Summary
Generatie recombinantrotavirussen uit plasmid DNA is een essentieel instrument voor de studie van rotavirusreplicatie en pathogenese, en de ontwikkeling van rotavirusexpressievectoren en vaccins. Hierin beschrijven we een vereenvoudigde omgekeerde genetica benadering voor het genereren van recombinante rotavirussen, met inbegrip van stammen uitdrukken fluorescerende reporter eiwitten.
Abstract
Rotavirussen zijn een grote en evoluerende populatie van gesegmenteerde dubbelstrengs RNA-virussen die ernstige gastro-enteritis veroorzaken bij de jonge van vele zoogdier- en vogelsoorten, waaronder mensen. Met de recente komst van rotavirus omgekeerde genetica systemen, is het mogelijk geworden om gerichte mutagenese te gebruiken om rotavirus biologie te verkennen, te wijzigen en te optimaliseren bestaande rotavirus vaccins, en rotavirus multitarget vaccin vectoren te ontwikkelen. In dit rapport beschrijven we een vereenvoudigd reverse genetica systeem dat het mogelijk maakt de efficiënte en betrouwbare herstel van recombinante rotavirussen. Het systeem is gebaseerd op co-transfection van T7 transcriptie vectoren uitdrukken full-length rotavirus (+)RNAs en een CMV vector codering van een RNA capping enzym in BHK cellen constitutief produceren T7 RNA polymerase (BHK-T7). Recombinant rotavirussen worden versterkt door het overzien van de getransfecteerde BHK-T7 cellen met MA104 cellen, een aap niercel lijn die zeer tolerant is voor virusgroei. In dit rapport beschrijven we ook een aanpak voor het genereren van recombinante rotavirussen die een apart fluorescerend reporter-eiwit uitdrukken door de introductie van een 2A translationeel stop-herstartelement in genoomsegment 7 (NSP3). Deze aanpak voorkomt het verwijderen of wijzigen van een van de virale open leesframes, waardoor de productie van recombinante rotavirussen die volledig functionele virale eiwitten behouden terwijl het uitdrukken van een fluorescerend eiwit.
Introduction
Rotavirussen zijn belangrijke oorzaken van ernstige gastro-enteritis bij zuigelingen en jonge kinderen, evenals de jongen van vele andere zoogdier- en vogelsoorten1. Als leden van de Reoviridae familie hebben rotavirussen een gesegmenteerd dubbelstrengs RNA (dsRNA) genoom. De genoomsegmenten bevinden zich in een niet-gehulde icosahedralvirion gevormd uit drie concentrische lagen eiwit2. Op basis van sequencing en fylogenetische analyse van de genoomsegmenten zijn negen soorten rotavirus (A−D, F−J) gedefinieerd3. Deze stammen die rotavirussoort A omvatten, zijn verantwoordelijk voor de overgrote meerderheid van de menselijke ziekte4. De introductie van rotavirusvaccins in kindervaccinatieprogramma's die in het laatste decennium beginnen, is gecorreleerd met een aanzienlijke vermindering van de mortaliteit en morbiditeit van het rotavirus. Het meest in het bijzonder is het aantal sterfgevallen door rotavirus gerelateerde sterfgevallen bij kinderen gedaald van ongeveer 528.000 in 2000 tot 128.500 in 20164,5. Rotavirus vaccins zijn geformuleerd uit levende verzwakte stammen van het virus, met 2 tot 3 doses toegediend aan kinderen door 6 maanden oud. Het grote aantal genetisch diverse rotavirusstammen die circuleren bij mensen en andere zoogdiersoorten, in combinatie met hun vermogen om snel te evolueren door middel van mutagenese en herassortiment, kan leiden tot antigene veranderingen in de soorten rotavirussen infecteren kinderen6,7,8. Dergelijke veranderingen kunnen de werkzaamheid van bestaande vaccins ondermijnen, waardoor ze moeten worden vervangen of gewijzigd.
De ontwikkeling van volledig plasmid-gebaseerde omgekeerde geneticasystemen die manipulatie van om het even welk van de 11 rotavirusgenoomsegmenten toelaten werd slechts onlangs bereikt9. Met de beschikbaarheid van deze systemen is het mogelijk geworden om moleculaire details van rotavirusreplicatie en pathogenese te ontrafelen, verbeterde screeningsmethoden met hoge doorvoer voor anti-rotavirusverbindingen te ontwikkelen en nieuwe potentieel effectievere klassen van rotavirusvaccins te creëren. Tijdens de replicatie van het rotavirus leiden afgetopte virale (+)RNA's niet alleen de synthese van virale eiwitten, maar dienen ze ook als sjablonen voor de synthese van progeny dsRNA genoomsegmenten10,11. Alle rotavirus reverse genetica systemen beschreven tot op heden vertrouwen op de transfection van T7 transcriptie vectoren in zoogdier cellijnen als een bron van cDNA-afgeleide (+)RNAs gebruikt bij het herstellen van recombinant virussen9,12,13. Binnen de transcriptievectoren worden virale cDNO's over de hele lengte geplaatst tussen een upstream T7-promotor en een downstream hepatitis deltavirus (HDV) ribozyme, zodat virale (+)RNA's worden gesynthetiseerd door T7 RNA polymerase die authentieke 5' en 3'termini (figuur 1A) bevatten. In de eerste generatie reverse genetica systeem, recombinante virussen werden gemaakt door transfecting baby hamster niercellen uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) met 11 T7 (pT7) transcriptie vectoren, elke regiesynthese van een uniek (+)RNA van de simian SA11 virusstam, en drie CMV promoter-drive expression plasmiden, één die het aviaire reovirus p10FAST-fusie-eiwit codeert en twee coderingssubeenheden van het vacciniavirus D1R-D12L capping enzymcomplex9. Recombinant SA11 virussen gegenereerd in transfected BHK-T7 cellen werden versterkt door toezicht met MA104 cellen, een cellijn tolerant voor rotavirus groei. Een aangepaste versie van de eerste generatie reverse genetica systeem is beschreven dat niet langer gebruik maakt van steun plasmiden12. In plaats daarvan genereert het gewijzigde systeem met succes recombinante rotavirussen door bhk-T7-cellen te transfecteren met de 11 SA11 T7 transcriptievectoren, waarbij het voorbehoud is dat vectoren voor de virale fabriek (viroplasma) bouwstenen (niet-structurele eiwitten NSP2 en NSP5) worden toegevoegd op niveaus die 3 keer hoger liggen dan de andere vectoren14,15. Gewijzigde versies van het omgekeerde genetica systeem zijn ook ontwikkeld die het herstel van de menselijke KU en Odelia stammen van rotavirus16,17ondersteunen . Het rotavirus genoom is opmerkelijk vatbaar voor manipulatie door omgekeerde genetica, met recombinant virussen gegenereerd tot op heden met mutaties geïntroduceerd in VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21, en NSP522,23. Onder de meest nuttige virussen die tot nu toe zijn gegenereerd, zijn die welke zijn ontworpen om fluorescerende reporter eiwitten (FPs)9,12,,21,24,25uit te drukken .
In deze publicatie bieden we het protocol voor het omgekeerde geneticasysteem dat we in ons laboratorium gebruiken om recombinante stammen van SA11 rotavirus te genereren. Het belangrijkste kenmerk van ons protocol is co-transfection van BHK-T7 cellen met de 11 pT7 transcriptie vectoren (gewijzigd om 3x niveaus van de pT7/NSP2SA11 en pT7/NSP5SA11 vectoren) en een CMV expressie vector codering van de Afrikaanse varkenspest virus (ASFV) NP868R capping enzym21 (Figuur 2). In onze handen leidt de aanwezigheid van de NP868R plasmid tot de productie van hogere titers van recombinante virussen door getransfecteerde BHK-T7 cellen. In deze publicatie bieden we ook een protocol voor het wijzigen van de pT7/NSP3SA11 plasmide zodanig dat recombinante virussen kunnen worden gegenereerd die niet alleen het segment 7 eiwitproduct NSP3 uitdrukken, maar ook een aparte FP. Dit wordt bereikt door het Open Leeskader (ORF) van NSP3 in het pT7/NSP3SA11 plasmide opnieuw te ontwerpen en een downstream 2A translationeel stop-restart-element te bevatten, gevolgd door een FP ORF (Figuur 1B)24,26. Door deze aanpak hebben we recombinante rotavirussen gegenereerd die verschillende FP's uitdrukken: UnaG (groen), mKate (verrood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)24,27,28. Deze FP-expressing rotavirussen worden gemaakt zonder de NSP3 ORF te verwijderen, waardoor virussen worden opgedaan die naar verwachting een volledige aanvulling van functionerende virale eiwitten zullen coderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Onderhoud van de mediavoorbereiding en celcultuur
- Verkrijgen baby hamster niercellen constitutief uitdrukken T7 RNA polymerase (BHK-T7) en Afrikaanse groene aap nier MA104 cellen.
OPMERKING: BHK-T7 (of BSR-T7) cellen zijn niet commercieel beschikbaar, maar zijn een gemeenschappelijke cellijn van laboratoria met behulp van omgekeerde genetica om RNA-virusbiologie te bestuderen. De BHK-T7 cellijn die in dit protocol werd gebruikt, werd verkregen van Dr. Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), een mede-ontwikkelaar van de originele BHK-cellijn die T7 RNA polymerase29uitdrukt. MA104 cellen zijn verkrijgbaar bij European Collection of Authenticated Cell Cultures (ECACC) en van American Type Culture Collection (ATCC). - Bereid de volgende cultuurmedia voor in een steriele omgeving, bij voorkeur een biologische veiligheidskast van klasse II. Bewaar de media in het donker bij 4 °C en warm tot 37 °C vlak voor gebruik.
OPMERKING: Bronnen van mediacomponenten zijn opgenomen in de tabel van materialen.- Om DMEM onvolledig medium voor te bereiden, combineert u 500 mL van dulbecco's gemodificeerde Eagle's minimum essentiële medium (MEM) met 4,5 g/L glucose en 1% glutamine met 5 mL van 100x pen-strep.
- Om DMEM compleet medium voor te bereiden, combineert u 500 mL DMEM onvolledig medium met 25 mL foetaal runderserum (FBS).
- Voor de bereiding van GMEM onvolledig medium, combineren 500 mL van Glasgow minimum essentieel medium, 5 mL van 100x glutamine, 50 mL van tryptose-fosfaat bouillon (TPB), 5 mL van 100x niet-essentiële aminozuren (NEAA), en 5 mL van 100x pen-strep.
- Om GMEM compleet medium voor te bereiden, combineer t.o.v. 500 mL GMEM onvolledig medium met 25 mL warmte-geïnactiveerde FBS.
- Om GMEM+G compleet medium voor te bereiden, voeg je 10 mL van 50 mg/mL geneticin (G418) toe aan 500 mL gmem compleet medium.
- Om mkb-onvolledig medium voor te bereiden, combineer tuur 500 mL van Joklik's gemodificeerde Eagle's MEM, 5 mL van 100x glutamine, 50 mL TPB, 5 mL van 100x NEAA en 5 mL van 100x pen-strep.
- Cultuur MA104 cellen in T75 of T175 kolven met respectievelijk 12 of 25 mL DMEM compleet medium. Om MA104-cellen te passeren die 100% samenvloeiing hebben bereikt, spoelt u de celmonolayer 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), dissocieert met trypsine (0,05%)-EDTA (0,1%) oplossing, en opnieuw opschorten in 5 (T75 kolf) of 10 mL (T175 kolf) van DMEM onvolledig medium.
- Plaats 0,5−1,0 mL geresuspendeerde cellen in verse kolven en breng het juiste eindvolume door dmem compleet medium toe te voegen. Doe kolven in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Propageer BHK-T7-cellen in T75-kolven, afwisselend tussen het gebruik van GMEM en GMEM+G complete medium bij elke passageronde. Om bhk-T7 cellen die hebben bereikt 100% samenvloeiing subcultuur, spoel de cel monolayer 2x met PBS, scheiden met trypsine-EDTA oplossing, en resuspend in 5 mL van medium.
- Na het plaatsen van 15 mL GEM of GMEM+G complete medium in een verse T75 kolf, voeg vier druppels geresuspendeerde BHK-T7 cellen. Plaats de kolf in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
2. Plasmidbereiding
- Verkrijg de volgende plasmiden die rotavirus SA11 (+)RNAs uitdrukken van Addgene: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11, pT7/VP4SA11, pT7/VP6SA11, pT7/VP7SA11, pT7/NSP1SA11, pT7/NSP2SA11, pT7/NSP3SA11, pT7/NSP4SA11 en pT7/NSP5SA11. Verkrijg de plasmide die het ASFV capping enzym (pCMV/NP868R) uitdrukt van de auteurs21.
OPMERKING: Gewijzigde pT7/NSP3SA11 plasmiden die zijn ontworpen om een FP uit te drukken door de activiteit van een 2A translationeel element (pT7/NSP3-2A-3xFL-FP) kunnen ook worden verkregen bij de auteurs24,26. pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmiden die de volgende FP's uitdrukken zijn beschikbaar: UnaG (groen), mKate (ver-rood), mRuby (rood), TagBFP (blauw), GVB (cyaan) en YFP (geel)24. - Zet plasmiden om in competente E. coli coli coli DH5α en verspreid bacteriën op Luria bouillon agar platen met de juiste antibioticum. Kweek bacteriële culturen geplukt uit individuele kolonies en bereiden kleinere hoeveelheden plasmite (20 μg) met behulp van een spin miniprep zuiveringskit (Table of Materials), volgens de instructies van de fabrikant. Bereid grotere hoeveelheden plasmide uit bacteriële culturen met behulp van midi en maxi zuivering kits (Tabel van materialen).
OPMERKING: Plasmids geschikt voor gebruik in de omgekeerde genetica systeem zijn ook bereid met andere plasmid zuivering kits. Het is niet nodig om plasmiden voor te bereiden met behulp van kits die speciaal zijn ontworpen om endotoxinevrij materiaal te genereren. - Pas de concentraties gezuiverde plasmiden aan op 1 mg/mL in nucleasevrij moleculair biologiegraadwater. Controleer de zuiverheid van plasmid door een 260/280-absorptieverhouding van ~ 1,8 te bevestigen met behulp van een spectrofotometer. Gebruik ook elektroforese op 0,8% agarose gels om te controleren of plasmiden voornamelijk supercoiled zijn.
- Aliquot gezuiverde plasmiden in 0,5 mL steriele microcentrifugebuizen, elk met 10 μL. Bewaar plasmiden bij -80 °C.
3. Generatie recombinantvirus
OPMERKING: Menselijk en dierlijk rotavirusonderzoek, met inbegrip van het genereren en karakteriseren van recombinante rotavirusstammen, moet worden behandeld onder Biosafety Level 2 (BSL-2) voorwaarden en vereist voorafgaande goedkeuring door het Institutioneel Biosafety Committee (IBC). Passende BSL-2 laboratoriumomstandigheden worden beschreven in Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) geproduceerd door de Centers for Disease Control and Prevention (CDC)30.
- Dag 1: zaaien van BHK-T7 cellen in 12-put platen
- Spoel een vers confluent monolayer van BHK-T7 cellen in een T75 kolf 2x met PBS. Verstoor de celmonolayer met trypsin-EDTA-oplossing en stouw de cellen opnieuw in 5 mL van GMEM complete medium.
- Gebruik een geautomatiseerde celteller en trypan-blauwe oplossing om de concentratie van levensvatbare BHK-T7 cellen in het medium te bepalen. Zaadcellen in 12-well celkweekplaten, waarbij elk put 2 x 105 cellen bevat in een totaal volume van 1 mL GMEM (G418-vrij) compleet medium. Incubeer in een 37 °C, 5% CO2 incubator. De cellen moeten 80−90% samenvloeiing bereiken op dag 2.
- Dag 2: transfection van BHK-T7 cellen met plasmidemengsels
- Voor de bereiding van het plasmidemengsel, combineer het volgende in een microcentrifugebuis van 0,5 mL met plasmidevoorraden aangepast aan 1 mg/mL: 0,8 μL elk van SA11 pT7 plasmiden VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 en NSP4, 2,4 μL elk van SA11 pT7 plasmiden NSP2 en NSP5 en 0,8 μL pCMV/NP868R. Meng de plasmiden voorzichtig door op de buis te tikken en de inhoud te verzamelen door pulscentrifugatie. Om recombinante virussen voor te bereiden die FP's uitdrukken, vervangt u pT7/NSP3SA11 door de juiste pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmi.
LET OP: Plasmidmengsels moeten op ijs worden opgeslagen totdat ze worden gebruikt. Voor elke transfection moet een aparte buis worden bereid. - Voor de bereiding van het plasmiat/gereduceerd serummedium/transfection reagensmengsel: Voeg 110 μL voorverwarmde (37 °C) gereduceerd serummedium (Materiaaltafel)toe aan elk plasmitiemengsel en meng door zachtjes op en neer te paien. Voeg daarna 32 μL transfection reagens(Table of Materials)toe aan elk plasmiing/gereduceerd serummediummengsel; dit levert een concentratie op van 2,5 μL transfection reagens per μg plasmide in mengsels. Vortex mengsels zachtjes en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Spoel tijdens de incubatietijd van 20 minuten BHK-T7 cellen in 12-well platen (bereid op dag 1) eenmaal met 2 mL GMEM onvolledige media. Voeg daarna 1 mL MKB onvolledig medium toe aan elke put en breng platen terug naar de incubator.
- Voeg na de incubatietijd van 20 min het plasmite/verminderde serummiddel/transfetiemengsel druppel voor druppel toe aan elke put van de 12-well platen met behulp van een 200 μL pipettor. Voorzichtig schommelplaten en terug naar een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Voor de bereiding van het plasmidemengsel, combineer het volgende in een microcentrifugebuis van 0,5 mL met plasmidevoorraden aangepast aan 1 mg/mL: 0,8 μL elk van SA11 pT7 plasmiden VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7, NSP1, NSP3 en NSP4, 2,4 μL elk van SA11 pT7 plasmiden NSP2 en NSP5 en 0,8 μL pCMV/NP868R. Meng de plasmiden voorzichtig door op de buis te tikken en de inhoud te verzamelen door pulscentrifugatie. Om recombinante virussen voor te bereiden die FP's uitdrukken, vervangt u pT7/NSP3SA11 door de juiste pT7/NSP3-2A-3xFL-FP plasmi.
- Dag 4: overzien de getransfde BHK-T7 cellen met MA104 cellen
- Spoel een vers confluent monolayer van MA104 cellen in een T75 kolf 2x met PBS. Verstoor de monolayer met trypsin-EDTA-oplossing en stouw cellen opnieuw op in 5 mL dmem-volledig medium.
- Met behulp van een geautomatiseerde celteller en trypan-blauwe oplossing, bepaal de concentratie van levensvatbare MA104-cellen in het medium. Pas de concentratie aan op 8 x 105 MA104 cellen/mL in DMEM onvolledig medium en voeg 0,25 mL van zwevende cellen (2 x 105 cellen) dropwise toe aan de putten met getransfecteerde BHK-T7 cellen.
- Pas de concentratie trypsine (varkens alvleeskliertype IX) in het medium aan tot ~0,5 μg/mL door 0,8 μL van 1 mg/mL trypsinevoorraad aan elke put toe te voegen.
OPMERKING: Trypsinevoorraden moeten worden bereid in PBS, aliquoted, en opgeslagen bij -20 °C. - Gebruik de resterende MA104-cellen om 6-well platen voor te bereiden die nodig zijn op dag 7 om recombinante virussen te versterken. Voor zaad 6-well platen, verdun geresuspended MA104 cellen tot een concentratie van 1,5 x 105 cellen/mL in DMEM compleet medium en plaats 2 mL in elke put. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Dag 7: herstel en versterking van recombinantvirus uit getransfecteerde cellen
- Onderwerp BHK-T7/MA104 cellen in 12-well platen tot drie cycli van vries-dooi onder steriele omstandigheden, bewegende platen tussen -20 °C vriezer en een kamertemperatuur oppervlak. Na het overbrengen van lysaten naar buizen van 1,5 mL, centrifugeren buizen gedurende 10 min bij 500 x g (4 °C) naar pellet grote cellulaire puin. Verzamel supernatant en bewaar bij 4 °C (korte termijn) of -20 °C (lange termijn).
- Was MA104 monolagen in 6-well platen (bereid op dag 4) 2x met PBS. Plaats 2 mL DMEM onvolledig medium voor elke put die 0,5 μg/mL trypsine bevat. Voeg 300 μL supernatant teruggewonnen uit BHK-T7/MA104 cellysaten toe aan putten en plaats platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator.
- Incubeerplaten gedurende 7 dagen of totdat volledige cytopathische effecten (CPE) worden waargenomen. Lyse MA104 cellen in 6-well platen door drie cycli van vries-dooi, dan overdracht lysats tot 1,5 mL microcentrifuge buizen. Pellet groot cellulair puin door centrifugering gedurende 10 min bij 500 x g (4 °C). Breng de geklaarde cellysataten over in 1,5 mL microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 °C.
4. Plaqueisolatie van recombinante virussen
- Activeer virussen in 100 μL van geklaarde cellysataaten door trypsine toe te voegen aan een eindconcentratie van 10 μg/mL en uit te broeden bij 37 °C gedurende 1 uur. Bereid een 10-voudige serie met seriële verdunning voor, variërend van 10-1 tot 10-7 (1 mL per stuk) in DMEM onvolledig medium.
- Spoel MA104 monolagen in 6-well platen 2x met 2 mL PBS en eenmaal met DMEM onvolledig medium. Voeg 400 mL lysaatverdunningsverdunningen in tweevoud toe aan de platen. Incubeer de platen voor 1 uur in een 37 °C, 5% CO2 incubator, schommelen elke 10−15 min om verdunningen over de monolayer te herverdelen.
- Bereid een agarose-MEM overlay oplossing door het combineren van gelijke volumes van 2x Eagle's minimale essentiële medium (EMEM; voorverwarmd tot 37 °C) met 1,5% agarose die is gesmolten in water met behulp van een magnetron en voorgekoeld tot 45 °C. Bewaar de overlayoplossing bij 42 °C met een waterbad en pas zich aan een eindconcentratie van 0,5 μg/mL trypsine aan vlak voordat u cellen plaatst.
- Trek lysate verdunningen van 6-well platen af en spoel vervolgens eenmaal cellen af met 2 mL onvolledige DMEM. Voorzichtig overlay 3 mL van de agarose-MEM overlay oplossing op de cel monolayer in elke put. Laat de agarose overlay uitharden bij kamertemperatuur en breng de platen terug naar de couveuse.
- Drie dagen later, bereiden een agarose-MEM overlay oplossing als in stap 4.3 en breng tot 42 °C. Pas vlak voor gebruik de overlayoplossing aan op een eindconcentratie van 50 μg/mL neutraal rood (Materiaaltafel).
- Voeg 2 mL van de overlay-oplossing toe bovenop de bestaande agaroselaag in de 6-well platen. Nadat de nieuwe agaroselaag is verhard, worden de platen terugnaar de couveuse gebracht. Bescherm oplossingen en platen die neutraal rood bevatten tegen blootstelling aan licht.
- In de komende 6 uur, identificeren rotavirus plaques in de 6-well platen met behulp van een lichtbak. Kies duidelijk gedefinieerde plaques met behulp van wegwerp overdracht pipten, herstellende agarose pluggen die zich volledig uitstrekken tot de cellaag.
- Verdwijn de stekker in een buis van 1,5 mL met 0,5 mL DMEM onvolledig medium en vortex het monster voor 30 s. Versterk het plaque-geïsoleerde virus dat in het medium wordt geëlueerd door vermeerdering op MA104 monolagen in 6-well platen of T25-kolven met DMEM onvolledig medium en 0,5 μg/mL trypsin.
OPMERKING: Aanvullende informatie over isolatie en titering van rotavirus door plaquetest is beschikbaar in Arnold et al.31.
5. Gel elektroforese van virale dsRNA
- Plaats 600 μL van geklaarde geïnfecteerde cellysaten en 400 μL guanidiniumthiocyanaat in 1,5 mL microcentrifugebuizen, vortex voor 30 s, en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Voeg 200 μL chloroform, vortex voor 30 s toe en incubeer gedurende 3 min. Na 5 min centrifuging bij 13.000 x g (4 °C), breng ~550 μL van de bovenste waterige fase over in verse buizen.
- Herstel viraal dsRNA uit de waterige fase door 2 volumes (~900 μL) koude isopropylalcohol toe te voegen en buizen 4−6x om te keren. Na 10 min op kamertemperatuur te hebben gebroed, centrifugeren de centrifugebuizen gedurende 10 min bij 13.000 x g (4 °C). Gooi supernatants weg en bewaar de RNA-pellets.
- Was de pellets door 1 mL ethanol aan de buis toe te voegen, één keer om te keren en 5 min te centrifugeren bij 7.500 x g (4 °C). Na het zorgvuldig verwijderen van de ethanolwassering met een pipettor, laat RNA-pellets gedurende 5−10 min luchtdrogen op de labbank. Los RNA-pellets op in 15 μL nuclease-vrij moleculair biologisch graadwater en bewaar op -20 °C.
- Combineer 10 μL opgeloste RNA-monsters met 2 μL van 6x DNA-laadbuffer, laad op 10% polyacrylamide minigels (of handgegoten equivalenten) en los RNA's op door elektroforese in Tris-glycine running buffer gedurende 2 uur onder een constante stroom (16 mA). Week gels voor 5−10 min in water dat ~1 μg/mL ethidium bromide bevat en detecteer rotavirusgenoomsegmenten met een UV-transilluminator.
6. Herstel en sequencing van virale dsRNA
- Zoek virale dsRNA-banden op polyacrylamidegels bij voorkeur met behulp van uv-licht met een lage intensiteit met een lange golflengte, om te voorkomen dat het genereren van nucleïnezuurcrosslinks. Met behulp van een vers scheermesje, knip gel fragmenten met dsRNA banden en overdracht in 1,5 mL microcentrifuge buizen.
- Na toevoeging van 10−20 μL RNase-vrij water, verpletter tover elk fragment met een RNase-vrije wegwerppelletstamper die is ontworpen om een microcentrifugebuis van 1,5 mL te passen of door een naald van 18 G op en neer te zetten. Incubeer verpletterde fragmenten 's nachts bij 4 °C.
- Herstel 3 μL vloeistof uit buizen die gemalen gelfragmenten bevatten. Genereren van cDNO's van de virale dsRNAs met behulp van een one-step reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RT-PCR) kit (Tabel van materialen) en de juiste oligonucleotide primers.
OPMERKING: PCR-producten worden gelgezuiverd met een PCR clean-up kit (Table of Materials) en verzonden voor 's nachts sequencing, samen met primers, door commerciële DNA-sequentie diensten.
7. Immunoblot-analyse van virale eiwitten
- Zaad 6-well platen met 3 x 105 MA104 cellen per put in een totaal volume van 2 mL DMEM compleet medium. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en laat tot de cellen samenvloeiing bereiken (3−5 dagen).
OPMERKING: Putten met confluente monolagen bevatten ~ 1,2 x 106 cellen. - Behandel verduidelijkte supernatants door met 10 μg/mL trypsine bij 37 °C gedurende 1 uur te broeden om recombinante rotavirusdeeltjes te activeren die erin zitten.
- Spoel MA104 monolagen in 6-well platen 2x met 2 mL PBS. Infecteer cellen door aan elke put 200 μL entmateriaal toe te voegen dat 3−5 plaquevormende eenheden (PFU) per cel van trypsin-geactiveerd rotavirus in DMEM onvolledig medium bevat. Breng de borden terug naar de couveuse.
- Elke 10 min, verwijder platen en zachtjes rock te herverdelen inoculum over de cel monolayer. Na 1 uur, vervang inoculum met 2 mL dmem onvolledig medium.
- Bij 8 uur na infectie, spoel cellen in 6-well platen 2x met PBS. Schraap cellen in 750 μL PBS en breng het volume over op een 1,5 mL microcentrifugebuis. Spoel de plaat af met nog eens 750 μL PBS en combineer met het vorige verzamelde monster van 750 μL.
- Pelletcellen in monster door centrifugeren op 5.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C. Na het weggooien van supernatant, bewaar celpellets bij -80 °C tot verder verwerkt.
- Bereid een cellysebuffer voor met 300 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2% Triton X-100 en 1x EDTA-vrije complete proteaseremmer. Na toevoeging van 300 μL lysisbuffer aan bevroren celpellets, kort vortexmonsters en 10 min in te broeden op ijs.
- Herhaal het proces van vortexen en het uitbroeden van monsters op ijs 3x. Centrifugeer daarna monsters op 15.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C, verzamel vervolgens supernatants en bewaar op -80 °C.
- Beslecht eiwitten in 20 μL-volumes van supernatant monsters door elektroforese op prefab lineaire 8−16% polyacrylamide minigels en overbrengen naar nitrocellulosemembranen. Blokmembranen door uit te broeden met PBS-Tween 20 (0,02%) oplossing met 5% vetvrije droge melk.
- Sondemembranen door incubatie met een of meer primaire antilichamen (bijvoorbeeld cavia anti-NSP3 of anti-VP6 antisera, muis monoklonale anti-Flag M2 antilichaam, of konijn monoklona anti-PCNA antilichaam). Detecteer primaire antilichamen door het uitbroeden van membranen met paardenanti-muisIgG, anti-cavia IgG of geitenanti-konijn IgG mierikswortel peroxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen, gevolgd door het verbeterde chemiluminescentie (ECL) mierikswortel chemiluminescentiesubstraat. Visualiseer luminescentiesignalen met behulp van een gelimaging systeem(Table of Materials)of Röntgenfilm.
8. Live-cell imaging van cellen die besmet zijn met FP-uitdrukkende virussen
- Zaad 6-well platen met 3 x 105 MA104 cellen per put in een totaal van 2 mL dmem compleet medium. Plaats platen in een 37 °C, 5% CO2 incubator en laat tot de cellen samenvloeiing bereiken (3−5 dagen).
OPMERKING: Putten met confluente monolagen bevatten ~ 1,2 x 106 cellen. - Activeer rotavirusmonsters, van bekende titer, door incubatie met 10 μg/mL trypsine bij 37 °C gedurende 1 uur.
- Spoel 6-well platen met MA104 monolayers 2x met 2 mL PBS. Infecteer cellen door aan elk goed 200 μL entmateriaal toe te voegen dat 3−5 PFU per cel van trypsin-geactiveerd rotavirus in onvolledig medium DMEM bevat. Breng platen terug naar de couveuse en voorzichtig rockplaten om de enoculum om de 10 min over de celmonolayer te verdelen.
OPMERKING: Putten die nep besmet zijn met virusvrije DMEM-inoculum moeten worden opgenomen als besturingselementen. - Na 1 uur virusadsorptie, spoel monolayer 2x met PBS en vervang medium met 0,5 mL per put van DMEM onvolledig medium. Vervang om 7,5 uur na de infectie het kweekmedium door DMEM door een lage achtergrondfluorescentie(Tabel van materialen). Bij 8 uur na infectie, gebruik maken van een live cel imager om cellen te onderzoeken op 20x vergroting voor groen, rood of blauw fluorescentie signaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het omgekeerde genetica protocol beschreven in dit artikel verloopt door middel van meerdere verschillende stappen: (1) co-transfection van BHK-T7 cellen met rotavirus pT7 transcriptie vectoren en een pCMV/NP868R expressie plasmide, (2) het toezicht op getransfecteerde BHK-T7-cellen met MA104-cellen, (3) versterking van recombinante virussen die aanwezig zijn in BHK-T7/MA104-cellen lysates met MA104-cellen en (4) plaqueisolatie van recombinantvirus met MA104-cellen (Figuur 2). In onze handen is het protocol efficiënt, waardoor titers van recombinant wildtype SA11 virus (rSA11/wt) in BHK-T7/MA104 cellysaten van ~104 PFU/mL en in versterkte MA104 cellysaten van >1 x 107 PFU/mL. SA11 recombinant virussen gegenereerd door omgekeerde genetica met behulp van gemodificeerde pT7/NSP3SA11 plasmiden uitdrukken FPs (bijvoorbeeld, rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG) groeien tot titers die ~4-voudig minder dan rSA11/wt.
Volgens het omgekeerde geneticaprotocol genereerden we recombinante SA11-virussen die gemakkelijk te herkennen waren door plaquetest op MA104-cellen, waardoor plaqueisolatie(figuur 3D)mogelijk werd. Virussen in plaques werden geplukt met een lange-tip wegwerp overdracht pipet en versterkt op MA104 cellen. De dsRNA-genomen van plaquegezuiverde rSA11/wt en rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-virussen werden geëxtraheerd met guanidiniumthiocyanaat, opgelost door elektroforese op een 10% polyacrylamidegel en gedetecteerd door vlekken met ethidiumbromide (figuur 3A). Zoals verwacht migreerde het segment 7 (NSP3) dsRNA van rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG veel langzamer dan dat van rSA11/wt (figuur 3A)als gevolg van de aanwezigheid van 2A-3xFL-UnaG-sequenties. Het segment 7 (NSP3) dsRNA van rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG werd gelgezuiverd, omgezet in cDNA-vorm door RT-PCR en gesequenced om de nauwkeurigheid te bevestigen.
Om te controleren op expressie van het Fluorescerende Eiwit van UnaG werden MA104-cellen in 6-well plates geïnfecteerd met 3 PFU per cel van rSA11/wt en rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. Bij 8 uur na infectie werden het kweekmedium in platen vervangen door 0,5 mL DMEM met een lage achtergrondfluorescentie per put en de platen die gedurende 30 min bij 37 °C in een CO2-incubator werden geïncubeerd. Daarna werden platen onderzocht op UnaG-expressie met behulp van een live celimager. Uit de analyse bleek dat rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG groene fluorescentie produceerde, waarbij de functionaliteit van het UnaG-gen in het recombinantvirus (figuur 3B) werd gecontroleerd. Daarentegen werd groene fluorescentie niet gedetecteerd in cellen die besmet zijn met rSA11/wt. Om aan te pakken of het 2A-element in het gewijzigde segment 7 van rSA11/NSP3-2AxFL-UnaG de expressie van twee afzonderlijke eiwitten (NSP3-2A en 3xFL-UnaG) bevorderde, werden MA104-cellen besmet met rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG en rSA11/wt. Cellysaten werden bereid uit cellen geoogst op 8 uur na infectie, opgelost door gel elektroforese, en uitgewist op nitrocellulose filters. De vlekken werden onderzocht met antilichamen die specifiek zijn voor rotavirus VP6 en NSP3, en FLAG-tag. Uit de analyse bleek dat NSP3-2A en 3xFL-UnaG werden uitgedrukt als afzonderlijke eiwitten in cellen die besmet waren met rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG, wat aangeeft dat het 2A-element functioneel was (figuur 3C). Cellen die besmet zijn met rSA11/wt drukten geen eiwit uit dat door anti-VLAG-antilichaam werd herkend. Het NSP3-eiwit dat aanwezig is in rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG-geïnfecteerde cellen door anti-NSP3-antilichamen migreerde iets langzamer dan NSP3 in rSA11/wt-geïnfecteerde cellen als gevolg van de aanwezigheid van reststoffen 2A-residuen in het C-eindpunt van NSP3.
Figuur 1: Rotavirus omgekeerde genetica plasmiden. (A) Full-length cDNO's van de 11 SA11 rotavirus genoom segmenten zijn gepositioneerd in pT7 plasmiden, ligated stroomopwaarts met een promotor voor T7 RNA polymerase en downstream met een HDV ribozyme. In aanwezigheid van T7 RNA polymerase produceren de rotavirus pT7 plasmiden sa11 (+)RNAs over de hele lengte met authentieke 5' en 3' termini. bB) Schema's van de (+)RNA- en eiwitproducten gemaakt door de pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG plasmide. Het schema omvat de NSP3 cDNA-sequentie en sequenties voor het varkensteschovirus 2A-achtige (2A) element, de 3x FLAG (FL) tag en het groene fluorescerende eiwit UnaG. De positie van de 2A translationele stop-restart site wordt aangegeven met een rode pijl. Door de activiteit van het 2A-element produceert de vertaling van het RNA twee eiwitten. Het NSP3-gedeelte bevat restanten van het 2A-element en het UnaG-gedeelte is gesmolten tot een tag van 3x FLAG. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Rotavirus omgekeerde genetica systeem. BHK-T7 monolagen worden getransfecteerd met 11 pT7 plasmiden, die elk een ander SA11 (+)RNA uitdrukken, en een pCMV-vector die het Afrikaanse varkenspestvirus (ASFV) NP868R capping enzym (pCMV/NP868R) uitdrukt. Na 3 dagen na infectie (d.p.i.) worden de BHK-T7-cellen overgezaaid met MA104-cellen. Na 7 dagen na infectie worden recombinante rotavirussen in BHK-T7/MA104 cellysaten versterkt door passage op MA104-cellen, vervolgens geïsoleerd door plaquezuivering. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Kenmerken van de recombinante stammen rSA11/wt en rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG. (A) Elektroforetische profielen van de dsRNA genoomsegmenten van plaque-geïsoleerde rSA11 stammen. De 11 genoomsegmenten zijn genummerd en de verschuiving in de positie van segment 7 (NSP3) wordt aangegeven met een rode lijn. (B) Fluorescentie gedetecteerd in rSA11-geïnfecteerde MA104 cellen op 8 uur na infectie met behulp van een live cel imager (20x vergroting) ingesteld op het groene detectiekanaal. Schaalbalk = 100 μm. (C) Immunoblot-analyse van eiwitten die aanwezig zijn bij 8 uur na infectie in MA104-cellen die zijn geïnfecteerd met rSA11-stammen met behulp van cavia anti-VP6 en anti-NSP3 antisera en muisanti-FLAG monoklonale antilichaam. (D) Plaques geproduceerd door rSA11/wt op MA104 cellen op 3 dagen na infectie en gedetecteerd door neutrale rode vlekken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In ons laboratorium vertrouwen we routinematig op het omgekeerde geneticaprotocol dat hierin wordt beschreven om recombinante SA11-rotavirussen te produceren. Met deze aanpak, individuen met weinig ervaring in moleculaire biologie technieken of het werken met rotavirussen herstellen recombinant virussen, zelfs op hun eerste poging. We hebben bijna 100 recombinante virussen gegenereerd volgens dit protocol, inclusief die met genomen die zijn opnieuw ontworpen om vreemde eiwitten (bijvoorbeeld FP's) uit te drukken en die sequentietoevoegingen, deleties en puntmutaties bevatten.
De voorwaarden en incubatietijden in dit protocol zijn van toepassing op het herstel van goed groeiende stammen van recombinante virussen. Aanpassingen moeten worden overwogen als een poging om SA11 virussen die, als gevolg van genetische modificatie, kan worden verwacht dat slecht groeien herstellen. In het bijzonder, omdat de titer van dergelijke virussen in getransfecteerde BHK-T7/MA014 cellysaten laag kan zijn, verdubbelen we meestal de hoeveelheid lysaat die als intmateriaal wordt gebruikt in latere versterkingsstappen. Bovendien kunnen slecht groeiende virussen bij de versterkingsstap langere incubatietijden vereisen voordat ze voldoende CPE-niveaus bereiken voor celoogst. Inderdaad, met dergelijke virussen, kunnen we toestaan dat infecties te gaan voor 10−14 dagen, of zelfs langer, voor het oogsten van cellen. Ten slotte, slecht groeiende virussen zijn waarschijnlijk kleine, langzaam groeiende plaques op MA104 cellen te genereren. Om deze virussen te isoleren, kan het dus nodig zijn om plaques te ontwikkelen tot 6−10 dagen na infectie voordat ze cellen met neutraal rood bevlekken en plaques plukken.
In onze ervaring, de belangrijkste factor in het betrouwbare herstel van de recombinant rotavirus is het gebruik van gezonde, goed onderhouden BHK-T7 cellen. In ons laboratorium, we routinematig passage BHK-T7 cellen 2x per week op dezelfde verdunning met behulp van medium aangevuld niet alleen met 10% FBS, maar ook met NEAA, TPB, en hoge niveaus van glucose (GMEM complete medium). De extra supplementen helpen BHK-T7 cellen behouden uitgebreide levensvatbaarheid na plasmid transfection, een factor waarschijnlijk cruciaal voor het herstellen van slecht groeiende mutant recombinant virussen. We vullen het medium elke andere passage aan met G418, een antibioticum dat selecteert voor het onderhoud van de T7 polymerase expressie plasmide. Passage voorwaarden moeten zodanig zijn dat BHK-T7 cellen zijn nooit toegestaan om te groeien verleden samenvloeiing, voorwaarden die snel leiden tot verminderde levensvatbaarheid van de cel. Voor ons presteren BHK-T7-cellen die zijn toegestaan om te overgroeien slecht in het omgekeerde geneticaprotocol, zelfs als de cellen vervolgens meerdere keren op de juiste manier worden doorgelicht. In plaats van te proberen overwoekerde BHK-T7 cellen te rehabiliteren, herstarten we de afstamming met cellen die eerder in vloeibare stikstof waren opgeslagen.
Mycoplasma besmetting van BHK-T7 en MA104 cellen kan een belangrijke factor in het falen van het rotavirus omgekeerde genetica systeem om recombinant virus te genereren. In ons laboratorium gebruiken we een PCR-gebaseerde mycoplasmadetectiekit(Table of Materials)om te controleren op verontreiniging van cellijnen, en wanneer gedetecteerd, wordt het meestal geassocieerd met onze BHK-T7-cellen. We hebben niet geprobeerd om cellijnen van contaminatie mycoplasma te genezen, in plaats daarvan het herstellen van de lijnen met eerdere mycoplasma-vrije passages opgeslagen in vloeibare stikstof. Voorafgaand aan het starten van nieuwe cellijnen, we ontdoen van alle eerder gebruikte medium en medium supplementen en grondig ontsmetten incubators, biologische veiligheidskasten, waterbaden, lab banken, en pipettors. We gebruiken ook mycoplasma detectie kits om voorraden van recombinante virussen te controleren op besmetting. Vanwege de weerstand van de rotavirusdeeltjes tegen denaturatie door organische oplosmiddelen, zoals Vertrel VF32,is het mogelijk om virusvoorraden te bevrijden van het besmetten van mycoplasma, waardoor de noodzaak om recombinante virussen te regenereren door omgekeerde genetica wordt ontkend. Het is belangrijk te benadrukken dat celleidingen en viruspreparaten die in het laboratorium worden ontvangen, moeten worden gecontroleerd op mycoplasmaverontreiniging voordat ze routinematig worden gebruikt.
Hoewel dag-in-dag-en-dag-uit, gebruiken we hetzelfde protocol om recombinante virussen te genereren, we weten dat bepaalde wijzigingen kunnen worden aangebracht die niet voorkomen dat virus herstel. Bijvoorbeeld, (i) co-transfection van de pCMV/NSP868R capping-enzym plasmide met SA11 pT7 vectoren is niet nodig voor herstel van recombinant virussen. Terwijl de toevoeging van de aftopping plasmid levert hogere virus titers in transfected BHK-T7/MA104 cel lysaten, hebben we in staat geweest om tal van virussen te herstellen, waaronder die uitdrukken FPs, zonder. We hebben echter geconcludeerd dat de expressie van het aftoppingsenzym door pCMV/NP868R aanzienlijk kan bijdragen aan het herstel van minder geschikte virussen. (ii) We hebben vastgesteld dat recombinante virussen kunnen worden gegenereerd, zelfs als de hoeveelheid van de transfection reagens (Tabel van materialen) gebruikt in de omgekeerde genetica protocol wordt verminderd met de helft, een wijziging die aanzienlijk kan kosten te verminderen. (iii) Op dezelfde manier hebben wij vastgesteld dat M199 complete medium kan worden gebruikt in plaats van DMEM complete medium. iv) Ten slotte is er geen vaste eis met betrekking tot het type vectorbackbone dat moet worden gebruikt bij de productie van SA11 T7-transcriptievectoren. Zolang de virale cDNA in de plasmid wordt omringd door een upstream T7 promotor en een downstream HDV ribozyme en T7 terminator, kan de plasmid worden verwacht dat het herstel van recombinant virus te ondersteunen. Met name pGEM-, pBluescript en pUC-gebaseerde vectoren zijn met succes gebruikt in het omgekeerde geneticasysteem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidies R03 AI131072 en R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, en de Lawrence M. Blatt Endowment. Wij danken de leden van het IU Rotahoosier laboratorium, Ulrich Desselberger, en Guido Papa voor hun vele bijdragen en suggesties in de ontwikkeling van de omgekeerde genetica protocol.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
References
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: https://talk.ictvonline.org/taxonomy (2019).
- Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age. Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).
- Troeger, C., et al. Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years. JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).
- Matthijnssens, J., Van Ranst, M. Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans. Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).
- McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes. Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).
- Patton, J. T. Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world. Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).
- Kanai, Y., et al. Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).
- Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication. Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).
- Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome. Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).
- Komoto, S., et al. Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system. Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).
- Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).
- Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo. Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).
- Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation. Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).
- Kawagishi, T., et al. Reverse genetics system for a human group A rotavirus. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome. Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).
- Mohanty, S. K., et al. A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model. Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).
- Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics. Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).
- Duarte, M., et al. Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1. Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).
- Philip, A. A., et al. Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system. Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).
- Papa, G., et al. Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories. Journal of Virology. , (2019).
- Komoto, S., et al. Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).
- Philip, A. A., et al. Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins. Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).
- Kanai, Y., et al. Development of stable rotavirus reporter expression systems. Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).
- Donnelly, M. L., et al. The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences. Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).
- Kumagai, A., et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle. Cell. 153, 1602-1611 (2013).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).
- Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. Culturing, storage, and quantification of rotaviruses. Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).
- Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins. Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).
