Summary
De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is een nieuwe benadering voor kwantitatieve detectie van endogene en exogenously toegepaste MeCP2 eiwitvarianten, die zeer kwantitatieve, nauwkeurige en reproduceerbare metingen produceert met een lage intra- en inter-assay-fout over een breed werkbereik. Hier wordt het protocol voor de MeCP2-ECLIA in een 96-well formaat beschreven.
Abstract
De ECLIA is een veelzijdige methode die in staat is om endogene en recombinante eiwithoeveelheden in een 96-put formaat te kwantificeren. Om eclia-efficiëntie aan te tonen, werd deze test gebruikt om intrinsieke niveaus van MeCP2 in muishersenweefsel en de opname van TAT-MeCP2 bij menselijke huidfibroblasten te analyseren. De MeCP2-ECLIA produceert zeer nauwkeurige en reproduceerbare metingen met een lage intra- en inter-assay fout. Samengevat hebben we een kwantitatieve methode ontwikkeld voor de evaluatie van MeCP2-eiwitvarianten die kunnen worden gebruikt in schermen met een hoge doorvoer.
Introduction
De elektrochemiluminescentie immunoassay (ECLIA) is gebaseerd op een proces dat gebruik maakt van etiketten die zijn ontworpen om luminescentie uit te stoten wanneer elektrochemisch gestimuleerd. Het is een breed toepasbare techniek voor de kwantitatieve detectie van biologische analyten in de basisindustrie en academisch onderzoek, de voedingsindustrie en in klinische diagnostiek1. Vaak wordt een wegwerp 96-well plaat met koolstofinkt elektroden gebruikt. Deze elektroden fungeren als een vaste fase drager voor de immunoassay. Een secundair antilichaam wordt geconjugeerd tot een elektrochemiluminescent label en wanneer elektriciteit wordt toegepast op het systeem, licht emissie van het chemische label wordt geactiveerd. Een ultralage geluidsbelastinggekoppelde inrichting (CCD) registreert de lichtintensiteit die rechtstreeks evenredig is met het antigeen dat aan het opname-antilichaam is gebonden, wat resulteert in de kwantificering van de beoogde analyt van het monster2. In vergelijking met de enzymgebonden immunosorbenttest (ELISA) wordt ECLIA als voordelig beschouwd omdat het een hogere gevoeligheid en reproduceerbaarheid biedt, evenals een betere automatisering en consistentie3.
Hier analyseerden we de methyl-CpG bindende eiwit 2 (MeCP2) niveaus in monsters van menselijke en murine oorsprong evenals verschillende varianten van het recombinant eiwit met behulp van de nieuw ontwikkelde ECLIA systeem. MecP2 is een X-gebonden nucleïnezuurbindende eiwit waarvan bekend is dat het interageren met gemethyleerde DNA-sequenties. Dit eiwit is betrokken bij de regulatie van genexpressie4,5. Verlies-van-functie mutaties in het gen dat dit eiwit codeert zijn de belangrijkste boosdoeners veroorzaakt Rett syndroom (RTT), een ernstige neuroontwikkelingsstoornis6. Een andere MeCP2-gerelateerde aandoening, MECP2 duplicatie syndroom, leidt ook tot neurologische symptomen die kunnen overlappen met die van RTT7. Met name worden vrouwen meestal beïnvloed door RTT, terwijl mannen6meestal worden getroffen door MECP2-duplicatiesyndroom 6,7. MECP2
Deze aandoeningen worden geassocieerd met respectievelijk onvoldoende of overtollige MeCP2-niveaus in het centrale zenuwstelsel (CNS). Daarom zouden behandelingsopties voor RTT die het verhogen van mecp2-niveaus in het CNS inhouden, de schadelijke effecten van een overmaat aan MeCP27moeten vermijden . Vanwege dit feit is een zeer gevoelige en nauwkeurige kwantificering van MeCP2-eiwitniveaus, zoals geboden door het ECLIA-systeem, van cruciaal belang voor de vooruitgang van RTT en mecp2-dubbelsyndroomonderzoek. De precieze metingen van endogene en exogene MeCP2-niveaus uit menselijke cellijnen en muizenweefselmonsters, evenals een recombinanteiwit bestaande uit menselijke MeCP2-isoform B (ook bekend als isoform e1), en een minimaal N-terminal HIV-TAT transductiedomein (TAT-MeCP2) dat het potentieel heeft om de bloed-hersenbarrière8over testeken,9 worden in dit werk gepresenteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Goedkeuring voor huidbiopsie inkoop voor onderzoeksdoeleinden werd verkregen van de Human Research Ethics Committee van het Children's Hospital in Westmead, Australië. Toestemming voor dierproeven werd verkregen van het Oostenrijkse federale ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Economie, die werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale dierenwelzijnsvoorschriften (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
OPMERKING: Het beginsel van het ECLIA-systeem is afgebeeld in figuur 1.
1. Selectie van antilichamen
- Evalueer de signaal-ruisverhouding voor een reeks verschillende MeCP2-antilichamen en identificeer de beste signaalsterkte en hoogste specificiteit binnen de combinatie van een primaire muismonoklonale MeCP2-antilichaam (kloon Mec-168) en konijnenpolyklonale MeCP2-detectieantilichaam (op maat gemaakt). Gebruik voor het secundaire antilichaam een systeemspecifiek antilichaam (Tabel van materialen),dat ook experimenteel werd geverifieerd.
OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van alle geverifieerde antilichamen tijdens de mecp2-ECLIA-ontwikkeling en hun geteste verdunningsbereiken.
| Functie | Naam | Kloon | Verdunning |
| Primaire | Muis, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500−1:10.000 |
| Primaire | Muis, anti-MeCP2 | 4B6 | 1:250−1:4.000 |
| Primaire | Muis, anti-MeCP2 | Mannen-8 | 1:500−1:4.000 |
| Primaire | Muis, anti-MeCP2 | 1B11 | 1:500−1:4.000 |
| Primaire | Konijn, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500−1:4.000 |
| Secundaire | Konijn, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2.000−1:20.000 |
| Secundaire | Konijn, anti-MeCP2 | Polyclonal | 1:2.000−1:20.000 |
| Detectie | SULFO-TAG gelabeld anti-konijn | Polyclonal | 1:500−1:1.000 |
Tabel 1: Lijst van antilichamen en gebruikte werkverdunningen.
- U ook elk paar MeCP2-antilichamen gebruiken dat goed werkt met conventionele ELISA.
2. Behandeling van HDF's met TAT-MeCP2-fusie-eiwit
OPMERKING: TAT-MeCP2 werd recombinantly uitgedrukt in Escherichia coli en gezuiverd met behulp van standaard chromatografische technieken zoals eerder beschreven8 en opgeslagen bij -80 °C.
- Plaat 1 x 106 menselijke dermale fibroblast (HDF) cellen in 100 mm schotels en groeien de cellen 's nachts bij 37 °C met 5% CO2 totdat ze ongeveer 90% samenvloeiing bereiken.
- Neem één flesje TAT-MeCP2-fusieeiwit. Ontdooi op ijs en meng zachtjes.
- Verdun TAT-MeCP2 tot een eindconcentratie van 500 nM in 50 mL hdf-cultuurmedia.
- Verwijder de media uit 100 mm schotels en incubeer de cellen met 500 nM TAT-MeCP2 bij 37 °C gedurende verschillende incubatieperioden tot 24 uur.
- Verwijder de TAT-MeCP2-oplossing uit de cellen. Was de cellen 2x met voorverwarmde Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS).
- Behandel de cellen met 2 mL van 0,05% trypsin-EDTA-oplossing gedurende 5 min bij 37 °C10.
- Voeg 6 mL HDF-kweekmedia toe om de trypsine te activeren en de cellen in buizen van 15 mL te verzamelen.
- Pellet de cellen door centrifugering op 500 x g voor 5 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder de supernatant en was de cellen 2x met ijskoude DPBS. Bewaar de pellet op ijs en ga verder met monstervoorbereiding.
3. Bereiding van de monsters
- HDF lysates
- Bepaal de hoogste eiwitniveaus van MeCP2 met behulp van de REAP-methode voor subcellulaire fractionering in de cytoplasmaen en nucleaire subcellulaire compartimenten volgens Suzuki et al.11. Beperk fractionatie tot niet meer dan zes monsters per experiment.
- Muis hersenen lysert
- Bereid 100 mL van elke hypotonische lyse reagens en extractiebuffer.
- Meng voor de hypotonische lysereagens goed 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride en 10 mM kaliumchloride.
- Meng voor de extractiebuffer goed 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchloride, 0,42 M natriumchloride, 0,2 mM EDTA en 25% (v/v) glycerol.
- Stel de pH van beide buffers aan op 7,9.
- Voeg 1 mM dithiothreitol (DTT) en 1x proteaseremmercocktail vers toe aan beide buffers. Chill op ijs voor gebruik.
- Schort 100 mg totale muishersenen op (stam: C57BL/6J, wildtype man en vrouw en B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous mannetje en heterozygoot vrouwtje; leeftijd: 4−8 weken oud) in 1 mL van ijskoud hypotonisch lysisreagens.
- Homogeniseer de hersenen met een voorgekoelde Dounce all-glas weefsel homogenisator door 15 slagen van homogenisator A (los, voor grote klaring) en B (strak, voor kleine klaring), respectievelijk.
- Breng de gehomogeniseerde cellen over in een schone buis en centrifugeer op 10.000 x g gedurende 20 min bij 4 °C. Gooi de supernatant weg (of bewaar het als cytoplasmatische fractie voor verder gebruik).
- De pellet opnieuw opschorten in 140 μL extractiebuffer per 100 mg uitgangsmateriaal. Plaats de buis in een voorgekoeld thermoblok en meng zachtjes gedurende 30 min bij 4 °C.
- Centrifugeer de buis op 16.000 g gedurende 10 min bij 4 °C. Breng de supernatant (d.w.z. de kernfractie) over op een nieuwe voorgekoelde buis en bewaar bij -80 °C tot gebruik.
OPMERKING: De eiwitconcentratie van lysaten afkomstig van muishersenen en HDF's kan worden beoordeeld door de BCA-eiwittest.
- Bereid 100 mL van elke hypotonische lyse reagens en extractiebuffer.
4. MeCP2-ECLIA-protocol
- Bereiding van wasoplossing, blokkerende buffer en testverdunningsoplossing (dag 1)
- Voeg 500 μL Tween 20 tot 1 L PBS toe om een 0,05% Tween 20 in PBS-oplossing te bereiden, meng krachtig en label als "wasoplossing".
LET OP: Zorg ervoor dat alleen vers bereide wasbuffer wordt gebruikt. - Bereid een blokkeraat van 3% A (Tabel van materialen) voor in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meng door zacht roeren, filter steriliseren en bewaar ze in de koelkast tot gebruik voor een maximum van twee weken.
- Voeg 5 mL blokkeringsoplossing toe aan 10 mL PBS om testverdunningsoplossing (1% blokker A in PBS) voor te bereiden.
- Voeg 500 μL Tween 20 tot 1 L PBS toe om een 0,05% Tween 20 in PBS-oplossing te bereiden, meng krachtig en label als "wasoplossing".
- Coating van hoge bindplaten
- Neem een 96-well multi-array single spot high bind plate.
LET OP: Hoge bindplaten hebben een grotere bindingscapaciteit en dus een groter dynamisch bereik dan standaardplaten met hydrofobe oppervlakken. - Ontdooi het monoklonale muisanti-MeCP2-antilichaam op ijs en meng 0,67 μL van het antilichaam met 4 mL PBS (1:6.000 antilichaamverdunning in PBS). Draai de antilichaamoplossing om goed te mengen en de buis te labelen als "coatingoplossing".
- Bedesudeer voorzichtig 25 μL coatingoplossing in de onderste hoek van elke put met behulp van een meerkanaals pipetor; dit wordt de oplossingscoatingmethode genoemd. Tik voorzichtig op de 96-putplaat aan elke kant om ervoor te zorgen dat de coatingoplossing de bodem van elke put bedekt.
- Sluit de plaat af met een kleeffolie en broed de plaat 's nachts op 4 °C (12-16 uur) in de koelkast.
- Neem een 96-well multi-array single spot high bind plate.
- Blokkeren (dag 2)
- Haal het bord uit de koelkast en verwijder de folie.
- Verwijder de antilichaam coating oplossing door flicking het in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle coating oplossing te verwijderen uit de putten.
- Voeg 125 μL blokkeringsoplossing per put toe. Sluit de plaat opnieuw af en plaats deze op een orbitale microplate shaker.
- Incubeer de plaat voor 90 min bij kamertemperatuur met constante schudden bij 800 rpm.
- Bereidingen van normen en monsters
- Bereid tijdens de incubatietijd de MeCP2- en/of TAT-MeCP2-eiwitnormen en diverse monsters voor.
OPMERKING: De Lysisbuffer die wordt gebruikt voor standaardverdunning moet dezelfde zijn als die welke in de geanalyseerde monsters wordt gebruikt. - Neem één flacon MePC2 en/of TAT-MeCP2 eiwitvoorraadoplossing (250 μg/mL), muishersenlysaten en HDF-lysaten van -80 °C. Ontdooi ze op ijs.
- Verdun de standaard voorraadoplossing (MeCP2 en/of TAT-MeCP2) in schone buizen volgens tabel 2.
- Verdun de monsters in lysisbuffer als volgt: 1−20 μg muishersenlysaat per 25 μL lysisbuffer en 0,25−1 μg HDF lysaat per 25 μL lysisbuffer. Bereid voldoende volume van elk monster voor om een analyse in drievoud uit te voeren.
- Bereid tijdens de incubatietijd de MeCP2- en/of TAT-MeCP2-eiwitnormen en diverse monsters voor.
| Standaard | Concentratie | Verdunning |
| Standaard 1 | 1.800 ng/mL | 1,08 μL Standaard voorraadoplossing + 148,92 μL Lysis buffer |
| Standaard 2 | 600 ng/mL | 50 μL Standaard 1 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 3 | 200 ng/mL | 50 μL Standaard 2 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 4 | 66,67 ng/mL | 50 μL Standaard 3 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 5 | 22.22 ng/mL | 50 μL Standaard 4 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 6 | 7.41 ng/mL | 50 μL Standaard 5 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 7 | 2,47 ng/mL | 50 μL Standaard 6 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 8 | 0,82 ng/mL | 50 μL Standaard 7 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 9 | 0,27 ng/mL | 50 μL Standaard 8 + 100 μL Lysis buffer |
| Standaard 10 | 0 ng/mL | 150 μL Lysis buffer |
Tabel 2: Standaardreeks van 0 tot 1800 ng/mL.
- Het toevoegen van de monsters en standaardoplossingen
- Verwijder de blokkeringsoplossing door deze in de prullenbak te vegen en tik op de plaat op een papieren handdoek om alle blokkeringsoplossing uit de putten te verwijderen.
- Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
- Voeg 25 ul van normen en monsters aan de onderste hoek van de put met behulp van een enkele kanaal pipet.
- Sluit de plaat af en broed de plaat 4 uur lang in bij kamertemperatuur met constant schudden bij 800 tpm.
- Antilichaam zonder label
- Ontdooi het polyklonale konijn anti-MeCP2 antilichaam op ijs. Verdun het antilichaam 1:6.000 in testverdunningsoplossing.
- Verwijder de normen en monsters door het flicking in de prullenbak en tik op de plaat op een papieren handdoek.
- Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
- Voeg 25 μL ongelabelde detectieantilichaam toe aan elk goed met de meerkanaals pipettor. Sluit de plaat af en incubeer deze gedurende 1 uur met constant schudden bij 800 rpm bij kamertemperatuur.
- Specifiek geconjugeerd antilichaam
- Haal het specifieke secundaire antilichaam (Table of Materials) uit de koelkast en plaats het op ijs. Verdun het antilichaam 1:666.67 in testverdunningsoplossing en meng voorzichtig.
- Verwijder het gratis secundaire antilichaam zonder label door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.
- Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing door de wasoplossing toe te voegen en onmiddellijk te verwijderen.
- Voeg 25 μL van specifieke geconjugeerde antilichaam (Tabel van materialen) aan elk goed met de multichannel pipettor. Sluit de plaat af en incubeer 1 uur met constant schudden bij 800 tpm bij kamertemperatuur.
- Het lezen van de plaat
- Verwijder het gratis geconjugeerde antilichaam (Table of Materials) door het in de afvalmand te vegen en op de plaat op een papieren handdoek te tikken.
- Was de plaat 3x met 150 μL wasoplossing.
- Voeg 150 μL van 1x Tris-gebaseerde Gold read buffer (Table of Materials) met oppervlakteactieve stof met tripropylamine als een co-reactant voor lichtopwekking aan de plaat. Vermijd luchtbellen door gebruik te maken van omgekeerde pipettertechnieken.
- Plaats de plaat op het microplaatdetectieplatform (Materiaaltafel)en start de meting onmiddellijk. Gebruik de instellingen voor 96-well plaat acquisitie.
- Leg de elektrochemiluminescentiesignalen vast door een ingebouwde CCD-camera in een elektrochemiluminescentiedetectiesysteem (Tabel van materialen)en leg de signaaltellingen vast, die overeenkomen met relatieve lichteenheden (RLU) en direct evenredig zijn met de intensiteit van het licht.
OPMERKING: Bij elektrochemische stimulatie zendt het rutheniumlabel dat gebonden is aan de koolstofelektrode luminescentielicht uit op 620 nm. Gegevens analyseren met de instrumentgestuurde software (Tabel van materialen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het beginsel van het ECLIA-systeem is beschreven in figuur 1. Standaardcurven voor twee MeCP2-varianten worden weergegeven in figuur 2. Nauwkeurige kwantificering was mogelijk over een breed scala van concentraties (1−1.800 ng/mL). In figuur 3werden MeCP2-niveaus van lysaten afgeleid van muishersenen en HDF's geanalyseerd. MeCP2-expressie in kernlysatataatstoffen in de hersenen van heterozygoot, wildtype en knock-outmuizen werden vergeleken in figuur 3A, terwijl in figuur 3B geen MeCP2-eiwit werd gedetecteerd in de MECP2-deficiënte menselijke fibroblasten (c.806delG) met behulp van de ECLIA. De opname van TAT-MeCP2 door de MECP2-deficiënte cellijn (c.806delG) werd ook in de loop van de tijd onderzocht (figuur 4). Ten slotte werd de inter- en intra-testprecisie aangetoond, zoals blijkt uit tabel 3.
Figuur 1: Diagram van MeCP2 elektrochemiluminescentietest. Dit cijfer is aangepast aan www.meso-scale.com. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: MeCP2-standaardcurve gegenereerd uit menselijke MeCP2 in meerdere metingen. De ondergrens van detectie (LLOD), gedefinieerd als 2,5 standaarddeviaties (SD's) boven de blanco, is 1,00 ng/mL. Recombinant menselijke MeCP2 (Abnova) kan nauwkeurig worden gekwantificeerd over een bereik van 1,00 ng/mL (LLOD) tot 1.800 ng/mL (bovengrens van detectie [ULOD]) met R2 = 0,996. Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van n = 3. Het cijfer is gewijzigd van Steinkellner et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: MeCP2-niveaus in muishersenen en HDF's. (A) MeCP2-eiwitniveaus werden gemeten in kernlysataten in de hersenen van heterozygoot (grijs, HET) en vrouwelijke wilde typemuizen (zwart, wildtype) (n = 4) en één Mecp2-knock-outmuis (RTT); (B) Cellysaten van MeCP2-deficiënte vezelblastcellijn (c.806delG) afgeleid van een mannelijke patiënt met neonatale encefalopathie als model voor rtt-syndroom werden uitgevoerd om de MeCP2-eiwitniveaus bij de mens en een gezonde controle (zwart) te beoordelen. De gepresenteerde gegevens zijn gemiddelde ± SD van drievoudputten (n = 3). Er werd geen MeCP2-eiwit (onder detectiebereik) in de gemuteerde cellijnen door immunofluorescentie of met behulp van de ECLIA aangetroffen, wat verder aantoont dat het een zeer gevoelig systeem is voor verdere opnamestudies met TAT-fusie-eiwitten. Dit cijfer is gewijzigd van Steinkellner et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Tijdafhankelijke opname van TAT-MeCP2. MeCP2-niveaus van kernfracties in c.806delG HDFs werden behandeld met 500 nM recombinant TAT-MeCP2-fusie-eiwit. De analyse werd uitgevoerd met de MeCP2-ECLIA. Op bepaalde tijdspunten werden de cellen gewassen met DPBS en geïncubeerd met 0,05% trypsin-EDTA gedurende 5 min om extracellulairgebonden TAT-MeCP2 te elimineren. Trypsinisatie werd gestopt door het toevoegen van media met serum. De celsuspensie werd gecentrifugeerd op 500 x g gedurende 5 min. Na het wassen van de celpellet 2x met ijskoude DPBS, werd het monster voorbereid voor extractie van kernfractie zoals beschreven in het protocol gedeelte. Dit cijfer is gewijzigd van Steinkellner et al.8. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| INTRA-ASSAY | INTER-ASSAY | ||||||||||
| ng MeCP2 per mL-eiwit | ng MeCP2 per mL-eiwit | ||||||||||
| Nou 1 | Nou 2 | Nou 3 | Bedoel | SDa | SEMb | %CVc | Bedoel | SDa | SEMb | %CVc | |
| Menselijke fibroblasten | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Muis hersenen lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a. Standaarddeviatie, bStandaardfoutgemiddelde, cVariatiecoëfficiënt | |||||||||||
Tabel 3: Bepaling van inter-assay precisie op drie opeenvolgende dagen van HDF en wildtype muis hersenen lyseren. Per bron werd 1−10 μg eiwit van cellysaat toegepast. a. SD, standaarddeviatie; b SEM, standaardfoutgemiddelde; c CV, variatiecoëfficiënt. Deze tabel is gewijzigd van Steinkellner et al.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om endogene MeCP2-, recombinant MeCP2- en TAT-MeCP2-niveaus te meten, werd een 96-well plaat ECLIA ontwikkeld. Het is aangetoond dat verlies van MeCP2 eiwitfunctie leidt tot RTT-syndroom6, waarvoor de behandeling momenteel beperkt is tot symptoombestrijding en fysiotherapie. Een veelbelovende behandelingsweg is de zogenaamde eiwitvervangende therapie, waarbij MeCP2-niveaus kunnen worden getitreerd tot hun benodigde concentratie12,13,14,15. Het potentieel van TAT-fusie-eiwitten om de bloed-hersenbarrière over te steken is in de afgelopen twee decennia succesvol gebleken12,13,14,15. Als zodanig kan deze methode voor MeCP2-toediening nuttig zijn in het kader van toediening van eiwitvervangende therapie. Om het potentieel van TAT-fusieeiwitten en andere behandelingen te beoordelen om het MeCP2-eiwitgehalte te herstellen, is het van het grootste belang om een efficiënte en betaalbare test te ontwikkelen die ze kan kwantificeren. De test beschreven in dit werk, de ECLIA, is in staat om de niveaus van MeCP2 nauwkeurig en consequent te bepalen, met gunstige intra- en inter-assay waarden (Tabel 3).
Voor het volgende MeCP2-ECLIA protocol werden muishersenlysaten en HDF's gebruikt als de cellen van belang. Dit protocol kan echter worden gebruikt met alle andere celtypen van ten minste menselijke en murine-oorsprong. Bovendien werden HDF's behandeld met TAT-MePC2-fusie-eiwit om het vermogen van deze test aan te tonen om verschillende MeCP2-eiwitvarianten te meten. Tijdens de voorbereiding van het monster is het vermijden of minimaliseren van reducerende stoffen in de lysisbuffer zoals DTT of β-mercaptoethanol van cruciaal belang voor het behoud van de efficiëntie van de techniek. Extra kritische stappen in deze methode omvatten plaatcoating met een muis anti-MeCP2 antilichaam, plaatblokkering en monstertoevoeging, gevolgd door een 4 uur incubatie met een konijn anti-MeCP2 antilichaam. Latere incubatie met een specifiek secundair antilichaam (Materiaaltafel)en toevoeging van reagentia die nodig zijn om de luminescentiereactie te laten plaatsvinden, omvatten de laatste belangrijke stappen van deze procedure.
Om de ECLIA-prestaties te optimaliseren, kunnen de volgende stappen worden ondernomen. De maximale output voor het signaal voor deze test mag niet meer dan een miljoen tellingen bedragen. Om te voorkomen dat de vloeistof zich buiten de elektrode verspreidt, kan een techniek genaamd spotcoating worden gebruikt om de coatingoplossing in de put te introduceren. Deze techniek vereist hoge precisie pipetteeren of het gebruik van een pipet robot. Bovendien kan het testen van verschillende concentraties antilichamen nuttig zijn om zowel de testspecificiteit te verhogen als het achtergrondsignaal te verminderen. Om dit laatste aan te pakken, kunnen verschillende blokkers (zoals MSD, Blocker D-M) ook worden gebruikt om een uiteindelijke concentratie van 0,1%. Om de signaalkwaliteit te optimaliseren, wordt het testen van verschillende incubatietijden (schudden bij of boven 300 rpm) aanbevolen. Ten slotte kunnen verschillende verdunningsmiddelen worden getest om de lineariteit in specifieke media zoals serum, plasma, urine of hersenvocht te verhogen.
Semi-kwantitatieve westerse vlek en commercieel beschikbare MeCP2-ELISA worden normaal gesproken gebruikt om MeCP2-eiwitniveaus te bestuderen. Het werkingsprincipe achter de ELISA is vergelijkbaar met dat van onze ECLIA met het opmerkelijke verschil is de detectiemodus. In vergelijking met deze methoden is de MeCP2-ECLIA sneller en handiger. De ECLIA werd gebruikt om te testen voor wildtype, heterozygoot en Mecp2-knockout muis hersenmonsters (Figuur 3A), met bevindingen in vergelijking met MeCP2 bedragen uit dezelfde monsters verkregen door westerse blotting (gegevens niet getoond). Een duidelijk verschil werd waargenomen in MeCP2 niveaus van vrouwelijke wildtype en heterozygoot muis hersenmonsters gemeten door de ECLIA die niet werd gedetecteerd als statistisch significant door de westelijke vlek. Deze hogere ECLIA testnauwkeurigheid kan belangrijk zijn bij het zoeken naar nieuwe verbindingen die het MeCP2-eiwitgehalte kunnen verhogen.
Bovendien is de MeCP2-ECLIA minder duur dan zijn MeCP2-ELISA tegenhanger en kan vanwege het hoge dynamisch bereik van 1 ng/mL tot 1.800 ng/mL (R2 = 0,996), worden gebruikt met monsters die lage MeCP2-hoeveelheden bevatten. In vergelijking met alle commercieel beschikbare ELISA kits, de ECLIA sterk beter presteert dan hen. ECLIA bezit een gunstiger dynamisch bereik van 1−1.800 ng/mL in vergelijking met zijn tegenhangers ELISA, die werden gevonden om 0.312−20 ng/mL (muis, Wolk-Kloon Corp.) en 0.156−10 ng/mL (menselijk, Wolk-Kloon Corp.). Omdat er geen expliciete definitie van een ondergrens van detectie bestaat, is de rechtstreekse vergelijking tussen deze twee tests niet mogelijk voor de toepassing van dit werk.
Samengevat is aangetoond dat de MeCP2-ECLIA de MeCP2-hoeveelheden nauwkeurig in vivo en in vitro kan bepalen. Terwijl het aanvullen van MeCP2 eiwitniveaus in de neuronen van RTT-getroffen patiënten inderdaad een veelbelovende behandelingsweg is, kan de aanwezigheid van overmatige MeCP2 ook leiden tot ernstige neurologische symptomen, geassocieerd met MECP2-duplicatiesyndroom16,17,18. Als zodanig kan deze methode van integraal belang zijn bij het optimaliseren van de hoeveelheid exogenously geïntroduceerde MeCP2 tijdens eiwitvervangende therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn Dr. Brigitte Sturm zeer dankbaar voor haar steun aan het ECLIA-instrument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H.
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
