטריפוגה 50 mL עם עד 45 mL של 10% באגירה ניטרלית ומניחים אותו מגש אחסון צנטריפוגה ליד מגש טיפול ברקמה.
איור 1: כיוונון של אזור טיפול ברקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
2. טיפול בסרטן שד טרי ספקטרוסקופיית שידור
זהירות: לפני טיפול בכל הרקמות החיות, לשים על כפפות יד מניטריל, משקפי מגן העין, מסכת פנים, וחלוק מעבדה. תמיד להשתמש פינצטה מעבדה כדי לטפל ברקמות ולהימנע מלגעת בהם ישירות עם הידיים. כל העבודה עם רקמה טרייה מחוץ למיכל אטום או בשלב הסריקה יש להתנהל באזור טיפול ברקמה שהוקמה בשלב 1.1.
הערה: כל הרקמות המטופלות בעבודה זו נשלחו במדיום של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) ופתרון אנטיביוטי מתוך biobank.
- להסיר את הגידול בצובר מהפתרון DMEM ולמקם אותו צלחת פטרי על הטיפול ברקמה באזור (ראה איור 2A).
- מבדיקה ברוטו, לזהות אזורי גידולים שונים שמהם לחתוך חלקים קטנים עבור אפיון השידור. חותכים קטע עבה 0.5 מ"מ של גידול מן הנקודות שזוהו באמצעות להב פרופיל נמוך נירוסטה, כפי שמוצג באיור 2B. מניחים את הקטע הפרוס בין שני חלונות קוורץ עם מרווח של עובי 0.1 מ"מ במחזיק מדגם נוזלי, כפי שמוצג באיור 2C.
איור 2: הגידול של המדידות באמצעות ספקטרוסקופיית השידור THz. (א) צילום של הגידול בצובר. (ב) צילום של סעיפים קטנים (0.5 מ"מ) של חתך הגידול מהגידול בצובר. (ג) חתך הגידול הפרוס ממוקם במחזיק הדגימה הנוזלית בין שני חלונות הקוורץ עם מרווח מגוון של 0.1 מ"מ בעובי של מדידת ספקטרוסקופיה. .ברשותו של טי . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
3. THz מדידות ספקטרוסקופיית הילוכים
- הגדר את מודול ספקטרוסקופיית השידור בתוך תא הליבה THz על ידי יישור מטפל מודול מעל הודעות ההרכבה במערכת הליבה והזזת השלב למטה לתוך המערכת. הדק את שני הברגים בפינה הימנית העליונה ובפינות השמאליות התחתונות של המודול כמוצג באיור 3A.
- לטהר את המערכת עם גז חנקן יבש ב 5 L/דקות (LPM) במהלך הליך ספקטרוסקופיית כולו כדי להסיר אדי מים מהחלל לדוגמה.
- פתח את תוכנת המדידה של ה-THz ספקטרוסקופיית שידור משולחן העבודה המחובר למערכת THz. . זה יפתח את החלון הראשי
- לחץ על הכרטיסייה סריקה בחלק העליון של החלון. יופיע חלון של התקנת סריקה של ספקטרום . מהתפריט הנפתח של הכרטיסיה מצב מדידה בחלק הימני העליון של החלון, בחר שידור כדי להגדיר ספקטרוסקופיית שידור. אם השיא אינו גלוי באופן אוטומטי, בדוק את האפשרות Enable תחת הכרטיסייה ' שיא ידני ' והבא באופן ידני את ההשהיה האופטית כדי להביא את השיא לתצוגה.
-
לאחר 30 דקות של טיהור, להקליט אות התייחסות אוויר על ידי ביצוע השלבים הבאים.
- תחת הכרטיסייה הגדרות סריקה בחלון ההתקנה של סורק התמונה, הזן שם מתאים עבור קובץ הייחוס, הגדר את ה- Num Scan ל-1,800 והגדר את הפעלת ההשהיה כ-0. השאר את ההגדרות האחרות כערכי ברירת המחדל שלהן.
- לחץ על מידת הפניה בחלון הגדרת הסריקה כדי לבצע את מדידת ההפניה האווירית. לאחר מכן לחץ על דגימת מידה כדי למדוד את אות השידור דרך האוויר כממוצע לדוגמה של 1,800 אותות מעל ~ 1 דקות.
איור 3: THz מודול ספקטרוסקופיית שידור ההתקנה. (א) thz תא ליבה עם מודול השידור רכוב על זה. (ב) תצלום של בעל הדגימה הנוזלית. (ג) מחזיק המדגם הוצב בתוך תא הליבה עבור המידות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
-
מדוד את שני חלונות הקוורץ במחזיק הדגימה הנוזלית כמוצג באיור 3B.
- הניחו את שני חלונות הקוורץ במחזיק הדגימה הנוזלית ללא מרווח באמצע.
- פתח את תא הליבה THz. הר את מחזיק דגימת נוזל על מודול ספקטרוסקופיית שידור, כפי שמוצג באיור 3C. . תסגור את החדר
- לחצו על הכרטיסייה ' סריקה ' בחלון הראשי. חזור על שלבים 3.5.1 – 3.5.2 עבור דגימת הקוורץ, אך עדכן הפעלת עיכוב (ים) ל-900. זה מאפשר לזמן לטהר את אדי המים לפני המדידה.
- אם הקוורץ רצוי כהפניה לדוגמאות נוספות, לחץ על הכרטיסיה הפניה ברורה תחת הגדרות הסריקה. . זה מנקה את ההפניה האווירית לאחר מכן לחץ על הכרטיסיה הפניה למידה כדי לתעד את מדידות הקוורץ כהפניה חדשה.
- מניחים את קטע הגידול הפרוס בין שני חלונות הקוורץ בתוך מחזיק המדגם הנוזלי ומקמו את המחזיק בתוך התא למדידת נקודה בודדת של הרקמה. כדי להקליט את המדידה, חזור על שלב 3.6.3.
- קחו את מחזיק הדגימה הנוזלי מהחדר כאשר המידות מושלמות והביאו אותה לאזור המיועד לטיפול ברקמות. לפרק את מחזיק הדגימה הנוזלית, לנגב את מקטע הגידול מהחלונות הקוורץ בעזרת מגבונים, ולהניח את מגבונים הרקמה המשמשים באותו מגש כדי להשליך את התיק הביולוגי יחד עם הפסולת הביולוגית האחרת.
- חזור על שלבים 2.2, 3.7 ו-3.8 לפי הצורך כדי לאפיין פרוסות גידול נוספות. לאחר השלמת המדידות, עבור לחלון הראשי ולחץ על הכרטיסייה ' קובץ ' כדי לשמור את נתוני המדידה. סגור את חלון התוכנה.
4. טיפול טרי סרטן השד הגידול עבור THz מצב השתקפות הדמיה
- להסיר את דגימת הגידול הטרי מהפתרון DMEM ואנטיביוטיקה ולמקם אותו על צלחת פטרי. באמצעות בדיקה ברוטו, בחר צד של הגידול להיות בתמונה כי הוא שטוח מספיק ויש לו קצת דם וכמה כלי דם. הימנע מרקמת דימות עם כלי דם או דם אם אפשר.
- מניחים את הגידול עם הצד כדי להיות בתמונה על הנייר כיתה 1 מסנן כדי לייבש את DMEM עודף ולנקות את רקמת הנוזל או הפרשות מן הגידול, כפי שמוצג באיור 4A. מקם מחדש את הגידול על נייר הסינון לנקודה יבשה כמו שהנייר מאיר את הנייר. יבש את הגידול עבור ~ 5 דקות.
איור 4: הכנה לדגימת גידול טרי להדמיה THz. (A) הגידולהניח על נייר סינון להתייבש. (ב) הגידול הניח על צלחת קלקר מעל חלון הדמיה עם רפידות לנגב רקמות לספוג עודף נוזלים. (ג) הגידול הנצפים מלמטה כדי לעקוב אחר האוריינטציה ולבדוק בועות אוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- בטל את טעינת מודול ספקטרוסקופיית השידור והגדר את מודול הדמיה השתקפות (RIM) בסיס השיקוף במערכת הליבה THz כפי שמוצג באיור 5A. לאחר קביעת המראות, הר את השלב סריקה RIM מעל בסיס המראה ולהרוס אותו לתוך מערכת הליבה (ראה איור 5B).
- לטהר את המערכת עם גז חנקן יבש ב 5 LPM במשך 30 דקות לפני הליך ההדמיה כדי להסיר אדי מים מהתא לדוגמה. לאחר 30 דקות, להפחית את כמות הגז חנקן יבש ל 3 LPM למשך שאר הזמן המערכת נמצאת בשימוש.
- מניחים צלחת פוליסטירן של עובי ~ 1.2 מ"מ על חלון הסריקה של קוטר ~ 37 מ"מ. מרכז את חלון הסריקה יחד עם צלחת הקלקר על הבמה המדגם.
איור 5: הגדרת מערכת לדימות השתקפות. (א) מודול הדמיה של השתקפות בסיס מראה. (ב) סריקה בשלב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
הערה: עוביים אחרים וחומרי צלחת מתאימים לשלב 4.5 אבל צריך להיות בעובי אחיד ולהיות מספיק מצומצם כדי לא לעכב את האות THz.
- פתח את תוכנת המדידה של השתקפות THz משולחן העבודה המחובר למערכת THz. חלון יופיע ויציג מספר סמלי דו-שיח עבור פונקציות ספציפיות ושני חלונות משניים עבור מגרשים של שדות THz (יחידות שרירותיות a.u.) כנגד הזמן והתדירות, בהתאמה.
- כדי להגדיר את הפרמטרים עבור הגדרת RIM, לחץ על סמל הדו של פרמטר התמונה בחלק העליון של החלון. חלון ' פרמטרים של רכישת תמונה ' יצוץ. בחר באפשרות שירים מהתפריט הנפתח של כרטיסיית התבנית כדי להגדיר הדמיה של השתקפות. הכה אישור ולחזור אל החלון הראשי של התוכנה.
- בחלון הראשי, לחץ על הסמל ' סריקה בנקודה קבועה '. פעולה זו תפעיל את האנטנות THz כדי להתחיל לשלוח את האירוע THz האות וקבלת אות THz משתקף מנקודה אחת על צלחת פוליסטירן.
- לחצו על סמל הדו ' שלב מוטורי ' בראש החלון הראשי. . חלון הבקרה של המנוע ייפתח כוונן את ציר ההשהיה האופטית על-ידי לחיצה על חיצי הכיוון הקדמיים/הפוכים כדי למרכז את הפולס המשתקף מהפוליסטירן שבחלון הראשי.
הערה: לאחר התאמת ציר ההשהיה האופטית, יש להציג שני פולסים על החלון, כפי שמוצג באיור 6: אחד מהממשק התחתון של צלחת הקלקר (השתקפות ראשית), ואחד מהממשק העליון של הצלחת הקלקר (השתקפות משנית). -
החלון את ההשתקפות הראשית מלוחית הקלקר ושמור את ההשתקפות המשנית בחלון, אשר תתרום להשתקפויות מהרקמה במהלך תהליך הדימות. פעולה זו מתבצעת בשני שלבים.
- תחילה, לחץ על לחצן DAQ settings בחלק העליון של החלון הראשי כדי לפתוח את חלון תיבת הדו הגדרות DAQ. שנה את ערך ההשהיה האופטית מ-5 V (ברירת מחדל) ל-4 V.
- שנית, התאם את המיקום האנכי של שלב הסריקה עם קנה המידה של המיקרומטר בשלבי הסריקה עד שהדופק של הפעימה המשנית הוא החזק ביותר. כוונן את ההשהיה האופטית של הציר בחלון הבקרה המוטורית כדי להציב את ההשתקפות הראשית מחוץ לטווח של האות המשתקף הנמדד.
הערה: עבור לוחית פוליסטירן בעובי 1.2 מ"מ, ההשתקפות העיקרית היא חלון החוצה כאשר השתקפות משנית מינימלית היא כ-0.3 מ"מ על ציר ההשהיה האופטית של חלון קבוצת המחשבים של הזמן.
איור 6: THz השתקפויות מן הממשקים התחתון והעליון של צלחת פוליסטירן. (א) thz האות האירוע והשתקף מתוך 1.2 מילימטר עובי קלקר צלחת. (ב) נמדד אותות התחום הראשוניים והמשניים של הזמן thz מן הפוליסטירן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- דרג את השלב לדוגמה והקלט את אות ההפניה.
- בחרו שתי נקודות בכל אחד מהצירים (ציר וציר ב') המציינים מיקומים על צלחת הפוליסטירן שליד החלון לדוגמה. לדוגמה, עבור ציר A הנע מ-15 מ"מ – 15 מ"מ, שתי נקודות התנוחה יכולות להיות-10 מ"מ ו-10 מ"מ; ועל ציר B הנע מ-15 מ"מ – 15 מ"מ, שתי נקודות מיקום יכול להיות -10 מ"מ ו 10 מ"מ.
- לחץ על לחצן תיבת הדו בקרת המנוע כדי לפתוח את חלון הבקרה המנוע. מקם מחדש את חלון בקרת המנוע ואת חלון התוכנה הראשי כך שהאות של קבוצת המחשבים תהיה גלויה בזמן התאמת המיקומים המוטוריים. הגדר הן את ציר ה-A והן את ציר B ל-0 מ"מ.
- דרג את הציר A באמצעות השלבים הבאים. טווח של 10 מ"מ – 10 מ"מ משמש כדוגמה.
- בחלון הבקרה המוטורית, שנה את הערך של ציר A מ -0 ל-10 והקלד Enter. השלב עובר לעמדה -10 מ"מ על ציר A ומשמרת במיקום האות בחלון הראשי הוא נצפתה.
- השתמש בסולם המיקרומטר הניתן לכוונון בשלב הסריקה המוצג באיור 5B כדי להעביר את השיא המינימלי של האות חזרה למיקום שהוגדר בשלב 4.10.2.
- שנה את הערך של ציר A ל-+10 והקלד enter. השלב יעבור כעת מ-10 מ"מ מיקום במיקום + 10 מ"מ על ציר A ומשמרת באות נצפה שוב. שים לב לכיוון ולמרחק שהאות השתנה ממיקומה הקודם ושנה את הערך של ציר A שוב ל-10. האות יחזור למצב שהוגדר בשלב 4.11.5.
- סובב את בורג ההחלקה על ציר א' של שלב הסריקה, כמוצג באיור 5B והזז את האות כדי להכפיל את המרחק באותו כיוון שהוא עבר מהמיקום המקורי. השתמש במיקרומטר בשלב הסריקה כדי להעביר את האות חזרה למיקום המקורי (-0.3 מ"מ עבור 1.2 מ"מ של פוליסטירן).
- חזור על שלבים 4.11.6 – 4.11.7 עד שהאות ב +10 ו -10 יהיו שווים והשיא עבור שני המיקומים מתמקד במיקום המקורי (-0.3 מ"מ על הציר האופטי).
- לאחר השגת ההחלקה של ציר A, שנה את הערך A-ציר ל-0 וחזור על אותו ההליך עבור ציר B. התחל על-ידי שינוי הערך של ציר B בחלון הבקרה המוטורית מ -0 לערך החיובי ביותר (לדוגמה, 10 מ"מ). כמו כן, במהלך ההחלקה, השתמש בבורג ההחלקה על ציר B של שלב הסריקה, המוצג באיור 5B.
- לאחר ששני הצירים מוחלקים, החזיר את ציר ה-A וציר ה-B ל-0 מ"מ. סגור את חלון הבקרה המוטורית וודא שהאות נמצא במיקומה המקורי למקרה שהוא מוזז מעט.
- הקלט אות זה כהפניה.
- עבור אל חלון הסט DAQ Properties (מאפיינים ). שנה את ערך הממוצע ל-5 ושמור את כל הפרמטרים האחרים כברירת מחדל.
- לחץ על ' הפניה חדשה'. המונה בממוצע בחלק הימני העליון של החלון ייחשב מ -0 – 20. לאחר שנגדית מגיע ל-20, שנה את הערך בממוצע ל-1 ולחץ על אישור. האות המשתקף מהפוליסטירן יישמר כהפניה לסריקות שצולמו מאוחר יותר.
הערה: אם יש לבצע את הליך הדימות THz בלבד, מומלץ לבצע את השלבים 4.3 – 4.14 לפני נטילת רקמת הגידול מתוך הפתרון DMEM.
- הר הגידול על צלחת הקלקר המכסה את החלון בשלב הסריקה.
- הסר את חלון ההדמיה משלב הסריקה והבא אותו לאזור הטיפול ברקמה. מניחים את הגידול על צלחת פוליסטירן, כפי שמוצג באיור 4B.
- ודא כי אין בועות אוויר משמעותיות בין הצלחת לבין הגידול. אם בועות אוויר נצפו, לחץ על הגידול עם מלקחיים או להרים את הגידול בעדינות לגלגל אותו על הפוליסטירן עד הפערים באוויר הם ממוזערים.
- הציבו מרווחים נספגים במרווחי זמן קבועים סביב דגימת הניסוי כמוצג באיור 4B. מניחים עוד צלחת פוליסטירן מעל הגידול ולחץ בעדינות כדי להפוך את פני הגידול שטוח ככל האפשר. הקלטת את הסידור של פוליסטירן מוקצף לגידול בחלון המדגם.
- להפוך את החלון לדוגמה כפי שמוצג באיור 4C, ולקחת תמונות של הגידול כדי לתעד את האוריינטציה שלו. החזר את החלון לדוגמה עם הגידול לשלב הסריקה.
- לחץ על לחצן תיבת הדו של פרמטר התמונה כדי לפתוח את החלון ' פרמטרים של רכישת תמונה '. הגדרת הערכים של Axis1min, Axis1max, Axis2minו- Axis2max כדי להקיף במלואו את מיקום הגידול בחלון ההדמיה
הערה: כברירת מחדל, Axis1 הוא ציר A ו-Axis2 הוא ציר B. - הגדר Axis1step ו Axis2step ל 0.2 מ"מ עבור סריקת ההדמיה.
הערה: הגדרת ה- Axis1step ו- Axis2step תגדיר את גודל הצעד של מנועי הקצב למרווחים של 200 יקרומטר במהלך תהליך הסריקה. ניתן להעריך את זמן הסריקה הכולל בחלון ' פרמטרי רכישת תמונה '. - לחצו על הכרטיסייה ' מדידה ' בחלון הראשי ובחרו באפשרות ' סריקה דו-ממדית של flyback '. בחלון שיצוץ, ציין את הספריה ואת שם הקובץ שתחתיו יש לשמור את נתוני הסריקה.
5. עיבוד הרקמה הטרייה בהכנה לטיפול בהיסטולוגיה
- עם סיום תהליך הסריקה, הסר את החלון לדוגמה, צלחות קלקר, ודגימת ממערכת THz הליבה והזיזו אותם לאזור המיועד לפסולת מסוכנת. להסיר את הגידול מלוחית קלקר ולמקם אותו על פיסת קרטון שטוח של גודל הדומה לזה של הגידול. ודא כי הכיוון של הגידול הוא זהה לזה שהיה על הפוליסטירן, עם פנים הדמיה נגיעה בקרטון.
- לטבול בספוגית כותנה בצבע רקמה אדומה כתם את הצד השמאלי של הגידול למטה למקום שבו קצה הגידול מקשר את קרטון. באופן דומה, כתם בצד הימני של הגידול עם צבע הרקמה הכחולה. כתם את המשטח חשוף של הגידול עם קו של צבע רקמה צהובה חיבור כתם אדום לכתם כחול כדי לציין את החלק האחורי של המדגם, כפי שמוצג באיור 7A.
הערה: כדי למנוע מהדיו להכתים את פתרון פורמלין, להחיל רק שכבה דקה על הרקמה. זה יכול להתבצע על ידי מנקה את הכותנה על משטח אחר לפני להכתים את הרקמה או באמצעות ספוגית כותנה נקייה לנגב כל צבע עודף. הימנעו מלתת לצבע ליצור קשר עם העור או הבגדים. זה תהליך כתמים הגידול מתנהל כהתייחסות לספק מידע על הצד הדמיה של הגידול וכיוון הפתולוג.
איור 7: לאחר עיבוד על הגידול לאחר THz הדמיה. (A) הגידולהניח הפנים למטה על מחזיק קרטון צבוע עם צבע סימון רקמה. (ב) מסנן נייר שהונח על גידול והודבק כדי לשמור על קשר. (ג) הגידול המוכתם תוקן על קרטון שקוע ב -10% פתרון באגירה ניטרלי וחתום עם parafilm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- תנו לדיו להתייבש בסביבות 3 – 4 דקות. חותכים פיסת נייר סינון עם אותם ממדים מקורבים כמו הקרטון. מניחים אותו על הגידול ולעטוף פיסת קלטת לחלוטין סביב נייר סינון וקרטון כפי שמוצג באיור 7B. הקלטת ונייר סינון צריך לאבטח את הגידול על קרטון מבלי להחיל כל לחץ משמעותי.
- לטבול את הרקמה המוכתמת המוצמדת לקרטון בתמיסה של 10% ניטרלי באגירה וחותם את צינורית הצנטריפוגה באמצעות סרט פרפין, כפי שמוצג באיור 7C. ציין את מספר המדגם, התאריך, סוג הרקמה ומספר הגידול של המדגם בתווית הצינורית. שלח את הגידול לפתולוג לעיבוד היתר.
6. סילוק פסולת מסוכנת
- לאסוף את כל הפסולת ממגש טיפול ברקמה יחד עם השק הביולוגי המשמש לכסות את המגש ולשים אותו בשק הביולוגי החדש, כפי שמוצג באיור 8. הביאו את השק לאזור הפסולת הביו-מסוכנים המיועד בבניין וקבעו פגישה עם המחלקה לבריאות הסביבה ובטיחות (EH & S) לאיסוף הפסולת. נקו את מגש הטיפול ברקמה ואת האזור שמסביב על השולחן עם 10% תמיסת אקונומיקה ואתנול.
איור 8: צילום של שקית הפסולת הביומסוכנת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- קחו את מחזיק הדגימה הנוזלי עם החללים וחלונות הקוורץ, חלון דגימה שבו הגידול היה רכוב, צלחות פוליסטירן, ומלקחיים מעבדה לאזור הכביסה. לשטוף את כל החומרים עם מים ולאחר מכן 10% תמיסת אקונומיקה, ניגוב עם מגבות נייר בהתאם לצורך להסיר פסולת רקמה. לשטוף שוב עם מים, לשפשף עם פתרון alconox, ולשטוף היטב. לזכוכית ולכלי חרס, שטפו ב-70% אלכוהול איזופרופיל והניחו הצידה להתייבש.
הערה: לאחר הגידול הוא פורמלין ומרחב לדוגמה הוא נקי, עיבוד נתונים ניתן לטפל באותו זמן כמו הדמיה או במועד מאוחר יותר.
7. עיבוד נתונים כדי לבנות תמונות THz
- יצא את קבצי הנתונים שנשמרו. tvl מהמערכת THz. קבצי נתונים גולמיים שהתקבלו מהמערכת נכתבים פיתון והם הטובים ביותר לקרוא פיתון לפני שמירה כמו קבצי נתונים MATLAB.
- כדי לבנות את תמונת THz של הרקמה הטרייה שנסרקה, המר את הנתונים הגולמיים של השתקפות תחום ההדמיה בתחום התדרים באמצעות התמרת פורייה במימד השלישי של מטריצת הנתונים הגולמיים (כלומר, ממד הזמן). גם לקחת את הטרנספורמציה פורייה של נתוני הייחוס.
הערה: הספקטרום הטיפוסי של תחום התדרים צריך לספק נתונים החל מ-0.1 THz – 4 THz. - לנרמל את הנתונים לדוגמה באמצעות נתוני הייחוס ולבצע את ספקטרום העוצמה בהתבסס על שילוב הנתונים המנורמל בטווח התדרים מ-f1 = 0.5 thz עד f2 = 1.0 thz באמצעות המשוואה הבאה19:
הערה: כאן Eלדוגמה הוא תדירות השתקפות התחום הדמיה נתונים של דגימת רקמות ו- Eהתייחסות הוא תחום התדר של השתקפות נקודה בודדת של האות התייחסות. - בנו את התמונה הדו באמצעות התוויית נתוני ספקטרום העוצמה המחושבים בכל נקודה במטריצה המוגדרת על-ידי ציר A וציר B. הדבר ידוע כתמונת ספקטרום העוצמה THz.
הערה: במקום זאת, השיטה להשגת תמונת טומוגרפית מפורטת בשלבים 7.5 – 7.7. - לאפיון, חשב את ההשתקפות התיאורטית התלויה בתדר של מגוון תכונות הרקמה הפוטנציאליותבמשוואההבאה:
הערה: כאן ρT, ij הוא מקדם השתקפות פרנל מורכבים בין אזור i לאזור j; dj הוא העובי של אזור j; ו θj היא זווית ההפצה באזור j הקשורים זווית של שכיחות על ידי חוק סנל.
הוא מקדם התפשטות מורכבת באזור j, כאשר ω הוא תדר זוויתי, c הוא מהירות האור בואקום, nj הוא החלק האמיתי של מדד השבירה, ו αabs, j הוא מקדם הקליטה18. אזור 1 הוא אוויר, אזור 2 הוא צלחת הפוליסטירן, ואזור 3 הוא הרקמה. - חישוב השתקפות במשוואה (2) עבור מגוון של אינדקסים מוגדרים על-ידי המשתמש ומקדמי הקליטה עבור אזור 3 (n3 ו- αabs, 3) ולהשוות עם האות נמדד בכל נקודה כדי לחשב את השגיאה המשולבת ממוצע בריבוע עבור סדר הגודל והשלב.
הערה: הפתרון עבור מדד השבירה ומקדם הקליטה הוא זוג ערכים הנותנים את השגיאה הנמוכה ביותר. - לבנות את התמונה של טומוגרפית מתוך מדד השבירה ואת מקדם הקליטה נתונים (n3 ו αabs, 3) בכל פיקסל. לנתח את אזורי הגידול על ידי השוואת עם התמונה פתולוגיה השקופית שהתקבלו מן הפתולוג. תוצאות הנציג מוצגות באיור 9, עם דוגמאות לדבקות בפרוטוקול באיור 10 ובאיור 11.
הוא מקדם התפשטות מורכבת באזור j, כאשר ω הוא תדר זוויתי, c הוא מהירות האור בואקום, nj הוא החלק האמיתי של מדד השבירה, ו αabs, j הוא מקדם הקליטה18. אזור 1 הוא אוויר, אזור 2 הוא צלחת הפוליסטירן, ואזור 3 הוא הרקמה.8. הוצאת תכונות חשמליות של הרקמה באמצעות נתוני ספקטרוסקופיית שידור
- על החלון הראשי של התוכנה למדידת ספקטרוסקופיית הילוכים, עבור לכרטיסייה קובץ ולחץ על אפשרות הייצוא . חלון יצוץ כדי לבחור את סוג הנתונים והדוגמה לייצוא. בחר באפשרות השראות והפחתת נתונים מסוג שלב עבור מדידות דגימת הקוורץ והרקמה.
- חישוב השידור התיאורטי התלוי בתדר למגוון של תכונות רקמה פוטנציאליות באמצעות המשוואה הבאה15:
הערה: להלן
היחס בין מקדמים העברת פרנל עבור הגדרות המדגם וההפניה; γ1 ו- γ3 הם קבועי ההפצה המורכבים של אוויר ורקמה, בהתאמה; ו -d היא העובי של הרקמה. קבוע ההפצה בכלל מוגדר כ 
. נ. ב . הוא מדד השבירה 
המורכב המוגדר, כאשר n הוא החלק האמיתי של מדד השבירה; c הוא מהירות האור; ω הוא תדר זוויתי; ו αabs הוא מקדם הקליטה15. - חישוב השגיאה המשולבת בריבוע בין סדר הגודל והשלב של השידור במשוואה (3) ונתוני המדידה מהמערכת למגוון ערכי n ו- αabs מוגדרים על-ידי המשתמש.
הערה: הפתרון עבור מדד השבירה ומקדם הקליטה הוא זוג ערכים הנותנים את השגיאה הנמוכה ביותר. - התוויית מידע השבירה מופק הנתונים מקדם הקליטה כנגד טווח התדר מ 0.15-3.5 THz. תוצאות הנציג מוצגות באיור 12.
היחס בין מקדמים העברת פרנל עבור הגדרות המדגם וההפניה; γ1 ו- γ3 הם קבועי ההפצה המורכבים של אוויר ורקמה, בהתאמה; ו -d היא העובי של הרקמה. קבוע ההפצה בכלל מוגדר כ 
. נ. ב . הוא מדד השבירה 
המורכב המוגדר, כאשר n הוא החלק האמיתי של מדד השבירה; c הוא מהירות האור; ω הוא תדר זוויתי; ו αabs הוא מקדם הקליטה15.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
The THz תוצאות הדמיה18 שהתקבלו בעקבות הפרוטוקול הנ ל של סרטן השד האדם הגידול #ND14139 שהתקבלו biobank מוצגים באיור 9. על פי הדו ח הפתולוגיה, הגידול ה#ND14139 היה כיתה I/II שחדר קרצינומה של החברה (IDC) המתקבל מאישה בת 49 באמצעות שד שמאלי הליך ניתוח כריתת גוש. התמונה של הגידול מוצג באיור 9A, הדמות הפתולוגית באיור 9a, ו thz ספקטרום כוח תמונה שהושג באמצעות משוואה (1) בפרוטוקול מוצג באיור 9a. הערכה של הדמות הפתולוגית נעשתה על ידי הפתולוג הייעוץ שלנו באוניברסיטת אוקלהומה סטייט. עם התייחסות לדימוי THz עם הדימוי הפתולוגי, היה ברור שאזור הסרטן (כלומר, אזור הצבע האדום באיור 9C) הראה השתקפות גבוהה יותר מאשר אזור השומן (כלומר, אזור הצבע הכחול באיור 9c). המעגל הכחול קרוב למרכז האזור של הסרטן באיור 9C היה בשל נוכחותו של בועת אוויר מתחת לגידול במהלך תהליך הדימות.
תמונות טומוגרפית מבוססות על תכונות החשמל של הגידול שהושג באמצעות מודל הנדון לעיל עבור כל פיקסל (2,477 פיקסלים בסך הכל) מוצגים גם. תמונות טומוגרפית המבוססות על מקדם הקליטה (cm-1) נתונים (α-תמונות) ואינדקס השבירה (n-תמונה) נתונים של הגידול שהושג בתדירות 0.5 THz ו 1.0 Thz מוצגים באיור 9D, 9E, 9e, ו 9e, בהתאמה. ככל שהתדר גדל, מקדם הספיגה המחושב (cm-1) ערכי הסרטן והשומן גדל, עם פיקסלים סרטניים המראים ערכים גבוהים יותר משומן בשני התדרים. לעומת זאת, מפתח השבירה של שתי הרקמות ירד ככל שהתדר עלה. יש לציין כי השלב נמדד הפכו כפופים וריאציות בקנה מידה של מיקרומטר בשלב הדמיה, עובי לוחית פוליסטירן, ו stepper להתעצבן מנוע כמו התדר גדל. לדוגמה, הקווים האופקיים שנצפו באיור 9E ו- 9e היו בגלל משמרת הפאזה הקטנה שהוצגה על ידי מנועי stepper במהלך תהליך הסריקה, אשר לא נצפתה בתדרים הנמוכים.
איור 9: ניתוח של סרטן השד הגידול #ND14139 באמצעות שיטת הדמיה THz. (א) צילום של הגידול. (ב) מחלות כוח נמוכות של הגידול. (ג) thz ספקטרום עוצמת התמונה על טווח תדירות 0.5 thz – 1.0 thz. (ד) thz מקדם הקליטה התמונה שהתקבלו ב 0.5 thz. תמונה זו נבנתה באמצעות הנתונים מקדם ספיגה מופק בכל פיקסל מן השתקפות raw הדמיה נתונים של הגידול. (ה) מקדם הקליטה התמונה שהתקבלו ב 1.0 thz. (F) השבירה התמונה (n-תמונה) שהתקבל ב 0.5 thz. התמונה הזאת נבנתה באמצעות השבירה מופק הנתונים המדד בכל פיקסל מן השתקפות raw נתונים הדמיה של הגידול. (G) השבירה התמונה (n-תמונה) שהתקבל ב 1.0 thz. איור פורסם מתוך ט. באומן ואח '18 עם אישור מבית המלון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
תוצאות THz שנדונו באיור 9 התקבלו בהצלחה בעקבות הפרוטוקול המתואר. טיפול מספיק של הרקמה יכול להוביל לתוצאות הדמיה מטעה. לדוגמה, הדמיה THz תוצאות באיור 10 לגידול סרטן השד האנושי #ND10405 הראות את ההשפעות של ייבוש מספיק. הפתרון העודף Dמאמ ברקמה שלטה התמונה הכוח של THz ספקטרום של הגידול באיור 10B28 עם השתקפות גבוהה כי לא בתיאום התמונה הפתולוגיה המוצגת באיור 10b28. זה הוביל תוצאה חיובית כוזבת, מציע נוכחות גדולה יותר של סרטן בגידול. DMEM ראה השבירה הגבוהה באופן דומה מקדם הקליטה למים, כפי שנראה באיור 10C19 ו 10c19, אז מומלץ מאוד לייבש את הגידול כראוי לפני הדמיה.
איור 10: ההשפעה על הדמיה של גידולים שנלקחו מתוך הפתרון DMEM ללא ייבוש באמצעות נייר סינון. (א) מחלות כוח נמוכות של הגידול #ND10405. (ב) thz ספקטרום התמונה של הגידול #ND10405 על טווח תדירות 0.5 thz – 1.0 thz. (ג) שידור השבירה מגרש מדד עבור dmem, PBS, ומים החל 0.15 THz – 3.5 Thz. (ד) מקדם ספיגת השידור (cm– 1) מגרש עבור dmem, PBS ומים החל מ 0.15 Thz – 3.5 thz. איור 10a, 10A מתפרסמות מראש מ-T. באומן ואח '28 עם הרשאה מ-IEEE ו- איור 10a, איור 10A מתפרסמות מראש מ-ווהרה ואח '19 עם אישור של הוצאת iop, בע מ נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של
דוגמה נוספת לדבקות מספיקות לפרוטוקול מוצגת ל#ND11713 הגידול באיור 11. במקרה זה, בועות האוויר בין צלחת הפוליסטירן לבין הגידול לא הוסרו כאשר הגידול הונח על הצלחת עבור הליך ההדמיה. הדבר גרם למספר נקודות של השתקפות נמוכה על פני תמונת THz באיור 11B, שמנעה השוואה מדויקת לפתולוגיה באיור 11b. כך, אם בועות אוויר שנצפו לאחר הצבת הגידול על הצלחת, לחצו על זה עם מלקחיים או להרים את הגידול ולגלגל אותו בעדינות על הפוליסטירן עד פערי האוויר מוסרים.
איור 11: הממצאים בתמונה THz הנגרמת על ידי נוכחות של בועות אוויר בין צלחת הקלקר והגידול. (A) כוח מחלות נמוך התמונה של הגידול #ND11713. (ב) thz ספקטרום התמונה של הגידול #ND11713 על טווח תדירות מ 0.5 – 1.0 Thz. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
ספקטרוסקופיית שידור תוצאות18 עבור אותו מדגם (ND14139) מוצגים באיור 12. חלקי הגידול נלקחו מנקודות 
ובאיור 12a ומאופיינים בעקבות הפרוטוקול. שתי הנקודות שנבחרו נלקחו מאזור רקמת הסרטן בגידול בהתאם לדימוי הפתולוגיה באיור 12B. מקדם ספיגה שחולצו ואת המדד השבירה עבור שני מקטעי הגידול מוצגים באיור 12ג, D. שתי הנקודות הראו הסכמה טובה. לכל טווח התדרים העקומה השחורה מ0.15 – 2 THz באיור 12C ואיור 12c מייצג נתונים שהתקבלו מן הספרות23 כדי להשוות את התוצאות שהתקבלו בעבודתנו.
איור 12: האפיון של סרטן השד הגידול #ND14139 באמצעות ספקטרוסקופיית שידור THz. (א) התמונה של הגידול עם שתי נקודות שנבחרו מסומנים ומשם 0.5 mm חלקים עבים של הגידול נחתכו עבור מדידות ספקטרוסקופיית שידור. (ב) מחלות כוח נמוכות של הגידול. (ג) מקדם קליטת השידור (cm– 1) העלילה החל 0.15 – 3.5 thz בנקודות ו. (ד) שידור השבירה מתווה העלילה החל 0.15 – 3.5 thz בנקודות ו . .ברשותו של טי . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יעיל THz השתקפות הדמיה של רקמה טרייה תלויה בעיקר בשני היבטים קריטיים: 1) את השיקול הנכון של טיפול ברקמה (סעיפים 2 ו 4.15); ו -2) הגדרת הבמה (בעיקר סעיף 4.11). ייבוש מספיק של הרקמה יכול לגרום השתקפות מוגברת חוסר יכולת להמחיש אזורים בשל השתקפויות גבוהות של DMEM ונוזלים אחרים. בינתיים, מגע רקמות עני עם חלון הדמיה יוצר טבעות או נקודות של השתקפות נמוכה בתמונה השתקפות THz שטשטש את התוצאות. מאמץ נוסף יש לנקוט כדי להבטיח מגע רקמות טוב עם חלון הדמיה, כולל מיקום הרקמה כדי להשיג ממשק טוב יותר. לאפיון רקמות, יש ליישם בקפידה שיקולים נוספים לכיוונון הבמה. איזון לא תקין של השלב על ידי מיקרון אפילו כמה יכול לגרום משמרות משמעותיות במדד השבירה המחושבת מקדם הקליטה של הרקמה. זה יכול להיות גם תוצאה של החלת לחץ יותר מדי על הרקמה בעת הרכבה על חלון הדמיה, אשר יכול לגרום להשתחוות של צלחת פוליסטירן. לחישובים מדויקים, יש להשיג גם את אות ההתייחסות שנבחר לאפיון מאותו מישור שלב של התמונה כדי להימנע משינוי פאזה מלאכותי.
האזור העיקרי בו ניתן לשנות את הפרוטוקול הוא בחומרים הדיאלקטרי המשמשים לטעינת הרקמה, כגון קוורץ (סעיפים 3.6 – 3.7) ופוליסטירן (החל בסעיף 4.5). כל עוד החומרים הנבחרים של החלון הם עבים בצורה אחידה של ספיגה נמוכה מספיק כדי להיות אינטראקציה אות טובה עם הגידול, חומרים אחרים יכולים להיות מוחלף. יש להעריך את החומרים לפני הזמן כדי לקבוע אם הם מספקים מטוס פאזה מספיק. לחלופין, עבור מערכות שבהן חלון הדימות יתוקן, ניתן לטפל בעובי חלון שאינו אחיד על-ידי אפיון התזוזה של השלב המחושב מסריקת חלון ריקה. יש גם מקום לשינוי איך הרקמה מותקן עבור המשלוח לפתולוג. בעוד הרקמה לסימון צבעים משמשים כאן מתוך האמנה, ההיבט החשוב הוא להיות שיטה במקום המאפשר השוואה בין הדמיה THz לבין פתולוגיה. החששות העיקריים לפתרון בעיות עבור הפרוטוקול יהיה כרוך בקבלת אות THz טוב והקמת הרוח הנכונה, אשר יהיה תלוי במערכת ספציפית בשימוש.
המגבלה העיקרית של כל טכניקה חדשה טיפול רקמות הוא הזמן כי הרקמה נחשפת לאוויר. פרוטוקול זה תוכנן כך הרקמה יכולה להישאר חשופה לא יותר 1 h כדי למנוע התפרקות לפני הערכת הפתולוגיה. דבר זה משתקף גם בבחירה של גודל השלב של התמונה. מערכת thz בפרוטוקול זה יכול להגיע כל גודל שלב מ 50-500 יקרומטר ב 50 יקרומטר בהפרשים, אם כי הרזולוציה המרחבית המקסימלית של המערכת היא סביב 80 יקרומטר בשל התוכן ספקטרלי של האות thz. השלב 200 יקרומטר בפרוטוקול סיפק פירוט מספיק תוך שמירה על זמן סריקה סביר של ~ 30 דקות. הערכה של דגימות הגידול על ידי הפתולוג הייעוץ שלנו קבע כי כמות זו של חשיפה אווירית לא לגרום נזק לרקמות בדרך הנצפה ברמה התאית. עם זאת, חומרים כגון ג'לטין ניתן להשתמש כדי לספק הדמיה THz ברורה ללא ייבוש יתר, והוא עשוי להיות נחקר לעדכונים עתידיים לפרוטוקול29. לשימוש יעיל בזמן, שלבים כמו טיהור המערכת עם חנקן יבש והגדרת הדמיה או ספקטרוסקופיה ניתן לבצע לפני הסרת הרקמה מתוך DMEM. זה חשוב גם עבור יישומים העתיד הפנימי שבו הזמן נלקח להדמיה הוא גורם מפתח ביישום הדמיה THz לתוך זרימת העבודה כירורגית.
שימוש בפרוטוקול זה מייצג ירידה משמעותית פוטנציאלית בזמן להעריך את השוליים הכירורגית של הגידול ממספר ימים או שבועות עד כמה דקות. זה יהיה מושגת כאשר החומרה של מערכת THz משופרת להשתמש במצלמות THz במקום סורקים מוטוריים stepper בעתיד. בשלב הנוכחי את השיטה הדומה ביותר המועסקים באופן הפנים הוא הדגימה רדיוגרפיה, אשר לוקח תמונות רנטגן של השידור של גידולים לפרשנות על ידי רדיולוג כדי לקבוע אם יש סרטן על משטח הרקמה. פרוטוקול הדימות המתואר מספק אמצעי הדמיה ישירה של משטח הרקמה. הפרוטוקול עבור גידולים בסרטן השד הטרי יכול לשמש גם לאפיון והדמיה של כל סוג אחר של גידול מוצק מראש הטרי8,9,10,11. בעוד כתב יד זה מתמקד בהדמיה הדמיה של גידולים השד הטרי בעקבות הפרוטוקול המתואר, thz הדמיה של התאים המשויכים formalin קבוע-מוטבע בלוקים רקמות יש גם אומת בהצלחה עם פתולוגיה14,15,16,17,19. ניתן לפתח פרוטוקולי דימות הדומים לזו המוצעת לתמיכה בפתולוגיה בניתוח רקמות מוטבעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים שאין להם ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) פרס R15CA208798 ובחלקו על ידי הקרן הלאומית למדע (NSF) פרס 1408007. מימון עבור מערכת THz פעמו הושג באמצעות NSF/MRI הפרס 1228958. אנו מכירים את השימוש ברקמות שרכש על ידי המחקר הלאומי מחקר מחלף (NDRI) עם תמיכה של NIH מענק U42OD11158. אנו מכירים גם את שיתוף הפעולה עם המעבדה לאבחון בעלי חיים של אוקלהומה באוניברסיטת מדינת אוקלהומה לניהול הליך histopathology על כל הרקמות שטופלו בעבודה זו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% isopropyl alcohol | VWR | 89108-162 | Contains 70% USP grade isopropanol and 30% USP grade deionized water |
| Alconox powder detergent | VWR | 21835-032 | Concentrated detergent to remove organic contaminants from glass, metal, stainless steel, porcelain, ceramic, plastic, rubber, and fiberglass |
| Bio Hazard Bags | Fisher Scientific | 19-033-712 | Justrite FM-Approved Biohazard Waste Container Replacement Bags |
| Cardboard holder | N/A | N/A | Scrap cardboard to keep tissue imaging face intact when immersed in formalin |
| Centrifuge Tubes | VWR | 10026-078 | Centrifuge Tubes with Flat Caps, Conical-Bottom, Polypropylene, Sterile, Standard Line |
| Cotton Swabs | Walmart | 551398298 | Q-tips Original Cotton Swabs used to dye the tissue |
| Ethyl Alcohol | VWR | 71002-426 | KOPTECH Pure (undenatured) anhydrous (200 proof/100%) ethyl alcohol |
| Eye protection goggles | VWR | 89130-918 | Kimberly-clark professional safety glasses |
| Face Mask | VWR | 95041-774 | DUKAL Corporation surgical masks |
| Filter paper | Sigma Aldrich | Z240087 | Whatman grade 1 cellulose filters |
| Formalin solution | Sigma Aldrich | HT501128-4L | 10% neutral buffered formalin |
| Human freshly excised tumors (Infilterating Ductal Carcinoma (IDC)) | National Disease Research Interchange (NDRI biobank | N/A | A protocol is signed with the NDRI for the type of tumors required |
| IRADECON Bleach solution | VWR | 89234-816 | Pre-diluted Sodium Hypochlorite Bleach solution |
| KIMTECH SCIENCE wipes | VWR | 21905-026 | Kimberly-clark professional Kim wipes |
| Laboratory Coat | VWR | 10141-342 | This catalog number is for medium size coat |
| Laboratory tweezers/Forceps | VWR | 82027-388 | Any laboratory tweezers can be used as long as it does not damage the tissue |
| Liquid sample holder (two quartz windows with a 0.1 mm teflon spacer) | TeraView, Ltd | N/A | 1" diameter, and 0.1452" thick quartz windows |
| Nitrile hand gloves | VWR | 82026-426 | This catalog number is for medium size gloves |
| Nitrogen cylinder | Airgas | NI UHP300 | NITROGEN UHP GR 5.0 SIZE 300 |
| Paper towel | VWR | 14222-321 | 11" x 8.78" Sheets, 1 Ply |
| Parafilm | VWR | 52858-076 | Flexible thermoplastic. Rolled, waterproof sheet interwound with paper to prevent self-adhesion. |
| Petri Dish | VWR | 470210-568 | VWR Petri Dish, Slippable, Mono Plate (undivided bottom) |
| Polystyrene Plate | Home Depot | 1S11143A | ~ 10 cm x 10 cm square piece cut from a 11" x 14" x 0.05" Non-glare styrene sheet |
| ScanAcquire Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz reflection imaging measurements |
| Stainless steel low-profile blade (#4689) | VWR | 25608-964 | Tissue-Tek Accu-Edge Disposable Microtome Blades |
| Stainless steel metal tray | Quick Medical | 10F | Polar Ware Stainless Steel Medical Instrument Trays |
| Tissue Marking Dyes | Ted Pella, Inc | Yellow Dye #27213-1 Red Dye #27213-2 Blue Dye #27213-4 |
Used to orient excised tissue samples sent to the histopathology laboratory |
| TPS Spectra 3000 | TeraView, Ltd | N/A | THz imaging and spectroscopy system |
| TPS Spectra Software | TeraView, Ltd | N/A | System Software for THz transmission spectroscopy measurements |
References
- Burford, N. M., El-Shenawee, M. O. Review of terahertz photoconductive antenna technology. Optical Engineering. 56 (1), 010901 (2017).
- Sun, Q., et al. Recent advances in terahertz technology for biomedical applications. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 7 (3), 345-355 (2017).
- Wilmink, G. J., et al. In vitro investigation of the biological effects associated with human dermal fibroblasts exposed to 2.52 THz radiation. Lasers in Surgery and Medicine. 43 (2), 152-163 (2011).
- Arbab, M. H., et al. Terahertz spectroscopy for the assessment of burn injuries in vivo. Journal of Biomedical Optics. 18 (7), 077004 (2013).
- Sy, S., et al. Terahertz spectroscopy of liver cirrhosis: investigating the origin of contrast. Physics in Medicine and Biology. 55 (24), 7587-7596 (2010).
- Yu, C., Fan, S., Sun, Y., Pickwell-Macpherson, E. The potential of terahertz imaging for cancer diagnosis: A review of investigations to date. Quantitative Imaging in Medicine and Surgery. 2 (1), 33-45 (2012).
- El-Shenawee, M., Vohra, N., Bowman, T., Bailey, K. Cancer detection in excised breast tumors using terahertz imaging and spectroscopy. Biomedical Spectroscopy and Imaging. 8 (1-2), 1-9 (2019).
- Yamaguchi, S., et al. Brain tumor imaging of rat fresh tissue using terahertz spectroscopy. Scientific Reports. 6 (30124), 1-6 (2016).
- Rong, L., et al. Terahertz in-line digital holography of human hepatocellular carcinoma tissue. Scientific Reports. 5 (8445), 1-6 (2015).
- Park, J. Y., Choi, H. J., Nam, G., Cho, K., Son, J. In Vivo Dual-Modality Terahertz / Magnetic Resonance Imaging Using Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles as a Dual Contrast Agent. IEEE Transactions on Terahertz Science and Technology. 2 (1), 93-98 (2012).
- Ji, Y. B., et al. Feasibility of terahertz reflectometry for discrimination of human early gastric cancers. Biomedical Optics Express. 6 (4), 1413-1421 (2015).
- Bowman, T., et al. A Phantom Study of Terahertz Spectroscopy and Imaging of Micro- and Nano-diamonds and Nano-onions as Contrast Agents for Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 3 (5), 055001 (2017).
- Chavez, T., Bowman, T., Wu, J., Bailey, K., El-Shenawee, M. Assessment of Terahertz Imaging for Excised Breast Cancer Tumors with Image Morphing. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 39 (12), 1283-1302 (2018).
- Bowman, T. C., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz Imaging of Excised Breast Tumor Tissue on Paraffin Sections. IEEE Transactions on Antennas and Propagation. 63 (5), 2088-2097 (2015).
- Bowman, T., El-Shenawee, M., Campbell, L. K. Terahertz transmission vs reflection imaging and model-based characterization for excised breast carcinomas. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3756-3783 (2016).
- Bowman, T., Wu, Y., Gauch, J., Campbell, L. K., El-Shenawee, M. Terahertz Imaging of Three-Dimensional Dehydrated Breast Cancer Tumors. Journal of Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves. 38 (6), 766-786 (2017).
- Bowman, T., et al. Pulsed terahertz imaging of breast cancer in freshly excised murine tumors. Journal of Biomedical Optics. 23 (2), 026004 (2018).
- Bowman, T., Vohra, N., Bailey, K., El-Shenawee, M. Terahertz tomographic imaging of freshly excised human breast tissues. Journal of Medical Imaging. 6 (2), 023501 (2019).
- Vohra, N., et al. Pulsed Terahertz Reflection Imaging of Tumors in a Spontaneous Model of Breast Cancer. Biomedical Physics and Engineering Express. 4 (6), 065025 (2018).
- Jacobs, L. Positive margins: the challenge continues for breast surgeons. Annals of Surgical Oncology. 15 (5), 1271-1272 (2008).
- Moran, M. S., et al. Society of Surgical Oncology--American Society for Radiation Oncology Consensus Guideline on Margins for Breast-Conserving Surgery With Whole-Breast Irradiation in Stages I and II Invasive Breast Cancer. International Journal of Radiation Oncology. 88 (3), 553-564 (2014).
- Fitzgerald, A. J., et al. Terahertz Pulsed Imaging of human breast tumors. Radiology. 239 (2), 533-540 (2006).
- Ashworth, P. C., et al. Terahertz pulsed spectroscopy of freshly excised human breast cancer. Optics Express. 17 (15), 12444-12454 (2009).
- Doradla, P., Alavi, K., Joseph, C., Giles, R. Detection of colon cancer by continuous-wave terahertz polarization imaging technique. Journal of Biomedical Optics. 18 (9), 090504 (2013).
- Reid, C. B., et al. Terahertz pulsed imaging of freshly excised human colonic tissues. Physics in Medicine and Biology. 56 (1), 4333-4353 (2011).
- Teraview. Teraview.com. , Available from: https://teraview.com (2019).
- Orosco, R. K., et al. Positive Surgical Margins in the 10 Most Common Solid Cancers. Scientific Reports. 8 (1), 1-9 (2018).
- Bowman, T., et al. Statistical signal processing for quantitative assessment of pulsed terahertz imaging of human breast tumors. 2017 42nd International Conference on Infrared, Millimeter, and Terahertz Waves (IRMMW-THz). , Cancun 1-2 (2017).
- Gavdush, A. A., et al. Terahertz spectroscopy of gelatin-embedded human brain gliomas of different grades: a road toward intraoperative THz diagnosis. Journal of Biomedical Optics. 24 (2), 027001 (2019).
