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Immunology and Infection

Pluripotent स्टेम सेल से मानव मैक्रोफेज का उत्पादन और लक्षण वर्णन

Published: April 16, 2020 doi: 10.3791/61038
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 1
1Centre for Regenerative Medicine, Scottish Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 2Centre for Reproductive Health, The Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मैक्रोफेज की मजबूत पीढ़ी का वर्णन करता है, और उनके बाद लक्षण वर्णन के लिए तरीकों । सेल सरफेस मार्कर अभिव्यक्ति, जीन अभिव्यक्ति, और कार्यात्मक परख का उपयोग इन आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के फेनोटाइप और कार्य का आकलन करने के लिए किया जाता है।

Abstract

मैक्रोफेज अधिकांश कशेरुकी ऊतकों में मौजूद हैं और विभिन्न कार्यों के साथ व्यापक रूप से फैले और विषम कोशिका आबादी शामिल हैं। वे स्वास्थ्य और रोग में प्रमुख खिलाड़ी हैं, प्रतिरक्षा रक्षा और मध्यस्थता ट्रोफिक, रखरखाव और मरम्मत कार्यों के दौरान फागोसाइट्स के रूप में कार्य करते हैं। हालांकि मानव मैक्रोफेज फ़ंक्शन में शामिल कुछ आणविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करना संभव हो पाया है, लेकिन प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के लिए जेनेटिक इंजीनियरिंग तकनीकों को लागू करना मुश्किल साबित हुआ है। इससे मैक्रोफेज जीव विज्ञान में शामिल जटिल आनुवंशिक रास्तों से पूछताछ करने और विशिष्ट रोग राज्यों के लिए मॉडल उत्पन्न करने की हमारी क्षमता में काफी बाधा आई है । मानव मैक्रोफेज का एक ऑफ-द-शेल्फ स्रोत जो आनुवंशिक हेरफेर तकनीकों के विशाल शस्त्रागार के लिए उत्तरदायी है, इसलिए, इस क्षेत्र में एक मूल्यवान उपकरण प्रदान करेगा। हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो विट्रो में मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) से मैक्रोफेज की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है। ये आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (आईपीएससी-डीएम) सीडी45, 25F9, CD163 और CD169 सहित मानव मैक्रोफेज सेल सतह मार्कर व्यक्त करते हैं, और हमारे लाइव-सेल इमेजिंग कार्यात्मक परख दर्शाता है कि वे मजबूत फागोसाइटिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। सुसंस्कृत आईपीएससी-डीएम को विभिन्न मैक्रोफेज राज्यों में सक्रिय किया जा सकता है जो एलपीएस और आईएफएनजी, आईएल4 या आईएल10 के अलावा परिवर्तित जीन अभिव्यक्ति और फागोसाइटिक गतिविधि प्रदर्शित करते हैं। इस प्रकार, यह प्रणाली आनुवंशिक परिवर्तन ों को ले जाने वाले मानव मैक्रोफेज उत्पन्न करने के लिए एक मंच प्रदान करती है जो विशिष्ट मानव रोग को मॉडल करती है और इन बीमारियों के इलाज के लिए दवा स्क्रीनिंग या सेल थेरेपी के लिए कोशिकाओं का स्रोत है।

Introduction

भ्रूणीय स्टेम सेल (ईएससी) और प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल (आईपीएससी) एक आत्म-नवीनीकरण सेल स्रोत का प्रतिनिधित्व करते हैं जिसे सभी तीन रोगाणु परत वंश की कोशिकाओं का उत्पादन करने के लिए विभेदित किया जा सकता है। मानव प्लुरिटेंट स्टेम सेल (पीएससी) जैसे जिंक फिंगर न्यूलीज, टीएलेंस और CRISPR-Cas9 के आनुवंशिक हेरफेर के लिए अनुमति देने वाली प्रौद्योगिकियों ने चिकित्सा अनुसंधान1,,2,,3,,4में क्रांति ला दी है। मानव पीएससी का आनुवंशिक हेरफेर एक विशेष रूप से आकर्षक रणनीति है जब ब्याज की प्राथमिक कोशिका का विस्तार करना और/या इन विट्रो को बनाए रखना मुश्किलहोता है, या आनुवंशिक रूप से हेरफेर करना मुश्किल होता है, जैसे मैक्रोफेज5,,6,,7,,8,99का मामला है । चूंकि मानव आईपीएससी को किसी भी दैहिक कोशिका से प्राप्त किया जा सकता है, इसलिए वे ईएससीएस से जुड़ी नैतिक सीमाओं को दरकिनार करते हैं, और व्यक्तिगत दवा देने के लिए एक रणनीति प्रदान करते हैं। इसमें रोगी-विशिष्ट रोग मॉडलिंग, दवा परीक्षण और ऑटोलॉगस सेल थेरेपी शामिल है, जिसमें प्रतिरक्षा अस्वीकृति और संक्रमण6,,8,,10,,11का कम जोखिम है।

आईपीएससी से मैक्रोफेज की पीढ़ी का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल में तीन चरण की प्रक्रिया शामिल है जिसमें शामिल हैं: 1) भ्रूणीय निकायों की पीढ़ी; 2) निलंबन में हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का उद्भव; 3) टर्मिनल मैक्रोफेज परिपक्वता।

भ्रूणीय निकायों (ईबी) के रूप में जाना जाने वाला त्रि-आयामी समुच्य का गठन आईपीएससी के भेदभाव की शुरुआत करता है। मेसोडर्म स्पेसिफिकेशन को चलाने और उभरते हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं7,,8,,9,,11,,12को समर्थन देने के लिए बोन मॉर्फोजेनेटिक प्रोटीन (बीएमपी4), स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), और वैस्कुलर एंडोथेलियल ग्रोथ फैक्टर (VEGF) जोड़ा जाता है । ईबी के भीतर विभेदित कोशिकाएं एनडब्ल्यूटी और एक्टिविन जैसे एंडोजेनस सिग्नलिंग रास्तों की सक्रियता भी शुरू करती हैं। कुछ विभेदन प्रोटोकॉल ईबी गठन के चरण से नहीं गुजरते हैं। इन मामलों में, डब्ल्यूएनटी और एक्टिविन सिग्नलिंग नियामक, जैसे कि रिकॉम्बिनेंट ह्यूमन एक्टिविन ए और/या चिरोन को मोनोलेयर फॉर्मेट13,,14,,15में आईपीएससी में अंतर करने में जोड़ा जाता है । यहां, हम एक प्रोटोकॉल पर ध्यान केंद्रित करते हैं जो ईबी गठन का उपयोग करता है। भेदभाव के दूसरे चरण के लिए, ईबीएस को एक अनुयायी सतह पर चढ़ाया जाता है। इन संलग्न कोशिकाओं को तब साइटोकिन्स के संपर्क में रखा जाता है जो निलंबन कोशिकाओं के उद्भव को बढ़ावा देते हैं जिनमें हेमेटोपोइटिक और माइलॉयड जनक शामिल हैं। इन इन विट्रो संस्कृति स्थितियों में, इंटरल्यूकिन-3 (आईएल 3) की संभावना हेमेटोपोइटिक स्टेम-प्रोजेनिटर सेल गठन और प्रसार16,,17,साथ ही माइलॉयड अग्रदूत प्रसार और विभेदन18का समर्थन करती है। मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (CSF1) माइलॉयड कोशिकाओं के उत्पादन और मैक्रोफेज19,,20के लिए उनके भेदभाव का समर्थन करता है । भेदभाव के तीसरे चरण के दौरान, इन निलंबन कोशिकाओं को टर्मिनल मैक्रोफेज परिपक्वता का समर्थन करने के लिए CSF1 की उपस्थिति में सुसंस्कृत किया जाता है।

विट्रो में मैक्रोफेज में मानव आईपीएससी का भेदभाव विकास के दौरान मैक्रोफेज उत्पादन की प्रारंभिक लहर की नकल करता है। ऊतक-निवासी मैक्रोफेज भ्रूण उत्पत्ति के दौरान स्थापित होते हैं और वयस्क मोनोसाइट्स से एक अलग विकासात्मक वंश होते हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि आईपीएससी-डीएम के पास एक जीन हस्ताक्षर है जो रक्त-व्युत्पन्न मोनोसाइट्स की तुलना में भ्रूण यकृत मैक्रोफेज के बराबर है, जिससे यह सुझाव दिया गया है कि आईपीएससी-डीएम ऊतक-निवासी मैक्रोफेज के समान हैं । आईपीएससी-डीएम जीन के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं जो ऊतक रीमॉडलिंग और एंजियोजेनेसिस में शामिल प्रोटीन के स्राव के लिए एन्कोड करते हैं और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्राव और एंटीजन प्रस्तुति गतिविधियों21,22के लिए एन्कोडिंग जीन के निचले स्तर को व्यक्त करते हैं । इसके अलावा, आईपीएससी-डीएम के पास ऊतक-निवासी मैक्रोफेज23,,24के लिए एक अनुरूप प्रतिलेखन कारक की आवश्यकता है। नॉकआउट आईपीएससी सेल लाइनों का उपयोग करना जो ट्रांसक्रिप्शन कारकों RUNX1, SPI1 (PU.1) और MYB, Buchrieser एट अल में कमी कर रहे हैं, ने दिखाया कि आईपीएससी-डीएम की पीढ़ी SPI1 और RUNX1 निर्भर है, लेकिन MYB स्वतंत्र है। यह इंगित करता है कि वे23विकास के दौरान हेमेटोपोइसिस की पहली लहर के दौरान उत्पन्न होने वाले जर्क-थैली व्युत्पन्न मैक्रोफेज के समान हैं। इसलिए, यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि आईपीएससी-डीएम ऊतक-निवासी मैक्रोफेज जैसे माइक्रोग्लिया14,,25 और कुफर कोशिकाओं11का अध्ययन करने के लिए अधिक उपयुक्त सेल मॉडल का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कोशिकाओं का एक अधिक वांछनीय स्रोत है जिसका उपयोग ऊतकों की मरम्मत के लिए उपचारों में संभवतः किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि माउस ईएससीएस से विट्रो में उत्पादित मैक्रोफेज वीवो11में सीसीएल 4-प्रेरित यकृत चोट मॉडल में फाइब्रोसिस को सुधारने में प्रभावी थे। इसके अलावा, ये ईएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज चूहों में लिपोसोमल क्लोड्रेनेट11 का उपयोग करके मैक्रोफेज के समाप्त कुफर सेल डिब्बों को फिर से आबाद करने में बोन मैरो-व्युत्पन्न मैक्रोफेज की तुलना में अधिक कुशल थे।

यहां, हम मानव आईपीएससी के रखरखाव, ठंड और विगलन के लिए सीरम और फीडर-मुक्त प्रोटोकॉल और कार्यात्मक मैक्रोफेज में इन आईपीएससी के भेदभाव के लिए वर्णन करते हैं। यह प्रोटोकॉल वैन विल्गेनबर्ग एट अल.12द्वारा वर्णित के समान है, जिसमें मामूली परिवर्तन शामिल हैं: 1) आईपीएससी-रखरखाव मीडिया; 2) ईबी गठन चरण में रॉक अवरोधक का उपयोग नहीं किया जाता है; 3) आईपीएससी कॉलोनियों से समान ईबी उत्पन्न करने के लिए एक एंजाइमैटिक दृष्टिकोण के बजाय एक यांत्रिक दृष्टिकोण का उपयोग किया जाता है; 4) ईबी फसल और चढ़ाना के लिए विधि अलग है; 5) निलंबन कोशिकाओं को साप्ताहिक के बजाय एक सप्ताह में 2x काटा जाता है; और 6) काटा निलंबन कोशिकाओं को 7 दिनों के बजाय 9 दिनों के लिए मैक्रोफेज परिपक्वता के लिए CSF1 के तहत सुसंस्कृत हैं। हम आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज फेनोटाइप और फंक्शन की विशेषता के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल ों का भी वर्णन करते हैं, जिसमें जीन अभिव्यक्ति (क्यूआरटी-पीसीआर), सेल सरफेस मार्कर अभिव्यक्ति (प्रवाह साइटोमेट्री) के लिए विश्लेषण और फागोसाइटोसिस और ध्रुवीकरण का आकलन करने के लिए कार्यात्मक परख शामिल हैं।

Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी अभिकर्मक ों और उपकरणों को टेबल ऑफ मैटेरियलमें सूचीबद्ध किया गया है । सेल कल्चर के लिए मीडिया को 37 डिग्री सेल्सियस पर होना चाहिए। मीडिया और भेदभाव प्रोटोकॉल में इस्तेमाल अभिकर्मकबाँ होना चाहिए।

1. मानव आईपीएससी लाइन विगलन और रखरखाव

  1. सेल रखरखाव माध्यम, विकास कारकों, और अन्य अभिकर्मकों को तैयार करें।
    1. एचएसईसी-सीरम फ्री मीडिया (एचएसएससी-एसएफएम; टेबल ऑफ मैटेरियल्सदेखें) को एचएसएससी सप्लीमेंट के साथ दुलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम-एफ12 (डीएमईएम/एफ12) को सप्लीमेंट करके तैयार करें, १.८% w/v गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए), और ०.१ एमएम 2-मर्काप्टोथेनॉल । (
    2. बीएफजीएफ को बाँझ 0.1% ह्यूमन सीरम एल्बुमिन (एचएसए) - फॉस्फेट बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) सॉल्यूशन में बीएफजीएफ को भंग करके ह्यूमन बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) स्टॉक सॉल्यूशन (10 μG/mL) तैयार करें। क्रेओट्यूब में स्टॉक समाधान को 200 माइक्रोन एलिकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक बीएफजीएफ को 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    3. Rho kinase अवरोधक (रॉक अवरोधक) तैयार-Y27632 स्टॉक समाधान (1 मिलीग्राम/mL) इसे बाँझ पानी में भंग करके । क्रायोट्यूब में स्टॉक सॉल्यूशन को 50 माइक्रोन एलकेकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। एक बार गल जाने के बाद स्टॉक रॉक अवरोधक को 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
  2. कमजोर स्टेम सेल सब्सट्रेट (सामग्री की तालिकादेखें) 1:50 है Dulbecco फॉस्फेट में कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ नमकीन बफर ।
  3. संस्कृति प्लेटों पर पतला स्टेम सेल सब्सट्रेट समाधान रखें ताकि प्रति सतह क्षेत्र अंतिम मात्रा 78 μL/सेमी2हो । 6 अच्छी प्लेट के कुएं को कोट करने के लिए, समाधान के 750 माइक्रोन जोड़ें।
  4. एक humified वातावरण में 1 घंटे के लिए लेपित प्लेट इनक्यूबेट 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2.
  5. स्टेम सेल सब्सट्रेट कोटिंग को एस्पिरेट करें और 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफ और 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक के साथ पूरक एचएसईएससी के 1 एमएल जोड़ें ।
  6. जमे हुए मानव आईपीएससी कोशिकाओं की एक शीशी गल करने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर शीशी इनक्यूबेट जब तक गल और 5 mL hESC-SFM मीडिया में कोशिकाओं को स्थानांतरित।
  7. 3 मिन के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  8. 0.5 एमएल एचएसएससी-एसएफएम में 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफ और 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक के साथ पूरक को फिर से निलंबित करें। कोटेड अच्छी तरह से कोशिकाओं को स्थानांतरित करें।
  9. 24 घंटे के लिए संस्कृति कोशिकाओं ।
  10. HESC-SFM के लिए मीडिया बदलें 20 एनजी/mL bFGF के साथ पूरक है, लेकिन रॉक अवरोधक के बिना ।
  11. कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए, हर दिन माध्यम बदल जब तक कोशिकाओं को ८०% प्रवाह तक पहुंचने । अविभेदित आईपीएससी को आमतौर पर 80% कन्फ्लंसिशन तक पहुंचने में 3-4 दिन लगते हैं।
  12. एक बार कोशिकाओं को 80% प्रवाह, मार्ग कोशिकाओं तक पहुंच गए हैं।
    1. 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफ (रॉक अवरोधक के बिना) के साथ पूरक ताजा एचएसईएससी-एसएफएम के १.५ मिलील के साथ खर्च संस्कृति माध्यम को प्रतिस्थापित करें ।
    2. एक हाथ में संस्कृति पोत पकड़ो और एक दिशा में थाली भर में एक डिस्पोजेबल सेल passaging उपकरण (सामग्री की मेजदेखें) रोल (यानी, बाएं से दाएं) । रोलर में सभी ब्लेड थाली को छू ने चाहिए। लुढ़कते समय एक समान दबाव बनाए रखें।
    3. जब तक पूरी अच्छी तरह से कवर किया गया है एक ही दिशा में रोलिंग दोहराएं।
    4. संस्कृति पोत को 90 डिग्री घुमाएं और 1.12.2 और 1.12.3 चरणों में वर्णित रोलिंग दोहराएं।
    5. उपयोग के बाद पासिंग टूल को त्यागें।
    6. एक बाँझ पिपेट के साथ, कटौती कालोनियों को उखाड़ फेंकने के लिए कुएं में मीडिया का उपयोग करें।
    7. प्रीकोटेड स्टेम सेल सब्सट्रेट वेल्स (चरण 1.2-1.5) पर 1:4 अनुपात पर कोशिकाओं को अंतिम मीडिया वॉल्यूम (एचएसईएससी-एसएफएफएम के साथ पूरक 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफएफ) 1.5 मिली0 प्रति कुएं में स्थानांतरित करें।

2. ह्यूमन आईपीएससी लाइन फ्रीजिंग

  1. आईपीएससी कोशिकाओं को फ्रीज करने के लिए, एचएसएससी-एसएफएम के साथ 6 अच्छी प्लेट के 70%-80% कन्फ्लोरल वेल के मीडिया को बदलें, जो 20 एनजी/एमएल बीएफजीएफ और 10 माइक्रोन रॉक अवरोधक के साथ पूरक हैं ।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस और 1 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर अच्छी तरह से इनक्यूबेट करें।
  3. सेल पासिंग टूल के साथ कॉलोनियों को काटें और एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में विघटित कॉलोनियों को रखें।
  4. 3 मिन के लिए 100 x ग्राम पर सेंट्रलाइज कोशिकाएं।
  5. मीडिया को एस्पिरेट करें और सेल क्रायोप्रिजर्वेशन मीडिया के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
  6. कोशिकाओं को समान रूप से दो क्रायोवियलमें विभाजित करें और उन्हें 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ठंडा सेल क्रायोप्रिजर्वेशन कंटेनर में रखें।
  7. 24-48 घंटे के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को स्टोर करें।
  8. शीशियों को या तो -135 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर या तरल नाइट्रोजन टैंक में स्थानांतरित करें।

3. मैक्रोफेज के लिए मानव आईपीएससी भेदभाव

नोट: मैक्रोफेज विभेदन प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सारांश चित्रित 1में दर्शाया गया है ।

  1. सेल विभेदन वृद्धि कारकों और अन्य अभिकर्मकों को तैयार करना
    1. एचएसईएससी-एसएफएम मीडिया तैयार करें (पिछला अनुभाग देखें)।
    2. जिलेटिन को बाँझ पानी में घोलकर पोर्सिन जिलेटिन का 01% डब्ल्यू/वी सॉल्यूशन तैयार करें। जिलेटिन समाधान 2 साल तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    3. बीएमपी4 को 4 एमएम हाइड्रोजन क्लोराइड (एचसीएल) -02% बीएसए पीबीएस सॉल्यूशन में घोलकर ह्यूमन बीएमपी4 स्टॉक सॉल्यूशन (25 माइक्रोजी/एमएल) तैयार करें। क्रायोट्यूब में स्टॉक सॉल्यूशन को 50 माइक्रोन एलकेकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक बीएमपी4 को 5 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    4. एक 02% बीएसए पीबीएस समाधान में VEGF भंग करके मानव VEGF स्टॉक समाधान (100 μg/mL) तैयार करें। क्रेओट्यूब में स्टॉक समाधान को 10 माइक्रोन एलीकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक वीजेएफ को 7 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    5. एससीएफ को 02 प्रतिशत बीएसए पीबीएस समाधान में भंग करके मानव एससीएफ स्टॉक सॉल्यूशन (100 μg/mL) तैयार करें। क्रेयोट्यूब में स्टॉक समाधान को 5 माइक्रोन एलिकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 1 वर्ष तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक एससीएफ को 10 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    6. आईएल 3 को 02% बीएसए पीबीएस सॉल्यूशन में घोलकर ह्यूमन आईएल3 स्टॉक सॉल्यूशन (10 μg/mL) तैयार करें। क्रायोट्यूब में स्टॉक सॉल्यूशन को 500 माइक्रोन एलकेकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 2 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक एससीएफ को 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    7. सीएसएफ1 को 02% बीएसए पीबीएस सॉल्यूशन में भंग करके ह्यूमन सीएसएफ1 स्टॉक सॉल्यूशन (10 μg/mL) तैयार करें। क्रायोट्यूब में स्टॉक समाधान को 1 मिलीएल एलिकोट के रूप में वितरित करें। स्टॉक समाधान 2 साल तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। गल जाने के बाद स्टॉक एससीएफ को 15 दिनों तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
    8. 02% बीएसए पीबीएस समाधानों में भंग करके इंटरफेरॉन-गामा (आईएफएनजी), इंटरल्यूकिन 4 (आईएल4) और इंटरल्यूकिन 10 (आईएल10) के अलग-अलग 10 μg/mL स्टॉक समाधान तैयार करें। 02% बीएसए पीबीएस समाधान में भंग करके (100 यू/एमएल) के स्टॉक समाधान के लिए लिपोपॉलीसैकराइड (एलपीएस) तैयार करें। प्रत्येक स्टॉक समाधान को 35 माइक्रोन एलीकोट के रूप में वितरित करें। 2 साल तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गल जाने के बाद 7 दिन तक स्टॉक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जा सकता है।
  2. चरण 1: भ्रूण निकायों की पीढ़ी (दिन 0-दिन 3)
    1. 0 दिन पर, स्टेज 1 मीडिया के २.२५ मिलील जोड़ें (एचएसईएससी-एसएफएम ५० एनजी/एमएल BMP4, ५० एनजी/mL VEGF, और 20 एनजी/mL SCF) के साथ एक अल्ट्रालो लगाव 6 अच्छी थाली के दो कुओं में पूरक ।
    2. स्टेज 1 मीडिया के 1.5 mL के साथ 6 अच्छी प्लेट में आईपीएससी के एक 80% confluent अच्छी तरह से के रखरखाव मीडिया की जगह।
    3. सेल पासिंग टूल का उपयोग करके कालोनियों में कटौती करें और अल्ट्रालो अटैचमेंट 6 अच्छी प्लेट (सामग्री की तालिकादेखें) के दो कुओं में एक पिपेट के साथ कट कॉलोनियों को स्थानांतरित करें।
    4. दूसरे दिन, साइटोकिन्स को एचएसईएससी-एसएफएम मीडिया के ०.५ एमएल का उपयोग करते हुए ५० एनजी/एमएल बीएमपी4, ५० एनजी/एमएल VEGF और 20 एनजी/एमएल एससीएफ की अंतिम एकाग्रता में लाएं ।
      नोट: आईपीएससी कॉलोनियां ईबीएस(फिगर 2ए)बनेंगी ।
  3. स्टेज 2: निलंबन में हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं का उद्भव
    1. 4 दिन पर, कोट 0.1% w/v जिलेटिन के साथ एक 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के 4 कुओं और कम से 10 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    2. जिलेटिन निकालें और स्टेज 2 मीडिया के २.५ मिलील (एक्स-VIVO15 १०० एनजी/mL CSF1, 25 एनजी/mL आईएल-3, 2 mM ग्लूटामैक्स, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और ०.०५५ m 2-mercaptoethanol) के साथ पूरक जोड़ें ।
    3. एक 50 मिलीआर अपकेंद्रित्र ट्यूब में ईबीएस का गठन एकत्र करें और उन्हें गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति दें। ध्यान से मीडिया को एस्पिरेट करें।
    4. स्टेज 2 मीडिया के 2 mL में ईबी को फिर से निलंबित करें।
    5. स्टेज 2 मीडिया के 2.5 मिलील वाले जिलेटिन-लेपित कुएं में 10-15 ईबीएस (15 से अधिक नहीं) स्थानांतरित करें।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 हवा में इनक्यूबेट ईबी।
    7. 2-3 सप्ताह के लिए हर 3-4 दिनों में चढ़ाया EBs पर मीडिया बदलें।
    8. 2-3 सप्ताह के बाद, ईबीएस निलंबन में अअनुयायी हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को जारी करना शुरू कर देते हैं।
      नोट: निलंबन सेल रिलीज की यह अवधि भिन्न हो सकती है और सेल लाइन निर्भर है। इस निलंबन में कोशिकाओं को काटा जा सकता है और मैक्रोफेज में परिपक्व किया जा सकता है (स्टेज 3 देखें)(चित्रा 2A)।
  4. स्टेज 3: टर्मिनल मैक्रोफेज परिपक्वता
    1. ईबी प्लेट पर निलंबन हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं और पुनः पूर्ति मीडिया (स्टेज 2 मीडिया) ले लीजिए।
    2. 3 मिन के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रलाइज निलंबन कोशिकाएं।
    3. स्टेज 3 मीडिया में निलंबन कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (एक्स-VIVO15 १०० एनजी/mL CSF1, 2 m ग्लूटामैक्स, और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक) ।
    4. प्लेट एकत्र और अनुपचारित प्लास्टिक पर कोशिकाओं घूमती 10 सेमी जीवाणु ग्रेड प्लेटें (10 mL) या अनकोटेड 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेटें (3 mL) ०.२ x १०६ कोशिकाओं/mL के घनत्व पर ।
    5. 9-11 दिनों के लिए स्टेज 3 मीडिया में कोशिकाओं को रखें, हर 5 दिनों में मीडिया बदलते रहें।
      नोट: चरण 3 से चरण 3.4.1-3.4.5 को हर 3-4 दिनों में दोहराया जा सकता है और 3 महीने तक मूल ईबी प्लेट से काटे गए निलंबन कोशिकाओं को दोहराया जा सकता है।
  5. मैक्रोफेज ध्रुवीकरण
    1. एक एम (एलपीएस + IFNg) फेनोटाइप के लिए मैक्रोफेज को सक्रिय करने के लिए, एलपीएस (अंतिम एकाग्रता: १०० एनजी/mL) और IFNg (अंतिम एकाग्रता: 10 U/mL) के साथ कोशिकाओं को ४८ घंटे के लिए उत्तेजित । कोशिकाओं को एम (आईएल4) फेनोटाइप में सक्रिय करने के लिए, आईएल 4 (अंतिम एकाग्रता: 20 एनजी/एमएल) के साथ कोशिकाओं को उत्तेजित करें। एम (आईएल10) फेनोटाइप को सक्रिय करने के लिए, IL10 (अंतिम एकाग्रता: 5 एनजी/mL) के साथ मैक्रोफेज को प्रोत्साहित करें।

4. आईपीएससी से व्युत्पन्न मैक्रोफेज क्वालिटी कंट्रोल चेक

  1. ईबी की प्रति 6 अच्छी प्लेट के प्रति उत्पादित हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करें, उन्हें हेमेटोसाइटोमीटर के साथ गिनकर।
  2. मैक्रोफेज आकृति विज्ञान का आकलन करें जैसा कि पहले वर्णित है (उदाहरण के लिए, वाणिज्यिक किट धुंधला)8,,9।
  3. जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके मैक्रोफेज विशिष्ट मार्कर और ध्रुवीकरण मार्कर की अभिव्यक्ति का पता लगाएं जैसा कि पहले8,9वर्णित है ।
    1. मैक्रोफेज की 6 अच्छी प्लेट के एक कुएं पर प्रवाह साइटोमेट्री प्रयोगों के लिए, उनके परिपक्वता मीडिया को aspirating द्वारा फसल कोशिकाओं, पीबीएस के 2 mL के साथ धोने, और उन्हें कमरे के तापमान (आरटी) पर 5 मिन के लिए एंजाइम मुक्त सेल विसोशन बफर के 2 mL के साथ इनक्यूबेट। बार-बार अलग और फसल मैक्रोफेज के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें।
    2. एक हेमेटोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें 2% बीएसए, 0.5 एम एथिलीनडायनेटेट्राएटिक एसिड (ईटीए) - पीबीएस समाधान के 80 माइक्रोन में फिर से निलंबित करें।
    3. एमएसीएस ह्यूमन एफसी अवरोधक के 20 माइक्रोन जोड़ें।
    4. 20 किमी के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें और प्रकाश से बचाएं।
    5. सेल एकाग्रता को 1 x 106 मैक्रोफेज/एमएल में लाने के लिए 2% बीएसए, 0.5 एमएम ईटीए पीबीएस समाधान की उचित मात्रा जोड़ें।
    6. दाग 1 x 105 कोशिकाओं में 2% बीएसए के 100 μL, 0.5 m EDTA PBS समाधान इसी एंटीबॉडी के साथ (नीचे नोट देखें) और आरटी पर 15 min के लिए इनक्यूबेट प्रकाश से संरक्षित।
    7. 2% बीएसए, 0.5 एमएम ईटीए पीबीएस के कम से कम 100 माइक्रोन के साथ 1x धोएं।
    8. 2% बीएसए, 0.5 एमएम ईटीए पीबीएस के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
    9. एक जीवित मृत रंग के रूप में 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, पतला 1:1,000) जोड़ें। इनक्यूबेट 3 मिन।
    10. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, मुख्य आबादी पर गेट, फिर एकल कोशिकाएं, और फिर जीवित कोशिकाएं। लाइव सेल आबादी पर, मैक्रोफेज से संबंधित मार्कर अभिव्यक्ति स्पष्ट है(चित्रा 3A)।
      नोट: मैक्रोफेज प्राप्त करने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रत्येक कोशिका रेखा के लिए एंटीबॉडी को सावधानीपूर्वक टिटकिया जाना चाहिए। परिणाम अनुभाग में प्रस्तुत एंटीबॉडी सामग्री की तालिकामें हैं । SFCi55-व्युत्पन्न मैक्रोफेज प्रवाह साइटोमेट्री परख के लिए कमजोर पड़ने का कारक भी शामिल है ।

5. उच्च थ्रूपुट फागोसाइटोसिस परख

  1. हार्वेस्ट आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (आईपीएससी-डीएम) मीडिया को एस्पिरेट करके, आइस कोल्ड एंजाइम फ्री सेल डिसोशन बफर जोड़कर, और 5 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करें । बार-बार पाइपिंग करके मैक्रोफेज कलेक्ट करें ।
  2. प्लेट 8 x 104 आईपीएससी-डीएम एक इमेजिंग ऊतक संस्कृति ग्रेड 96 अच्छी प्लेटें (जैसे, सेलकैरियर अल्ट्रा, पर्किन एल्मर) के एक कुएं में कम से कम 2 दिन पहले स्टेज 3 मीडिया के 200 माइक्रोन में उच्च थ्रूपुट इमेजिंग।
  3. पीबीएस ("समाधान 1") के 2 एमएल में एक शीशी को फिर से निलंबित करके pHrodogreen Zymosan-A बायोपार्टिकल्स तैयार करें। 10 एस के लिए भंवर समाधान।
  4. अधिक PBS ("समाधान 2") के साथ PBS bead निलंबन 1:5 के 2 mL पतला ।
  5. सोनीकेट सॉल्यूशन 2 के लिए 8 एस और भंवर समाधान के लिए 10 एस। इस समाधान का उपयोग चरण 5.11 में किया जाएगा।
  6. चढ़ाया आईपीएससी-डीएम पर मीडिया को हटादें और पीबीएस से धोएं।
  7. होचस्ट 33342 पतला 1:20 युक्त पीबीएस समाधान के साथ आईपीएससी-डीएम दाग। 20 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  8. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  9. गहरे लाल प्लाज्मा झिल्ली दाग पतला 1:1,000 (सामग्री की तालिकादेखें) युक्त पीबीएस समाधान के साथ दाग। 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  10. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोएं।
  11. आईपीएससी-डीएम के प्रत्येक कुएं में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखे गए बीड समाधान के 100 माइक्रोन जोड़ें। प्लेटें अब इमेजिंग के लिए तैयार हैं।
  12. एक उच्च सामग्री इमेजिंग प्रणाली का उपयोग करके प्लेट छवि और अच्छी तरह से भर में तीन या अधिक क्षेत्रों के अधिग्रहण के लिए अच्छी तरह से एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्राप्त करते हैं ।
  13. कोलंबस सॉफ्टवेयर (उच्च सामग्री इमेजिंग विश्लेषण प्रणाली सॉफ्टवेयर) का उपयोग करके फागोसाइटोसिस की मात्रा निर्धारित करें। स्पष्ट छवि बैच विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट एल्गोरिदम विकसित किया जा सकता है:
    1. नीली तीव्रता को मापें और सॉफ्टवेयर में परिभाषित करें कि नीला संकेत नाभिक को इंगित करता है।
    2. लाल तीव्रता को मापें और सॉफ्टवेयर में परिभाषित करें कि रेड सिग्नल साइटोप्लाज्म को इंगित करता है।
    3. परिभाषित करें कि नाभिक और साइटोप्लाज्म एक साथ एक कोशिका से मेल खाती है।
    4. कोशिकाओं में हरित तीव्रता को मापें और एक कोशिका को फागोसाइटिक के रूप में विचार करने के लिए एक सख्त कट-ऑफ/दहलीज मूल्य स्थापित करें ।
    5. प्रति सेल फैगोसाइटिक सेल अंश और औसत फागोसाइटिक इंडेक्स की मात्रा निर्धारित करता है। क्योंकि मनका रंग तीव्रता मोतियों की संख्या के आनुपातिक है, फागोसाइटिक गतिविधि मोतियों की संख्या से मापा जा सकता है।
    6. हर क्षेत्र के भीतर और प्राप्त सभी समय बिंदुओं पर एल्गोरिदम/पाइपलाइन लागू करें, जिससे कोशिकाओं की फागोसाइटिक क्षमताओं का निर्धारण करने के लिए एक मजबूत और निष्पक्ष बैच दृष्टिकोण की अनुमति दी जा सके ।
      नोट: कोलंबस एक उच्च सामग्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर है, जो सेल फेनोटाइपिंग और कार्यात्मक परीक्षण के लिए सेल सेगमेंटेशन विश्लेषण प्रदान करता है।

Representative Results

भेदभाव प्रगति, मैक्रोफेज संख्या, और आकृति विज्ञान
प्रस्तुत किए गए परिणाम एसएफएससीआई55 मानव आईपीएससी लाइन के विभेदन से हैं , जिनका वर्णन किया गया है और कईअध्ययनोंमें उपयोग किया गया है 8,9,10,26। मैक्रोफेज की ओर आईपीएससी भेदभाव की प्रक्रिया की निगरानी ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी द्वारा की जा सकती है। आईपीएससी उपनिवेशों, भ्रूणीय निकायों (ईबी), हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं, और परिपक्व मैक्रोफेज रूपात्मक रूप से अलग थे(चित्रा 2A)। परिपक्व मैक्रोफेज आकृति विज्ञान को सेंट्रलाइज्ड साइटोस्पिन तैयारियों के धुंधला द्वारा आगे मान्य किया जा सकता है। आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज बड़े थे, और इसमें एक छोटे अंडाकार आकार के नाभिक और प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म थे जिनमें कई वेसिकल्स(चित्रा 2 बी)शामिल थे।

ईबीएस की एक पूर्ण 6 अच्छी प्लेट की हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं की फसल (दिन 16-28) के पहले 2 सप्ताह, औसतन, 2.59 x 106 ± 0.54 कोशिकाएं शामिल हैं। 28 दिन के बाद, ईबी की 6 अच्छी प्लेट प्रति निलंबन कोशिकाओं के 4.64 x 106 ± 0.94 का औसत उत्पादन किया गया था। दिन 80 के बाद से, निलंबन कोशिकाओं की संख्या में गिरावट शुरू हो गई क्योंकि ईबी समाप्त हो गया है(चित्रा 2 C)। ईबी की 6 अच्छी प्लेट प्रति फसल प्रति 3 x 106 अग्रदूत से नीचे की संख्या ड्रॉप होने के बाद भेदभाव प्रोटोकॉल को रोकने की सिफारिश की जाती है।

आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज सेल सरफेस मार्कर अभिव्यक्ति
फ्लो साइटोमेट्री मानव मैक्रोफेज के फेनोटाइप का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली सबसे आम विधि बनी हुई है। कोशिका सतह मार्कर अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए गेटिंग रणनीति में आकार और दानेदारता जैसे भौतिक मापदंडों का उपयोग करके कोशिकाओं की मुख्य आबादी को गेटिंग करना शामिल है, जिसके बाद एकल कोशिकाओं और फिर लाइव कोशिकाओं(चित्रा 3A)का उपयोग किया जाता है। परिपक्व आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज वंश मार्कर सीडी45 और मैक्रोफेज परिपक्वता मार्कर 25F9 व्यक्त करना चाहिए, और मोनोसाइट/अपरिपक्व मैक्रोफेज मार्कर CD93 के लिए नकारात्मक होना चाहिए । यह हमारी टिप्पणियों(चित्रा 3A)के अनुरूप है । आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज वंश माइलॉयड मार्कर CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163, और CD169(चित्रा 3B)के लिए भी सकारात्मक थे । वे प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेशन मार्कर सीडी86 के लिए सकारात्मक थे, और उनमें से एक छोटा सा अनुपात भोली राज्य(चित्रा 3B)में केमोकिन रिसेप्टर्स CX3CR1, CCR2, CCR5, और CCR8 व्यक्त किया गया। भूखंडों को हमारी प्रयोगशाला8द्वारा पहले प्रकाशित आंकड़ों से प्राप्त किया गया था ।

आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज फागोसाइटोसिस और ध्रुवीकरण
मेजबान रक्षा और ऊतक होमोस्टासिस में मैक्रोफेज की प्रमुख विशेषताओं में से एक रोगजनकों, अपोप्टोटिक कोशिकाओं और मलबे27को फागोसाइटोज करने की उनकी क्षमता है। फागोसाइटोसिस की दर विशिष्ट फेनोसाइटिक राज्यों के साथ निकटता से जुड़ी हुई है। आईपीएससी-डीएम फैगोसाइटिक क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने एक उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम दृष्टिकोण8,,9,,11 का उपयोग किया जो पर्किनेल्मर ओपेरेटा माइक्रोस्कोप और फेड्रोडो ज़िमोसन बायोपार्टिकल्स (पीएच-संवेदनशील डाइ कंजूगेट्स) का उपयोग करता है। संस्कृतियों(चित्रा 4A)में जोड़े जाने पर बायोपार्टिक्स नॉनफ्लोरोसेंट थे, लेकिन इंट्रासेलर अम्लीय पीएच(चित्रा 4B)में उज्ज्वल हरे रंग को फ्लोरोस्कैन किया गया था। लाइव इमेजिंग Operetta माइक्रोस्कोप १७५ मिन के कुल समय के लिए मोतियों के अलावा के बाद हर 5 मिन छवि के लिए सेट किया गया था । एक उच्च थ्रूपुट और निष्पक्ष छवि विश्लेषण पाइपलाइन का उपयोग कोलंबस प्लेटफॉर्म में फैगोसाइटिक अंश के संदर्भ में गतिविधि की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया गया था जो कोशिकाओं के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है जो थैलेसीटोस किए गए मोतियों और फागोसाइटिक इंडेक्स का प्रतिनिधित्व करता है जो मोतियों की संख्या का एक उपाय है जो प्रत्येक सेल को किया जाता है।

मैक्रोफेज पर्यावरण ीय संकेतों के आधार पर अपने फेनोटाइप का जवाब दे सकते हैं और बदल सकते हैं। पर्यावरण उत्तेजनाओं पर प्रतिक्रिया और परिवर्तन करने की उनकी क्षमता का आकलन करने के लिए, आईपीएससी-डीएम को एलपीएस और आईएफएनजी, आईएल4 या आईएल10 के साथ इलाज किया जा सकता है। 48 एच के उपचार के बाद, उन्होंने फेनोटाइप बदल दिया, इसके साथ क्रमशः29एम (एलपीएस + आईएफएनजी), एम (आईएल4), और एम (आईएल10) के रूप में संदर्भित किया गया। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण मैक्रोफेज की ध्रुवीकरण की स्थिति का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है। एलपीएस और आईएफएनजी उत्तेजना पर, मैक्रोफेज जीन सीडी40, वीसीएएम 1और टीएनएफए (चित्रा 5A)की एमआरएनए अभिव्यक्ति को बढ़ा देता है। IL4 उत्तेजना पर, कोशिकाओं ने जीन सीडी68, सीडी84,और एमआरसी 1 (चित्रा 5B)की एमआरएनए अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया। IL10 उत्तेजना पर, आईपीएससी-डीएम MRC1 (चित्रा 5B)की अभिव्यक्ति को बढ़ा दिया । फागोसाइटोसिस के संदर्भ में, एलपीएस + आईएफएनजी या आईएल4 के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज ने भोली मैक्रोफेज की तुलना में फागोसाइटिक कोशिकाओं का काफी कम प्रतिशत दिखाया। आईएल10 के साथ इलाज किए गए आईपीएससी-डीएम ने फागोसाइटिक कोशिकाओं और फागोसाइटिक इंडेक्स(चित्रा 5C-ई)का प्रतिशत बढ़ाया।

Figure 1
चित्रा 1: परिपक्व कार्यात्मक मैक्रोफेज के लिए आईपीएससी भेदभाव का ग्राफिक सारांश। बायोरेंडर के साथ खींचा गया आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मैक्रोफेज और आईपीएससी-डीएम नंबर और आकृति विज्ञान के प्रति आईपीएससी भेदभाव।(ए)उज्ज्वल क्षेत्र छवियां (बाएं से दाएं): एक आईपीएससी कॉलोनी, भ्रूणयी निकाय (ईबी), काटी गई निलंबन कोशिकाएं, और परिपक्व मैक्रोफेज। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ख)क्विक-डिफ किट से दाग मैक्रोफेज साइटोस्पिन ्स की छवि । स्केल बार = 25 माइक्रोन। (ग)ईबी की प्रति एक 6 अच्छी प्लेट प्रति फसल एकत्र की गई निलंबन कोशिकाओं की संख्या। प्लॉट शो मतलब + एसईएम; (n = 6 जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोग)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: मैक्रोफेज सेल सरफेस मार्कर फेनोटाइप। (A)आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति । एकल, लाइव कोशिकाओं को गेट किया गया था, फिर सेल सतह मार्कर सीडी45, सीडी 9 3 और 25F9 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया गया था। सेल सतह मार्कर के लिए गेट्स फ्लोरेसेंस माइनस एक (FMO) नियंत्रण का उपयोग कर तैयार किए गए थे । (ख)रिप्रेजेंटेटिव फ्लो साइटोमेट्री हिस्टोग्राम आईपीएससी-डीएम (ब्लू) और आईसोटाइप कंट्रोल्स (ग्रे) के लिए वंश और माइलॉयड मार्कर, इम्यून मॉड्यूलेशन मार्कर, परिपक्वता मार्कर और केमोकिन रिसेप्टर्स के लिए । भूखंड CD105 और CD206 (n = 3) को छोड़कर सभी वंश और माइलॉयड मार्कर के लिए एन = 5 जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं; परिपक्वता मार्कर (एन = 5); प्रतिरक्षा-मॉड्यूलेशन मार्कर (एन = 3); और केमोकिन रिसेप्टर्स (एन = 3)। भूखंड पहले प्रकाशित डेटा8का उपयोग करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: आईपीएससी-डीएम ध्रुवीकरण और फागोसाइटोसिस परख। मोती के अलावा के बाद जाइमोसन फेड्रोडो हरे मोतियों और(बी)175 मिन के अलावा तुरंत बाद आईपीएससी-डीएम(ए)की प्रतिनिधि छवियां। नीला कोशिकाओं के नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है; लाल कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म का प्रतिनिधित्व करता है। ग्रीन किए गए मोतियों (स्केल बार = 20 माइक्रोन) का प्रतिनिधित्व करता है। (ग)भोली अवस्था में समय के साथ phagocytic मैक्रोफेज और(डी)phagocytic सूचकांक/हरी तीव्रता प्रति फागोसाइटिक मैक्रोफेज का अंश (n= 6 जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोग) । भूखंड मतलब मूल्य दिखाते हैं और बार एसईएम का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्लॉट पहले प्रकाशित डेटा8का उपयोग करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
अंक 5: आईपीएससी-डीएम ध्रुवीकरण राज्यों का मूल्यांकन। (ए)एम (एलपीएस +IFN) की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए भोली और ध्रुवीकृत आईपीएस-डीएम के आरटी-पीसीआर विश्लेषणों का सापेक्ष परिमाणीकरण; (B)एम (IL4) और एम (IL10) से जुड़े जीन (n = 6 जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोग; एक तरह से ANOVA और Holm-Sidak कई तुलना के बाद परीक्षण । ध्रुवीकृत समूहों को केवल भोले समूह की तुलना में सांख्यिकीय रूप से किया गया था)। भूखंड मतलब मूल्य दिखाते हैं, और त्रुटि सलाखों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । भूखंडों में ND = ट्रांसक्रिप्ट का पता नहीं चला। इन भूखंडों के लिए डेटा पहले8प्रकाशित किए गए थे । (C)आईपीएससी-डीएम 175 मोतियों के साथ इलाज (बाएं से दाएं): कोई साइटोकिन्स, एलपीएस +आईएफएन-वाई, आईएल-4, और आईएल-10 (स्केल बार = 20 माइक्रोन) के बाद आईपीएससी-डीएम 175 मिनकी प्रतिनिधि छवियां। (घ)थैलोसाइटिक मैक्रोफेज का अंश और(ई)फागोसाइटिक इंडेक्स/ग्रीन तीव्रता प्रति फागोसाइटिक मैक्रोफेज में भोले और ध्रुवीकृत मैक्रोफेज उपचार 175 मिनट के बाद मोतियों के अलावा (n= 12 जैविक रूप से स्वतंत्र प्रयोग, एक तरह से ANOVA और Holm-Sidak के कई तुलना के बाद परीक्षण। ध्रुवीकृत समूहों को केवल भोले समूह की तुलना में सांख्यिकीय रूप से किया गया था)। भूखंड मतलब मूल्य दिखाते हैं और त्रुटि बार मानक विचलन (* पी एंड एलटी; 0.05, **पी एंड एलटी; 0.01, ***पी एंड एलटी; 0.001, ****पी एंड एलटी; 0.001, **** पी एंड एलटी; 0.0001) का प्रतिनिधित्व करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यहां वर्णित आईपीएससी-डीएम की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल मजबूत है और अपेक्षाकृत कम संख्या में आईपीएससी से बड़ी संख्या में सजातीय कोशिकाओं के उत्पादन के लिए अनुमति देता है । लगभग 1 x 106 आईपीएससी के प्रारंभिक भेदभाव के बाद, बाद की संस्कृतियों को 2-3 महीनों तक हर 4 दिनों में काटा जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप उस समय कम से कम 6.5 x 107 मैक्रोफेज का उत्पादन होता है। ये इन-जेनरेटेड ह्यूमन मैक्रोफेज प्राथमिक मानव मैक्रोफेज के समान रूप से हैं, प्रमुख मैक्रोफेज सेल सतह मार्कर को व्यक्त करते हैं, और फागोसाइटिक गतिविधि का प्रदर्शन करते हैं। मैक्रोफेज भेदभाव के लिए प्रोटोकॉल प्रजनन योग्य है और अन्य hiPSC और एचएसएससी सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है, लेकिन मैक्रोफेज अग्रदूत की पहली फसल का सटीक समय और उत्पन्न की जा सकने वाली कोशिकाओं की पूर्ण संख्या आईपीएससी लाइनों के बीच भिन्न होती है।

यह दर्शाया गया है कि आईपीएससी से मैक्रोफेज उत्पन्न किए जा सकते हैं जिन्हें आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया है। उदाहरण के लिए, संविलियन कैग प्रमोटर के नियंत्रण में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जेडएसग्रीन से मिलकर एक ट्रांसजीन कैसेट को SFCi55 iPSC लाइन के AAVS1 लोकस में डाला गया था, और बाद में यह दिखाया गया कि इस आईपीएससी लाइन को जेडग्रीन-व्यक्त मैक्रोफेज8में अंतर किया जा सकता है । इन फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज का उपयोग भविष्य में रोग के मॉडलमें चिकित्सीय मैक्रोफेज के प्रवास और स्थिरता को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है। एक अन्य अध्ययन में, मैक्रोफेज एक आईपीएससी लाइन से उत्पन्न हुए थे जिसे टैमोक्सिफेन-प्रेरित ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर, KLF1 को व्यक्त करने के लिए आनुवंशिक रूप से हेरफेर किया गया था। आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में केएलएफ1 की सक्रियता के परिणामस्वरूप एरिथ्रोइड द्वीप9के मैक्रोफेज के बराबर फेनोटाइप के साथ मैक्रोफेज का उत्पादन हुआ। संभवतः, इस रणनीति का उपयोग आनुवंशिक रूप से आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज को अन्य ऊतक-विशिष्ट मैक्रोफेज आबादी जैसे जिगर की कुफर कोशिकाओं या त्वचा की लैंगरहंस कोशिकाओं से जुड़े फेनोटाइप में प्रोग्राम करने के लिए किया जा सकता है। इन सेल प्रकारों को परिभाषित करने वाले प्रमुख प्रतिलेखन कारकों की पहचान किए जाने के बाद यह संभव होगा।

प्रोटोकॉल के लिहाज से यह ध्यान रखना बेहद जरूरी है कि सफल भेदभाव के लिए आईपीएससी की शुरुआती आबादी की हालत नाजुक है। मानव आईपीएससी संस्कृतियों को कई मार्गों पर कायोआम असामान्य उपआबादी के साथ उग आ सकता है, इसलिए आईपीएससी स्टॉक और जीनोम गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन बड़े बैच मास्टर स्टॉक के मजबूत क्यूरेशन की सिफारिश की जाती है। हमारे हाथों में, यहां वर्णित रखरखाव प्रोटोकॉल निरंतर संस्कृति में 2 महीने तक के लिए karyoआम तौर पर सामान्य आईपीएससी बनाए रख सकते हैं, लेकिन यह विभिन्न सेल लाइनों और विभिन्न प्रयोगशालाओं के लिए भिन्न हो सकता है। यदि समस्याओं का सामना करना पड़ता है, तो प्रत्येक विभेदन प्रयोग के लिए अविभेदित आईपीएससी की एक ताजा शीशी का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। इसके अलावा, अविभेदित आईपीएससी की प्रारंभिक संस्कृति 80% से अधिक अभिप्रवाह नहीं होनी चाहिए। ईबी चढ़ाना चरण में, केवल 10-15 ईबी को 6 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के प्रति अच्छी तरह से चढ़ाया जाना चाहिए, और यह महत्वपूर्ण है कि ये ईबी समान रूप से अच्छी तरह से फैले हुए हैं। अच्छी तरह से केंद्र में ईबी की अधिक संख्या और/या झुरमुट का उत्पन्न मैक्रोफेज की संख्या पर नकारात्मक प्रभाव पड़ा । ध्यान रखा जाना चाहिए जब मीडिया की भरपाई और ईबी संस्कृतियों से मोनोसाइट की तरह जनक निलंबन कोशिकाओं की कटाई के लिए लेपित संस्कृति प्लेटों की सतह के लिए EBs के आसंजन परेशान से बचने के लिए । प्रत्येक फसल के साथ धीरे-धीरे उत्पादित हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है, जिसमें भेदभाव के 40-72 दिनों के बीच इष्टतम उत्पादन होता है(चित्रा 2)। उत्पादन उत्तरोत्तर दिन ६८ और प्लेटों के बाद गिरावट आती है २.५ महीने के बाद निकास करते हैं, हालांकि सटीक समय iPSC लाइन के आधार पर भिंन हो सकते हैं ।

हमारे प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि स्टेज 2 के अंत में उत्पन्न हेमेटोपोइटिक निलंबन कोशिकाओं को क्रायोसंरक्षित करना संभव नहीं हो पाया है। प्रोटोकॉल जो क्रायोप्रिजर्वेशन के बाद 40% वसूली दर के बारे में डब्ल्यूएनटी रिपोर्ट के एक्सोजेनस सक्रियण पर भरोसा करते हैं, लेकिन ये प्रोटोकॉल केवल एक सेल फसल की रिपोर्ट करते हैं, इसलिए उत्पन्न मैक्रोफेज की पूर्ण संख्याकम 30है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल, ईबी के गठन के माध्यम से एंडोजेनस सिग्नलिंग को प्रेरित करते हुए, द्विसाप्ताहिक काटा जा सकता है, जिससे बहुत अधिक कुल मैक्रोफेज उपज का उत्पादन होता है।

सारांश में, हम कार्यात्मक आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। स्वास्थ्य और रोग में मैक्रोफेज जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के साथ इन विट्रो प्रयोगों की स्थापना मोनोसाइट-व्युत्पन्न मैक्रोफेज (एमडीएम) के साथ प्रयोगों पर कई फायदे हैं । इन फायदों में सामग्री तक पहुंच में आसानी (उदाहरण के लिए, किसी दानदाताओं की आवश्यकता नहीं है), बहुत बड़ी मात्रा में मैक्रोफेज का उत्पादन किया जा सकता है, और आनुवंशिक रूप से संशोधित मैक्रोफेज का उत्पादन करना संभव और अपेक्षाकृत सरल है। इसके अलावा, आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ऊतक-निवासी मैक्रोफेज जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए बेहतर संसाधन हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषणा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम माइक्रोस्कोपी के साथ फ्लो साइटोमेट्री, इओघन ओ 'डुइथिर और बर्ट्रेंड वर्ने के साथ सहायता के लिए फियोना रॉसी और क्लेयर क्रायर को धन्यवाद देते हैं। इस काम को CONACYT (M.L.-Y.), वेलकम ट्रस्ट (१०२६१०) और इनोवेट यूके (एल.एम.एफ.), वेलकम ट्रस्ट पीएचडी स्टूडेंटशिप (ए.एम.एम.), एमआरसी प्रिसिजन मेडिसिन स्टूडेंटशिप (टीवी) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । एलसी और J.W.P. वेलकम ट्रस्ट (101067/जेड/13/जेड), मेडिकल रिसर्च काउंसिल (एमआर/N022556/1), और कॉस्ट एक्शन BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu) द्वारा समर्थित थे ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM) Invitrogen 31350010
Abtibody CD64-APC -CY7 Biolegend 305026 Dilution factor: 1:100
Antibody 25F9-EFLUOR 660 Ebioscience 15599866 Dilution factor: 1:20
Antibody CCR2-PE-Cy7 Biolegend 357212 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR5 PE Biolegend 313707 Dilution factor: 1:100
Antibody CCR8 PE Biolegend 360603 Dilution factor: 1:100
Antibody CD11b-PE Biolegend 301305 Dilution factor: 1:50
Antibody CD14-APC Ebioscience 10669167 Dilution factor: 1:20
Antibody CD163-PE-CY7 BIolegend 333614 Dilution factor: 1:25
Antibody CD169-APC Biolegend 346007 Dilution factor: 1:25
Antibody CD206-PE Biolegend 321106 Dilution factor: 1:100
Antibody CD209-PE-CY7 Biolegend 3310114 Dilution factor: 1:100
Antibody CD274-PE-CY7 Biolegend 329718 Dilution factor: 1:100
Antibody CD43-PE Ebioscience 10854419 Dilution factor: 1:100
Antibody CD45-APC Ebioscience 15577936 Dilution factor: 1:20
Antibody CD86-APC Biolegend 305412 Dilution factor: 1:100
Antibody CD93-PE Ebioscience 10804637 Dilution factor: 1:100
Antibody CX3CR1-PE Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antibody HLA-DR-BV650 Biolegend 307650 Dilution factor: 1:100
Antiboy CD115-PE Biolegend 347308 Dilution factor: 1:40
Cell Dissociation Buffer, enzyme free Thermofisher 13151014
Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS Gibco 13151014
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well PerkinElmer 6055302
CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain Thermofisher C10046 Cryopreservation media
Cryostor CS10 Sigma C2874
CTS CELLstart Substrate Invitrogen A1014201 Stem cell substrate
DAPI Merck D9542-1MG Final concentration 1 μg/mL
DPBS, calcium, magnesium (500 mL) Thermofisher 14040091
FcR Blocking Reagent, human MACS Miltenyi Biotec 130-059-901
FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein Thermofisher PHG0021
GlutaMAX Supplement Thermofisher 35050061
Human Recombinant IFNY Thermofisher 14-8319-80
Human Serum Albuminum Irvine Scientific 9988
Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli Sigma L2630
NucBlue (Hoechst33342) Thermofisher R37605
pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis Thermofisher P35365
Porcine Skin Gelatin Sigma G9136
Recombinant Human BMP4 Protein R&D 314-BP-010
Recombinant Human IL10 Preprotech 200-10
Recombinant Human IL3 Preprotech 200-03-10
Recombinant Human IL4 Preprotech 200-04
Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg Biolegend 574806
Recombinant Human VEGF Protein R&D 293-VE-010
Rock Inhibitor Y-27632 Merck SCM075
SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein Thermofisher PHC2111
StemPro hESC SFM Thermofisher A1000701
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool Thermofisher 23181010
Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface Greiner 657970
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020
X-Vivo 15 500 mL bottle Lonza BE02-060F

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References

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