Med optogenetisk manipulation af specifikke neuronale populationer eller hjerneregioner, adfærd kan ændres med høj tidsmæssig og rumlig opløsning i frit bevægelige dyr. Ved at bruge forskellige optogenetiske værktøjer i kombination med kronisk implanterede optiske fibre, en række neuronale modulationer og adfærdsmæssige test kan udføres.
Optogenetisk modulering af neuronale kredsløb i frit bevægende mus påvirker akut og langvarig adfærd. Denne metode er i stand til at udføre manipulationer af enkelte neuroner og region-specifikke sender frigivelse, op til hele neuronal kredsløb i centralnervesystemet, og giver mulighed for direkte måling af adfærdsmæssige resultater. Neuroner udtrykke optogenetiske værktøjer via en injektion af virale vektorer bærer DNA valg, såsom Channelrhodopsin2 (ChR2). Lys bringes ind i specifikke hjerneregioner via kroniske optiske implantater, der ender direkte over målregionen. Efter to ugers restitution og korrekt værktøjsudtryk, mus kan gentagne gange anvendes til adfærdsmæssige tests med optogenetisk stimulation af neuroner af interesse.
Optogenetisk graduering har en høj tidsmæssig og rumlig opløsning, der kan opnås med høj cellespecificitet, sammenlignet med de almindeligt anvendte metoder såsom kemisk eller elektrisk stimulation. Lyset skader ikke neuronalt væv og kan derfor bruges til langsigtede eksperimenter samt til flere adfærdsmæssige eksperimenter i en mus. Mulighederne for optogenetiske værktøjer er næsten ubegrænset og gør det muligt aktivering eller lyddæmning af hele neuroner, eller endda manipulation af en bestemt receptor type ved lys.
Resultaterne af sådanne adfærdsmæssige eksperimenter med integreret optogenetisk stimulation visualiserer direkte ændringer i adfærd forårsaget af manipulation. Adfærden af det samme dyr uden lys stimulation som en baseline er en god kontrol for inducerede ændringer. Dette giver en detaljeret oversigt over neuronal typer eller neurotransmitter systemer involveret i specifikke adfærd, såsom angst. Plasticiteten af neuronale netværk kan også undersøges i detaljer gennem langsigtet stimulation eller adfærdsmæssige observationer efter optisk stimulation. Optogenetics vil bidrage til at oplyse neuronal signalering i flere former for neurologiske sygdomme.
Gradueringen af neuronal kredsløb i centralnervesystemet og deres adfærdsmæssige resultater er vigtige for at forstå, hvordan hjernen fungerer, især i psykiatriske sygdomme og kognitive opgaver såsom læring og hukommelse. Med optogenetik kan enkelte celler eller cellepopulationer op til hele kredsløb moduleres af lys. Fælles optogenetiske værktøjer som Channelrhodopsin2 (ChR2) eller Archaerhodopsin (Arch) er i stand til at aktivere eller lukke munden på neuroner, eller øge eller hæmme sender frigivelse på axon terminaler projicere til forskellige hjerne regioner1,2,3,4. Arch skal dog bruges omhyggeligt, da det blev påvist, at dens aktivering på præsynaptiske terminaler øger spontan sender frigivelse5. Arch er en ydre korrigerende protonpumpe, der ændrer pH-værdien inde i cellen. Denne alkaliske miljø inducerer calcium tilstrømning og forbedrer sender frigivelse5. For specifikt at modulere intracellulære signalveje kan receptorklokker, der består af et let aktivereligt optogenetisk værktøj, såsom rhodopsin eller kegle opsin, sammen med en passende G-proteinkoblet receptor, oprettes6,,7,,8. Mængden og variationen af de optogenetiske værktøjer , der er til rådighed , er steget betydeligt i løbet af det sidste årti9.
Formålet med optogenetics er at manipulere neuronal kredsløb under adfærd. Optogenetik gør det muligt for eksempel at måle akutte adfærdsændringer såsom ændringer i angstadfærd. Optogenetiske værktøjer leveres til målområder i hjernen via virale vektorer. Ved hjælp af særlige initiativtagere og smagsforstærkere eller Cre-loxP-systemet kan der sikres celletypespecificitet til udtryk for optogenetiske værktøjer (figur 1A). Der er flere genetisk modificerede muselinjer, der udtrykker enzymet Cre-Recombinase i specifikke celletyper. For eksempel, Nex-Cre mus udtrykke Cre-Recombinase i pyramideformede neuroner i cortex og hippocampus under kontrol af Nex-promotor10. Dette enzym er i stand til at invertere DNA-sekvenser, som er flankeret af loxP sider11. Derfor kan DNA-sekvensen af et dobbelt-floxet optogenetisk værktøj, som er omvendt og flankeret af loxP sider, kun transskriberes af neuroner, der besidder Cre-Recombinase, men ikke af andre neuronale typer12,13. I tilfælde af Nex-Cre mus, vil det optogenetiske værktøj udelukkende udtrykkes i pyramideale neuroner. Lysstimulation af visse hjerneregioner opnås derefter via kronisk implantation af optiske fibre direkte over regionen af interesse. Dyr kan derefter kobles til en passende lyskilde og frit opføre sig i næsten alle former for adfærdsmæssige tests.
Figur 1: Injektion og implantation. A) Cre-loxP system til ChR2-YFP. Dobbelt floxed optogenetisk værktøj er pakket i en adeno associeret virus (AAV) til injektion i hjernevævet. B)Sagittal syn på virusinjektion og implantation af en optisk neuronal grænseflade til/over IL-regionen i mPFC. Injektion og implantation blev udført ovenfra. Alle interesseregioner, IL, BLA og DRN, vises. C)Detaljeret visning af den implanterede optiske fiber, ærme og lyskilde. D)Spredning af blåt og rødt laserlysstimulation i gråt stof hjernevæv fra en 200 μm lysfiber (Yizhar et al. 2011). Blåt lys spreder, ved maksimum, 0,5 mm ind i vævet, rødt lys omkring 1 mm. Farvekodning: rød 50%, gul 10%, grøn 5%, blå 1%, hvis lyset når dette område. E)Koronal opfattelse af den ensidige implantation direkte over venstre IL med en 200 μm optisk fiber. IL-området har en bredde på 0,25 mm på hver halvkugle og en dybde på 0,2 mm. Blå og røde pærer er boarder af 5% lys spredning og overføres fra Yizhar et al til den rigtige størrelse. LoxP: locus af X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP: gult fluorescerende protein; dflox: dobbelt floxed; IL: infralimbe cortex; BLA: basolateral amygdala; DRN: dorsal raphe kerner; PrL: prelimbic region. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.
Optogenetiske tilgange udnyttes, da det muliggør både høj tidsmæssig og rumlig opløsning14 og celletype specifik graduering. Derudover er det muligt gentagne gange at bruge den implanterede enhed uden yderligere behandling. Efter en stereotaktisk operation, hvor injektion af en adeno-associeret virus bærer optogenetiske værktøj og implantation af den optiske fiber udføres, mus kan komme sig i to uger. Vi har valgt en restitutionstid på kun 2 uger, fordi det er tid nok til at komme sig efter operationen og for virus til at udtrykke. Da de adfærdsmæssige eksperimenter efterfølges af immunhisemi, er vi nødt til at sikre, at mus ikke bliver for gamle under eksperimentet; ellers er vævskvaliteten nedsat. De viser ingen åbenlyse adfærdsmæssige svækkelser fra implantatet og engagere sig i typiske bur adfærd. Selvfølgelig er implantationen ledsaget af en betydelig kirurgisk læsion; derfor overvåges musene intensivt. Efter operationen skal mus være enkelt anbragt, da gruppeop husede mus har tendens til at skade hinandens friske sår og implantater. Men, boligforhold har en stor indvirkning på angst niveau af mandlige mus, som enkelt huse mus viser lavere angst niveauer15 og generelt mindre depressive-lignende symptomer16.
Kemisk eller elektrisk manipulation af hjernekredsløb mangler den høje celletype specificitet af optogenetik og har en lavere tidsmæssig og rumligopløsning 14,17,18. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål, elektrisk eller kemisk stimulation kan have forskellige fordele. Når du passerer fiber terminaler i en bestemt region også skal stimuleres, elektrisk stimulation er den bedste metode. Kemisk stimulation er et godt valg, når senderspecifikke receptorer i en hel region skal aktiveres af agonister. En anden stor fordel ved optogenetik i forhold til kemisk eller elektrisk stimulation er, at endogent, neuroner ikke er følsomme over for lys, som undgår forekomsten af bivirkninger19. Faktisk kan høje lysintensiteter fremkalde varmeeffekter8,20, men på grund af ordentlig kontrolgrupper, kan de adfærdsmæssige virkninger på grund af optogenetisk manipulation elimineres.
Undersøgelse gnaver adfærd, især med hensyn til psykiatriske sygdomme, har i høj grad forbedret med optogenetik i frit bevægelige dyr, da det gør det muligt direkte graduering af enkelt receptorer op til specifikke cellepopulationer21 og kredsløb22. Muligheden for at måle de akutte virkninger af sådanne modulationer, samt de langsigtede adfærdsmæssige virkninger efter en defineret tid23 eller efter kronisk stimulation24, giver en bred fleksibilitet af eksperimentelle design og giver meget detaljeret indsigt i hjernen kredsløb. Lysstimulering kan bruges til at modulere neuroner placeret på injektionsstedet for det optogenetiske værktøj. Når både injektion og implantation adresse samme hjerne region, celle organer og ryg fremskrettede axoner af princip neuroner og interneuroner i denne region kan målrettes3,,6,8. Men, den lette fiber kan også implanteres i en region forskellig fra den injicerede en. I dette tilfælde kan lysstimulering modulere senderudløsning ved axonterminaler i projektionsområder i det injicerede område25,26,27.
I undersøgelsen her, optogenetik bruges i kombination med eksperimenter til at analysere angst-relaterede adfærd. Angstrelaterede psykiatriske sygdomme rammer mere end en tredjedel af verdensbefolkning 28,29,30 ogforårsager en stor økonomisk byrde31. De berørte lider af en følelse af ophidselse, spænding og bekymring efterfulgt af undgåelse adfærd32,33. Disse kronisk forekommende negative følelser, som primært er fokuseret på fremtidige begivenheder34, stærkt forstyrre dagligdagen for patienter. Almindelige behandlinger som benzodiazepiner eller selektive serotonin reuptake hæmmere (SSR-præparater) er kun en succes i nogle af patienterne. En stor mængde mennesker reagerer ikke på behandlingen på alle35, viser, at den mekanisme, der ligger til grund for sådanne sygdomme er endnu ikke fuldt forstået. Den mediale præfrontale cortex (mPFC) er kendt for at spille en vigtig rolle i udviklingen og manifestation af angst21,,25,,27,,36,37,38. Specifikt, overaktivering af den infralimbe cortex (IL) region i mPFC kan være en del af angst-relaterede lidelser39,40. Det eksempel eksperiment, der er beskrevet her kunne hjælpe med at forstå, hvordan modulationer i IL-regionen af mPFC påvirke angst adfærd. Derudover kan udviklingen af nye terapeutiske strategier for angstrelaterede psykiatriske sygdomme også potentielt støttes.
2-6 måneder gamle mandlige Nex-Cre mus bruges til at udtrykke ChR2 specifikt i pyramideformede neuroner i IL-regionen i mPFC41. Nex-Cre mus har en C57Bl/6 baggrund og udtrykke enzymet Cre-recombinase specifikt i pyramideformede neuroner. Under en stereotaktisk operation injiceres dobbelt floxed ChR2-DNA i IL-regionen via adeno-tilknyttede virusvektorer. Det optiske implantat placeres direkte over interesseområdet (Figur 1B), og implantatet fastgøres med tandcement. Kontroldyr får en injektion af dobbelt floxed tdTomato-DNA i samme region for at efterligne cellespecifikke udtryk.
Dyr er gruppe-opstærret indtil dagen for operationen og bagefter er enkelt opstærret for at undgå skader fra andre mus. Mus er anbragt i individuelle ventilerede bur (IVC) stativer i TypI-L bure til enkelt opsatte mus. Den lyse-mørke cyklus følger en 12:12 h rytme, lyset fase starter ved 10 AM. Alle adfærdsmæssige eksperimenter udføres i den mørke fase, som ligner den aktive fase af gnavere. Vand og standard mad pellets er tilgængelige ad libitum. Efter to ugers restitution, som sikrer et tilstrækkeligt udtryk for ChR2 i pyramideale neuroner, bruges mus til adfærdsmæssige eksperimenter.
Open Field (OF) er en 50 cm x 50 cm firkantet labyrint med sandblæste 40 cm høje vægge. Jorden er opdelt i 16 felter, hvor den indre 4 repræsenterer midten. Den målte funktionsmåde er: 1) tid brugt i midten, 2) antal centerposter og 3) samlet tilbagelagt distance. Under dette eksperiment er der 4 forsøg på i alt 20 minutter. I forsøg 1 og 3 sker der ingen lysstimulering, og i forsøg 2 og 4 udføres en 20 Hz stimulering med 5 ms lysimpuls og 1 mW lysintensitet på 473 nm (Figur 2A). I de senere forsøg blev der taget hensyn til tilvænning til testområdet, men brugen af sham-injicerede kontroldyr angiver, hvordan tilvænning udtrykkes.
Barnes Maze er et eksperiment for læring og hukommelse. Det er en cirkulær platform, der er 92 cm i diameter og indeholder 20 lige store huller omkring omkredsen. 19 af hullerne er lukket, og under et hul en flugtkasse præsenteres. I 4 på hinanden følgende dage har mus 4 træningsforsøg for at lære, hvor flugtboksen er. På den5. dag fjernes flugtboksen, og musene testes for, hvor meget tid de har brug for til at finde det rigtige hul. Den målte adfærd er: 1) Tid, indtil flugtboksen / det korrekte hul er fundet, 2) Antal målbesøg og fejl og 3) Afstand flyttet til i flugtboksen. Lysstimuleringen i forskellige grupper sker enten under erhvervelse eller konsolidering, som finder sted på træningsdagen 1-4, eller under hentning på testdagen, som er dag 5 (Figur 2D).
Figur 2: Adfærdsmæssige eksperimenter med optogenetiske protokoller. A)Skematisk tegning af Open Field eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. C)Skematisk tegning af Elevated-Plus Maze eksperiment med den tilsvarende lysstimuleringsprotokol. D)Skematisk tegning af Barnes Maze eksperiment med den tilsvarende lys stimulation protokol. EPM: Forhøjet Plus Labyrint; AF: Åbent felt; BM: Barnes labyrint test. Dette tal er blevet ændret fra Berg 201948. Klik her for at se en større version af dette tal.
For optogenetisk stimulation skal lysintensiteten og -hyppigheden tilpasses det optogenetiske værktøj og den neuronale type, der undersøges. Den lavest mulige lysintensitet bør anvendes for at undgå beskadigelse af vævet, da flere undersøgelser har vist, at der er mulige varmeeffekter på grund af stærklysintensitet 8,20. For ChR2 anvendes en 20 Hz stimulation med en lyspuls på 5 ms almindeligt2. Da ChR2 er ret lysfølsom, er 1 mW lysintensitet tilstrækkelig. Lysstimuleringsprotokollen veksler mellem lys fra og på forsøg for direkte at måle adfærdsændringer. De eksterne rumbetingelser for adfærdsmæssige eksperimenter bør forblive stabile for hele gruppen af dyr. Vigtige betingelser at overveje er støj (husk på, at enhederne selv kan gøre støj), lugten (altid rense adfærdsmæssige opsætninger med ethanol), lysintensiteten, og eksperimentatoren. Eksperimentatoren skal altid være den samme person. Desuden bør tidspunktet på dagen for forsøgene være det samme for alle dyr i en gruppe, et par timer efter starten på den mørke fase i anlægget foretrækkes.
Målet med dette eksperiment er at øge excitation / hæmning (E / I) forholdet i IL-regionen gennem stærk aktivering af excitatoriske pyramideformede neuroner. En forbedret E / I forholdet i denne særlige cortex region er kendt for at øge angst niveauer i mus40,,42,,43,,44.
Brug af lys til at manipulere neuronal signalering har været den foretrukne metode i næsten et årti nu. Siden 2005 er antallet af offentliggjorte artikler om udvikling af nye optogenetiske værktøjer4,6,8,14,49,,50,51 ogundersøgelser, hvor sådanne værktøjer anvendes til at undersøge hjernekredsløb21,23,40,43,52,steg kraftigt. På den ene side, med den enorme mangfoldighed af injicerbare optogenetiske værktøjer, implantation varianter, transgene muselinjer og adfærdsmæssige eksperimenter, muligheden for eksperimenter er mangfoldig og ubegrænset. På den anden side er muligheden for at lave fejl i valget af forsøgsbetingelser meget høj, og forsøgene er så specifikke, at sammenligneligheden med andre undersøgelser ofte er vanskelig.
Kritiske trin
Et vigtigt kritisk skridt i denne protokol er korrekt planlægning. Valget af det optogenetiske værktøj bør svare til det videnskabelige spørgsmål. Er det kun nødvendigt at manipulere den samlede aktivitet af en neuron eller synapse? Så kommercielt forudsat værktøjer som ChR221,,25,,27 og Arch37 er et godt valg. Men bortset fra det, hvis en særlig neurotransmitter system eller endda en enkelt receptor bør manipuleres, en individuel receptor kimær er ofte det bedre valg3,6. Flere receptor kimærer med GPCRs, de såkaldte Opto-XRs, og retningslinjer for at producere dem er allerede tilgængelige4,50. Ud over valget af optogenetiske værktøjer er muselinjen i kombination med adfærdseksperimentet også kritisk. Forskellige baggrundsstammer, som for eksempel C57Bl/6 og BALB/cByJ, viser forskellige adfærdsmæssige fænotyper i noglehenseender 53,54. C57Bl/6 mus har en lav baseline angst og kan bruges til angstdæmpende manipulation, mens BALB/cByJ viser højere angst niveauer og er derfor mere følsomme over for angstdæmpende medicin. Derudover kan de transgene varianter af disse baggrundsstammer også variere i deres fænotype48. Med en ordentlig kombination af specifikke initiativtagere i forbindelse med en optogenetisk værktøj og transgene muselinje, kan næsten alle ønskede cellepopulation målrettes.
Et kritisk skridt under operationen er rettet mod den korrekte placering. Ved hjælp af musen hjernen atlas, passende koordinater for den forreste-posterior akse, og mediale-laterale akse, og dybden af strukturen kan etableres45. I virkeligheden har hvert kranium en lidt anden form og størrelse. Således F-faktor46 til at justere stereotaktiske koordinater er ganske vigtigt, som er den korrekte næse og øre fiksering under stereotaktisk kirurgi. Hvis hovedet af musen vippes, vil injektionsdylen ikke målrette den ønskede region af interesse.
Derudover er diameteren af injektionsdylen også kritisk. Hvis det er for lille, ingen virus kan frigives i vævet, hvis det er for bredt, kanylen vil lække virus løsning på vej til regionen af interesse. Hvis den implanterede optiske fiber ender direkte over målregionen, virusudtryk i cortex regioner ovenfor betyder ikke noget. Men hvis implantatet er placeret over andre regioner for at stimulere axon terminaler, axonerne i øvre cortex regioner vil også blive aktiveret af lys og forfalske indhentede data. Som et eksempel: IL-regionen og den prælimske (PrL) region både projekt til basal amygdala55,56, men har helt forskellige funktioner og roller i graduering af angst26,57., Hvis implantatet placeres over amygdala for at aktivere axonterminaler fra IL-regionen, og under injektionsvirusopløsningen også blev placeret i PrL på grund af den forkerte injektionsdyle, er risikoen for også at aktivere axonterminaler fra PrL meget høj.
Under udarbejdelsen af kraniet til fiksering af implantatet er den sparsomme brug af primer og binding afgørende for en pålidelig og holdbar fiksering. Hvis 2-komponent vedhæftning system ikke anvendes tyndt, kan dental cement løsne sig fra kraniet efter et par dage eller uger. Derudover skal kraniet også tørres helt, før implantatet fastgøres, da cementen ellers ikke vil fastgøre korrekt til kraniet.
Der findes også kritiske trin i den adfærdsmæssige del af denne protokol. For det første er opførelsen af labyrinten meget vigtig. I hver adfærdsmæssig opsætning findes der flere varianter i litteraturen vedrørende størrelse og form samt for selve proceduren58,59,60. Det er vigtigt at vælge en variant, der gør dataene sammenlignelige og reproducerbare. Der bør også tages hensyn til særlige krav til udnyttede muselinjer43,48. I de repræsentative data for EPM kan det ses, at flere Nex-Cre mus faldt ned fra labyrinten eller gled af flere gange (Figur 2b). For disse mus ville en labyrint med en lille væg omkring de åbne arme have været et bedre alternativ.
For det andet er det afgørende at holde alle eksterne rumforhold konstante61, ellers ville forskellige grupper af mus slet ikke være sammenlignelige. I den forbindelse er det meget vigtigt at vælge tidspunktet for eksperimentet som et tidspunkt, hvor den eksperimentelle opsætning er ledig, og eksperimentatoren altid er til stede. Endvidere bør hændelser i bygningen, såsom byggearbejde, afprøvning af systemer (brandalarm) eller rengøringsdagen for museanlægget, overvejes for at undgå interferens med de opnåede data.
Endelig er håndterings- og boligforhold afgørende for adfærdsmæssige eksperimenter. Når en implantation udføres, mus skal være enkelt ophus på grund af risikoen for skade fra andre mus. For at sikre god sammenlignelighed mellem grupper og en lav fejl inden for en gruppe skal hver mus have samme burstørrelse og berigelse. For angst-relaterede eksperimenter, enkelt boliger har nogle fordele som singe opsatte mandlige mus viser en lavere baseline angst niveau, mindre variation i deres angst niveau, og mindre depressive-lignende symptomer15,16. Gruppe husede hanmus kan være meget forskellige i deres angstniveau på grund af hierarkiet blandt musene. Udover huset er en konstant og lige håndtering af alle mus og grupper også vigtig. Sensationsprægede musen for at forbinde lyset fiber på implantatet er meget stressende. Derfor skal denne procedure være den samme for hver mus, hvilket betyder den samme teknik og den samme eksperimentator. Desuden skal tilvænningstiden i venteburet, som skal berolige musen fra den stressende forbindelsesprocedure, også have lige vilkår i varighed, strøelse og position til labyrinten. Håndteringen i musefaciliteten er også afgørende for senere adfærdsmæssige ydeevne. Forsøgs- og kontroldyr bør ikke rengøres på forskellige dage eller af forskellige mennesker, da dette også er stressende for mus. Derudover bør rengøringsdagen ikke være den eksperimentelle dag for at undgå forskelle i adfærd.
Fejlfinding
Der kan opstå flere problemer under protokollen. For eksempel, boring en helhed i kraniet under stereotaktisk kirurgi kan skade blodkarrene. Normalt, stærk blødning opstår, især over bregma og lambda. Hvis dette sker, skal du ikke forsøge at stoppe blødningen med bomuldspinde, da de har tendens til at udvide endnu mere blødning ud af beholderen på grund af deres sugelighed, i stedet, direkte skyl med NaCl.
Det kan også ske, at trykinjektion af virusopløsningen ikke virker. I dette tilfælde kan det være, at parafilm, en skurv fra burr hul eller hjernevæv, er tilstopning spidsen af kanylen. I dette tilfælde skal du fjerne kanulaen langsomt ud af hjernen uden at ændre x- eller y-aksen og bruge en pincet til at fjerne 1-2 mm af den forreste del af kanylespidsen. Før du sænker kanylen igen, test for funktionalitet ved at anvende lille mængde pres for at se, om virus kommer ud af kanylen spidsen. For at undgå forstoppelse skal du sænke kaninen med en konstant hastighed og ikke stoppe bevægelsen, før injektionssidens dybeste dybde er nået. Hvis for meget af kanylen spidsen fjernes, og diameteren er for stor, kanylen vil skade væv og risikoen for at anvende virus på én gang vil blive øget. Sørg således for, at kun den tilstoppede del af spidsen fjernes omhyggeligt.
Under adfærdseksperimentet kan opsætningen af eksperimentet i videosporingssoftwaren (f.eks. Hvis for eksempel lysudgangen ikke fungerer korrekt, kan det skyldes flere årsager. Pulseren skal åbnes, programmeres og startes, før Ethovision XT åbnes. Hardwaren skal vælges korrekt i “Eksperimentel opsætning” (trin 3.2.2.4). Hvis den forkerte IO-Box, eller andet end “Costume Hardware” er valgt, pulser enheden kan ikke styres af Ethovision. Hvis testen af lysoutputtet lykkes, men den programmerede lysprotokol i “Indstillinger for prøvekontrol” ikke fungerer under anskaffelsen, kan underreglen eller underregelreferencen være placeret forkert, eller betingelserne og handlingerne er uklare. For eksempel: Hører referencen til den korrekte underregel? Er referencen programmeret korrekt (f.eks. hvor ofte udføres underreglen)?
Derudover kan det ske, at dyret under “detektionsindstillinger” spores tilstrækkeligt, men under erhvervelsen er der prøver, hvor emnet ikke findes. I dette tilfælde skal du kontrollere, om belysningen i det eksperimentelle rum blev ændret, eller om noget producerede uønskede skygger i labyrinten. Hele bunden af labyrinten skal have samme farve, da indstillingen kun vil fungere for en bestemt kombination. Hvis uanset af hvilken grund forskellige nederste farver eller skygger ikke kan undgås, definere detektion indstilling i den mørkeste del af labyrinten.
Hvis du vil ændre indstillinger efter erhvervelsen af de første dyr, skal du ikke anvende disse ændringer i de allerede anvendte indstillinger. Duplikere dem for at justere dem. Det betyder også, at det allerede registrerede forsøg ikke længere er gyldigt til dataanalyse. I et sådant tilfælde skal du registrere alle dyr for denne eksperimentelle gruppe med de oprindelige indstillinger og oprette et nyt eksperiment bagefter, hvor de optagede videoer analyseres i stedet for live sporing. I dette “fra video”-eksperiment kan flere indstillinger bruges til analyse uden at miste sammenlignelighed mellem dyr eller endda data.
Begrænsninger og fremtidige applikationer
Denne metode til at manipulere adfærd med optogenetik i frit bevægelige dyr omfatter også begrænsninger. Under operationen er nærheden af de to implantater begrænset. Ved dobbelt implantation skal afstanden mellem de to implantater minimalt være bredden af apparatet for at holde implantatet. Apparatet skal sænke det andet implantat ind i grathullet, mens de første implantater allerede er fastgjort. En løsning til dette kan være en vinklet implantation, hvor spidsen af glasfiber kan være meget tæt, mens de keramiske ferler over kraniet har større afstand23,,55,,56,57,62,63. En ulempe ved en vinklet implantation er lysspredningen. Når fiberspidsen er skråt i stedet for fra lige over, er det stimulerede område anderledes. I tilfælde af to målregioner i umiddelbar nærhed skal der tages hensyn til den ændrede position for lysstimuleringen.
Under adfærdseksperimentet kan konstruktionen af labyrinten forstyrre det optiske kabel, der er forbundet til dyret. Nogle adfærdsmæssige tests, såsom lys-mørk boks, indeholder et indendørs område64,65, og andre labyrinter indeholder rum, som musen skal indtaste. Sådanne eksperimenter kan ikke udføres med denne opsætning. Alternativt kan et trådløst system være en mulighed22,26,66. Men heldigvis nogle labyrinter, såsom Barnes Maze, kan arrangeres på en sådan måde, at musene er i stand til at komme ind i de relevante rum67.
Ud over dem med lukkede zoner, labyrinter, der er for bred kan forårsage også problemer. Jo større området af labyrinten, jo længere kablet skal være at tillade dyret at gå til alle positioner i labyrinten. Man skal passe på, at dyret ikke er i stand til at træde på kablet eller få fat i det og bide det. En løsning for det kan være en konstruktion, der ruller op overflødige kabel. En ulempe er, at træk for at rulle kablet er svært for mus. Denne løsning ville bedre passer egnet til rotter. En anden mulig mulighed kunne være at gøre lyset stimulation på forhånd, i stedet for under forsøget, selvfølgelig er dette kun muligt, hvis en langsigtet effekt på grund af lysstimuleringopstår 23.
Sammenligning med eksisterende/alternative metoder
Alternative metoder ville være kemisk eller elektrisk stimulation under adfærd8,18. Kemiske agonister eller antagonister er i stand til at aktivere eller tavshed neuroner via specifikke receptorer og kan også manipulere enkelt neurotransmittersystemer 38,68. På den ene side, receptor-specificitet er ganske høj for kemikalier, fordi specifikke agonist eller antagonist kun aktivere visse receptorer39. På den anden side, specificitet for receptor undertyper af samme neurotransmitter gruppe er ofte utilstrækkelig. De fleste kemikalier binder sig til mindst to undertyper med forskellige sandsynligheder69. Derudover, kemikalier kan ikke skelne mellem neuronal celletyper, så længe de besidder de samme receptor typer. Ud over dette, tidsmæssige og rumlige opløsning er dårlig for kemiske manipulationer i forhold til optogenetik. Agonister eller antagonister administreres ofte oralt35 eller via systemiskeinjektioner 57,70. Hvis infusion af kemikaliet sker direkte i hjernevævet, virkninger vises hurtigere end med mundtlige anvendelser, men stadig på en langsommere tidshorisont end med lys stimulation. Som de administrerede kemikalier diffuse i hjernen og er ikke specifikke for neuronale typer eller hjerne regioner, manipulation af specifikke hjernekredsløb det ikke muligt.
Elektrisk stimulering har en højere tidsopløsning end kemisk stimulation9,14. Spredningen i neuronal væv er mindre end med kemisk stimulation og den rumlige opløsning er bedre end med kemisk stimulation. Men elektrisk stimulation mangler mulighed for specifikt at behandle forskellige neuronal celletyper eller receptor typer, som hver neuron i nærheden af elektroden vil reagere på den elektriske stimulation.
Alternative metoder til adfærd i frit bevægende mus er for eksempel elektrofysiologiske optagelser i hjernen skiver, hvor enkelt neuroner eller axoner kan moduleres med optogenetik og fremkaldte effekter kan måles via optagelse elektroder6,71. In vitro-eksperimenter giver mulighed for at undersøge det molekylære og cellulære grundlag af optogenetiske stimulationer, men har den begrænsning, at der mangler iboende forbindelse og input fra andre hjerneregioner. En anden mulighed er at bruge optogenetic i forbindelse med multiphoton imaging1,72. I dette tilfælde har mus deres hoved fast og kan bedøves eller være vågen til at løse simple opgaver.
For at udføre en vellykket optogenetisk eksperiment, en bred vifte af værktøjer og applikationer er tilgængelige i dag. Udvælgelsen af optogenetiske værktøjer og den adfærdsmæssige set-up er afgørende for at besvare specifikke forskningsspørgsmål. Hvis den rigtige kombination af værktøjer og eksperimenter er valgt, optogenetics giver mulighed for en hidtil uset, dybdegående undersøgelse af neuronal kredsløb med høj tidsmæssig og rumlig opløsning. Dette vil bidrage til at forstå og udvikle nye terapeutiske strategier for psykiatriske sygdomme og kognition.
The authors have nothing to disclose.
Stor tak til prof. Klaus-Armin Narve og Dr. Sandra Goebbels (Max-Plank-Institute of Experimental Medicine, Goettingen, Tyskland) for venligt at levere Nex-Cre mus. Også, vi takker vores video-team Yunus Dikici og Ruben Wiesner for optagelse og behandling af JoVE video til denne artikel. Desuden stor tak til Kristin Claussen for hendes voice-over og Kimberly Anne Go for korrekturlæsning af manuskriptet.
De præsenterede resultater blev opnået på Ruhr-universitetet i Bochum og videoen blev optaget på universitetet i Bremen.
Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – Projektnummer 122679504 – SFB 874 og DFG MA 4692/3-2.
Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753-64 | Anestasia |
20 % Glucose | AlleMan Pharma | Injection s.c. for fast recovery | |
Behavioral mazes | Costum made | Measure anxiety | |
Bepanthen | Bayer | Ophthalmic oinment | |
Betaisodona | Monodipharma | Sterilant containing iodine | |
Betaisodona | Monodipharma | Iodine oinment | |
Binocular | Olympus | SZ52, 110AL0.62x WD160 | Surgery |
Ceramic ferrules | Thorlabs | CFLC230-10 | Implant |
Ceramic Fiber Scribe | Thorlabs | CSW12.5 | Cutting of the glass fiber |
Channelrhodopsin2-YFP virus | Penn Vector Core | Addgene 20298 | Optogenetic tool |
Compressed air | Kontakt Chemie | Druckluft 67 | Drying of the skull |
Coordinate system | Stoelting | Stereotactic coordinates for the surgery | |
Correl Draw | Graphical software version 13 | ||
Cryoslicer | MICROM | HM500OM | Production of brain slices for staining |
Ethovision XT 14 | Noldus | Software for behavioral tracking | |
Exel | Statistical Software | ||
Ferrule Polishing Puck | Thorlabs | D50-F | Polishing implants round side |
Fiber Patch Cord dual | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cables, which are connected with the two implants of a bilateral implantation |
Fiber Patch Cord single | Prizmatix | Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Ferrule core 1,25 mm | Cable, which is connected with the implant via a sleeve |
Fiber Stripping Tool | Thorlabs | T06S13 | Stripping glass fiber for implant |
Filter paper | VWR European | 516-0300 | Cut into pieces for the Novelty-Suppressed Feeding test |
Food pellets | Mühle Levers | Höveler Nagerfutter | Nutrition for the mice |
Glass pipettes | Harvard Apparatus | GC150-10 | Injection pipettes |
Gradia direct-Flo | Henry Schein | 103322 | Fluid dental cementum |
Heating lamp | efbe-Schott/Phillips | R95E | Prevent the mice from cooling after the surgery |
Heating plate | Stoelting | Integrated into coordinate system | |
Injection canula | Braun | 100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20 | All injections and to bore hole into the skull |
Litter | T 1350 | Grounding for the Novelty-Supressed Feeding test | |
Mouse cages | Zoonlab | 405 cm^2 | Single housing for experiments |
Optibond FL | Kerr | 26684E | Preparation of the skull for implantation |
Optical glass fiber | Thorlabs | FT200EMT | Light fiber for implant |
Optogenetics-LED.STSI | Prizmatix | Optogenetic toolbox for light stimulation during behavioral experiments | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 16005-1KG-R | Perfusion of mice to remove the brains |
Polishing sheet 0.02 µm grit | Thorlabs | LFCF | Polishing implants round side |
Polishing sheet 1 µm grit | Thorlabs | LF1D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 30 µm grit | Thorlabs | LF30D | Polishing implants round side |
Polishing sheet 6 µm grit | Thorlabs | LF6D | Polishing implants round side |
Pulser Software | Prizmatix | Software for light device control | |
Rimadyl-Carprofen | Zoetis | Analgesia | |
Sigma Plot | Software for statistics | ||
Sleeve | Thorlabs | FT200EMT | Connection of implant and light cable |
SodiumCloride (NaCl) | Braun | 3570410 | Rinsing of the skull |
Superglue | Pattex Henkel | To Fix the glass fiber in the ferrule | |
td-Tomato virus | Penn Vector Core | Addgene 51503 | Optogenetic tool |
UV light | KoQGHJ | wireless, 1200 mW/cm^2 | Polymeration lamp for dental cementum |
Xylavet-Xylazin | cp pharma | Anesthesia |