Summary
यह विधि एस अल्बा पत्तियों में मेटाबोलिक प्रक्रियाओं को समझने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) का उपयोग करती है जब ज़ेनोबायोटिक्स के संपर्क में आती है। विधि विशिष्ट, अक्षुण्ण ऊतकों के भीतर ब्याज के यौगिकों और उनके अनुमानित मेटाबोलाइट्स के स्थानिक स्थानीयकरण की अनुमति देती है।
Abstract
प्रस्तुत विधि एस अल्बा पत्तियों के मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल स्थापित करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (एमएसआई) का उपयोग करती है जब ज़ेनोबायोटिक्स के संपर्क में आती है। एक गैर-लक्षित दृष्टिकोण का उपयोग करके, पौधे के मेटाबोलाइट्स और ब्याज के ज़ेनोबायोटिक्स की पहचान की जाती है और विशिष्ट वितरण पैटर्न को उजागर करने के लिए पौधों के ऊतकों में स्थानीयकृत किया जाता है। फिर, पहचाने गए ज़ेनोबायोटिक्स से संभावित मेटाबोलाइट्स (यानी कैटाबोलाइट्स और संजूगेट) की सिलिको भविष्यवाणी में किया जाता है। जब एक ज़ेनोबायोटिक मेटाबोलाइट ऊतक में स्थित होता है, तो पौधे द्वारा इसके परिवर्तन में शामिल एंजाइम का प्रकार दर्ज किया जाता है। इन परिणामों का उपयोग पत्तियों में ज़ेनोबायोटिक संचय के जवाब में एस अल्बा पत्तियों में होने वाली विभिन्न प्रकार की जैविक प्रतिक्रियाओं का वर्णन करने के लिए किया गया था। मेटाबोलाइट्स की भविष्यवाणी दो पीढ़ियों में की गई थी, जिससे पत्तियों के ऊतकों में ज़ेनोबायोटिक्स को बदलने के लिए लगातार जैविक प्रतिक्रियाओं के प्रलेखन की अनुमति दी गई थी।
Introduction
ज़ेनोबायोटिक्स मानव गतिविधियों के कारण दुनिया भर में व्यापक रूप से वितरित किए जाते हैं। इनमें से कुछ यौगिक पानी में घुलनशील होते हैं और मिट्टी1द्वारा अवशोषित होते हैं और जब वे पौधे के ऊतकों में जमा होते हैं तो खाद्य श्रृंखला में प्रवेश करते हैं2,3,4. पौधे कीड़े और शाकाहारी द्वारा खाए जाते हैं, जो अन्य जीवों का शिकार होते हैं। कुछ ज़ेनोबायोटिक्स का सेवन और पौधे के स्वास्थ्य पर उनका प्रभाव5, 6,7,8बताया गया है , लेकिन हाल ही में ऊतक स्तर9पर । इसलिए, यह अभी भी स्पष्ट नहीं है कि ज़ेनोबायोटिक्स का मेटाबोलिज्म कहां या कैसे होता है, या यदि विशिष्ट पौधे मेटाबोलाइट्स विशिष्ट ऊतकों में ज़ेनोबायोटिक संचय से सहसंबद्ध हैं10। इसके अलावा, अधिकांश शोध ने पौधों में ज़ेनोबायोटिक्स और उनके मेटाबोलाइट्स के मेटाबोलिज्म की अनदेखी की है, इसलिए पौधों के ऊतकों में इन प्रतिक्रियाओं के बारे में बहुत कम जाना जाता है।
यहां प्रस्तावित जैविक नमूनों में एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं की जांच करने की एक विधि है जो प्रतिक्रियाओं के सब्सट्रेट्स और उत्पादों के ऊतक स्थानीयकरण से जुड़ी हो सकती है। विधि एक प्रयोग में जैविक नमूने की पूर्ण मेटाबोलिक प्रोफ़ाइल आकर्षित कर सकती है, क्योंकि विश्लेषण गैर-लक्षित है और ब्याज के विश्लेषण की कस्टम सूचियों का उपयोग करके जांच की जा सकती है। बशर्ते मूल डाटासेट में ट्रैक किए गए उम्मीदवारों की सूची हो । यदि नमूने में रुचि के एक या कई विश्लेषणों को नोट किया जाता है, तो विशिष्ट ऊतक स्थानीयकरण संबंधित जैविक प्रक्रियाओं के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है। इसके बाद संभावित उत्पादों/मेटाबोलाइट्स की खोज के लिए प्रासंगिक जैविक कानूनों का उपयोग करके सिलिको में ब्याज के विश्लेषण को संशोधित किया जा सकता है । प्राप्त मेटाबोलाइट्स की सूची का उपयोग तब शामिल एंजाइमों की पहचान करके और ऊतकों में प्रतिक्रियाओं को स्थानीयकृत करके मूल डेटा का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है, इस प्रकार होने वाली मेटाबोलिक प्रक्रियाओं को समझने में मदद मिलती है। कोई अन्य विधि जैविक नमूनों में होने वाली प्रतिक्रियाओं के प्रकार, ब्याज के यौगिकों के स्थानीयकरण, और उनके संबंधित मेटाबोलाइट्स के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करती है। इस विधि का उपयोग किसी भी प्रकार की जैविक सामग्री पर किया जा सकता है एक बार ताजा और बरकरार ऊतक उपलब्ध होते हैं और ब्याज के यौगिकों को आयनित किया जा सकता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल विलेट एट अल12 में प्रकाशित किया गया था और वैज्ञानिक समुदाय द्वारा उपयोग के लिए यहां विस्तृत है।
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Protocol
1. नमूना तैयार करना
- जैविक नमूना प्राप्त करें और या तो इसे ताजा और बरकरार रखें (उदाहरण के लिए, इसे ट्यूब में मजबूर न करें) या इसे फ्रीज करें। प्रस्तावित प्रोटोकॉल विशिष्ट ऊतकों में यौगिकों को स्थानीयकृत करने के लिए किसी भी प्रकार के ठोस जैविक नमूने (यानी पौधे, पशु या मानव ऊतकों) पर लागू होता है।
- एक क्रायोमीक्रॉम को -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें। नमूना धारक और ब्लेड को एक ही तापमान पर रखें।
- यदि आवश्यक हो, तो काटने के दौरान इसे संरक्षित करने के लिए एम1 एम्बेडिंग माध्यम में ऑब्जेक्ट को एम्बेड करें।
- क्रायोमि्रोटॉम कक्ष में रखे प्लास्टिक मोल्ड में कुछ मैट्रिक्स डालें। तेजी से नमूना जोड़ें और इसे कवर करने के लिए कुछ और एम्बेडिंग माध्यम डालें। मोल्ड के केंद्र में नमूना बनाए रखें क्योंकि मैट्रिक्स ठंडा करते समय जम जाता है।
नोट: एम्बेडिंग सभी जैविक वस्तुओं के लिए आवश्यक नहीं है। माउस दिमाग जैसी समरूप वस्तुओं को एम्बेडिंग माध्यम की आवश्यकता नहीं होती है और इसे जमे हुए काटा जा सकता है।
- क्रायोमि्रोटॉम कक्ष में रखे प्लास्टिक मोल्ड में कुछ मैट्रिक्स डालें। तेजी से नमूना जोड़ें और इसे कवर करने के लिए कुछ और एम्बेडिंग माध्यम डालें। मोल्ड के केंद्र में नमूना बनाए रखें क्योंकि मैट्रिक्स ठंडा करते समय जम जाता है।
- कैमियोम्रोटॉम धारक पर एम्बेडेड या जमे हुए नमूने को रखें और इसे तेज ब्लेड से काटें। पौधों के नमूनों के लिए 5-30 माइक्रोन की मोटाई अच्छी होती है, जिन्हें उनकी विषमता के कारण काटना मुश्किल होता है। काटने की मोटाई और तापमान को नमूने में अनुकूलित करें, जिससे सबसे अच्छी स्थितियों को खोजने के लिए कई कटौती की जा सके। दिए गए उदाहरण में, नमूना -20 डिग्री सेल्सियस पर काटा गया था। नमूना गिरावट से बचने के लिए नमूना को 0 डिग्री सेल्सियस के तहत रखने पर विचार करें।
नोट: क्रायोमिक्रोम के बगल में रखे दूरबीन माइक्रोस्कोप का उपयोग स्लाइस की गुणवत्ता निर्धारित करने में मदद कर सकता है। ऊतकों को बरकरार रहना चाहिए। - सांद्रता या एक छोटे तूलिका का उपयोग करके स्लाइस को आईटीओ-लेपित स्लाइड में सावधानी से ले जाएं, फिर नमूने को गर्म करने और सूखने के लिए स्लाइड के नीचे एक उंगली रखें। स्लाइड को क्रायोमीक्रॉमी चैंबर में तब तक रखें जब तक कि सभी सैंपल तैयार न हो जाएं। गर्मी के झटके से बचने के लिए धीरे-धीरे स् लाइड में- स् कीम निकालें।
नोट: स्लाइड के किस तरफ आईटीओ-लेपित है, इसकी जांच करने के लिए, कमरे के तापमान (आरटी) पर स्लाइड पर पानी की एक बूंद रखें। ड्रॉप आईटीओ-लेपित पक्ष पर गोल रहेगा या अनकोटेड साइड पर समतल होगा । - एक पतली मार्कर कलम या सुधार तरल पदार्थ का उपयोग कर स्लाइड पर निशान आकर्षित और मैट्रिक्स जमाव से पहले एक उच्च संकल्प स्कैनर के साथ इसे स्कैन । अंकों का उपयोग बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर में होने पर स्लाइड पर नमूने की सटीक स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जाएगा। संदर्भ के सटीक अंक प्राप्त करने का सबसे अच्छा तरीका एक क्रॉस आकर्षित करना है।
2. मैट्रिक्स बयान
- माल्डी मैट्रिक्स तैयार करें: 70 मिलीग्राम α-साइनो-4-हाइड्रोक्सीसिननामिक एसिड (एचसीसीए) मैट्रिक्स का वजन करें और इसे 0.2% टीएफए के साथ 10 एमएल पानी और मेथनॉल समाधान (50:50) में पतला करें। आर टी में 10 मिनट के लिए मैट्रिक्स सोनीकेट । सोनीफिकेशन के बाद अतिरिक्त ठोस मैट्रिक्स हो सकता है।
नोट: विभिन्न प्रकार के मालडी मैट्रिस का उपयोग ब्याज के विश्लेषण के आधार पर किया जा सकता है। - मैट्रिक्स जमाव रोबोट को 100% मेथनॉल से साफ करें।
- मेथनॉल और एक सटीक पोंछ का उपयोग करना, स्लाइड को साफ करें, नमूनों को उन्हें छूने के बिना और निशान को हटाए बिना पकड़े। नमूने के बिना एक क्षेत्र में स्लाइड पर एक साफ कवरलिप जोड़ें। स्लाइड का वह हिस्सा तो मैट्रिक्स बयान को ट्रैक करने के लिए ऑप्टिकल डिटेक्टर पर रखा जाता है ।
नोट: ऑप्टिकली मैट्रिक्स मोटाई ट्रैक करने के लिए, स्लाइड और कवरस्लिप बहुत साफ होना चाहिए । - मैट्रिक्स जमाव के लिए रोबोट का उपयोग करें: जलाशय में मैट्रिक्स समाधान के केवल 6 एमएल रखें, और 8 मिलील की कुल मात्रा के लिए 100% मेथनॉल के 2 एमएल जोड़ें।
नोट: बयान के साथ मैट्रिक्स मोटाई की रिकॉर्डिंग स्वचालित है और एक यूएसबी छड़ी का उपयोग कर बरामद किया जा सकता है । छिड़काव विधि का विकास यहां विस्तृत नहीं है।
3. डेटा अधिग्रहण
- मैट्रिक्स चोटियों को संदर्भ के रूप में उपयोग करके द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर को कैलिब्रेट करने के लिए एक माल्डी प्लेट पर मैट्रिक्स का 1 माइक्रोन रखें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर पर एक अधिग्रहण विधि का विकास यहां विस्तृत नहीं है।
- स्रोत में मालदी प्लेट डालें, एफटीएमएसकंट्रोल सॉफ्टवेयर में"लोड टारगेट"पर क्लिक करें, और प्लेट लोड होने का इंतजार करें।
- माल्डी प्लेट का प्रतिनिधित्व करने वाली छवि में मौके पर क्लिक करके मैट्रिक्स स्पॉट की स्थिति चुनें।
- सॉफ्टवेयर के"नमूना जानकारी"टैब में नमूना नाम और फ़ोल्डर इंगित करें।
- "अधिग्रहण" पर क्लिक करकेअधिग्रहणशुरू करें।
- "MALDI वीडियो"टैब पर माउस पॉइंटर का उपयोग करके अधिग्रहण के दौरान प्लेट को थोड़ा ले जाएं ताकि लेजर विभिन्न स्थानों पर अंक हो।
- अधिग्रहण समाप्त होने पर,"अंशांकन"टैब पर जाएं, क्वाड्रेटिक मोड में एचसीसीए अंशांकन सूची चुनें और स्वचालित क्लिक करें। वैश्विक अंशांकन परिणाम"अंशांकन प्लॉट"विंडो में इंगित किया गया है और सोलारिक्स एक्सआर 7टी के लिए 0.2 पीपीएम से कम होना चाहिए।
- यदि अंशांकन अच्छा है, तो"स्वीकार करें"पर क्लिक करें और विधि को बचाएं।
- एक बार जब नमूनों पर मैट्रिक्स जमाव समाप्त हो जाता है, तो स्लाइड एडाप्टर में स्लाइड रखें और प्लास्टिक कवर का उपयोग करके निशानों की स्थिति को पुनः प्राप्त करें।
- फ्लेक्सइमेजिंग सॉफ्टवेयर में, सॉफ्टवेयर के साथ खुलने वाली पहली विंडो का उपयोग करके एक नया इमेजिंग रन सेट करें।
- इमेजिंग रन का नाम, परिणाम निर्देशिकाका चयन करें, और अगलेक्लिक करें ।
- रैस्टर आकार (यानी, उपयोगकर्ता-परिभाषित माप क्षेत्र) को इंगित करें, उपयोग की जाने वाली विधि का चयन करें (धारा 3.1 पर कैलिब्रेटेड), और आगेक्लिक करें।
- स्लाइड स्कैन करने के बाद चरण 1.6 पर प्राप्त स्लाइड की ऑप्टिकल इमेज लोड करें और आगेक्लिक करें ।
- छवि एक व्यापक खिड़की में खुलती है। स्लाइड की स्थिति सिखाने के लिए स्लाइड पर अंकों का उपयोग करें: FTMSControlमें, माल्डी वीडियो विंडो के लक्ष्य को एक निशान की सही स्थिति पर रखें, फिर वापस फेल्सीइमिंग पर आएं और ऑप्टिकल इमेज पर सटीक उसी बिंदु पर क्लिक करें। इसे तीन स्वतंत्र बिंदुओं के लिए दोहराएं। निशान वाले प्लास्टिक कवर को अपनी स्थिति को ठीक करने और शिक्षण की सुविधा के लिए मालदी प्लेट पर रखा जाता है।
नोट: यदि अंक एक मार्कर के साथ किए गए थे, स्लाइड के पीछे सफेद सुधार तरल पदार्थ जोड़ने उंहें शिक्षण के दौरान बाहर खड़े कर सकते हैं ।
- "जोड़ें माप क्षेत्रों" उपकरणों का उपयोग कर फ्लेक्सइमिंग सॉफ्टवेयर में नमूनों में रुचिके क्षेत्रोंड्रा।
- इमेजिंग रन और एक"AutoXecute अनुक्रम"सहेजें अगर कई नमूनों का विश्लेषण किया जाना है ।
- यदि कई नमूनों का विश्लेषण किया जाता है तो"ऑटोएक्सीयूट बैच रनर"का उपयोग करके एक अनुक्रम लॉन्च करें।
नोट: डेटा को नियमित रूप से सुरक्षित स्थान पर सिंक्रोनाइज़ करें.
4. डाटा प्रोसेसिंग
- विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर (एससीआईएलएस लैब) में कच्चे डेटा का आयात करें और एक डेटासेट बनाएं। यह इस सॉफ्टवेयर में दो अलग-अलग चरणों में किया जाता है।
- "बैचआयातक"उपकरण का उपयोग करें और कच्चे डेटा का चयन करें, लक्ष्य निर्देशिका को इंगित करें, और"आयात"पर क्लिक करें।
- आयात के बाद, आगे के विश्लेषण के लिए कई डेटासेट को जोड़ा जा सकता है। डेटासेट को मिलाने के लिए, "फ़ाइल का उपयोगकरें| नया| डेटासेट"उपकरण।
- अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले उपकरण के प्रकार का चयन करें,"+"पर क्लिक करके आयातित डेटासेट जोड़ें, और वस्तुओं पर क्लिक करके और खींचकर छवियों की व्यवस्था करें।
- ब्याज की सीमा का संकेत देकर यदि आवश्यक हो तो मास रेंज सेटिंग्स की जांच करें या संशोधित करें। आयात सारांश देखने और आयात लॉन्च करने के लिए आगे क्लिक करें।
- एक नमूने के विभिन्न ऊतकों में रुचि के m/z कल्पना और/ बस ब्याज की m/z का चयन करने के लिए स्पेक्ट्रा पर क्लिक करें या m/z बॉक्समें मूल्य टाइप करें ।
- यदि विभिन्न ऊतकों और/या विभिन्न नमूनों के बीच कोलोकैलाइज्ड या भेदभावपूर्ण मूल्यों की खोज करने के लिए आवश्यक हो तो सांख्यिकीय परीक्षण करें ताकि एम/जेड ऑफ इंटरेस्ट का निर्धारण किया जा सके । उपकरण'टूल'मेनू में उपलब्ध हैं और इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं किए जाएंगे।
- ऑब्जेक्ट टैब से एक .csv फाइल के रूप में एम/जेड ऑफ इंटरेस्ट (जैसे, कोलोकैलाइज्ड, भेदभावपूर्ण यौगिक) का निर्यात करें। अगर यह बहुत बड़ा नहीं है (यानी अधिकतम 60,000 लाइनें) तो पूरे डेटासेट का निर्यात भी किया जा सकता है। लाल तीर द्वारा इंगित ब्याज के क्षेत्र के दाईं ओर"निर्यात"आइकन पर क्लिक करें।
- एनोटेशन सॉफ्टवेयर (मेटाबोस्केप) में एक नया डेटासेट बनाने के लिए .csv फाइल आयात करें। "प्रोजेक्ट्स | पर क्लिक करें सीएसवी परियोजना का आयातकरें "। ध्यान रखें कि केवल सटीक एम/जेड पर विचार किया जाएगा, और आइसोटोपिक प्रोफाइल खो गया है।
नोट: 5.0 सॉफ्टवेयर संस्करण विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर से डेटा के सीधे आयात की अनुमति देता है, जो अधिक सटीक एनोटेशन को सक्षम बनाता है, क्योंकि आइसोटोपिक प्रोफ़ाइल पर विचार किया जा सकता है। - कस्टम-निर्मित विश्लेषण सूची के साथ एनोटेट करें, जिसे सार्वजनिक रूप से उपलब्ध डेटाबेस से प्राप्त किया जा सकता है। एनालिट लिस्ट बनाने के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा एक टेम्पलेट दिया जाता है।
- एनोटेटेड यौगिकों के मेटाबोलाइट्स के सिलिको भविष्यवाणी में प्रदर्शन करने के लिए भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर (मेटाबोलाइट भविष्यवाणी) का उपयोग करें। ब्याज के यौगिक के विकसित सूत्र की आवश्यकता है, या तो सॉफ्टवेयर में उपयोगकर्ता द्वारा तैयार किया गया है या .mol फ़ाइल के रूप में आयात किया गया है। फिर विधि एक सरल कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल है।
- मेटाबोलाइट्स की सूची को ठीक करें, एक विश्लेषण सूची बनाएं, और अनुमानित मेटाबोलाइट्स के साथ कच्चे डेटा को एनोटेट करने के लिए एनोटेशन सॉफ्टवेयर में इसका उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, यदि मेटाबोलाइट्स की सूची कम है, तो मैन्युअल रूप से चरण 4.8 में इसे खोजें।
- विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा में मेटाबोलाइट्स के ऊतक वितरण की कल्पना करें।
- रुचि के अनुमानित मेटाबोलाइट पर सही क्लिक करके भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर में मेटाबॉलिक प्रक्रियाओं में शामिल एंजाइमों के नाम ठीक करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल पर्यावरण में ज़ेनोबायोटिक्स के संपर्क में एस अल्बा पेड़ से नमूना ताजा पत्तियों पर लागू किया गया था। इस प्रक्रिया को चित्र 1में दर्शाया गया है । पहला कदम ब्याज के नमूने के पतले स्लाइस तैयार करना है। पौधों के नमूनों को अक्सर जानवरों के नमूनों की तुलना में काटना अधिक कठिन होता है, क्योंकि ऊतक विषम होते हैं और इसमें पानी और/या हवा हो सकती है । इस कठिनाई को एम्बेडिंग माध्यम का उपयोग करके संभाला जाता है, जो नमूने के चारों ओर एक सजातीय ब्लॉक बनाता है। मैट्रिक्स जमाव एक रोबोट के उपयोग से सुविधा है, हाथ हेरफेर से बचने और प्रजनन योग्य परिणामों को आश्वस्त। पूरी प्रक्रिया के दौरान मालडी मैट्रिक्स लेयर की मोटाई का पालन किया जाता है और इसे रिकॉर्ड किया जा सकता है। डेटा अधिग्रहण के लिए एक उच्च संकल्प बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर को संभालने और नमूनों और यौगिकों के प्रकार के लिए विधि अनुकूलित करने के लिए सीखने की आवश्यकता है जांच की जा रही है । कच्चे डेटा को ब्याज के यौगिकों की खोज करने और उनके ऊतक स्थानीयकरण को प्रदर्शित करने के लिए एक विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर में आयात किया जाता है। सॉफ्टवेयर में उपलब्ध सांख्यिकीय उपकरणों का उपयोग करके भेदभावपूर्ण या कोलोकैलाइज्ड यौगिक पाए जा सकते हैं। इस कदम पर यौगिकों की केवल हूबहू एम/जेड ही पता चल जाती है। ब्याज के यौगिकों को तब एनोटेशन सॉफ्टवेयर में निर्यात किया जाता है, जो उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित ब्याज के यौगिकों की एक कस्टम सूची के साथ सटीक एम/जेड की तुलना कर सकता है । यदि सटीक एम/जेड ब्याज के एक यौगिक के m/z से मेल खाता है, तो यह एनोटेटेड है । मेटाबोलिक प्रोफाइल जांच के संदर्भ में, मेटाबोलाइट्स की सिलिको भविष्यवाणी में एनोटेटेड यौगिकों का चयन किया जाता है। मेटाबोलाइट्स उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले जैविक प्रतिक्रिया नियमों के प्रकार उपयोगकर्ता द्वारा आसानी से चुने जाते हैं, साथ ही उन पीढ़ियों की संख्या भी होती है जिन पर मेटाबोलाइट्स की भविष्यवाणी की जाती है। भविष्यवाणी मेटाबोलाइट्स की सूची का उपयोग एनोटेशन सॉफ्टवेयर में कच्चे डेटा सटीक एम/जेड और भविष्यवाणी मेटाबोलाइट्स एम/जेड (चित्रा 1)के बीच मैचों की खोज करने के लिए किया जा सकता है । एनोटेटेड मेटाबोलाइट्स को उनके ऊतक स्थानीयकरण(चित्रा 2)प्राप्त करने के लिए विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ्टवेयर में खोजा जा सकता है। जैविक नमूने(चित्र 3)में होने वाली मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं को आकर्षित करने के लिए ब्याज के मूल यौगिकों के चयापचय में शामिल एंजाइमों को बरामद किया जा सकता है।
इस उदाहरण में, पौधे की पत्तियों में दवा टेलमिसरतन की पहचान की गई थी; यह ऊतकों भर में वितरित किया गया था। टेलमिसरतन के मेटाबोलाइट्स की भविष्यवाणी की गई और कच्चे आंकड़ों में उनकी तलाश की गई । एनोटेशन से पता चला कि पत्तियों के आंतरिक ऊतकों में पहली पीढ़ी (I) मेटाबोलाइट का पता लगाया गया था और आगे दूसरी पीढ़ी (II) मेटाबोलाइट्स में अपमानित किया गया था, जो आंतरिक ऊतकों में स्थानीयकृत थे या आम तौर पर सभी पत्ती ऊतकों(चित्रा 2)में वितरित किए गए थे। ये परिणाम टेलमिसरतन को नीचा दिखाने के लिए पत्तियों में एक सक्रिय मेटाबोलिक प्रतिक्रिया का सुझाव देते हैं। इस प्रक्रिया को पत्तियों में एनोटेटेड ब्याज के कई यौगिकों पर लागू किया गया था, और प्रतिक्रियाओं में शामिल एंजाइमों को ज़ेनोबायोटिक्स संचय के लिए पौधे की प्रतिक्रिया में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए बरामद किया गया था। यह एस अल्बा पत्तियों(चित्रा 3)में ज़ेनोबायोटिक्स मेटाबोलिज्म में शामिल एंजाइमों का अवलोकन देता है।
चित्रा 1. विधि की सामान्य संरचना। एक ताजा नमूना काटा जाता है और उपयुक्त माल्डी मैट्रिक्स के साथ छिड़काव किए गए आईटीओ-लेपित स्लाइड पर रखा जाता है। माल्डी अधिग्रहण कच्चे डेटा प्रदान करता है जिससे ऊतक के भीतर स्थानीयकरण को एससीआईएलएस लैब सॉफ्टवेयर के साथ देखा जा सकता है। मेटाबोस्केप का उपयोग एनोटेशन के लिए किया जाता है, और मेटाबोलाइट भविष्यवाणी का उपयोग मेटाबोलाइट (यानी कैटाबोलाइट्स और कंजूगेट्स) भविष्यवाणी के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। एस अल्बा पर प्राप्त परिणामों का उदाहरण ज़ेनोबायोटिक्स के संपर्क में आता है। तेलमिसरतन को पौधे की पत्तियों में पहचाना गया था और सभी ऊतकों में कल्पना की गई थी। टेलमिसार्टन मेटाबोलाइट्स की भविष्यवाणी की गई थी और उनके ऊतक स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए कच्चे डेटा पर एनोटेट किया गया था। पहली पीढ़ी (I) मेटाबोलाइट सी33एच32एन4ओ3 मुख्य रूप से आंतरिक ऊतकों में स्थानीयकृत किया गया था, जबकि दूसरी पीढ़ी (II) मेटाबोलाइट्स कभी-कभी अधिक आम तौर पर वितरित किए जाते थे। यह आंकड़ा Villette एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3। एस अल्बा पत्तियों में होने वाली संभावित प्रतिक्रियाओं के लिए प्रस्तावित वैश्विक एंजाइमेटिक प्रोफाइल ज़ेनोबायोटिक्स एक्सपोजर के जवाब में। मेटाबोलाइट भविष्यवाणी और ब्याज की वस्तु पर एनोटेशन ने ब्याज के यौगिक के मेटाबोलिज्म के लिए जिम्मेदार संभावित एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का सुझाव दिया। यह आंकड़ा Villette एट अल से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण हिस्सा नमूना तैयारी है: नमूना नरम और बरकरार होना चाहिए। काटना सबसे कठिन हिस्सा है, क्योंकि नमूने का तापमान और मोटाई अध्ययन किए गए नमूने के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकती है। पशु ऊतक आमतौर पर सजातीय और काटने में आसान होते हैं। पौधे के नमूने अक्सर विभिन्न संरचनाओं को शामिल करते हैं और इसलिए ब्लेड को नरम, कठोर या खाली संवहनी ऊतकों के रूप में बरकरार रखना अधिक कठिन होता है। हाइड्रोफिलिक ऊतकों में बर्फ के गठन और उनके विनाश से बचने के लिए पौधों के नमूनों के साथ काम करते समय ताजा ऊतकों का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है। आईटीओ-लेपित स्लाइड पर जमा होने पर स्लाइस को धीरे-धीरे ले जाया जाना चाहिए। मैल्डी मैट्रिक्स को मैट्रिक्स क्रिस्टल के साथ स्प्रे शीट के क्लॉगिंग से बचने के लिए थोड़ा पतला किया गया था, जो तब हो सकता है जब 100% मेथनॉल के 2 एमएल को चरण 2.4 पर नहीं जोड़ा जाता है।
यह विधि एक आसान एक दिन का नमूना तैयारी प्रोटोकॉल प्रदान करती है जो माल्डी मैट्रिक्स जमाव के लिए रोबोट के उपयोग के कारण प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करती है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल ऊतक काटने और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग में क्षमता की आवश्यकता है और केवल यौगिकों कि आयनित किया जा सकता है पर लागू होता है । हालांकि, यह इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री11में उपयोग किए जाने वाले लेबलिंग की आवश्यकता के बिना आणविक पहचान प्रदान करता है। उच्च संवेदनशीलता हासिल की जाती है क्योंकि यौगिकों को सीधे ऊतकों या कोशिकाओं में आयनित किया जाता है, जो निष्कर्षण प्रोटोकॉल12द्वारा उत्पादित कमजोर पड़ने के प्रभाव से बचते हैं। नमूनों का विश्लेषण गैर-लक्षित तरीके से किया जाता है, जो नमूनों में अंतर्जात या ज़ेनोबायोटिक्स यौगिकों की बड़े पैमाने पर प्रोफाइलिंग की अनुमति देता है। इसलिए, बहिर्जात यौगिकों के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं का पालन किया जा सकता है। गैर-लक्षित विश्लेषण के साथ मेटाबोलाइट्स की सिलिको भविष्यवाणी शास्त्रीय द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग में एक और आयाम जोड़ती है, क्योंकि मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं को ऊतकों में जमा होने वाले बहिर्जात यौगिकों के प्राथमिकताओं के ज्ञान के बिना निगरानी की जा सकती है। आज तक, इस विधि (उदाहरण के लिए, चूहों को खिलाई जाने वाली ब्याज की दवाएं)13के साथ केवल ज्ञात यौगिकों और कुछ मेटाबोलाइट्स का पालन किया गया है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के साथ, मूल यौगिकों और उनके मेटाबोलाइट्स ऊतकों के भीतर स्थानीयकृत किया जा सकता है, और बहिर्जात यौगिकों के संचय के लिए जैविक प्रतिक्रियाओं और/या उनके मेटाबोलाइट्स का पालन किया जा सकता है ।
यह प्रोटोकॉल न केवल ज़ेनोबायोटिक्स के लिए पौधों की प्रतिक्रिया पर लागू होता है, बल्कि दवाओं के जवाब में पशु चयापचय को समझने, पौधे/कवक बातचीत का पालन करने, बायोटिक या अजैविक तनावों के लिए पौधों की प्रतिक्रिया, या बीमारियों के विकास को समझने के लिए, ब्याज के ऊतकों में मेटाबोलिक प्रक्रियाओं का खुलासा करने के लिए भी उपयोग किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम चार्ल्स पिनेऊ, मेलेनी लैगरिग और रेगिस लैविग्ने को पौधों के नमूनों के MALDI इमेजिंग के लिए नमूना तैयार करने के बारे में उनके सुझावों और चालों के लिए धन्यवाद देते हैं।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
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