Summary
Detta protokoll beskriver den robusta generationen av makrofager från mänskliga inducerad pluripotenta stamceller och metoder för deras efterföljande karakterisering. Cell yta markör uttryck, genuttryck och funktionella analyser används för att bedöma fenotyp och funktion av dessa iPSC-härledda makrofager.
Abstract
Makrofager finns i de flesta ryggradsdjur vävnader och omfattar allmänt spridda och heterogena cell populationer med olika funktioner. De är nyckelaktörer inom hälsa och sjukdom, fungerar som fagocyter under immunförsvaret och medla trofiska, underhåll och reparationsfunktioner. Även om det har varit möjligt att studera några av de molekylära processer som är involverade i människans makrofagfunktion, har det visat sig svårt att tillämpa genteknik på primära mänskliga makrofager. Detta har avsevärt hämmat vår förmåga att förhöra de komplexa genetiska vägar som är involverade i makrofagbiologi och att generera modeller för specifika sjukdomstillstånd. En off-the-shelf källa till mänskliga makrofager som är mottagliga för den stora arsenal av genetisk manipulation tekniker skulle därför ge ett värdefullt verktyg på detta område. Vi presenterar ett optimerat protokoll som möjliggör generering av makrofager från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) in vitro. Dessa iPSC-härledda makrofager (iPSC-DMs) uttrycker mänskliga makrofag cell yta markörer, inklusive CD45, 25F9, CD163 och CD169 och vår live-cell imaging funktionell analys visar att de uppvisar robust fagocytic aktivitet. Odlade iPSC-DMs kan aktiveras till olika makrofagtillstånd som visar förändrade genuttryck och fagocytisk aktivitet genom tillägg av LPS och IFNg, IL4 eller IL10. Således ger detta system en plattform för att generera mänskliga makrofager som bär genetiska förändringar som modell specifika mänskliga sjukdomar och en källa till celler för läkemedelsscreening eller cellterapi för att behandla dessa sjukdomar.
Introduction
Embryonala stamceller (ESCs) och inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) utgör en självförnyande cellkälla som kan differentieras för att producera celler av alla tre könsskiktshärstamningar. Teknik som möjliggör genetisk manipulering av mänskliga pluripotenta stamceller , såsom Zink Finger Nuclease, TALENS och CRISPR-Cas9, har revolutionerat medicinsk forskning1,,2,3,4. Genetisk manipulation av humana privata säkerhetsföretag är en särskilt attraktiv strategi när den primära cellen av intresse är svår att expandera och/eller att upprätthålla in vitro, eller är svår att genetiskt manipulera, såsom är fallet för makrofager5,,6,7,8,9. Eftersom mänskliga iPSC kan härledas från alla somatiska celler, kringgår de etiska begränsningar som är förknippade med ESC, och ger en strategi för att leverera personlig medicin. Detta inkluderar patientspecifik sjukdomsmodellering, drogtester och autolog cellterapi med minskad risk för immunavstötning och infektion6,,8,,10,11.
Protokoll som beskriver generering av makrofager från iPSC består av en trestegsprocess som omfattar: 1) Generering av embryoidkroppar; 2) Uppkomsten av hematopoietiska celler i suspension; 3) Terminal makrofag mognad.
Bildandet av tredimensionella aggregat, så kallade embryoid organ (EBs) initierar differentiering av iPSCs. Benmorfogenetiska protein (BMP4), stamceller faktor (SCF), och vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF) läggs till för att driva mesoderm specifikation och stödja nya hematopoietiska celler7,,8,9,11,12. De differentierande cellerna inom EBs initierar också aktivering av endogena signalvägar som Wnt och Activin. Vissa differentiering protokoll går inte igenom scenen i EB formation. I dessa fall läggs Wnt- och Activin-signalregulatorer, såsom rekombinanta humana Activin A och/eller Chiron, till differentiering av iPSC i ett monolagerformat13,14,15. Här fokuserar vi på ett protokoll som använder EB-formation. För det andra steget av differentiering, EBs är pläterade på en vidhäftning yta. Dessa bifogade celler utsätts sedan för cytokiner som främjar uppkomsten av suspensionsceller som inkluderar hematopoietiska och myeloiska förfäder. I dessa in vitro-odlingsförhållanden stöder interleukin-3 (IL3) sannolikt hematopoietic stam-stam-stamcellsbildning och spridning16,17, samt myeloiska prekursorer spridning och differentiering18. Makrofagkolonistimulerande faktor (CSF1) stöder produktionen av myeloiska celler och deras differentiering till makrofager19,20. Under den tredje etappen av differentiering, dessa suspension celler odlas i närvaro av CSF1 att stödja terminal makrofag mognad.
Differentiering av mänskliga iPSCs i makrofager in vitro härmar den tidiga vågen av makrofag produktion under utveckling. Vävnad-bosatt makrofager är etablerade under embryogenesis och har en distinkt utvecklingsmässiga härstamning från vuxna monocyter. Flera studier har visat att iPSC-DMs har en gensignatur som är mer jämförbar med fetala lever-härledda makrofager än blod-härledda monocyter, vilket tyder på att iPSC-DMs är mer besläktad med vävnad-bosatt makrofager. iPSC-DMs uttrycka högre nivåer av gener som kodar för utsöndring av proteiner som deltar i vävnad remodellering och angiogenes och uttrycka lägre nivåer av gener kodning för proinflammatoriska cytokin sekretion och antigen presentation verksamhet21,22. Dessutom har iPSC-DMs ett motsvarande krav på transkriptionsfaktor som gäller för makrofager med vävnadsboende23,,24. Med hjälp av knockout iPSC cellinjer som är bristfälliga i transkriptionsfaktorer RUNX1, SPI1 (PU.1), och MYB, Buchrieser et al. visade att genereringen av iPSC-DMs är SPI1 och RUNX1 beroende, men MYB oberoende. Detta tyder på att de är transkriptionellt liknar äggula-säcken härledda makrofager som genereras under den första vågen av hematopoiesis under utveckling23. Därför är det allmänt accepterat att iPSC-DMs representerar en lämpligare cellmodell för att studera vävnadsboende makrofager som microglia14,,25 och Kupffer celler11, och en mer önskvärd källa till celler som potentiellt skulle kunna användas i terapier för att reparera vävnader. Det har till exempel visats att makrofager som produceras in vitro från mus ESCs var effektiva vid förbättring av fibros i en CCl4-inducerad leverskada modell in vivo11. Dessutom var dessa ESC-härledda makrofager effektivare än benmärgsbaserade makrofager vid återbefolkande Kupffer cellrum utarmat av makrofager med liposomala clodronate11 hos möss.
Här beskriver vi serum- och matarfria protokoll för underhåll, frysning och upptining av mänskliga iPSCs och för differentiering av dessa iPSCs i funktionella makrofager. Detta protokoll är mycket lik det som beskrivs av Van Wilgenburg et al.12, med mindre ändringar inklusive: 1) iPSC-underhåll media; 2) ROCK-hämmare används inte i EB-formationsstadiet; 3) En mekanisk metod snarare än en enzymatisk metod används för att generera enhetliga EBs från iPSC kolonier; 4) Metoden för EB skörd och plätering ner är annorlunda; 5) Suspensionsceller skördas 2x i veckan, snarare än varje vecka; och 6) Skördade suspensionsceller odlas under CSF1 för makrofag mognad i 9 dagar snarare än 7 dagar. Vi beskriver också protokoll som används för att karakterisera iPSC-härledda makrofagen fenotyp och funktion, inklusive analyser för genuttryck (qRT-PCR), cell yta markör uttryck (flöde cytometri) och funktionella analyser för att bedöma fagocytos och polarisering.
Protocol
OBS: Alla reagenser och all utrustning som används i detta protokoll är listade i register över material. Media bör vara på 37 °C för cellodling. Media och reagenser som används i differentieringsprotokollet måste vara sterila.
1. Human iPSC Line upptining och underhåll
-
Förbered cellunderhållsmedlet, tillväxtfaktorer och andra reagenser.
- Förbered hESC-serumfritt medium (hESC-SFM; se Tabell över material) genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagle medium-F12 (DMEM/F12) med hESC-tillägg, 1,8% w/v bovin serumalbumin (BSA) och 0,1 mM 2-mercaptoetanol. (
- Förbered humant grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) stamlösning (10 μg/ml) genom att lösa upp bFGF i en steril 0,1% humant serum albumin (HSA)-fosfat buffrad saltlösning (PBS). Fördela stamlösningen som 200 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 1 år. När det har tinats kan lager bFGF förvaras vid 4 °C i 7 dagar.
- Förbered Rho kinashämmare (ROCK-hämmare)-Y27632 stamlösning (1 mg/ml) genom att lösa upp den i sterilt vatten. Fördela stamlösningen som 50 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 1 år. När lagret har tinats kan lager ROCK-hämmaren förvaras vid 4 °C i 7 dagar.
- Späd stamcellssubstrat (se Tabell över material) 1:50 i Dulbeccos fosfatbuffertbufferad saltlösning med kalcium och magnesium.
- Placera den utspädda stamcellssubstratlösningen på odlingsplattorna så att den slutliga volymen per yta är 78 μL/cm2. För att belägga brunnen på en 6-brunnsplatta, tillsätt 750 μL lösning.
- Inkubera den belagda plattan i 1 h i en humifierad atmosfär vid 37 °C och 5 % CO2.
- Aspirera stamcellssubstratbeläggningen och tillsätt 1 ml hESC kompletterat med 20 ng/mL bFGF och 10 μM ROCK-hämmare.
- För att tina upp en injektionsflaska med frysta mänskliga iPSC-celler, inkubera injektionsflaskan vid 37 °C tills den tinat och överför cellerna till 5 ml hESC-SFM-media.
- Centrifugceller vid 100 x g i 3 min.
- Resuspend i 0,5 ml hESC-SFM kompletterad med 20 ng/mL bFGF och 10 μM ROCK-hämmare. Överför celler till den belagda brunnen.
- Kulturceller för 24 h.
- Ändra media till hESC-SFM kompletterat med 20 ng/mL bFGF, men utan ROCK-hämmare.
- För att bibehålla cellerna, ändra mediet varje dag tills cellerna når 80% konfluenser. Odifferentierade iPSC brukar ta 3-4 dagar att nå 80% sammanflödet.
-
När cellerna har nått 80% konfluenser, passageceller.
- Ersätt använt odlingsmedium med 1,5 ml färsk hESC-SFM kompletterad med 20 ng/mL bFGF (utan ROCK-hämmare).
- Håll odlingskärlet i ena handen och rulla ett engångscellpasseringsverktyg (se Materialbord) över plattan i en riktning (dvs. från vänster till höger). Alla blad i rullen måste röra vid plattan. Håll ett jämnt tryck medan du rullar.
- Upprepa rullande i samma riktning tills hela brunnen har täckts.
- Rotera odlingskärlet 90° och upprepa valsning enligt beskrivningen i steg 1.12.2 och 1.12.3.
- Kassera passeringsverktyget efter användning.
- Med en steril pipett, använd media i brunnen för att rubba skurna kolonier.
- Överför celler med ett 1:4-förhållande på förbelagda stamcellssubstratbrunnar (steg 1,2–1,5) till en slutlig medievolym (hESC -SFM kompletterad med 20 ng/ml bFGF) på 1,5 ml per brunn.
2. Mänskliga iPSC Line Frysning
- För att frysa iPSC-celler, byt ut media på en 70%–80% konfluentbrunn av en 6-brunnsplatta med hESC-SFM kompletterad med 20 ng/ml bFGF och 10 μM ROCK-hämmare.
- Inkubera väl vid 37 °C och 5% CO2 för 1 h.
- Skär kolonier med cellpasseringsverktyget och placera bortfallna kolonier i ett centrifugrör.
- Centrifugceller vid 100 x g i 3 min.
- Aspirera media och resuspend cellerna i 1 ml cell cryopreservation media (se Tabell över material).
- Dela upp cellerna lika i två kryovialer och placera dem i en förkyld cell kryobevarande behållare vid 4 °C.
- Förvara celler vid -80 °C i 24–48 timmar.
- Överför injektionsflaska till antingen en -135 °C frys eller till en flytande kvävetank.
3. Human iPSC Differentiering till makrofager
OBS: En schematisk sammanfattning av ändringsprotokollet för makrofag visas i figur 1.
- Förbereda celldifferentieringstillväxtfaktorer och andra reagenser
- Förbered hESC-SFM-media (se föregående avsnitt).
- Förbered 0,1 % w/v-lösning av svingellatin genom att lösa upp gelatinet i sterilt vatten. Gelatinlösning kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 år.
- Förbered human BMP4-stamlösning (25 μg/ml) genom att lösa upp BMP4 i en 4 mM väteklorid (HCl)-0,2% BSA PBS-lösning. Fördela stamlösningen som 50 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 1 år. När bmp4 har tinats kan det förvaras vid 4 °C i 5 dagar.
- Förbered human VEGF-stamlösning (100 μg/ml) genom att lösa upp VEGF i en 0,2% BSA PBS-lösning. Fördela stamlösningen som 10 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 1 år. När vegf har tinat kan det förvaras vid 4 °C i 7 dagar.
- Förbered human SCF-stamlösning (100 μg/ml) genom att lösa upp SCF till en 0,2% BSA PBS-lösning. Fördela stamlösningen som 5 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 1 år. När lagret har tinats kan lager SCF förvaras vid 4 °C i 10 dagar.
- Förbered den mänskliga IL3-stamlösningen (10 μg/ml) genom att lösa upp IL3 till en 0,2% BSA PBS-lösning. Fördela stamlösningen som 500 μL alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 2 år. När lagret har tinats kan lager SCF förvaras vid 4 °C i 15 dagar.
- Förbered human CSF1-stamlösning (10 μg/ml) genom att lösa upp CSF1 till en 0,2% BSA PBS-lösning. Fördela stamlösningen som 1 ml alikvoter i kryotuber. Stamlösningar kan förvaras vid -20 °C upp till 2 år. När lagret har tinats kan lager SCF förvaras vid 4 °C i 15 dagar.
- Förbered separata 10 μg/ml-stamlösningar av interferon-gamma (IFNg), interleukin 4 (IL4) och interleukin 10 (IL10) genom att lösas upp i 0,2% BSA PBS-lösningar. Förbered lipopolysackarid (LPS) till en stamlösning på (100 U/ml) genom att lösas upp i en 0,2% BSA PBS-lösning. Fördela varje stamlösning som 35 μL alikvoter. Förvaras vid -80 °C upp till 2 år. När lagren har tinats kan de lagras vid 4 °C i 7 dagar.
- Steg 1: Generation av embryoidkroppar (dag 0–dag 3)
- På dag 0, tillsätt 2,25 ml steg 1 media (hESC-SFM kompletteras med 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, och 20 ng/mL SCF) i två brunnar av en ultralow fastsättning 6 väl platta.
- Byt ut underhållsmedier på en 80% konfluent brunn av iPSC i en 6-brunnsplatta med 1,5 ml steg 1-media.
- Skär kolonier med hjälp av cellpasseringsverktyget och överför skurna kolonier med en pipett till de två brunnarna i en ultralow attachment 6-brunnsplatta (se Tabell över material).
- På dag 2, ta cytokiner till en slutlig koncentration av 50 ng/mL BMP4, 50 ng/mL VEGF, och 20 ng/mL SCF med 0,5 ml hESC-SFM media.
OBS: IPSC kolonier kommer att bli EBs (Figur 2A).
- Steg 2: Uppkomst av hematopoietiska celler i suspension
- På dag 4, päls 4 brunnar av en 6 väl vävnad kultur platta med 0,1% w / v gelatin och inkubera i minst 10 min.
- Ta bort gelatin och tillsätt 2,5 ml steg 2-medium (X-VIVO15 kompletterat med 100 ng/ml CSF1, 25 ng/ml IL-3, 2 mM glutamax, 1% penicillin-streptomycin och 0,055 mM 2-mercaptoetanol).
- Samla bildade EBs i en 50 ml centrifugrör och låt dem bosätta sig på botten av röret av tyngdkraften. Försiktigt aspirera på media.
- Resuspend EBs i 2 ml av steg 2 media.
- Överför 10–15 EBs (högst 15) till en gelatinbelagd brunn som innehåller 2,5 ml steg 2-media.
- Inkubera EBs vid 37 °C och 5% CO2 luft.
- Byt media på pläterade EBs var 3–4 dag i 2–3 veckor.
- Efter 2–3 veckor börjar EBs släppa nonadherent hematopoietic celler i suspension.
OBS: Denna period av suspension cell release kan variera och är cellinje beroende. Celler i denna suspension kan skördas och mognas till makrofager (se steg 3) (figur 2A).
- Steg 3: Plinal mognad
- Samla upphängningspsokietiska celler och fyll på media (steg 2-media) på EB-plattan.
- Centrifugensusensen vid 200 x g i 3 min.
- Resuspend suspension celler i steg 3 media (X-VIVO15 kompletteras med 100 ng/mL CSF1, 2 mM glutamax och 1% penicillin-streptomycin).
- Platta som samlats in och spunnits celler på obehandlad plast 10 cm bakteriologiska plattor (10 ml) eller obestrukna 6 brunnsvävnadodlingsplattor (3 ml) med en densitet av 0,2 x 106 celler/ml.
- Håll celler i steg 3-media i 9–11 dagar och ändra media var femte dag.
OBS: Steg 3.4.1–3.4.5 från steg 3 kan upprepas var 3–4:e dag och suspensionsceller skördas från den ursprungliga EB-plattan i upp till 3 månader.
- Makrofagpolarisering
- För att aktivera makrofager till en M(LPS + IFNg) fenotyp, stimulera cellerna med LPS (slutlig koncentration: 100 ng/mL) och IFNg (slutlig koncentration: 10 U/ml) för 48 h. För att aktivera celler till en M(IL4) fenotyp, stimulera celler med IL4 (slutlig koncentration: 20 ng/mL). För att aktivera till en M(IL10) fenotyp, stimulera makrofager med IL10 (slutlig koncentration: 5 ng/mL).
4. IPSC-härledda makrofager kvalitetskontroll
- Bestäm antalet hematopoietiska suspensionsceller som produceras per 6 brunnsplatta av EBs genom att räkna dem med en hematocytometer.
- Bedöm makrofagmorfologi enligt tidigare beskrivna (t.ex. kommersiell kitfärgning)8,9.
-
Identifiera uttrycket av makrofagspecifika markörer och polariseringsmarkörer med hjälp av genuttrycksanalyser och flödescytometri enligt tidigare beskrivna8,9.
- För flödescytometriexperiment på en brunn av en 6-brunnsplatta makrofager, skörda celler genom att aspirera deras mognadsmedia, tvätta med 2 ml PBS och inkubera dem med 2 ml enzymfri celldissociationsbuffert i 5 min vid rumstemperatur (RT). Pipett upp och ner upprepade gånger för att lossa och skörda makrofager.
- Räkna celler med en hematocytometer och återsuspend dem i 80 μL av en 2% BSA, 0,5 mM etylenediaminetetraacetic syra (EDTA)-PBS lösning.
- Tillsätt 20 μl MACSC human F C-blockerare.
- Inkubera på is i 20 min och skydda mot ljus.
- Tillsätt en lämplig volym på 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS lösning för att få cellkoncentrationen till 1 x 106 makrofager/ml.
- Bets 1 x 105 celler i 100 μL av 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS-lösning med motsvarande antikropp (se OBS nedan) och inkubera i 15 min vid RT skyddad från ljus.
- Tvätta 1x med minst 100 μl av 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Återanvända cellerna i 200 μL av 2% BSA, 0,5 mM EDTA PBS.
- Tillsätt 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI, utspädd 1:1000) som en levande-död färgämne. Inkubera 3 min.
- För flödescytometrianalyser, grind på huvudpopulationen, sedan enstaka celler och sedan levande celler. På den levande cellpopulationen är makrofagrelaterat marköruttryck uppenbart (figur 3A).
OBS: Antikroppar bör noggrant titreras för varje cellinje som används för att härleda makrofager. Antikroppar som presenteras i resultatavsnittet finns i materialregistret. Utspädningsfaktorn för SFCi55-härledda makrofager flöde cytometri analyser ingår också.
5. Hög genomströmning Fagocytos analys
- Skörda iPSC-härledda makrofager (iPSC-DMs) genom att aspirera på mediet, lägga till iskalla enzymfria celldissociationsbuffert och inkubera i 5 min. Samla makrofager genom pipettering upprepade gånger.
- Platta 8 x 104 iPSC-DMs i en brunn av en bildbehandling vävnad kultur klass 96 väl plattor (t.ex. Cellcarrier Ultra, Perkin Elmer) minst 2 dagar före hög genomströmning imaging i 200 μL av steg 3 media.
- Förbered pHrodoGreen Zymosan-A Biopartiklar genom att återanvända en injektionsflaska i 2 ml PBS ("Lösning 1"). Vortexlösning för 10 s.
- Späd 2 ml PBS-pärlfjädring 1:5 med mer PBS ("Lösning 2").
- Sonicate Solution 2 för 8 s och virvellösning i 10 s. Håll den vid 4 °C. Denna lösning kommer att användas i steg 5.11.
- Ta bort mediet på pläterade iPSC-DMs och tvätta med PBS.
- Stain iPSC-DMs med en PBS-lösning som innehåller Hoechst 33342 utspädd 1:20. Inkubera i 20 min vid 37 °C.
- Tvätta celler med PBS.
- Fläck med en PBS-lösning som innehåller djupröd plasmamembranfläck utspädd 1:1 000 (se Tabell över material). Inkubera i 30 min vid 37 °C.
- Tvätta celler med PBS.
- Tillsätt 100 μl pärllösning som hålls vid 4 °C till varje brunn av iPSC-DMs. Plattorna är nu klara för avbildning.
- Avbilda plattan med hjälp av ett högkvalitativt bildsystem och förvärva tre eller flera fält över brunnen för att få en bra representation av brunnen.
-
Kvantifiera fagocytos med hjälp av Columbus programvara (High-Content Imaging analyssystem programvara). En specifik algoritm kan utvecklas för entydig bildbatchenanalys:
- Mät blå intensitet och definiera i programvaran att blå signal indikerar kärnorna.
- Mät röd intensitet och definiera i programvaran att röd signal indikerar cytoplasma.
- Definiera att kärnan och cytoplasma tillsammans motsvarar en cell.
- Mät grön intensitet i cellerna och upprätta ett strikt cut-off/threshold värde för att betrakta en cell som fagocytisk.
- Kvantifiera den fagocytiska cellfraktionen och det genomsnittliga fagocytiska indexet per cell. Eftersom pärla färgintensitet är proportionell mot antalet pärlor, fagocytisk aktivitet kan mätas med antalet pärlor intas.
- Tillämpa algoritmen/pipelinen på alla bilder inom varje fält och vid alla förvärvade tidpunkter, vilket möjliggör en robust och opartisk batch-metod för att bestämma cellernas fagocytiska kapacitet.
OBS: Columbus är en hög innehåll analys programvara, som erbjuder cell segmentering analys för cell fenotypning och funktionell testning.
Representative Results
Differentieringsprogression, makrofagnummer och morfologi
De resultat som presenteras är från differentiering av SFCi55 mänskliga iPSC linje som har beskrivits och använts i ett antal studier8,9,10,26. Processen för IPSC differentiering mot makrofager kan övervakas genom optisk mikroskopi. iPSC kolonier, embryoid organ (EBs), hematopoietiska suspensionsceller och mogna makrofager var morfologiskt distinkt (figur 2A). Mogna makrofag morfologi kan valideras ytterligare genom färgning av centrifugerad cytospin preparat. IPSC-härledda makrofager var stora och hade enstaka små ovala kärnor och riklig cytoplasma som innehöll många blåsor (figur 2B).
De första 2 veckorna av hematopoietiska suspensionsceller skördar (dag 16–28) av en hel 6-brunnsplatta eBs innehöll i genomsnitt 2,59 x 106 ± 0,54 celler. Efter dag 28 producerades i genomsnitt 4,64 x 106 ± 0,94 suspensionsceller per 6 brunnsplatta eBs. Från dag 80 och framåt började antalet suspensionsceller att minska när EBs blir uttömda (figur 2C). Det rekommenderas att stoppa differentieringsprotokollet efter att antalet sjunker under 3 x 106 prekursorer per skörd per 6 brunnsplatta eBs.
Uttryck för ipsc-härledda makrofagcellsmarkeringar
Flödescytometri är fortfarande den vanligaste metoden som används för att bedöma fenotypen av mänskliga makrofager. Gating-strategin för att bedöma cellytans markeringsuttryck består i att gating huvudpopulationen av celler med hjälp av fysiska parametrar som storlek och granularitet, följt av gating enstaka celler och sedan levande celler (figur 3A). Mogna iPSC-härledda makrofager bör uttrycka härstamningsmarkören CD45 och makrofagmognadsmarkör 25F9 och vara negativ för monocyt/omogen makrofagmarkör CD93. Detta är förenligt med våra iakttagelser (figur 3A). IPSC-härledda makrofager var också positiva för härstamning myeloisk markörer CD11b, CD14, CD43, CD64, CD115, CD163 och CD169 (Figur 3B). De var positiva för immunmodulering markör CD86, och en liten del av dem uttryckt chemokine receptorer CX3CR1, CCR2, CCR5 och CCR8 i naivt tillstånd (Figur 3B). Tomterna erhölls från data som tidigare publicerats av vårt laboratorium8.
iPSC-härledda makrofager fagocytos och polarisering
En av de viktigaste funktionerna i makrofager i värd försvar och vävnad homeostas är deras förmåga att fagocytos patogener, apoptotiska celler och skräp27. Graden av fagocytos är nära förknippad med specifika fenotypiska tillstånd28. För att utvärdera iPSC-DM fagocytic förmåga, använde vi en hög innehåll bildsystem strategi8,9,11 som använder sig av PerkinElmer Operetta Mikroskop och pHrodo Zymosan biopartiklar (pH-känsliga färgämne konjugates). Biopartiklar var icke-fluororescerande när de tillsattes till kulturerna (figur 4A) men fluorescerade ljusgrönt i det intracellulära sura pH(figur 4B). Den live-imaging Operetta mikroskop var inställd på bild var 5 min efter tillsats av pärlor för en total tid på 175 min. En hög genomströmning och opartisk bildanalyspipeline användes sedan i Columbus-plattformen för att kvantifiera aktivitet i termer av den fagocytiska fraktionen som representerar andelen celler som fagocytosed pärlor och fagocytiska index som är ett mått på antalet pärlor som varje cell intas.
Makrofager kan svara och ändra sin fenotyp beroende på miljösignaler. För att bedöma deras förmåga att reagera och ändra på miljöstimuli kan iPSC-DMs behandlas med LPS och IFNg, IL4 eller IL10. Efter 48 h behandling, ändrade de fenotyp, häri kallas M (LPS + IFNg), M (IL4), och M (IL10),respektive 29. Genuttrycksanalys är ett användbart verktyg för att testa makrofagers polariseringsstatus. Vid LPS- och IFNg-stimulering, makrofager uppreglerade mRNA uttryck av gener CD40, VCAM1och TNFA (Figur 5A). Vid IL4-stimulering, celler uppreglerade mRNA uttryck av gener CD68, CD84och MRC1 (Figur 5B). Vid IL10-stimulering uppreglerade iPSC-DMs uttryck för MRC1 (figur 5B). När det gäller fagocytos uppvisade makrofager som behandlades med LPS + IFNg eller IL4 en signifikant lägre andel fagocytiska celler jämfört med naiva makrofager. iPSC-DMs behandlas med IL10 visade en ökad andel av fagocytiska celler och fagocytiska index (Figur 5C–E).
Figur 1: Grafisk sammanfattning av iPSC-differentiering till mogna funktionella makrofager. Diagram ritat med Biorender. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: IPSC-differentiering mot makrofager och iPSC-DM-nummer och morfologi. (A)Ljusa fältbilder från (vänster till höger): en IPSC-koloni, embryoidkroppar (EBs), skördade suspensionsceller och mogna makrofager. Skalstång = 100 μm. (B) Bild av makrofag cytospiner färgas med Kwik-diff kit. Skalstång = 25 μm. CCAntal suspensionsceller som samlats in per skörd per en 6-brunnsplatta av EBs. Tomt visar medelvärdet + SEM; (n = 6 biologiskt oberoende experiment). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Makrofagcellens yta markör fenotyp. (A)Gating strategi för analys av mogna iPSC-härledda makrofager. Ensamstående, levande celler var gated, sedan analyseras för uttryck av cellytan markörer CD45, CD93 och 25F9. Grindar för cellytans markörer ritades med fluorescens minus en (FMO) kontroller. (B)Representativa flödescytometri histogram för enstaka fläckar av iPSC-DMs (blå) och isotyp kontroller (grå) för härstamning och myeloisk markörer, immunmodulering markörer, mognad markörer och chemokine receptorer. Områden är representativa för n = 5 biologiskt oberoende experiment för alla härstamnings- och myeloiska markörer, utom CD105 och CD206 (n = 3). mognadsmarkörer (n = 5). immunmodulering markörer (n = 3); och chemokinereceptorer (n = 3). Tomter använder tidigare publicerade data8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: IPSC-DM polarisering och fagocytos analyser. Representativa bilder av iPSC-DMs (A) omedelbart efter tillsats av Zymosan pHrodo gröna pärlor och (B) 175 min efter tillsats av pärlor. Blått representerar cellernas kärnor; rött representerar cellernas cytoplasma. Grön representerar intvalda pärlor (Skala bar = 20 μm). C)Fraktion av fagocytiska makrofager och (D) fagocytiskt index/grön intensitet per fagocytisk makrofag över tiden i det naiva tillståndet (n = 6 biologiskt oberoende experiment). Diagram visar medelvärdet och staplarna representerar SEM. Tomter använder tidigare publicerade data8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Utvärdering av polariseringstillstånd iPSC-DM. Relativ kvantifiering av RT-PCR-analyser av naiva och polariserade iPSC-DMs för att bedöma uttrycket av(A)M(LPS+IFNΥ); B)M(IL4) och M (IL10)-associerade gener (n = 6 biologiskt oberoende experiment. ANOVA och Holm-Sidaks flertal jämförelser efter testet. Polariserade grupper jämfördes statistiskt endast med den naiva gruppen). Diagram visar medelvärdet och felstaplarna representerar standardavvikelsen. ND i tomter = avskrift har inte upptäckts. Uppgifterna för dessa ritplaner har tidigare publicerats8. (C)Representativa bilder av iPSC-DMs 175 min efter tillsats av pHrodo pärlor från iPSC-DMs behandlas med (vänster till höger): inga cytokiner, LPS + IFN-Y, IL-4 och IL-10 (Scale bar = 20 μm). (D)Fraktion av fagocytiska makrofager och (E) fagocytiskt index/grön intensitet per fagocytisk makrofag i naiva och polariserade makrofagbehandlingar 175 min efter tillsats av pärlor (n = 12 biologiskt oberoende experiment, enkelriktade ANOVA och Holm-Sidaks flertal jämförelser efter testet. Polariserade grupper jämfördes statistiskt endast med den naiva gruppen). Diagram visar medelvärdet och felstaplarna representerar standardavvikelsen (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet för generering av iPSC-DMs som beskrivs här är robust och möjliggör produktion av ett stort antal homogena celler från ett relativt litet antal iPSC. Efter den första differentieringen av cirka 1 x 106 iPSC kan de efterföljande kulturerna skördas var fjärde dag i upp till 2–3 månader, vilket resulterar i produktion av minst 6,5 x 107 makrofager under den tiden. Dessa in vitro-genererade mänskliga makrofager är morfologiskt liknar primära mänskliga makrofager, uttrycka de viktigaste makrofag cellytan markörer, och uppvisar fagocytisk aktivitet. Protokollet för makrofagdifferentiering kan reproduceras och kan tillämpas på andra hiPSC- och hESC-cellinjer, men den exakta tidpunkten för den första skörden av makrofagenprekursorer och det absoluta antalet celler som kan genereras varierar mellan iPSC-linjer.
Det har visat sig att makrofager kan genereras från iPSCs som har manipulerats genetiskt. Till exempel sattes en transgenkassett bestående av den fluorescerande reportern ZsGreen under kontroll av den konstituerande CAG-promotorn in i AAVS1-lokaliseringen av SFCi55 iPSC-linjen, och det visades senare att denna iPSC-linje kunde differentieras till ZsGreen-expressing macrophages8. Dessa fluorescerande makrofager skulle kunna användas i framtiden för att spåra migration och stabilitet av terapeutiska makrofager i sjukdomsmodeller. I en annan studie genererades makrofager från en iPSC-linje som hade manipulerats genetiskt för att uttrycka en tamoxifen-inducerad transkriptionsfaktor, KLF1. Aktivering av KLF1 i iPSC-härledda makrofager resulterade i produktion av makrofager med en fenotyp jämförbar med makrofager på erytoidön9. Potentiellt, denna strategi kan användas för att genetiskt programmera iPSC-härledda makrofager i fenotyper som är associerade med andra vävnadsspecifika makrofag populationer såsom Kupffer celler i levern eller Langerhans celler i huden. Detta skulle vara möjligt när de viktigaste transkriptionsfaktorerna som definierar dessa celltyper identifieras.
När det gäller protokollet är det mycket viktigt att notera att villkoret för startpopulationen av iPSC är avgörande för en lyckad differentiering. Mänskliga iPSC kulturer kan invaderas med karyotypically onormala subpopulationer över flera passager, så robust kurering av iPSC lager och stora lager parti mästare utsätts för genom kvalitetskontroll rekommenderas. I våra händer kan underhållsprotokollen som beskrivs här upprätthålla karyotypiskt normala iPSC i upp till 2 månader i kontinuerlig kultur, men detta kan variera för olika cellinjer och i olika laboratorier. Om problem uppstår är det lämpligt att använda en ny injektionsflaska med odifferentierade iPSC för varje differentieringsexperiment. Dessutom bör startkulturen för odifferentierade iPSC inte vara mer än 80 % konfluent. Vid EB-pläteringsstadiet bör endast 10–15 EBs pläteras per brunn av en 6-brunnsvävnadsodlingsplatta, och det är viktigt att dessa EBs är jämnt utspridda över brunnen. Ett större antal EBs och / eller klumpar av EBs i mitten av brunnen hade en negativ effekt på antalet makrofager genereras. Försiktighet bör iakttas vid påfyllning av media och skörd av monocytliknande stamfaderfjädringsceller från EB-kulturerna för att undvika att störa EBs vidhäftning till ytan av de belagda kulturplattorna. Antalet hematopoietiska suspensionsceller som produceras ökar gradvis med varje skörd, med optimal produktion mellan dag 40–72 av differentiering (figur 2). Produktionen minskar gradvis efter dag 68 och plattor tenderar att avgas efter 2,5 månader, även om den exakta tidpunkten kan variera beroende på iPSC-linjen.
En begränsning av vårt protokoll är att det inte har varit möjligt att cryopreserve hematopoietic suspension celler som genereras i slutet av steg 2. Protokoll som förlitar sig på exogen aktivering av WNT rapport om en 40% återvinning efter cryopreservation, men dessa protokoll rapporterar bara en cell skörd, så det absoluta antalet makrofager genereras är låg30. Det protokoll som beskrivs här, förmå endogen signalering via bildandet av EBs, kan skördas varannan vecka, vilket ger en mycket högre total makrofag avkastning.
Sammanfattningsvis presenterar vi ett detaljerat protokoll för produktion av funktionella iPSC-härledda makrofager. Att sätta upp in vitro-experiment med makrofager som härrör från iPSC för att studera makrofagbiologi i hälsa och sjukdom har många fördelar jämfört med experiment med monocytbaserade makrofager. Dessa fördelar omfattar enkel tillgång till materialet (t.ex. inga givare krävs), mycket stora mängder makrofager kan produceras, och det är möjligt och relativt enkelt att producera genetiskt modifierade makrofager. Dessutom kan iPSC-härledda makrofager vara bättre resurs för studier av vävnad-bosatt makrofag biologi.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Fiona Rossi och Claire Cryer för hjälp med flödescytometri, Eoghan O'Duibhir och Bertrand Vernay med mikroskopi. Detta arbete finansierades av CONACYT (M.L.-Y.), Wellcome Trust (102610) och Innovate UK (L.M.F), Wellcome Trust PhD studentship (A.M), MRC Precision Medicine Studentship (T.V). L.C. och J.W.P. stöddes av Wellcome Trust (101067/Z/13/Z), Medical Research Council (MR/N022556/1) och COST Action BM1404 Mye-EUNITER (http://www.mye-euniter.eu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Invitrogen | 31350010 | |
| Abtibody CD64-APC -CY7 | Biolegend | 305026 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody 25F9-EFLUOR 660 | Ebioscience | 15599866 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CCR2-PE-Cy7 | Biolegend | 357212 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR5 PE | Biolegend | 313707 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CCR8 PE | Biolegend | 360603 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD11b-PE | Biolegend | 301305 | Dilution factor: 1:50 |
| Antibody CD14-APC | Ebioscience | 10669167 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD163-PE-CY7 | BIolegend | 333614 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD169-APC | Biolegend | 346007 | Dilution factor: 1:25 |
| Antibody CD206-PE | Biolegend | 321106 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD209-PE-CY7 | Biolegend | 3310114 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD274-PE-CY7 | Biolegend | 329718 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD43-PE | Ebioscience | 10854419 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD45-APC | Ebioscience | 15577936 | Dilution factor: 1:20 |
| Antibody CD86-APC | Biolegend | 305412 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CD93-PE | Ebioscience | 10804637 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody CX3CR1-PE | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antibody HLA-DR-BV650 | Biolegend | 307650 | Dilution factor: 1:100 |
| Antiboy CD115-PE | Biolegend | 347308 | Dilution factor: 1:40 |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme free | Thermofisher | 13151014 | |
| Cell Dissociation Buffer, enzyme-free, PBS | Gibco | 13151014 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well | PerkinElmer | 6055302 | |
| CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain | Thermofisher | C10046 | Cryopreservation media |
| Cryostor CS10 | Sigma | C2874 | |
| CTS CELLstart Substrate | Invitrogen | A1014201 | Stem cell substrate |
| DAPI | Merck | D9542-1MG | Final concentration 1 μg/mL |
| DPBS, calcium, magnesium (500 mL) | Thermofisher | 14040091 | |
| FcR Blocking Reagent, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| FGF-Basic (AA 10-155) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHG0021 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 35050061 | |
| Human Recombinant IFNY | Thermofisher | 14-8319-80 | |
| Human Serum Albuminum | Irvine Scientific | 9988 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) from E. Coli | Sigma | L2630 | |
| NucBlue (Hoechst33342) | Thermofisher | R37605 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate for Phagocytosis | Thermofisher | P35365 | |
| Porcine Skin Gelatin | Sigma | G9136 | |
| Recombinant Human BMP4 Protein | R&D | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human IL10 | Preprotech | 200-10 | |
| Recombinant Human IL3 | Preprotech | 200-03-10 | |
| Recombinant Human IL4 | Preprotech | 200-04 | |
| Recombinant Human MCSF (carrier-free) 100 μg | Biolegend | 574806 | |
| Recombinant Human VEGF Protein | R&D | 293-VE-010 | |
| Rock Inhibitor Y-27632 | Merck | SCM075 | |
| SCF (C-Kit Ligand) Recombinant Human Protein | Thermofisher | PHC2111 | |
| StemPro hESC SFM | Thermofisher | A1000701 | |
| StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | Thermofisher | 23181010 | |
| Ultralow attachment plates: Cell culture multi-well plate, 6 well, cell star cell repellent surface | Greiner | 657970 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 | |
| X-Vivo 15 500 mL bottle | Lonza | BE02-060F |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 115-130 (2017).
- Focosi, D., Amabile, G. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Red Blood Cells and Platelet Concentrates: From Bench to Bedside. Cells. 7 (1), (2017).
- Inoue, H., Nagata, N., Kurokawa, H., Yamanaka, S. IPS cells: A game changer for future medicine. EMBO Journal. 33 (5), 409-417 (2014).
- Lachmann, N., et al. Large-Scale Hematopoietic Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Provides Granulocytes or Macrophages for Cell Replacement Therapies. Stem Cell Reports. 4 (2), 282-296 (2015).
- Kuhn, A., et al. TALEN-mediated functional correction of human iPSC-derived macrophages in context of hereditary pulmonary alveolar proteinosis. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Ackermann, M., et al. Ex vivo Generation of Genetically Modified Macrophages from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Transfusion Medicine and Hemotherapy. 44 (3), 135-142 (2017).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. A human iPSC line capable of differentiating into functional macrophages expressing ZsGreen: A tool for the study and in vivo tracking of therapeutic cells. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 373 (1750), (2018).
- Lopez-Yrigoyen, M., et al. Genetic programming of macrophages generates an in vitro model for the human erythroid island niche. Nature Communications. 10 (1), 881 (2019).
- Cassetta, L., et al. Human Tumor-Associated Macrophage and Monocyte Transcriptional Landscapes Reveal Cancer-Specific Reprogramming, Biomarkers, and Therapeutic Targets. Cancer Cell. 35 (4), 588-602 (2019).
- Haideri, S. S., et al. Injection of embryonic stem cell derived macrophages ameliorates fibrosis in a murine model of liver injury. NPJ Regenerative Medicine. 2, 1-10 (2017).
- van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. Efficient, long term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions. PLoS One. 8 (8), 71098 (2013).
- Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
- Douvaras, P., et al. Directed Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
- Heideveld, E., et al. Methods for macrophage differentiation and in vitro generation of human tumor associated-like macrophages. Methods in Enzymology. , 1-18 (2019).
- Leary, A. G., et al. Synergism between interleukin-6 and interleukin-3 in supporting proliferation of human hematopoietic stem cells: comparison with interleukin-1 alpha. Blood. 71 (6), 1759-1763 (1988).
- Robin, C., et al. An Unexpected Role for IL-3 in the Embryonic Development of Hematopoietic Stem Cells. Developmental Cell. 11 (2), 171-180 (2006).
- Moldenhauer, A. Hematopoietic progenitor cells and interleukin-stimulated endothelium: Expansion and differentiation of myeloid precursors. BMC Immunology. 9, 56 (2008).
- Kodama, H., Nose, M., Shumpei Niida, S., Yarnasakit, A. Essential Role of Macrophage Colony-Stimulating Factor in the Osteoclast Differentiation Supported by Stromal Cells. Brief Definitive Report. , 1291-1294 (1991).
- Bender, A. T., Ostenson, C. L., Giordano, D., Beavo, J. A. Differentiation of human monocytes in vitro with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor produces distinct changes in cGMP phosphodiesterase expression. Cellular Signalling. 16 (3), 365-374 (2004).
- Klimchenko, O., et al. Monocytic cells derived from human embryonic stem cells and fetal liver share common differentiation pathways and homeostatic functions. Blood. 117 (11), 3065-3075 (2011).
- Alasoo, K., et al. Transcriptional profiling of macrophages derived from monocytes and iPS cells identifies a conserved response to LPS and novel alternative transcription. Scientific Reports. , August 1-15 (2015).
- Buchrieser, J., et al. Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Macrophages Share Ontogeny with MYB-Independent Tissue-Resident Macrophages. Stem Cell Reports. 8 (2), 334-345 (2017).
- Vanhee, S., et al. In vitro human embryonic stem cell hematopoiesis mimics MYB-independent yolk sac hematopoiesis. Haematologica. 100 (2), 157-166 (2015).
- Abud, E. M., et al. iPSC-Derived Human Microglia-like Cells to Study Neurological Diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
- Yang, C. -T., et al. Activation of KLF1 Enhances the Differentiation and Maturation of Red Blood Cells from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 35 (4), 886-897 (2017).
- Karavitis, J., Kovacs, E. J. Macrophage phagocytosis: effects of environmental pollutants, alcohol, cigarette smoke, and other external factors. Journal of Leukocyte Biology. 90 (6), 1065-1078 (2011).
- Sica, A., Mantovani, A. Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas. The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).
- Murray, P. J., et al. Macrophage Activation and Polarization: Nomenclature and Experimental Guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
- Cao, X., et al. Differentiation and Functional Comparison of Monocytes and Macrophages from hiPSCs with Peripheral Blood Derivatives. Stem Cell Reports. 12, 1282-1297 (2019).
