Summary
Denna metod använder masspektrometri imaging (MSI) för att förstå metaboliska processer i S. alba blad när de utsätts för xenobiotika. Metoden möjliggör rumslig lokalisering av föreningar av intresse och deras förväntade metaboliter inom specifika, intakta vävnader.
Abstract
Metoden som presenteras använder masspektrometri imaging (MSI) för att fastställa den metaboliska profilen av S. alba blad när de utsätts för xenobiotika. Med hjälp av ett icke-riktat tillvägagångssätt identifieras växtmetaboliter och xenobiotika av intresse och lokaliseras i växtvävnader för att avslöja specifika distributionsmönster. Sedan, i silico förutsägelse av potentiella metaboliter (dvs kataboliter och konjugat) från de identifierade xenobiotika utförs. När en xenobiotisk metabolit finns i vävnaden registreras den typ av enzym som är involverad i dess förändring av växten. Dessa resultat användes för att beskriva olika typer av biologiska reaktioner som förekommer i S. alba blad som svar på xenobiotiska ackumulering i bladen. Metaboliterna förutspåddes i två generationer, vilket gör det möjligt att dokumentation av successiva biologiska reaktioner omvandla xenobiotika i bladvävnaderna.
Introduction
Xenobiotika är utbredd över hela världen på grund av mänskliga aktiviteter. Några av dessa föreningar är vattenlösliga och absorberas av jord1, och kommer in i livsmedelskedjan när de ackumuleras iväxtvävnader 2,3,4. Växterna äts av insekter och växtätare, som är rov för andra organismer. Intaget av vissa xenobiotika och deras inverkan på en växts hälsa har beskrivits5,6,7,8, men först nyligen på envävnadsnivå 9. Därför är det fortfarande oklart var eller hur metabolismen av xenobiotika förekommer, eller om specifika växtmetaboliter är korrelerade till xenobiotisk ackumulering i specifikavävnader 10. Dessutom har de flesta forskning förbisett metabolismen av xenobiotika och deras metaboliter i växter, så lite är känt om dessa reaktioner i växtvävnader.
Här föreslås en metod för att undersöka enzymatiska reaktioner i biologiska prover som kan kopplas till vävnadslokalisering av substrat och produkter av reaktionerna. Metoden kan rita den fullständiga metaboliska profilen för ett biologiskt prov i ett experiment, eftersom analysen inte är riktad och kan undersökas med hjälp av anpassade listor över analyter av intresse. Det finns en lista över kandidater som spåras i den ursprungliga datauppsättningen. Om en eller flera analyter av intresse noteras i provet kan den specifika vävnadslokaliseringen ge viktig information om de relaterade biologiska processerna. De analyter som är av intresse kan sedan modifieras i silico med hjälp av relevanta biologiska lagar för att söka efter möjliga produkter/metaboliter. Listan över erhållna metaboliter används sedan för att analysera de ursprungliga uppgifterna genom att identifiera de enzymer som är inblandade och lokalisera reaktionerna i vävnaderna, vilket hjälper till att förstå de förekommande metaboliska processerna. Ingen annan metod ger information om de typer av reaktioner som förekommer i de biologiska proverna, lokaliseringen av intresseföreningarna och deras relaterade metaboliter. Denna metod kan användas på alla typer av biologiskt material när färska och intakta vävnader finns tillgängliga och de föreningar som är av intresse kan joniseras. Det föreslagna protokollet publicerades i Villette et al.12 och beskrivs här för användning av forskarsamhället.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provberedning
- Ta det biologiska provet och håll det antingen friskt och intakt (t.ex. tvinga det inte till ett rör) eller frys det. Det föreslagna protokollet gäller alla typer av fasta biologiska prover (dvs. växtvävnader, animaliska eller mänskliga vävnader) för att lokalisera föreningar i specifika vävnader.
- Kyl ner en kryomicrotome till -20 °C. Håll provhållaren och bladet vid samma temperatur.
- Om det behövs bäddar du in objektet i M1-inbäddningsmediet för att bevara det under skärning.
- Häll lite matris i en plastform placerad i kryomikrotomkammaren. Tillsätt snabbt provet och häll lite mer inbäddningsmedium för att täcka det. Håll provet i mitten av formen när matrisen stelnar medan du kyler ner.
OBS: Inbäddning är inte nödvändigt för alla biologiska objekt. Homogena föremål som mushjärnor behöver inte bäddas in medium och kan skäras frysta.
- Häll lite matris i en plastform placerad i kryomikrotomkammaren. Tillsätt snabbt provet och häll lite mer inbäddningsmedium för att täcka det. Håll provet i mitten av formen när matrisen stelnar medan du kyler ner.
- Placera det inbäddade eller frysta provet på kryomikrotomhållaren och skär det med ett vasst blad. En tjocklek på 5-30 μm är bra för växtprover, som är svåra att skära på grund av deras heterogenitet. Anpassa skärtjockleken och temperaturen till provet och gör flera snitt för att hitta de bästa förutsättningarna. I exemplet klipptes provet vid -20 °C. Överväg att hålla provet under 0 °C för att undvika provnedbrytning.
OBS: Användning av ett kikarmikroskop placerat bredvid kryokrotomen kan hjälpa till att bestämma kvaliteten på skivorna. Vävnaderna måste förbli intakta. - Flytta försiktigt skivan till en ITO-belagd rutschkana med tång eller en liten pensel och placera sedan ett finger under bilden för att värma upp och torka provet. Håll rutschkanan i kryomikrotomkammaren tills alla prover är klara. Ta långsamt ut rutschkanan ur kammaren för att undvika värmestötar.
OBS: För att kontrollera vilken sida av bilden som är ITO-belagd, placera en droppe vatten på bilden vid rumstemperatur (RT). Droppen kommer att vara rund på den ITO-belagda sidan eller platta på den obelagda sidan. - Rita märken på bilden med en tunn markörpenna eller korrigeringsvätska och skanna den med en högupplöst skanner före matrisdeposition. Märkena kommer att användas för att bestämma provets exakta position på bilden när den är i masspektrometern. Det bästa sättet att få exakta referenspunkter är att rita ett kors.
2. Matrisdeposition
- Förbered matrisen för maldiverna: väg 70 mg α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (HCCA) matris och späd den i 10 ml vatten- och metanollösning (50:50) med 0,2% TFA. Sonicate matrisen i 10 minuter på RT. Det kan finnas extra fast matris efter ultraljudsbehandling.
OBS: Olika typer av MALDI-matriser kan användas beroende på analyter av intresse. - Rengör matrisdepositionsroboten med 100% metanol.
- Rengör diabilden med hjälp av metanol och en precisionsservett, håll i proverna utan att vidröra dem och utan att ta bort märkena. Lägg till ett rent täckglas över bilden i ett område utan exempel. Den delen av bilden placeras sedan över den optiska detektorn för att spåra matrisdeposition.
OBS: För att optiskt spåra matristjockleken måste bilden och täcket vara mycket rena. - Använd roboten för matrisdeposition: placera endast 6 ml matrislösning i behållaren och tillsätt 2 ml 100% metanol för en total volym på 8 ml.
OBS: Inspelning av matristjocklek längs deposition är automatisk och kan återställas med ett USB-minne. Utvecklingen av en sprutningsmetod beskrivs inte här.
3. Datainsamling
- Placera 1 μL matrisen på en MALDI-platta för att kalibrera masspektrometern med matristopparna som referenser. Utvecklingen av en förvärvsmetod på masspektrometern beskrivs inte här.
- Sätt in MALDI-plattan i källan, klicka på "Load Target" i ftmsControl-programvaran och vänta tills plattan laddas.
- Välj matrisfläckens position genom att klicka på platsen i bilden som representerar maldaldiplattan.
- Ange exempelnamnet och mappen på fliken "Exempelinformation" i programvaran.
- Starta förvärvet genom att klicka på "Förvärv".
- Flytta plattan något under förvärvet med muspekaren på fliken "MALDI video" så att lasern pekar på olika ställen.
- När förvärvet är klart går du till fliken "Kalibrering", väljer HCCA-kalibreringslista i kvadratiskt läge och klickar på Automatisk. Det globala kalibreringsresultatet anges i fönstret "Kalibreringsdiagram" och bör vara mindre än 0,2 ppm för en SolariX XR 7T.
- Om kalibreringen är bra klickar dupå" Acceptera " och sparar metoden.
- När matrisdepositionen på proverna är klar placerar du bilden i en bildadapter och hämtar markeringsläget med hjälp av ett plastlock.
- I flexImaging-programvaran ställer du in en ny bildkörning med det första fönstret som öppnas med programvaran.
- Namnge bildkörningen, välj Resultatkatalog ochklicka på Nästa.
- Ange rasterstorleken (dvs. användardefinierat mätområde), välj vilken metod som ska användas (kalibrerad i avsnitt 3.1) och klicka på Nästa.
- Läs in den optiska bilden av bilden som erhålls i steg 1.6 efter att ha skannat bilden och klicka på Nästa.
- Bilden öppnas i ett bredare fönster. Använd märkena på bilden för att lära ut bildernas position: i ftmsControlplacerar du målet för MALDI-videofönstret på den exakta positionen för ett märke och kommer sedan tillbaka till felxImaging och klickar på exakt samma punkt på den optiska bilden. Upprepa detta för tre oberoende punkter. Plasthöljet som bär märkena placeras på en MALD-platta för att återfå sin position och underlätta undervisningen.
OBS: Om märkena gjordes med en markör kan tillsats av vit korrigeringsvätska på baksidan av bilden göra att de sticker ut under undervisningen.
- Rita de regioner som är av intresse för proverna i flexImaging-programvaran med hjälp av verktygen "Lägg till mätregioner".
- Spara bildkörningen och en "AutoXecute Sequence" om flera prover ska analyseras.
- Starta en sekvens med "AutoXecute Batch Runner" om flera prover analyseras.
Synkronisera data regelbundet till en säker plats.
4. Databehandling
- Importera rådata till visualiseringsprogrammet (SCiLS Lab) och skapa en datauppsättning. Detta görs i två separata steg i den här programvaran.
- Använd verktyget "BatchImporter" och välj rådata, ange målkatalogen och klicka på "Importera".
- Efter importen kan flera datamängder kombineras för vidare analys. Om du vill kombinera datamängder använder du "File| Nytt| Datauppsättning" verktyg.
- Välj vilken typ av instrument som används för anskaffning, lägg till importerade datamängder genom att klicka på "+", och ordna bilderna genom att klicka och dra objekten.
- Kontrollera inställningarna för massintervallet eller ändra vid behov genom att ange intresseintervallet. Klicka på Nästa om du vill visa importsammanfattningen och starta importen.
- Visualisera m/z av intresse för olika vävnader i ett prov och/eller i olika prover. Klicka bara på spektra för att välja m / z av intresse eller skriv värdet i m / z-rutan .
- Utför statistiska tester om det behövs för att söka efter colocalized eller diskriminerande värden mellan olika vävnader och/eller olika prover för att bestämma m/z av intresse. Verktygen finns i menyn "Verktyg" och kommer inte att beskrivas i det här protokollet.
- Exportera m/z av intresse (t.ex. colocalized, discriminative compounds) som en .csv fil från fliken Objekt. Hela datauppsättningen kan också exporteras om den inte är för stor (dvs. högst 60 000 rader). Klicka på ikonen" Export" till höger om den intresseregion som indikeras av en röd pil.
- Importera .csv för att skapa en ny datauppsättning i anteckningsprogrammet (Metaboscape). Klicka på "Projekt | Importera CSV-projekt". Var medveten om att endast den exakta m / z kommer att beaktas, och den isotopiska profilen går förlorad.
OBS: 5.0-programvaruversionen möjliggör direktimport av data från visualiseringsprogramvaran, vilket möjliggör en mer exakt anteckning, eftersom den isotopiska profilen kan övervägas. - Kommentera med skräddarsydda analytlistor, som kan härledas från offentligt tillgängliga databaser. En mall ges av programvaran för att skapa analytlistor.
- Använd förutsägelseprogramvaran (Metabolite Predict) för att utföra i silico förutsägelse av metaboliterna i de kommenterade föreningarna. Den utvecklade formeln av intresseföreningen behövs, antingen ritad av användaren i programvaran eller importerad som en .mol-fil. Då är metoden ett enkelt steg-för-steg-protokoll.
- Återställ listan över metaboliter, skapa en analytlista och använd den i anteckningsprogramvaran för att kommentera rådata med förutsagda metaboliter. Alternativt, om listan över metaboliter är kort, sök manuellt efter den i steg 4.8.
- Visualisera vävnadsfördelningen av metaboliterna i rådata i visualiseringsprogramvaran.
- Återställ namnen på de enzymer som är involverade i de metaboliska processerna i förutsägelseprogramvaran genom att högerklicka på den förväntade metaboliten av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll tillämpades på färska blad som provtagits från ett S. alba träd utsätts för xenobiotika i miljön. Processen visas i figur 1. Det första steget är att förbereda tunna skivor av det intresseprov som finns. Växtprover är ofta svårare att skära än djurprover, eftersom vävnaderna är heterogena och kan innehålla vatten och/eller luft. Denna svårighet hanteras med hjälp av inbäddningsmedium, som bildar ett homogent block runt provet. Matrisdepositionen underlättas av användning av en robot, vilket undviker handmanipulation och försäkrar reproducerbara resultat. MALDI-matrisskiktets tjocklek följs under hela processen och kan registreras. Datainsamling kräver att man lär sig att hantera en högupplöst masspektrometer och att anpassa metoden till den typ av prover och föreningar som undersöks. Rådata importeras till en visualiseringsprogramvara för att söka efter intresseföreningar och visa deras vävnadslokalisering. Diskriminerande eller colocalized föreningar kan hittas med hjälp av statistiska verktyg som finns i programvaran. I detta steg är endast de exakta m/ z av föreningarna kända. Föreningarna av intresse exporteras sedan till anteckningsprogramvaran, som kan jämföra den exakta m/z med en anpassad lista över föreningar av intresse som definieras av användaren. Om den exakta m/z matchar m/z av en förening av intresse, kommenteras den. I samband med en metabolisk profil undersökning väljs de kommenterade föreningarna för i silico förutsägelse av metaboliter. De typer av biologiska reaktionsregler som används för att generera metaboliter väljs lätt av användaren, liksom antalet generationer över vilka metaboliterna förutspås. Listan över förutsagda metaboliter kan användas i anteckningsprogramvaran för att söka efter matchningar mellan rådata exakt m/z och förväntade metaboliter m/z (Figur 1). De kommenterade metaboliterna kan sökas i visualiseringsprogramvaran för att få deras vävnadslokalisering (Figur 2). De enzymer som är involverade i metabolismen av de ursprungliga föreningarna av intresse kan återvinnas för att dra de metaboliska reaktioner som förekommer i det biologiska provet (figur 3).
I detta exempel identifierades läkemedlet telmisartan i växtbladen; det distribuerades i hela vävnaderna. Telmisartans metaboliter förutspåddes och söktes i rådata. Anteckningarna visade att en första generationens (I) metabolit upptäcktes i bladens inre vävnader och ytterligare försämrades till andra generationens (II) metaboliter, som lokaliserades i inre vävnader eller mer allmänt distribuerades i allabladvävnader( figur 2 ). Dessa resultat tyder på en aktiv metabolisk reaktion i bladen för att försämra telmisartan. Processen tillämpades på flera föreningar av intresse som kommenterats i bladen, och enzymerna som var involverade i reaktionerna återfanns för att undersöka deras roll i växtens svar på xenobiotika ackumulering. Detta ger en översikt över de enzymer som är involverade i xenobiotikametabolism i S. albablad (Figur 3).
Figur 1. Metodens allmänna struktur. Ett färskt prov skärs och placeras på en ITO-belagd glid som sprutas med lämplig maldaldimatris. MALDI-förvärvet ger rådata från vilka lokaliseringen i vävnaden kan observeras med SCiLS Lab-programvaran. Metaboscape används för anteckning, och Metabolite Predict används för metabolit (dvs. kataboliter och konjugat) förutsägelse. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2. Exempel på de resultat som erhållits på S. alba blad utsätts för xenobiotika. Telmisartan identifierades i växtbladen och visualiserades i alla vävnader. Telmisartan metaboliter förutspåddes och kommenteras på rådata för att visualisera deras vävnad lokalisering. Den första generationen (I) metabolit C33H32N4O3 lokaliserades huvudsakligen i de inre vävnaderna, medan andra generationens (II) metaboliter ibland var mer allmänt distribuerade. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Villette et al.12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 3. Global enzymatisk profil föreslås för potentiella reaktioner som förekommer i S. alba lämnar som svar på xenobiotika exponering. Metabolit förutsägelse och anteckningar om föremålet för intresse föreslog de potentiella enzymatiska reaktioner som ansvarar för metabolismen av föreningen av intresse. Denna siffra har anpassats med tillstånd från Villette et al.12. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kritiska delen av detta protokoll är provberedningen: provet måste vara mjukt och intakt. Skärning är den svåraste delen, eftersom provets temperatur och tjocklek kan variera beroende på vilken typ av prov som studeras. Djurvävnader är vanligtvis homogena och lättare att skära. Växtprover innehåller ofta olika strukturer och är därför svårare att hålla intakta eftersom bladet stöter på mjuka, hårda eller tomma kärlvävnader. Det rekommenderas starkt att använda färska vävnader när du arbetar med växtprover för att undvika bildandet av is i de hydrofila vävnaderna och deras förstörelse. Skivorna måste flyttas försiktigt när de deponeras på den ITO-belagda rutschkanan. MALDI-matrisen späddes något för att undvika igensättning av sprayplåten med matriskristaller, vilket kan hända om 2 ml 100% metanol inte tillsätts i steg 2.4.
Denna metod erbjuder ett enkelt provberedningsprotokoll på en dag som ger reproducerbara resultat på grund av användning av en robot för MALDI-matrisdeposition. Det föreslagna protokollet kräver kompetens inom vävnadsskärning och masspektrometriavbildning och gäller endast föreningar som kan joniseras. Det ger dock molekylär identifiering utan behov av märkning som används i immunohistokemi11. Hög känslighet uppnås eftersom föreningarna är direkt joniserade i vävnaderna eller cellerna, vilket undviker utspädningseffekter som produceras av ett extraktionsprotokoll12. Proverna analyseras på ett icke-riktat sätt, vilket möjliggör en storskalig profilering av de endogena eller xenobiotiska föreningarna i proverna. Därför kan biologiska svar på exogena föreningar följas. In silico förutsägelse av metaboliter i kombination med icke-riktad analys lägger till en annan dimension till klassisk massa spektroskopi imaging, eftersom metaboliska reaktioner kan övervakas utan a priori kunskap om de exogena föreningar som kommer att ackumuleras i vävnaderna. Hittills har endast kända föreningar och några metaboliter följts med denna metod (t.ex. läkemedel av intresse som matas till råttor)13. Med det föreslagna protokollet kan de ursprungliga föreningarna och deras metaboliter lokaliseras inom vävnaderna, och de biologiska svaren på ackumulering av exogena föreningar och/eller deras metaboliter kan följas.
Detta protokoll gäller inte bara för växters svar på xenobiotika, men kan också användas för att förstå djurmetabolism som svar på droger, för att följa växt- / svampinteraktioner, växtrespons på biotiska eller abiotiska påfrestningar eller för att förstå utvecklingen av sjukdomar, vilket avslöjar de metaboliska processerna i vävnaderna av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Charles Pineau, Mélanie Lagarrigue och Régis Lavigne för deras tips och tricks gällande provberedning för MALDI-avbildning av växtprover.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slips | Bruker Daltonics | 267942 | |
| Cryomicrotome | Thermo Scientific | ||
| Excel | Microsoft corporation | ||
| flexImaging | Bruker Daltonics | ||
| ftmsControl | Bruker Daltonics | ||
| GTX primescan | GX Microscopes | ||
| HCCA MALDI matrix | Bruker Daltonics | 8201344 | |
| ImagePrep | Bruker Daltonics | ||
| ITO-coated slides | Bruker Daltonics | 237001 | |
| M1-embedding matrix | ThermoScientific | 1310 | |
| Metabolite Predict | Bruker Daltonics | ||
| Metaboscape | Bruker Daltonics | ||
| Methanol | Fisher Chemicals | No specific reference needed | |
| MX 35 Ultra blades | Thermo Scientific | 15835682 | |
| Plastic molds | No specific reference needed | ||
| SCiLS Lab | Bruker Daltonics | ||
| SolariX XR 7Tesla | Bruker Daltonics | The method proposed is not limited to this instrument | |
| Spray sheets for ImagePrep | Bruker Daltonics | 8261614 | |
| TFA | Sigma Aldrich | No specific reference needed |
References
- Zhang, D., Gersberg, R. M., Ng, W. J., Tan, S. K. Removal of pharmaceuticals and personal care products in aquatic plant-based systems: A review. Environmental Pollution. 184, 620-639 (2014).
- Adeel, M., Song, X., Wang, Y., Francis, D., Yang, Y. Environmental impact of estrogens on human, animal and plant life: A critical review. Environment International. 99, 107-119 (2017).
- Prosser, R. S., Sibley, P. K. Human health risk assessment of pharmaceuticals and personal care products in plant tissue due to biosolids and manure amendments, and wastewater irrigation. Environment International. 75, 223-233 (2015).
- Wang, J., et al. Application of biochar to soils may result in plant contamination and human cancer risk due to exposure of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environment International. 121, 169-177 (2018).
- Marsik, P., et al. Metabolism of ibuprofen in higher plants: A model Arabidopsis thaliana cell suspension culture system. Environmental Pollution. 220, 383-392 (2017).
- He, Y., et al. Metabolism of ibuprofen by Phragmites australis: uptake and phytodegradation. Environmental Science and Technology. 51 (8), 4576-4584 (2017).
- Huber, C., Bartha, B., Harpaintner, R., Schröder, P. Metabolism of acetaminophen (paracetamol) in plants-two independent pathways result in the formation of a glutathione and a glucose conjugate. Environmental Science and Pollution Research. 16 (2), 206-213 (2009).
- Thomas, F., Cébron, A. Short-term rhizosphere effect on available carbon sources, phenanthrene degradation, and active microbiome in an aged-contaminated industrial soil. Frontiers in Microbiology. 7, 1-15 (2016).
- Villette, C., et al. In situ localization of micropollutants and associated stress response in Populus nigra leaves. Environment International. 126, 523-532 (2019).
- Sandermann, H. Plant metabolism of organic xenobiotics. Status and prospects of the 'Green Liver' concept. Plant Biotechnology and In Vitro Biology in the 21st Century. , 321-328 (1999).
- Sula, B., Deveci, E., Özevren, H., Ekinci, C., Elbey, B. Immunohistochemical and histopathological changes in the skin of rats after administration of lead acetate. International Journal of Morphology. 34 (3), 918-922 (2016).
- Villette, C., Maurer, L., Wanko, A., Heintz, D. Xenobiotics metabolization in Salix alba leaves uncovered by mass spectrometry imaging. Metabolomics. 15, 122 (2019).
- Khatib-Shahidi, S., Andersson, M., Herman, J. L., Gillespie, T. A., Caprioli, R. M. Direct Molecular Analysis of Whole-Body Animal Tissue Sections by Imaging MALDI Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 78 (18), 6448-6456 (2006).
