Summary
プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。
Abstract
ロタウイルスは、ヒトを含む多くの哺乳類および鳥類宿主種の若者に重度の胃腸炎を引き起こすセグメント化された二本鎖RNAウイルスの大規模で進化する集団である。近年のロタウイルス逆遺伝学システムの登場により、指向性変異誘発を用いてロタウイルス生物学を探索し、既存のロタウイルスワクチンを修飾・最適化し、ロタウイルス多標的ワクチンベクターを開発することが可能になりました。本報告では、組換えロタウイルスの効率的かつ確実な回復を可能にする、簡素な逆遺伝学システムについて述べる。このシステムは、フルレングスロタウイルス(+)RNAを発現するT7転写ベクターと、T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を構成的に産生するBHK細胞にRNAキャッピング酵素をコードするCMVベクターの共同トランスフェクションに基づいている。組換えロタウイルスは、トランスフェクトされたBHK-T7細胞をMA104細胞(ウイルス増殖に対して非常に寛容であるサル腎臓細胞株)で過剰播種することによって増幅される。本報告では、ゲノムセグメント7(NSP3)への2A翻訳ストップリスタート素子の導入を通じて、別の蛍光レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成するアプローチについても述べる。このアプローチは、ウイルスのオープンリーディングフレームのいずれかを削除または変更することを避け、蛍光タンパク質を発現させながら完全に機能するウイルスタンパク質を保持する組換えロタウイルスの産生を可能にする。
Introduction
ロタウイルスは、乳幼児の重度の胃腸炎の主な原因であり、他の多くの哺乳類および鳥類の若者1.レオビリダ科の一員として、ロタウイルスはセグメント化された二本鎖RNA(dsRNA)ゲノムを有する。ゲノムセグメントは、タンパク質2の3つの同心層から形成された非エンベロープ二面体のビリオン内に含まれている。ゲノムセグメントのシーケンシングと系統解析に基づいて、9種のロタウイルス(A-D、F-J)が定義されている。ロタウイルス種Aを含む株は、ヒト疾患4の大多数を担っている。過去10年間に始まった小児予防接種プログラムへのロタウイルスワクチンの導入は、ロタウイルスの死亡率および罹患率の有意な減少と相関している。最も顕著なのは、ロタウイルス関連の小児死亡率は、2000年の約528,000人から2016年には128,500人に減少した。,5ロタウイルスワクチンは、生きたウイルスの弱化株から処方され、生後6ヶ月までに小児に2〜3回投与される。ヒトおよび他の哺乳類種で循環する多数の遺伝的に多様なロタウイルス株は、突然変異および再分類を通じて急速に進化する能力と相まって、小児66、7、87,8に感染するロタウイルスの種類の抗原性変化を招く可能性がある。このような変化は、既存のワクチンの有効性を損ない、その交換または改変を必要とする可能性がある。
11個のロタウイルスゲノムセグメントの操作を可能にする完全プラスミドベースの逆遺伝学系の開発は、最近になってようやく達成された。これらのシステムの利用により、ロタウイルス複製および病因の分子詳細を解明し、抗ロタウイルス化合物の高スループットスクリーニング方法を開発し、ロタウイルスワクチンの新しい潜在的に効果的なクラスを作成することが可能になりました。ロタウイルス複製の間、制限されたウイルス(+)RNAは、ウイルスタンパク質の合成を導くだけでなく、子孫のdsRNAゲノムセグメント10、11,11の合成のためのテンプレートとしても役立つ。これまでに記載されたすべてのロタウイルス逆遺伝学系は、組換えウイルス9、12、13,の回収に使用されるcDNA由来(+)RNAの供給源として、T7転写ベクターを哺乳動物細胞株に9,トランスフェクションすることに依存している。13転写ベクター内では、フルレングスのウイルスcRNAは、ウイルス(+)RNAが本物の5'および3'末語を含むT7 RNAポリメラーゼによって合成されるような上流T7プロモーターと下流型肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムの間に位置付けられている(図1A)。第1世代逆遺伝学系では、T7RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を11T7(pT7)転写ベクターで発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞をトランスフェクトすることにより組換えウイルスが作られた、 各各々は、シミアンSA11ウイルス株のユニークな(+)RNAの合成、及び3つのCMVプロモーター駆動発現プラスミド、1つはワクシニアウイルスD1R-D12Lキャッピング酵素複合体9のアビアンレオウイルスp10FAST融合タンパク質および2つのコード化サブユニットをコードする。トランスフェクトされたBHK-T7細胞で生成された組換えSA11ウイルスは、MA104細胞とのオーバーシードにより増幅され、ロタウイルス増殖に対する細胞株透過性である。第1世代リバース遺伝学系の改変版は、もはや支持プラスミド12を使用していないと述べてきた。代わりに、改変系は、11個のSA11 T7転写ベクターを用いてBHK-T7細胞をトランスフェクトするだけで組み換えロタウイルスを生成することに成功し、ウイルス工場(viroplasm)ビルディングブロック(非構造タンパク質NSP2およびNSP5)のベクターが他のベクターよりも3倍高いレベルで追加されるという14,警告がある。逆遺伝学システムの改変バージョンは、ロタウイルス16、17,17のヒトKUおよびオデリア株の回復をサポートするも開発されている。ロタウイルスゲノムは、逆遺伝学による操作に非常に適しており、VP418、NSP19、NSP219、NSP3,20、21、およびNSP520,2122、23に導入された変異を伴ってこれまでに生成された組換えウイルスを有する。23これまでに生成された最も有用なウイルスの中には、蛍光レポータータンパク質(F)9、12、21、24、2512,21,24,25を発現するように設計されたものがある。9
本稿では、我々の研究室で使用する逆遺伝学システムのプロトコルを提供し、SA11ロタウイルスの組換え株を生成する。我々のプロトコルの主な特徴は、BHK-T7細胞を11 pT7転写ベクター(pT7/NSP2SA11およびpT7/NSP5SA11ベクターの3倍のレベルを含むように改変した)およびアフリカの豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素をコードするCMV発現ベクターである21(我々の手では、NP868Rプラスミドの存在は、トランスフェクトされたBHK-T7細胞による組換えウイルスのより高い強化剤の産生をもたらす。本稿では、セグメント7タンパク質産物NSP3だけでなく、別のFPを発現する組換えウイルスを生成できるよう、pT7/NSP3SA11プラスミドを改変するためのプロトコルも提供する。これは、pT7/NSP3SA11プラスミドのNSP3オープンリーディングフレーム(ORF)を再設計し、下流の2Aトランスレーショナルストップリスタート要素を含み、続いてFP ORF(図1B)24、26を含むことによって達成される。24このアプローチを通じて、UnaG(緑)、mKate(ファーレッド)、mRuby(赤)、タグBFP(青)、CFP(シアン)、YFP(黄色)24、27、28,27など、さまざまなFPを発現する組み換えロタウイルスを28生成しました。これらのFP発現ロタウイルスは、NSP3 ORFを削除することなく作られ、機能するウイルスタンパク質の完全な補完をコードすると予想されるウイルスを生み出す。
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Protocol
1. 培地調製および細胞培養のメンテナンス
- T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)およびアフリカの緑色のサル腎臓MA104細胞を構成的に発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞を得る。
注:BHK-T7(またはBSR-T7)細胞は市販されていませんが、RNAウイルス生物学を研究するために逆遺伝学を使用する実験室の一般的な細胞株です。このプロトコルで使用されるBHK-T7細胞株は、T7 RNAポリメラーゼ29を発現する元のBHK細胞株の共同開発者であるウルスラ・J・ブッフホルツ博士(国立衛生研究所、ベセスダ、米国)から得られた。MA104細胞は、欧州認証細胞培養物(ECACC)およびアメリカンタイプ培養コレクション(ATCC)から入手可能です。 - 滅菌環境で以下の培養培地を調製し、好ましくはクラスII生物学的安全キャビネットである。4°Cの暗闇の中でメディアを保管し、使用する直前に37°Cに温めます。
注: メディア コンポーネントのソースは、次の表の「資料表」に記載されています。- DMEM不完全培地を調製するには、4.5 g/Lグルコースを含むダルベッコの修正イーグルの最小必須培地(MEM)の500 mLと100xペンストレップの5 mLと1%グルタミンを組み合わせます。
- DMEM完全培地を調製するには、500 mLのDMEM不完全培地と25 mLの胎児ウシ血清(FBS)を組み合わせます。
- GMEM不完全培地を調製するには、グラスゴー最小必須培地500mL、100xグルタミン5mL、トリプトーゼ-リン酸ブロス(TPB)50mL、100x非必須アミノ酸5mL(NEAA)、100xペンストレップの5mLを組み合わせます。
- GMEM完全培地を調製するには、500 mLのGMEM不完全培地と25 mLの熱不活化FBSを組み合わせます。
- GMEM+G完全培地を調製するには、50 mg/mLジェネティックシン(G418)の10 mLをGMEM完全培地の500 mLに加えます。
- SMEM不完全培地を調製するには、ジョクリクの修正イーグルMEMの500mL、100xグルタミンの5mL、TPBの50 mL、100x NEAAの5 mL、100xペンストレップの5 mLを組み合わせます。
- 培養MA104細胞は、それぞれ12または25mLのDMEM完全培地を含有するT75またはT175フラスコ内で培養した。100%合流に達したMA104細胞を通過するには、細胞単層2xをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でリンスし、トリプシン(0.05%)-EDTA(0.1%)と解化する。溶液中に再懸濁し、DMEM不完全培地の5(T75フラスコ)または10mL(T175フラスコ)中に再懸濁する。
- 0.5~1.0 mLの再懸濁セルをフレッシュフラスコに入れ、DMEM完全培地を添加して適切な最終体積にします。フラスコを37°C、5%CO2イン2キュベーターに入れる。
- BhK-T7細胞をT75フラスコに伝搬し、通過の各ラウンドでGMEMとGMEM+G完全培地の使用を交互に行う。100%合流に達したBHK-T7細胞をサブカルチャーするには、細胞単層2xをPBSでリンスし、トリプシン-EDTA溶液と解化し、培地5mLで再懸濁する。
- GEMまたはGMEM+G完全培地を15mL新鮮なT75フラスコに入れた後、4滴の再懸濁したBHK-T7細胞を加えます。フラスコを37°C、5%CO2イン2キュベーターに入れる。
2. プラスミド製剤
- アプジーンからロタウイルスSA11(+)RNAを発現するプラスミドを以下から入手します: pT7/VP1SA11, pT7/VP2SA11, pT7/VP3SA11,pT7/VP4SA11,pT7/VP6SA11,pT7/VP7SA11,pT7/NSP1SA11,pT7/NSP2SA11,pT7/NSP3SA11,pT7/NSP3SA11,pT7/NSP4SA11,pT111,pT111,pT111,pT111,pT7/NSP4SA11,pT1Sp11,pT7/NSP3SA11,pT111,pT111,pT111,pT11Sp11,pT7/NSP4SA11,pT111、pT7/NSP3SA11、pT7/NSP3SA11、pT7/NSP4SA11、pT7/NSP11Sp111著者21からASFVキャッピング酵素(pCMV/NP868R)を発現するプラスミドを入手する。
注:修正されたpT7/NSP3SA11プラスミドは、2Aトランスレーショナルエレメント(pT7/NSP3-2A-3xFL-FP)の活性を通じてFPを発現するように設計された、著者24,26,26からも入手できる。pT7/NSP3-2A-3xFL-FP プラスミドは、以下の FP を表現する利用可能です: UnaG (緑), mkate (ファーレッド), mRuby (赤), タグBFP (青), CFP (シアン), YFP (黄色)24. - プラスミドを有能なEに変換する.大腸菌DH5αと適切な抗生物質を含むルリアブロス寒天プレートに細菌を広げます。個々のコロニーから選んだ細菌培養物を栽培し、メーカーの指示に従ってスピンミニプレップ精製キット(材料表)を使用して、より少量のプラスミド(20 μg)を調製します。ミディおよびマキシ精製キットを使用して細菌培養からプラスミドの大量を準備する (材料の表).
注:逆遺伝学システムでの使用に適したプラスミドは、他のプラスミド精製キットと共に調製されています。特に、内毒素を含まない材料を生成するように設計されたキットを使用してプラスミドを調製する必要はありません。 - ヌクレアーゼを含まない分子生物学グレードの水中の精製プラスミド濃度を1mg/mLに調整します。分光光度計を用いて、260/280吸光度比~1.8を確認してプラスミド純度を確認します。また、0.8%のアガロースゲルで電気泳動を使用して、プラスミドが主にスーパーコイル化されていることを確認します。
- アリコート精製プラスミドを0.5 mLの無菌マイクロ遠心チューブに、それぞれ10 μLを含み、プラスミドを-80°Cに保存します。
3. 組換えウイルスの生成
注:組換えロタウイルス株の生成と特性を含むヒトおよび動物のロタウイルス研究は、バイオセーフティレベル2(BSL-2)条件下で処理する必要があり、機関バイオセーフティ委員会(IBC)の事前承認が必要です。適切なBSL-2検査条件は、疾病管理予防センター(CDC)30によって製造された微生物学および生物医学研究所(BMBL)におけるバイオセーフティに記載されている。
- 1日目:BHK-T7細胞を12ウェルプレートに播種
- T75フラスコ2xに含まれるBHK-T7細胞の新しいコンフルエント単層をPBSでリンスする。トリプシン-EDTA溶液で細胞単層を破壊し、GMEM完全培地の5 mLで細胞を再懸濁する。
- 自動セルカウンターとトリパンブルー溶液を使用して、培地中の生存可能なBHK-T7細胞の濃度を決定します。細胞を12ウェル細胞培養プレートに播種し、各ウェルに2 x105細胞を全量1 mLのGMEM(G418フリー)完全培地で含有する。37°C、5%CO2インキュベーター2でインキュベート。細胞は2日目までに80~90%の合流度に達するはずです。
- 2日目:プラスミド混合物を用いたBHK-T7細胞のトランスフェクション
- プラスミド混合物を調製するには、1mg/mLに調整されたプラスミドストックを使用して0.5 mLマイクロ遠心分離チューブに以下を組み合わせる:0.8 μLそれぞれSA11 pT7プラスミドVP1、 VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP3およびNSP4、2.4 μL SA11 pT7プラスミドNSP2およびNSP5、および0.8 μL pCMV/NP868R。チューブをタップしてプラスミドを軽く混ぜ、パルス遠心で内容物を収集します。FPを発現する組換えウイルスを調製するには、pT7/NSP3SA11を適切なpT7/NSP3-2A-3xFL-FPプラスミドに置き換えてください。
注:プラスミド混合物は、使用されるまで氷の上に保存する必要があります。トランスフェクションごとに別々のチューブを用意する必要があります。 - プラスミド/還元血清培地/トランスフェクション試薬混合物を調製するには:各プラスミド混合物に110μLの予熱(37°C)減らされた血清培地(材料表)を加え、上下に軽くピペットで混合します。その後、各プラスミド/還元血清培地混合物に32μLのトランスフェクション試薬(材料表)を加えます。これは混合物のプラスミドのμgあたりのトランスフェクション試薬の2.5 μLの濃度を得る。渦混合物を穏やかに、室温で20分間インキュベートする。
- 20分インキュベーション期間中、12ウェルプレート(1日目に調製)でBHK-T7細胞を2mLのGMEM不完全培地で1回リンスします。その後、各ウェルに1mLのSMEM不完全培地を加え、プレートをインキュベーターに戻します。
- 20分インキュベーション期間の後、プラスミド/還元血清培地/トランスフェクション混合物を200 μLピペットを使用して12ウェルプレートの各ウェルに滴下します。プレートを軽く揺らし、37°C、5%CO2インキュベーターに戻します。2
- プラスミド混合物を調製するには、1mg/mLに調整されたプラスミドストックを使用して0.5 mLマイクロ遠心分離チューブに以下を組み合わせる:0.8 μLそれぞれSA11 pT7プラスミドVP1、 VP2、VP3、VP4、VP6、VP7、NSP1、NSP3およびNSP4、2.4 μL SA11 pT7プラスミドNSP2およびNSP5、および0.8 μL pCMV/NP868R。チューブをタップしてプラスミドを軽く混ぜ、パルス遠心で内容物を収集します。FPを発現する組換えウイルスを調製するには、pT7/NSP3SA11を適切なpT7/NSP3-2A-3xFL-FPプラスミドに置き換えてください。
- 4日目:MA104細胞を使用したトランスフェクトされたBHK-T7細胞の過剰播種
- T75フラスコ2xに含まれるMA104細胞の新しいコンフルエント単層をPBSでリンスする。トリプシン-EDTA溶液を用いて単層を破壊し、5 mLのDMEM完全培地中の細胞を再懸濁する。
- 自動化された細胞カウンターとトリパンブルー溶液を使用して、培地中の生き残ったMA104細胞の濃度を決定する。DMEM不完全培地中の8 x 105 MA104細胞/mLに濃度を調整し、トランスフェクトされたBHK-T7細胞を含むウェルに0.25mLの浮遊細胞(2 x 105細胞)を滴下する。
- 各ウェルに0.8 μLの1 mg/mLストックを加えて、培地中のトリプシン(豚膵臓型IX)の濃度を~0.5 μg/mLに調整します。
注:トリプシン株は、PBSで調製し、アリクォートし、-20°Cで保存する必要があります。 - 残りの MA104 細胞を使用して、組換えウイルスを増幅するために 7 日目に必要となる 6 ウェル プレートを準備します。6ウェルプレートをシードするには、再懸濁したMA104細胞をDMEM完全培地中の1.5 x 105細胞/mLの濃度に希釈し、各ウェルに2mLを入れる。プレートを37°C、5%CO2イン2キュベーターに入れる。
- 7日目:トランスフェクト細胞からの組換えウイルスの回復と増幅
- 被験者BHK-T7/MA104細胞を12ウェルプレートで、滅菌条件下で3サイクルの凍結融解し、プレートを-20°C冷凍庫と室温表面の間で移動させた。1.5 mLチューブにリセートを移管した後、遠心管は500 x g(4°C)で10分間、大きな細胞の破片をペレットにした。 g上清を収集し、4 °C(短期)または-20 °C(長期)で保管してください。
- 6ウェルプレート(4日目に用意)2倍の2倍の6ウェルプレートでMA104モノレイヤーをPBSで洗浄します。0.5 μg/mL トリプシンを含む各ウェルに、2 mLのDMEM不完全培地を配置します。BHK-T7/MA104細胞のライセートから回収した300μLの上清をウェルに加え、プレートを37°C、5%CO22インキュベーターに入れる。
- 7日間、または完全な細胞パシー効果(CPE)が観察されるまでインキュベートプレート。凍結融解の3サイクルによって6ウェルプレート内のLYSE MA104細胞、その後、1.5 mLマイクロ遠心チューブにライセートを移管します。ペレット大細胞デブリスは500xg(4°C)で10分間遠g心分離してペレット状。透明化した細胞ライセートを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移し、-20°Cで保管します。
4. 組換えウイルスのプラーク分離
- 10μg/mLの最終濃度にトリプシンを加え、37°Cで1時間インキュベートすることで、100μLの清浄化細胞溶解物でウイルスを活性化し、DMEMの不完全培地で10-1から10-7(それぞれ1mL)の範囲の10倍の連続希釈シリーズを準備します。
- 6ウェルプレート2xでMA104モノレイヤーを2mLのPBSで、DMEM不完全培地で1回リンスします。プレートに400mLの溶液希釈液を加えます。プレートを37°C、5%CO2インキュベーターで1時間2インキュベートし、10〜15分ごとに揺れ、単層全体に希釈液を再分配します。
- 2xイーグルの最小限の必須培地(EMEM;37°Cにプリウォーム)と電子レンジを使用して水中で溶かし、45°Cに予冷した1.5%のアガロースを組み合わせることで、アガロース-MEMオーバーレイソリューションを準備します。水浴を使用して42°Cでオーバーレイ溶液を維持し、細胞に置く直前に0.5 μg/mLのトリプシンの最終濃度に調整します。
- 6ウェルプレートから溶菌希釈液を引き出し、不完全なDMEMの2 mLで細胞を一度リンスします。アガロース-MEMオーバーレイ溶液の3mLを各ウェルに含まれるセル単層にそっと重ねます。アガロースオーバーレイを室温で硬化させ、プレートをインキュベーターに戻します。
- 3日後、ステップ4.3のようにアガロース-MEMオーバーレイ溶液を調製し、42°Cに持ち込みます。使用直前に、オーバーレイ溶液を50μg/mLニュートラルレッド(材料表)の最終濃度に調整します。
- 6ウェルプレートの既存のアガロース層の上に2mLのオーバーレイ溶液を追加します。新しいアガロース層を硬化させてから、プレートをインキュベーターに戻します。ニュートラルレッドを含む溶液とプレートを光への露出から保護します。
- 次の6時間にわたって、ライトボックスの助けを借りて6ウェルプレートのロタウイルスプラークを識別します。使い捨て可能な移動ピペットを使用して明確に定義されたプラークを選び、細胞層に完全に伸びるアガロースプラグを回収する。
- 0.5 mLのDMEM不完全培地を含む1.5mLチューブに差し込み、30秒の試料をボルテックスし、6ウェルプレートまたはDMEM不完全培地および0.5 μg/mLトリプシンを含むMA104単層に伝播して培地に溶出したプラーク分離ウイルスを増幅します。
注:プラークアッセイによるロタウイルスの分離と引き起きに関する追加情報は、Arnold et al.31.
5. ウイルス性dsRNAのゲル電気泳動
- 600 μLの透明化された感染細胞ライセートと400 μLのグアニジニウムチオシアネートを1.5 mLマイクロ遠心分離管に配置し、30秒の渦を室温で5分間インキュベートし、200 μLのクロロホルム、30秒の渦液、3分間インキュベートを加える。13,000 x g (4 °C) で 5 分間遠心処理を行った後、上側水相の約 550 μL を新しいチューブに移します。
- 2つの容積(900 μL)の冷たいイソプロピルアルコールおよび反転管を4-6倍に加えることによって、水相からウイルス性dsRNAを回収します。室温で10分間インキュベートした後、遠心管を13,000xg(4°C)で10分間g用いた。上清を捨て、RNAペレットを保持します。
- 75%エタノール1mLをチューブに加えてペレットを洗浄し、1回反転し、遠心分離を7,500xg(4°C)で5g分間洗浄します。ピペットでエタノール洗浄を慎重に除去した後、ラボベンチで5〜10分間RNAペレットを空気乾燥させ、RNAペレットをヌクレアーゼを含まない分子生物学グレードの水を15μLに溶解し、-20°Cで貯蔵します。
- 溶解したRNAサンプル10 μLを2μLの6倍のDNAローディングバッファーと組み合わせ、プレキャスト10%ポリアクリルアミドミニゲル(またはハンドキャスト相当)に負荷をかけます。約1μg/mL臭化エチジウムを含む水中に5〜10分間のゲルを浸し、UVトランイルミニンタでロタウイルスゲノムセグメントを検出します。
6. ウイルス性dsRNAの回復とシーケンシング
- 低強度の長波長UV光を用いることが好ましいポリアクリルアミドゲル上のウイルスdsRNAバンドを見つけ、核酸架橋を発生させないようにする。新鮮なカミソリの刃を使用して、dsRNAバンドを含むゲル断片を切り取り、1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。
- 10-20 μLのRNaseフリー水を加えた後、1.5 mLマイクロ遠心分離管にフィットするように設計されたRNaseフリーの使い捨てペレットペスルで、または18G針を通して上下に引き出して各断片を粉砕します。砕いた断片を一晩4°Cでインキュベートする。
- 破砕されたゲルフラグメントを含むチューブから3μLの液体を回収します。ワンステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)キット(表)および適切なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ウイルスdsRNAのcRNAを生成する。
注: PCR 製品は PCR クリーンアップ キット (材料表) でゲル精製され、市販の DNA 配列サービスによって、プライマーと共に夜間シーケンシング用に送り出されます。
7. ウイルスタンパク質の免疫ブロット分析
- DMEM完全培地の2 mLの総容積でウェルあたり3 x 105 MA104細胞を含む6ウェルプレートをシード。プレートを37°C、5%CO2イン2キュベーターに入れ、細胞が合流するまで(3-5日)放置します。
注:コンフルエントモノレイヤーを持つウェルは、〜1.2 x 106細胞を含みます。 - 37°Cで10μg/mLトリプシンを1時間、1時間インキュベートして、その中に含まれる組換えロタウイルス粒子を活性化させて、清澄化した上清を治療します。
- 6ウェルプレート2xで2mLのPBSでMA104モノレイヤーをリンスします。各ウェルに、DMEM不完全培地中のトリプシン活性化ロタウイルスの細胞当たり3−5プラーク形成単位(PFU)を含む200μLの接種を加えることによって細胞に感染させる。プレートをインキュベーターに戻します。
- 10分ごとにプレートを取り除き、穏やかに揺れ、細胞単層全体に接種を再分配します。1時間後、インオキュラムを2 mLのDMEM不完全培地に交換してください。
- 感染後8時間で、PBSで6ウェルプレート2xで細胞をすすいだ。細胞を750 μLのPBSにスクレープし、体積を1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに移します。別の750 μLのPBSでプレートをリンスし、以前に収集した750 μLサンプルと組み合わせます。
- ペレット細胞は、4°Cで10分間5,000xgで遠心分離反応を行い、試料中に。 g上清を捨て、さらに処理するまで細胞ペレットを-80°Cに保存します。
- 300 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、pH 7.4、2% トリトン X-100、および 1x EDTA フリー完全プロテアーゼ阻害剤を含む細胞のリシスバッファーを調製します。凍結した細胞ペレットに300 μLのリシスバッファーを加えた後、短時間渦試料を加え、氷上で10分間インキュベートします。
- 氷の3倍の上で渦とインキュベートのサンプルのプロセスを繰り返します。その後、遠心分離機サンプルを4°Cで10g分間15,000xgで採取し、上清を集めて-80°Cで保管します。
- プレキャストリニア 8-16% ポリアクリルアミドミニゲルの電気泳動とニトロセルロース膜への転写により、20 μLの上清サンプルに含まれるタンパク質を解決します。PBS-Tween 20 (0.02%)5%の無脂肪乾燥乳を含む溶液。
- プローブ膜は、1つ以上の一次抗体(例えば、モルモット抗NSP3または抗VP6抗セラ、マウスモノクローナル抗旗M2抗体、またはウサギモノクローナル抗PCNA抗体)と共にインキュベートする。馬抗マウスIgG、抗モルモットIgG、またはヤギ抗ウサギIgGわさびペルオキシダーゼ共役二次抗体で膜をインキュベートすることにより、一次抗体を検出し、続いて化学発光(ECL)西洋ワサビ化学発光基質を増強した。ゲルイメージングシステム(表)またはX線フィルムを使用して発光信号を可視化します。
8. FP発現ウイルスに感染した細胞の生細胞イメージング
- シード 6 ウェルプレート 3 x 105 MA104 細胞 1 ウェルあたり合計 2 mL の DMEM 完全培地。プレートを37°C、5%CO2イン2キュベーターに入れ、細胞が合流するまで(3-5日)放置します。
注:コンフルエントモノレイヤーを持つウェルは、〜1.2 x 106細胞を含みます。 - 既知のチターのロタウイルスサンプルを、37°Cで1時間10μg/mLトリプシンでインキュベーションして1時間活性化する。
- 2 mLのPBSでMA104モノレイヤー2xで6ウェルプレートをすすいでください。DMEM不完全培地中のトリプシン活性化ロタウイルスの細胞当たり3-5 PFUを含む接種の各ウェル200μLに加えて細胞に感染する。プレートをインキュベーターに戻し、プレートを穏やかに揺らし、10分ごとに細胞単層全体に接種を再分配します。
注:ウイルスフリーDMEM接種に感染したモックであるウェルは、コントロールとして含まれるべきです。 - 1時間のウイルス吸着後、単層2xをPBSでリンスし、DMEMの不全培地のウェルあたり0.5mLで培地を交換する。感染後7.5時間で、低バックグラウンド蛍光を有するDMEMで培養培地を置き換える(材料表)。感染後8時間で、ライブセルイメージャーを使用して、20倍の倍率で細胞を調べ、緑色、赤、または青色の蛍光シグナルを調べます。
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Representative Results
本稿で説明する逆遺伝学プロトコルは、複数の異なるステップを経て進行します: (1) ロタウイルス pT7 転写ベクターと pCMV/NP868R 発現プラスミドを持つ BHK-T7 細胞の共同トランスフェクション, (2)MA104細胞を用いたトランスフェクトされたBHK-T7細胞の過剰播種、(3)MA104細胞を用いたリセートのBHK-T7/MA104細胞に存在する組換えウイルスの増幅、および(4)MA104細胞を用いた組換えウイルスのプラーク単離(図2)。私たちの手では、プロトコルは効率的であり、BHK-T7/MA104細胞ライセートの組換え野生型SA11ウイルス(rSA11/wt)の力素を生み出し、約104 PFU/mLの細胞ライセートを増幅し、>1 x 107 PFU/mLのMA104細胞ライセートを増幅します。FPを発現する修飾pT7/NSP3SA11プラスミド(例えば、rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG)を用いて逆遺伝学によって生成されたSA11組換えウイルスは、rSA11/wtより〜4倍少ない価に成長する。
逆遺伝学プロトコルに従って、MA104細胞上のプラークアッセイによって容易に同定された組換えSA11ウイルスを生成し、プラークの単離を可能にする(図3D)。プラーク中のウイルスは、長い先端使い捨て可能な伝達ピペットで摘み取られ、MA104細胞上で増幅された。プラーク精製rSA11/wtおよびrSA11/NSP3-3xFL-UnaGウイルスのdsRNAゲノムをグアニジニウム・チオシアネートで抽出し、10%ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によって分解し、エチドブロミドで染色して検出した(図3A)。予想通り、rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGのセグメント7(NSP3)dsRNAは、2A-3xFL-UnaG配列の存在により、rSA11/wt(図3A)よりもはるかに遅く移行しました。rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGのセグメント7(NSP3)dsRNAをゲル精製し、RT-PCRによりcDNA型に変換し、正確性を確認するために配列した。
UnaG蛍光タンパク質の発現を確認するために、6ウェルプレートのMA104細胞に、rSA11/wtおよびrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGの細胞当たり3PFUを感染させた。8時間のポスト感染時に、プレート中の培養培地を、低バックグラウンド蛍光1ウェルで0.5mLのDMEMに置き換え、プレートをCO2インキュベーターで37°Cでさらに30分間インキュベートした。その後、ライブセルイメージャーを用いてUnaG発現についてプレートを調べた。分析の結果、rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGが緑色蛍光を生成し、組換えウイルスにおけるUnaG遺伝子の機能性を検証した(図3B)。これに対し、rSA11/wtに感染した細胞では緑色蛍光は検出されなかった。rSA11/NSP3-2AxFL-UnaGの改変セグメント7内の2A要素が2つの別々のタンパク質(NSP3-2Aおよび3xFL-UnaG)の発現を促進したかどうかに対処するために、MA104細胞はrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGおよびrSA1/wtに感染した。 細胞ライセートは、感染後8時間で採取した細胞から調製し、ゲル電気泳動によって分解し、ニトロセルロースフィルターにブロットした。ブロットは、ロタウイルスVP6およびNSP3に特異的な抗体、およびFLAGタグでプローブした。分析の結果、NSP3-2Aおよび3xFL-UnaGは、rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGに感染した細胞内で別々のタンパク質として発現し、2A元素が機能していたことを示した(図3C)。rSA11/wtに感染した細胞は、抗FLAG抗体で認識されるタンパク質を発現しなかった。抗NSP3抗体によってrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG感染細胞に存在するNSP3タンパク質は、NSP3のC末語に残骸2A残基が存在するため、rSA11/wt-fected細胞に存在するNSP3よりもわずかに遅く移行した。
図1:ロタウイルス逆遺伝学プラスミド(A) 11個のSA11ロタウイルスゲノムセグメントの全長cDNAは、pT7プラスミド内に位置し、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターで上流に連結し、HDVリボザイムを有する下流に位置付けた。T7 RNAポリメラーゼの存在下で、ロタウイルスpT7プラスミドは、本物の5'および3'末端を有する全長SA11(+)RNAを産生する。(B) pT7/NSP3-2A-3xFL-UnaG プラスミドで作られた(+)RNAおよびタンパク質産物の概略図。この回路図は、NSP3 cDNA配列、およびブタテショウイルス2A様(2A)元素、3x FLAG(FL)タグ、および緑色蛍光タンパク質UnaGに対する配列とを含む。2Aのトランスレーショナルストップリスタートサイトの位置は赤い矢印で示されます。2A元素の活性により、RNAの翻訳は2つのタンパク質を産生する。NSP3部分は2A要素の残骸を含み、UnaG部分は3x FLAGタグに融合される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ロタウイルス逆遺伝学系BHK-T7単層は、11 pT7プラスミドをトランスフェクトし、それぞれ異なるSA11(+)RNAを発現し、アフリカ豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素(pCMV/NP868R)を発現するpCMVベクターとを発現する。感染後3日目(d.p.i.)で、BHK-T7細胞はMA104細胞でオーバーシードされる。感染後7日で、BHK-T7/MA104細胞ライセート中の組換えロタウイルスはMA104細胞の通過によって増幅され、次いでプラーク精製によって単離される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:組換え株rSA11/wtおよびrSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaGの特性。(A)プラーク単離型rSA11株のdsRNAゲノムセグメントの電気泳動プロファイル。11個のゲノムセグメントに番号が付き、セグメント7(NSP3)の位置のシフトが赤線で示されています。(B)緑色検出チャネルに設定された生細胞画像(20倍倍)を用いて感染後8時間でrSA11感染MA104細胞で検出された蛍光。スケールバー=100μm(C)モルモット抗VP6および抗NSP3抗抗セラおよびマウス抗FLAGモノクローナル抗体を用いてrSA11株に感染したMA104細胞における感染後8時間で存在するタンパク質の免疫ブロット分析。C(D) 感染後3日でMA104細胞上でrSA11/wtによって産生され、中性赤色染色によって検出されたプラーク。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
我々の研究室では、組換えSA11ロタウイルスを産生するために本明細書に記載されている逆遺伝学プロトコルに日常的に依存しています。このアプローチでは、分子生物学の技術やロタウイルスの研究経験がほとんどない人は、最初の試みでも組み換えウイルスを回復します。このプロトコルに従って、外来タンパク質(例えば、FP)を発現するように再設計され、配列の追加、欠失、点突然変異を含むゲノムを含む100近くの組換えウイルスを生成しました。
このプロトコルで与えられた条件およびインキュベーション時間は、組換えウイルスの十分に成長株の回復に適用されます。遺伝子組み換えのために、低成長が予想される可能性があるSA11ウイルスを回復しようとする場合は、調整を考慮する必要があります。特に、BHK-T7/MA014細胞ライセートにトランスフェクトされたウイルスの価率が低い場合があるため、その後の増幅工程で接種物として使用されるリセートの量は通常2倍となる。さらに、増幅段階では、不十分なウイルスは、細胞の収穫に十分なレベルのCPEに達する前に、より長い時間のインキュベーションを必要とするかもしれません。実際、このようなウイルスでは、細胞を採取する前に、感染が10〜14日間、またはさらに長く進行することを可能にする可能性があります。最後に、不十分に成長しているウイルスは、MA104細胞に小さな、ゆっくりと成長するプラークを生成する可能性が高い。したがって、プラークがこれらのウイルスを単離するためには、中性赤色で細胞を染色し、プラークを摘む前に、感染後6〜10日までプラークを発症させる必要がある。
我々の経験では、組換えロタウイルスの確実な回復の唯一の最も重要な要因は、健康で、よく維持されたBHK-T7細胞の使用である。当研究室では、10%FBSだけでなく、NEAA、TPB、高レベルのグルコース(GMEM完全培地)を補充した培地を用いて、週2回のBHK-T7細胞を同じ希釈液で日常的に通過しています。追加のサプリメントは、BHK-T7細胞がプラスミドトランスフェクション後の拡張生存率を保持するのに役立ちます, 不十分に成長している変異型組換えウイルスを回復するために重要な可能性が高い要因.T7ポリメラーゼ発現プラスミドの維持のために選択する抗生物質であるG418を用いて、他のすべての通路で培地を補います。通過条件は、BHK-T7細胞が過去の合流性、急速に細胞生存率の低下につながる条件を成長させてはならないようにすべきである。私たちにとって、過剰増殖を許されたBHK-T7細胞は、たとえその後に細胞が適切に複数回通過したとしても、逆遺伝学プロトコルでは不十分なパフォーマンスを発揮します。生い茂ったBHK-T7細胞をリハビリしようとする代わりに、以前に液体窒素に貯蔵された細胞で系統を再開します。
BHK-T7およびMA104細胞のマイコプラズマ汚染は、組換えウイルスを生成するロタウイルス逆遺伝学系の障害の主要な要因となり得る。研究室では、PCRベースのマイコプラズマ検出キット(材料表)を使用して細胞株の汚染を確認し、検出された場合はBHK-T7細胞に最も頻繁に関連しています。私たちは、マイコプラズマを汚染する細胞株を治そうとせず、液体窒素に貯蔵された以前のマイコプラズマフリー通路でラインを再確立しようとしました。新しい細胞株を始める前に、以前に使用されていたすべての媒体および中型サプリメントを廃棄し、インキュベーター、生物学的安全キャビネット、水浴、実験室ベンチ、およびピペットを徹底的に除染します。また、マイコプラズマ検出キットを使用して、組換えウイルスの汚染を確認します。Vertrel VF32のような有機溶媒による変性に対するロタウイルス粒子の抵抗性のために、マイコプラズマを汚染することからウイルスストックを解放し、逆遺伝学によって組換えウイルスを再生成する必要性を否定する。研究室に入った細胞株やウイルス製剤は、定期的に使用する前にマイコプラズマ汚染をチェックする必要があることを強調することが重要です。
日中と日中ですが、我々は組換えウイルスを生成するために同じプロトコルを使用していますが、我々はウイルスの回復を妨げない特定の変更を行うことができることを知っています。例えば、(i)組換えウイルスの回復には、(i)SA11 pT7ベクターを用いたpCMV/NSP868Rキャッピング酵素プラスミドの共トランスフェクションは必要ない。キャッピングプラスミドの添加は、トランスフェクトBHK-T7 / MA104細胞ライセートにおいてより高いウイルス力素をもたらす一方で、それを含む多数のウイルスを回収することができた。しかし、pCMV/NP868Rによるキャッピング酵素の発現は、より少ない適合ウイルスの回復に大きく寄与する可能性があると結論付けました。(ii) 逆遺伝学プロトコルに用いるトランスフェクション試薬(表)の量が半分に減っても、組換えウイルスが生成されうることがわかった。(iii) 同様に、DMEM完全培地の代わりにM199完全培地を使用できると判断しました。(iv) 最後に、SA11 T7転写ベクトルの製造に使用しなければならないベクターバックボーンの種類に関する要件は設定されていない。プラスミド中のウイルスcDNAが上流T7プロモーターと下流のHDVリボザイムおよびT7ターミネーターによって囲まれている限り、プラスミドは組換えウイルスの回復を支えることを期待できる。特に、pGEM-,pBluescript,pUCベースのベクターは、逆遺伝学系において正常に使用されている。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、NIH助成金R03 AI131072とR21 AI144881、インディアナ大学スタートアップ資金、ローレンスM.ブラット基金によってサポートされました。私たちは、IUロタフージャー研究所、ウルリッヒ・デッセルベルガー、グイド・パパのメンバーに、逆遺伝学プロトコルの開発における多くの貢献と提案に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells | Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Cellometer AutoT4 viable cell counter | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Gel Imaging System | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Quality Biological | 115-073-101 | |
| Ethanol, Absolute (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM with low background fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7074S | |
| Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum | Patton lab | lot 55068 | |
| Guinea Pig Anti-VP6 Antierum | Patton lab | lot 53963 | |
| Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated | KPL | 5220-0366 | |
| Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated | Cell-Signaling Technology | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit | JH Science | 25235 | |
| Isopropyl alcohol | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution (100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Luria Agar Powder (Miller's LB Agar) | RPI research products | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Culture Medium | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cells | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| NanoDrop One Spectrophotometer | ThermoScientific | ||
| Neutral Red Solution (0.33%) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Non-Essential Amino Acid Solution (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | |
| Pellet pestle (RNase-free, disposable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Porcine Trypsin, Type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Transcription Vectors | Addgene | 89162-89172 | |
| SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins | Contact: jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | For gel electrophoresis |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | For plaque assay |
| Superscript III One-Step RT-PCR kit | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Trans-Llot Turbo Transfer System | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Transfection Reagent | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Trizol RNA Extraction Reagent | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution | Quality Biological | 118-087-721 | |
| Tryptose Phosphate Broth | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvent | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Fluorescent Live Cell Imager | Bio-Rad |
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