Summary
Deze methode maakt gebruik van massaspectrometrie beeldvorming (MSI) om metabolische processen in S. alba bladeren te begrijpen wanneer blootgesteld aan xenobiotica. De methode maakt de ruimtelijke lokalisatie mogelijk van belangrijke verbindingen en hun voorspelde metabolieten in specifieke, intacte weefsels.
Abstract
De gepresenteerde methode maakt gebruik van massaspectrometrie beeldvorming (MSI) om het metabolische profiel van S. alba bladeren vast te stellen bij blootstelling aan xenobiotica. Met behulp van een niet-gerichte aanpak worden plantenmetabolieten en xenobiotica van belang geïdentificeerd en gelokaliseerd in plantenweefsels om specifieke distributiepatronen te ontdekken. Vervolgens wordt bij silicovoorspelling van potentiële metabolieten (d.w.z. katabolieten en conjugaten) uit de geïdentificeerde xenobiotica uitgevoerd. Wanneer een xenobiotische metaboliet zich in het weefsel bevindt, wordt het type enzym geregistreerd dat betrokken is bij de verandering ervan door de plant. Deze resultaten werden gebruikt om verschillende soorten biologische reacties te beschrijven die optreden in S. alba bladeren als reactie op xenobiotische accumulatie in de bladeren. De metabolieten werden voorspeld in twee generaties, waardoor de documentatie van opeenvolgende biologische reacties xenobiotica in de bladweefsels kon transformeren.
Introduction
Xenobiotica worden wijd verspreid over de hele wereld als gevolg van menselijke activiteiten. Sommige van deze verbindingen zijn in water oplosbaar en worden geabsorbeerd door de bodem1, en komen in de voedselketen wanneer ze zich ophopen in plantenweefsels2,3,4. De planten worden gegeten door insecten en herbivoren, die ten prooi vallen aan andere organismen. De inname van sommige xenobiotica en hun impact op de gezondheid van een plant zijn beschreven5,6,7,8, maar pas onlangs op weefselniveau9. Daarom is het nog steeds onduidelijk waar of hoe het metabolisme van xenobiotica optreedt, of dat specifieke plantenmetabolieten gecorreleerd zijn met xenobiotische accumulatie in specifieke weefsels10. Bovendien heeft het meeste onderzoek het metabolisme van xenobiotica en hun metabolieten in planten over het hoofd gezien, dus er is weinig bekend over deze reacties in plantenweefsels.
Hier wordt een methode voorgesteld om enzymatische reacties in biologische monsters te onderzoeken die kunnen worden geassocieerd met de weefsellokalisatie van substraten en producten van de reacties. De methode kan het volledige metabolische profiel van een biologisch monster in één experiment trekken, omdat de analyse niet gericht is en kan worden onderzocht met behulp van aangepaste lijsten van analytischen van belang. Hieronder vindt u een lijst met kandidaten die worden bijgehouden in de oorspronkelijke gegevensset. Als een of meer van belang analyten in het monster worden genoteerd, kan de specifieke weefsellokalisatie belangrijke informatie geven over de gerelateerde biologische processen. De analyten van belang kunnen vervolgens in silico worden gewijzigd met behulp van relevante biologische wetten om te zoeken naar mogelijke producten / metabolieten. De lijst van verkregen metabolieten wordt vervolgens gebruikt om de oorspronkelijke gegevens te analyseren door de betrokken enzymen te identificeren en de reacties in de weefsels te lokaliseren, waardoor de voorkomende metabolische processen worden geholpen te begrijpen. Geen enkele andere methode geeft informatie over de soorten reacties die optreden in de biologische monsters, de lokalisatie van de betrokken verbindingen en de bijbehorende metabolieten. Deze methode kan op elk type biologisch materiaal worden gebruikt zodra verse en intacte weefsels beschikbaar zijn en de verbindingen van belang kunnen worden geïoniseerd. Het voorgestelde protocol werd gepubliceerd in Villette et al.12 en wordt hier beschreven voor gebruik door de wetenschappelijke gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Monstervoorbereiding
- Verkrijg het biologische monster en houd het vers en intact (bijv. forceer het niet in een buis) of vries het in. Het voorgestelde protocol is van toepassing op elk type vast biologisch monster (d.w.z. plantaardige, dierlijke of menselijke weefsels) om verbindingen in specifieke weefsels te lokaliseren.
- Koel een cryomicrotome af tot -20 °C. Houd de monsterhouder en het zaagblad op dezelfde temperatuur.
- Sluit het object indien nodig in M1-insluitmedium in om het tijdens het snijden te behouden.
- Giet wat matrix in een plastic mal die in de cryomicrotomekamer is geplaatst. Voeg snel het monster toe en giet wat meer inbeddingsmedium om het te bedekken. Houd het monster in het midden van de mal terwijl de matrix stolt tijdens het afkoelen.
OPMERKING: Inbedding is niet nodig voor alle biologische objecten. Homogene objecten zoals muizenhersenen hebben geen insluitmedium nodig en kunnen bevroren worden gesneden.
- Giet wat matrix in een plastic mal die in de cryomicrotomekamer is geplaatst. Voeg snel het monster toe en giet wat meer inbeddingsmedium om het te bedekken. Houd het monster in het midden van de mal terwijl de matrix stolt tijdens het afkoelen.
- Plaats het ingebedde of bevroren monster op de cryomicrotomehouder en snijd het met een scherp mes. Een dikte van 5-30 μm is goed voor plantenmonsters, die moeilijk te snijden zijn vanwege hun heterogeniteit. Pas de snijdikte en temperatuur aan het monster aan en maak verschillende sneden om de beste omstandigheden te vinden. In het verstrekte voorbeeld werd het monster bij -20 °C gesneden. Overweeg het monster onder 0 °C te houden om monsterdegradatie te voorkomen.
OPMERKING: Het gebruik van een verrekijkermicroscoop naast de cryomicrotome kan helpen bij het bepalen van de kwaliteit van de plakjes. De weefsels moeten intact blijven. - Verplaats het plakje voorzichtig naar een ITO-gecoate dia met een tang of een kleine kwast en plaats vervolgens een vinger onder de dia om het monster op te warmen en te drogen. Houd de schuif in de cryomicrotomekamer totdat alle monsters klaar zijn. Haal de schuif langzaam uit de kamer om hitteschok te voorkomen.
OPMERKING: Om te controleren welke kant van de glijbaan ITO-gecoat is, plaatst u een druppel water op de glijbaan bij kamertemperatuur (RT). De druppel blijft rond aan de ITO-gecoate kant of vlakt af aan de ongecoate kant. - Teken markeringen op de dia met behulp van een dunne markeerstift of correctievloeistof en scan deze met een scanner met hoge resolutie vóór matrixdepositie. De markeringen worden gebruikt om de exacte positie van het monster op de dia te bepalen wanneer deze zich in de massaspectrometer bevindt. De beste manier om precieze referentiepunten te verkrijgen, is door een kruis te tekenen.
2. Matrixdepositie
- Bereid de MALDI-matrix voor: weeg 70 mg α-cyano-4-hydroxycinnaminezuur (HCCA) matrix en verdun deze in 10 ml water en methanoloplossing (50:50) met 0,2% TFA. Soniceer de matrix gedurende 10 minuten bij RT. Er kan extra solide matrix zijn na sonicatie.
OPMERKING: Afhankelijk van de beschikbare analyten kunnen verschillende soorten MALDI-matrices worden gebruikt. - Reinig de matrixdepositierobot met 100% methanol.
- Maak de dia schoon met methanol en een precisiedoekje, houd de monsters vast zonder ze aan te raken en verwijder de markeringen. Voeg een schone coverslip toe over de dia in een gebied zonder monster. Dat deel van de dia wordt vervolgens over de optische detector geplaatst om matrixdepositie te volgen.
OPMERKING: Om de matrixdikte optisch te volgen, moeten de schuif en de afdeklip zeer schoon zijn. - Gebruik de robot voor matrixdepositie: plaats slechts 6 ml van de matrixoplossing in het reservoir en voeg 2 ml 100% methanol toe voor een totaal volume van 8 ml.
OPMERKING: Het registreren van matrixdikte langs depositie is automatisch en kan worden hersteld met behulp van een USB-stick. De ontwikkeling van een spuitmethode is hier niet gedetailleerd.
3. Gegevensverwerving
- Plaats 1 μL van de matrix op een MALDI-plaat om de massaspectrometer te kalibreren met behulp van de matrixpieken als referentie. De ontwikkeling van een acquisitiemethode op de massaspectrometer wordt hier niet gedetailleerd beschreven.
- Plaats de MALDI-plaat in de bron, klik op "Doel laden" in ftmsControl-software en wacht tot de plaat is geladen.
- Kies de positie van de matrixspot door op de plek in de afbeelding van de MALDI-plaat te klikken.
- Geef de voorbeeldnaam en de map aan op het tabblad "Voorbeeldinformatie" van de software.
- Start acquisitie door te klikken op "Acquisitie".
- Beweeg de plaat tijdens de aanwinst iets met behulp van de muisaanwijzer op het tabblad "MALDI video" zodat de laser op verschillende plekken wijst.
- Wanneer de aanwinst is voltooid, gaat u naar het tabblad "Kalibratie", kiest u de HCCA-kalibratielijst in de kwadratische modus en klikt u op Automatisch. Het globale kalibratieresultaat wordt aangegeven in het venster "Kalibratieplot" en moet minder dan 0,2 ppm zijn voor een SolariX XR 7T.
- Als de kalibratie goed is, klikt u op "Accepteren" en slaat u de methode op.
- Zodra de matrixdepositie op de monsters is voltooid, plaatst u de dia in een diaadapter en haalt u de positie van de markeringen op met behulp van een plastic deksel.
- Stel in flexImaging-software een nieuwe imaging-uitvoering in met behulp van het eerste venster dat met de software wordt geopend.
- Geef de weergaverun een naam, selecteer de resultatenmapen klik op Volgende.
- Geef de rastergrootte aan (d.w.z. door de gebruiker gedefinieerd meetgebied), kies de te gebruiken methode (gekalibreerd in sectie 3.1) en klik op Volgende.
- Laad de optische afbeelding van de dia die is verkregen bij stap 1.6 na het scannen van de dia en klik op Volgende.
- De afbeelding wordt in een breder venster geopend. Gebruik de markeringen op de dia om de positie van de dia's aan te leren: plaats in ftmsControlhet doel van het MALDI-videovenster op de exacte positie van een markering, kom dan terug naar felxImaging en klik op exact hetzelfde punt op de optische afbeelding. Herhaal dit voor drie onafhankelijke punten. De plastic hoes met de markeringen wordt op een MALDI-plaat geplaatst om zijn positie te herstellen en het onderwijs te vergemakkelijken.
OPMERKING: Als de markeringen zijn gemaakt met een markering, kan het toevoegen van witte correctievloeistof aan de achterkant van de dia ervoor zorgen dat ze opvallen tijdens het lesgeven.
- Teken de regio's die van belang zijn voor de voorbeelden in de flexImaging-software met behulp van de tools "Meetgebieden toevoegen".
- Sla de imaging run en een "AutoXecute Sequence" op als er meerdere samples geanalyseerd moeten worden.
- Start een reeks met "AutoXecute Batch Runner" als meerdere samples worden geanalyseerd.
OPMERKING: Synchroniseer de gegevens regelmatig naar een veilige locatie.
4. Gegevensverwerking
- Importeer de onbewerkte gegevens in de visualisatiesoftware (SCiLS Lab) en maak een gegevensset. Dit gebeurt in twee afzonderlijke stappen in deze software.
- Gebruik het gereedschap "BatchImporteur" en selecteer de onbewerkte gegevens, geef de doelmap aan en klik op "Importeren".
- Na het importeren kunnen verschillende gegevenssets worden gecombineerd voor verdere analyse. Als u gegevenssets wilt combineren, gebruikt u hetbestand | Nieuw| Gereedschap Gegevensset" .
- Selecteer het type instrument dat wordt gebruikt voor acquisitie, voeg de geïmporteerde gegevenssets toe door op "+ "te klikken en rangschik de afbeeldingen door op de objecten te klikken en te slepen.
- Controleer de instellingen van het massabereik of wijzig indien nodig door het interessebereik aan te geven. Klik op Volgende om het importoverzicht te bekijken en het importeren te starten.
- Visualiseer de m/z van belang in de verschillende weefsels van een monster en/of in verschillende monsters. Klik gewoon op de spectra om de m/z van belang te selecteren of typ de waarde in het vak m/z .
- Voer indien nodig statistische tests uit om te zoeken naar gekoloniseerde of discriminerende waarden tussen verschillende weefsels en/of verschillende monsters om de m/z van belang te bepalen. De tools zijn beschikbaar in het menu "Tool" en worden niet beschreven in dit protocol.
- Exporteer de m/z van belang (bijv. gekoloniseerde, discriminerende verbindingen) als een .csv bestand vanaf het tabblad Object. De hele gegevensset kan ook worden geëxporteerd als deze niet te groot is (d.w.z. maximaal 60.000 regels). Klik op het pictogram "Exporteren" aan de rechterkant van het interessegebied aangegeven door een rode pijl.
- Importeer het .csv bestand om een nieuwe gegevensset te maken in de annotatiesoftware (Metaboscape). Klik op "Projecten | CSV-project importeren". Houd er rekening mee dat alleen de exacte m/z in aanmerking wordt genomen en dat het isotopenprofiel verloren gaat.
OPMERKING: De 5.0-softwareversie maakt directe import van gegevens uit de visualisatiesoftware mogelijk, wat een nauwkeurigere annotatie mogelijk maakt, omdat het isotopenprofiel kan worden overwogen. - Maak aantekeningen met op maat gemaakte analytlijsten, die kunnen worden afgeleid uit openbaar beschikbare databases. De software geeft een sjabloon om analytenlijsten te maken.
- Gebruik de voorspellingssoftware (Metaboliet voorspellen) om te presteren in silico voorspelling van de metabolieten van de geannoteerde verbindingen. De ontwikkelde formule van de samengestelde interesse is nodig, hetzij getrokken door de gebruiker in de software of geïmporteerd als een .mol bestand. Dan is de methode een eenvoudig stap-voor-stap protocol.
- Herstel de lijst met metabolieten, maak een analytenlijst en gebruik deze in de annotatiesoftware om aantekeningen te maken op de onbewerkte gegevens met voorspelde metabolieten. Als de lijst met metabolieten kort is, zoekt u er ook handmatig naar in stap 4.8.
- Visualiseer de weefselverdeling van de metabolieten in de ruwe gegevens in de visualisatiesoftware.
- Herstel de namen van de enzymen die betrokken zijn bij de metabolische processen in de voorspellingssoftware door met de rechtermuisknop op de voorspelde metaboliet van belang te klikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dit protocol werd toegepast op verse bladeren bemonsterd uit een S. alba boom blootgesteld aan xenobiotica in het milieu. Het proces is weergegeven in figuur 1. De eerste stap is het bereiden van dunne plakjes van het monster van belang. Plantenmonsters zijn vaak moeilijker te snijden dan diermonsters, omdat de weefsels heterogeen zijn en water en/of lucht kunnen bevatten. Deze moeilijkheid wordt aangepakt met behulp van insluitmedium, dat een homogeen blok rond het monster vormt. De matrixdepositie wordt vergemakkelijkt door het gebruik van een robot, waardoor handmanipulatie wordt vermeden en reproduceerbare resultaten worden verzekerd. De dikte van de MALDI matrixlaag wordt gedurende het gehele proces gevolgd en kan worden vastgelegd. Voor het verkrijgen van gegevens moet worden geleerd om te gaan met een massaspectrometer met hoge resolutie en om de methode aan te passen aan het type monsters en verbindingen dat wordt onderzocht. Onbewerkte gegevens worden geïmporteerd in een visualisatiesoftware om te zoeken naar de verbindingen van belang en hun weefsellokalisatie weer te geven. Discriminerende of gekokoloniseerde verbindingen zijn te vinden met behulp van statistische tools die beschikbaar zijn in de software. Bij deze stap zijn alleen de exacte m/z van de verbindingen bekend. De verbindingen van belang worden vervolgens geëxporteerd naar de annotatiesoftware, die de exacte m/z kan vergelijken met een aangepaste lijst van verbindingen van belang die door de gebruiker zijn gedefinieerd. Als de exacte m/z overeenkomt met de m/z van een samengestelde interesse, wordt deze geannoteerd. In het kader van een metabolisch profielonderzoek worden de geannoteerde verbindingen geselecteerd voor in silico-voorspelling van metabolieten. De soorten biologische reactieregels die worden gebruikt om metabolieten te genereren, kunnen gemakkelijk door de gebruiker worden gekozen, evenals het aantal generaties waarover de metabolieten worden voorspeld. De lijst met voorspelde metabolieten kan in de annotatiesoftware worden gebruikt om te zoeken naar overeenkomsten tussen ruwe gegevens exact m/z en voorspelde metabolieten m/z (figuur 1). De geannoteerde metabolieten kunnen worden gezocht in de visualisatiesoftware om hun weefsellokalisatie te verkrijgen (Figuur 2). De enzymen die betrokken zijn bij het metabolisme van de oorspronkelijke verbindingen van belang kunnen worden teruggewonnen om de metabolische reacties in het biologische monster te trekken (figuur 3).
In dit voorbeeld werd het medicijn telmisartan geïdentificeerd in de bladeren van de plant; het werd verspreid over de weefsels. Telmisartan's metabolieten werden voorspeld en gezocht in de ruwe gegevens. De annotaties toonden aan dat één metaboliet van de eerste generatie (I) werd gedetecteerd in de interne weefsels van de bladeren en verder werd afgebroken tot metabolieten van de tweede generatie (II), die gelokaliseerd waren in interne weefsels of meer in het algemeen verspreid waren in alle bladweefsels (figuur 2). Deze resultaten suggereren een actieve metabolische reactie in de bladeren om telmisartan af te doen. Het proces werd toegepast op verschillende verbindingen van belang geannoteerd in de bladeren, en de enzymen die betrokken zijn bij de reacties werden teruggevonden om hun rol in de reactie van de plant op xenobiotica accumulatie te onderzoeken. Dit geeft een overzicht van de enzymen die betrokken zijn bij het xenobiotisch metabolisme in S. albabladeren (Figuur 3).
Figuur 1. Algemene structuur van de methode. Een vers monster wordt gesneden en op een ito-gecoate dia geplaatst die met de juiste MALDI-matrix wordt besproeid. De MALDI-acquisitie levert ruwe gegevens op van waaruit de lokalisatie in het weefsel kan worden waargenomen met de SCiLS Lab-software. Metaboscape wordt gebruikt voor annotatie en Metaboliet Predict wordt gebruikt voor metaboliet (d.w.z. katabolieten en conjugaten) voorspelling. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Voorbeeld van de resultaten verkregen op S. alba bladeren blootgesteld aan xenobiotica. Telmisartan werd geïdentificeerd in de bladeren van de plant en gevisualiseerd in alle weefsels. Telmisartan metabolieten werden voorspeld en geannoteerd op de ruwe gegevens om hun weefsellokalisatie te visualiseren. De metaboliet C33 H 32N4O3van de eerste generatie (I) werd voornamelijk gelokaliseerd in de interne weefsels, terwijl metabolieten van de tweede generatie (II) soms meer algemeen werden gedistribueerd. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Villette et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3. Globaal enzymatisch profiel voorgesteld voor mogelijke reacties die optreden in S. alba bladeren als reactie op blootstelling aan xenobiotica. De metabolietvoorspelling en annotatie op het object van belang suggereerden de potentiële enzymatische reacties die verantwoordelijk zijn voor het metabolisme van de verbinding van belang. Dit cijfer werd aangepast met toestemming van Villette et al.12. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het kritieke deel van dit protocol is het monstervoorbereiding: het monster moet zacht en intact zijn. Snijden is het moeilijkste deel, omdat de temperatuur en dikte van het monster kunnen variëren, afhankelijk van het type monster dat wordt bestudeerd. Dierlijke weefsels zijn meestal homogeen en gemakkelijker te snijden. Plantenmonsters bevatten vaak verschillende structuren en zijn daarom moeilijker intact te houden omdat het blad zachte, harde of lege vasculaire weefsels tegenkomt. Het wordt ten zeerste aanbevolen om verse weefsels te gebruiken bij het werken met plantenmonsters om de vorming van ijs in de hydrofiele weefsels en hun vernietiging te voorkomen. De plakjes moeten voorzichtig worden verplaatst wanneer ze op de ito-gecoate dia worden gedeponeerd. De MALDI-matrix werd enigszins verdund om verstopping van de spuitplaat met matrixkristallen te voorkomen, wat kan gebeuren als de 2 ml 100% methanol niet wordt toegevoegd bij stap 2.4.
Deze methode biedt een eenvoudig eendaags monstervoorbereidingsprotocol dat reproduceerbare resultaten biedt dankzij het gebruik van een robot voor MALDI-matrixdepositie. Het voorgestelde protocol vereist competentie in weefselsnijden en massaspectrometrie beeldvorming en is alleen van toepassing op verbindingen die kunnen worden geïoniseerd. Het biedt echter moleculaire identificatie zonder dat etikettering nodig is zoals gebruikt in immunohistochie11. Hoge gevoeligheid wordt bereikt omdat de verbindingen direct geïoniseerd zijn in de weefsels of cellen, waardoor verdunningseffecten die worden veroorzaakt door een extractieprotocol worden vermeden12. De monsters worden op een niet-gerichte manier geanalyseerd, wat een grootschalige profilering van de endogene of xenobiotische verbindingen in de monsters mogelijk maakt. Daarom kunnen biologische reacties op exogene verbindingen worden gevolgd. De in silico voorspelling van metabolieten gekoppeld aan niet-gerichte analyse voegt een andere dimensie toe aan klassieke massaspectrometrie beeldvorming, omdat metabole reacties kunnen worden gecontroleerd zonder a priori kennis van de exogene verbindingen die zich in de weefsels zullen ophopen. Tot op heden zijn alleen bekende verbindingen en enkele metabolieten met deze methode gevolgd (bv. geneesmiddelen van belang die aan ratten worden gevoerd)13. Met het voorgestelde protocol kunnen de oorspronkelijke verbindingen en hun metabolieten in de weefsels worden gelokaliseerd en kunnen de biologische reacties op de accumulatie van exogene verbindingen en/of hun metabolieten worden gevolgd.
Dit protocol is niet alleen van toepassing op de reactie van planten op xenobiotica, maar kan ook worden gebruikt om het metabolisme van dieren te begrijpen als reactie op geneesmiddelen, om interacties tussen planten en schimmels te volgen, de reactie van planten op biotische of abiotische spanningen, of om de evolutie van ziekten te begrijpen, waardoor de metabolische processen in de weefsels van belang worden onthuld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets bekend te maken.
Acknowledgments
We danken Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue en Régis Lavigne voor hun tips en trucs met betrekking tot de monstervoorbereiding voor MALDI-beeldvorming van plantenmonsters.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
