Summary
Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er en ny tilnærming for kvantitativ påvisning av endogene og eksogene brukte MeCP2 proteinvarianter, som produserer svært kvantitative, nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og inter-analyse feil over et bredt arbeidsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-brønnformat beskrevet.
Abstract
ECLIA er en allsidig metode som er i stand til å kvantifisere endogene og rekombinant proteinmengder i et 96-brønnformat. For å demonstrere ECLIA effektivitet, denne analysen ble brukt til å analysere iboende nivåer av MeCP2 i mus hjernevev og opptaket av TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA produserer svært nøyaktige og reproduserbare målinger med lav intra- og interanalysefeil. Oppsummert utviklet vi en kvantitativ metode for evaluering av MeCP2 proteinvarianter som kan brukes i skjermer med høy gjennomstrømning.
Introduction
Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) er basert på en prosess som benytter etiketter designet for å avgi luminescens når elektrokjemisk stimulert. Det er en bredt anvendelig teknikk for kvantitativ påvisning av biologiske analytter i grunnleggende industri og akademisk forskning, næringsmiddelindustrien samt i klinisk diagnostikk1. Vanligvis brukes en engangs 96-brønnplate med karbonblekkelektroder. Disse elektrodene fungerer som en solid fase bærer for immunoassay. Et sekundært antistoff er konjugert til en elektrochemiluminescerende etikett, og når elektrisitet påføres systemet, utløses lettutslipp av den kjemiske etiketten. En ultra-lav støy lade-koblet enhet (CCD) registrerer lysintensiteten som er direkte proporsjonal med antigenet bundet til fangstantistoffet som resulterer i kvantifisering av den målrettede aalyten til prøven2. Sammenlignet med enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA), anses ECLIA å være fordelaktig, da det gir høyere følsomhet og reproduserbarhet samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserte vi metyl-CpG bindingprotein 2 (MeCP2) nivåer i prøver av menneskelig og murine opprinnelse samt ulike varianter av rekombinant protein ved hjelp av det nyutviklede ECLIA-systemet. MecP2 er et X-koblet nukleinsyrebindende protein som er kjent for å samhandle med metylerte DNA-sekvenser. Dette proteinet har vært innblandet i reguleringen av genuttrykk4,5. Tap av funksjon mutasjoner i genet som koder dette proteinet er de viktigste skyldige forårsaker Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En annen MeCP2-relatert lidelse, MECP2 dupliseringssyndrom, fører også til nevrologiske symptomer som kan overlappe med rtt7. Spesielt er kvinner for det meste påvirket av RTT mens menn er for det meste plaget av MECP2 dupliseringsyndrom6,7.
Disse lidelsene er forbundet med henholdsvis utilstrekkelige eller overskytende MeCP2-nivåer i sentralnervesystemet (CNS). Behandlingsalternativer for RTT som involverer økende MeCP2-nivåer i CNS må derfor unngå de skadelige effektene forbundet med overskudd av MeCP27. På grunn av dette faktum er en svært følsom og nøyaktig kvantifisering av MeCP2 proteinnivåer, som gitt av ECLIA-systemet, avgjørende for utviklingen av RTT samt MECP2 dupliseringsyndromforskning. De nøyaktige målingene av endogene og eksogene MeCP2-nivåer fra humancellelinjer og musevevsprøver samt et rekombinant protein bestående av humanmeCP2 isoform B (også kjent som isoform e1), og et minimalt N-terminal HIV-TAT transduksjonsdomene (TAT-MeCP2) som har potensial til å krysse blod-hjerne-barriere8,,9 er presentert i dette arbeidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkjenning for hudbiopsianskaffelser for forskningsformål ble innhentet fra Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australia. Samtykke til dyreforsøk ble innhentet fra det østerrikske føderale vitenskaps-, forsknings- og økonomidepartementet, som ble utført i samsvar med lokale dyrevelferdsforskrifter (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
MERK: Prinsippet i ECLIA-systemet er avbildet i figur 1.
1. Valg av antistoff
- Evaluer signal-til-støy-forholdet for en rekke ulike MeCP2-antistoffer og identifiser den beste signalstyrken og høyeste spesifisitet i kombinasjonen av et primærmusmonoklonalt MeCP2-antistoff (klone Mec-168) og kaninpolyklonal MeCP2-deteksjonsantistoff (skreddersydd). For det sekundære antistoffet, bruk et systemspesifikt antistoff (Table of Materials), som også ble eksperimentelt verifisert.
MERK: Tabell 1 gir en oversikt over alle verifiserte antistoffer under MeCP2-ECLIA-utvikling og deres testede fortynningsområder.
| Funksjonen | navn | Klone | Fortynning |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | Mec-168 (Andre) | 1:500−1:10 000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | 4B6 (andre kan være på den siden) | 1:250−1:4000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | Menn-8 | 1:500−1:4000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | 1B11 (andre er i seg selv) | 1:500−1:4000 |
| Primære | Kanin, anti-MeCP2 | D4F3 (andre er i seg selv) | 1:500−1:4000 |
| Sekundær | Kanin, anti-MeCP2 | polyklonal | 1:2 000−1:20 000 |
| Sekundær | Kanin, anti-MeCP2 | polyklonal | 1:2 000−1:20 000 |
| Oppdagelsen | SULFO-TAG merket anti-kanin | polyklonal | 1:500−1:1000 |
Tabell 1: Liste over antistoffer og brukte arbeidsfortynninger.
- Alternativt kan du bruke hvert par MeCP2-antistoffer som fungerer godt med konvensjonelle ELISA.
2. Behandling av HDFs med TAT-MeCP2 fusjonsprotein
MERK: TAT-MeCP2 ble rekombinantuttrykt i Escherichia coli og renset ved hjelp av standard kromatografiske teknikker som tidligere beskrevet8 og lagret ved -80 °C.
- Plate 1 x 106 humane dermal fibroblastceller (HDF) i 100 mm retter og vokse cellene over natten ved 37 °C med 5% CO2 til de når ca 90% samløpet.
- Ta ut ett hetteglass med TAT-MeCP2 fusjonsprotein. Tin på is og bland forsiktig.
- Fortynn TAT-MeCP2 til en endelig konsentrasjon på 500 nM i 50 ml HDF kulturmedier.
- Fjern mediet fra 100 mm retter og inkuber cellene med 500 nM TAT-MeCP2 ved 37 °C for ulike inkubasjonsperioder opp til 24 timer.
- Fjern TAT-MeCP2-løsningen fra cellene. Vask cellene 2x med pre-varmet Dulbeccofosfat-bufret saltvann (DPBS).
- Behandle cellene med 2 ml 0,05 % trypsin-EDTA-løsning i 5 min ved 37 °C10.
- Legg til 6 ml HDF kulturmedier for å deaktivere trypsin og samle cellene i 15 ml rør.
- Pellet cellene ved sentrifugering på 500 x g i 5 min ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten og vask cellene 2x med iskald DPBS. Oppbevar pelleten på is og fortsett med prøveforberedelse.
3. Prøveforberedelse
- HDF lysates
- Bestem de høyeste proteinnivåene av MeCP2 ved hjelp av REAP-metoden for subcellulær fraksjon i cytoplasmatiske og kjernefysiske subcellulære rom i henhold til Suzuki et al.11. Begrens fraksjonering til ikke mer enn seks prøver per eksperiment.
- Mus hjernen lysates
- Forbered 100 ml av hver hypotonisk lysisreagens og ekstraksjonsbuffer.
- For hypotonisk lysis reagens, bland godt 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid og 10 mM kaliumklorid.
- For ekstraksjonsbufferen, bland godt 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid, 0,42 M natriumklorid, 0,2 mM EDTA og 25 % (v/v) glyserol.
- Juster pH-en til begge bufferne til 7,9.
- Tilsett 1 mM dithiothreitol (DTT) og 1x proteasehemmercocktail til begge bufferne som er ferskt. Avkjøl på is før bruk.
- Suspend100 mg total mus hjerne (stamme: C57BL/6J, wildtype mann og kvinne og B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous mann og heterozygous kvinne; alder: 4-8 uker gammel) i 1 ml iskald hypotonisk lysis reagens.
- Homogeniser hjernen med en pre-kjølt Dounce all-glass vev homogenisator med 15 slag homogenisator A (løs, for stor klaring) og B (stramt, for liten klaring), henholdsvis.
- Overfør de homogeniserte cellene til et rent rør og sentrifuge ved 10 000 x g i 20 min ved 4 °C. Kast supernatanten (eller behold den som cytoplasmatisk fraksjon for videre bruk).
- Resuspender pelleten i 140 μL ekstraksjonsbuffer per 100 mg startmateriale. Legg røret i en forhåndskjølt termoblokk og bland forsiktig i 30 min ved 4 °C.
- Sentrifuge røret ved 16.000 g i 10 min ved 4 °C. Overfør supernatanten (dvs. atomfraksjonen) til et nytt forkjølt rør og oppbevar på -80 °C til bruk.
MERK: Proteinkonsentrasjonen av lysater avledet fra mushjerne og HDF-er kan vurderes av BCA-proteinanalysen.
- Forbered 100 ml av hver hypotonisk lysisreagens og ekstraksjonsbuffer.
4. MeCP2-ECLIA-protokoll
- Tilberedning av vaskeløsning, blokkering av buffer og analysefortynningsløsning (dag 1)
- Tilsett 500 μL Tween 20 til 1 L PBS for å forberede en 0,05% Tween 20 i PBS-løsning, bland kraftig og merk som "vaskeløsning".
MERK: Kontroller at det kun brukes nylaget vaskebuffer. - Forbered en blokkeringsløsning på 3 % blokker A (Materialtabell) i fosfatbufret saltvann (PBS). Bland ved skånsom omrøring, filtrer steriliser og oppbevar dem i kjøleskapet til bruk i maksimalt to uker.
- Tilsett 5 ml blokkeringsløsning til 10 ml PBS for å klargjøre analysefortynningsløsning (1 % blokkering A i PBS).
- Tilsett 500 μL Tween 20 til 1 L PBS for å forberede en 0,05% Tween 20 i PBS-løsning, bland kraftig og merk som "vaskeløsning".
- Belegg av høye bind plater
- Ta ut en 96-brønn multi-array single-spot høy bind plate.
MERK: Høye bindingsplater har en større bindingskapasitet og dermed et større dynamisk område enn standardplater med hydrofobe overflater. - Tin monoklonal mus anti-MeCP2 antistoff på is og bland 0,67 μL av antistoffet med 4 ml PBS (1:6,000 antistoff fortynning i PBS). Vortex antistoffoppløsningen for å blande godt og merke røret som "beleggløsning".
- Dispenser forsiktig 25 μL beleggoppløsning i nederste hjørne av hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipettor; Dette kalles løsningsbeleggmetoden. Trykk forsiktig på 96-brønnplaten på hver side for å sikre at beleggløsningen dekker bunnen av hver brønn.
- Forsegle platen med en klebende folie og inkuber platen i kjøleskapet ved 4 °C over natten (12-16 h).
- Ta ut en 96-brønn multi-array single-spot høy bind plate.
- Blokkering (dag 2)
- Ta ut platen fra kjøleskapet og fjern folien.
- Fjern antistoffbeleggløsningen ved å flikke den inn i avfallskurven og bank på platen på et papirhåndkle for å fjerne all beleggoppløsningen fra brønnene.
- Tilsett 125 μL blokkeringsløsning per brønn. Forsegle platen igjen og plasser den på en orbital mikroplateshaker.
- Inkuber platen i 90 minutter ved romtemperatur med konstant risting ved 800 o/min.
- Forberedelser av standarder og prøver
- Under inkubasjonstiden, forberede MeCP2 og / eller TAT-MeCP2 protein standarder og ulike prøver.
MERK: Lysisbufferen som brukes til standard fortynning må være den samme som den som brukes i de analyserte prøvene. - Ta ut ett hetteglass med MePC2 og/eller TAT-MeCP2 proteinlageroppløsning (250 μg/ml), mushjernelysater og HDF lysates fra -80 °C. Tin dem på is.
- Fortynn standard lagerløsning (MeCP2 og/eller TAT-MeCP2) i rene rør i henhold til tabell 2.
- Fortynn prøvene i lysisbuffer som følger: 1–20 μg mushjernelysat per 25 μL lysisbuffer, og 0,25–1 μg HDF lysat per 25 μL lysisbuffer. Forbered nok volum av hver prøve til å utføre analyse i triplicate.
- Under inkubasjonstiden, forberede MeCP2 og / eller TAT-MeCP2 protein standarder og ulike prøver.
| Standard (Standard) | Konsentrasjon | Fortynning |
| Standard 1 | 1800 ng/ml | 1,08 μL Standard lagerløsning + 148,92 μL lysisbuffer |
| Standard 2 | 600 ng/ml | 50 μL Standard 1 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 3 | 200 ng/ml | 50 μL Standard 2 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 4 | 66,67 ng/ml | 50 μL Standard 3 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 5 (Standard 5) | 22,22 ng/ml | 50 μL Standard 4 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 6 | 7,41 ng/ml | 50 μL Standard 5 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 7 (Standard 7) | 2,47 ng/ml | 50 μL Standard 6 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 8 | 0,82 ng/ml | 50 μL Standard 7 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 9 | 0,27 ng/ml | 50 μL Standard 8 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 10 | 0 ng/ml | 150 μL lysse buffer |
Tabell 2: Standardserie fra 0 til 1 800 ng/ml.
- Legge til eksempler og standardløsninger
- Fjern blokkeringsløsningen ved å sveipe den inn i avfallskurven og bank på platen på et papirhåndkle for å fjerne all blokkeringsløsningen fra brønnene.
- Vask platen 3x med 150 μL vaskeløsning ved å tilsette vaskeløsningen og fjern den umiddelbart.
- Legg til 25 ul av standarder og prøver nederst i hjørnet av brønnen ved hjelp av en enkelt kanal pipette.
- Forsegle platen og inkuber platen i 4 timer ved romtemperatur med konstant risting ved 800 rpm.
- Umerket deteksjonsantistoff
- Tin polyklonal kanin anti-MeCP2 antistoff på is. Fortynn antistoffet 1:6000 i analysefortynningsvæskeoppløsning.
- Fjern standardene og prøvene ved å sveipe den inn i avfallskurven og trykk på platen på et papirhåndkle.
- Vask platen 3x med 150 μL vaskeløsning ved å tilsette vaskeløsningen og fjern den umiddelbart.
- Tilsett 25 μL umerket deteksjonsantistoff til hver brønn med flerkanals pipettor. Forsegle platen og inkuber den i 1 h med konstant risting ved 800 rpm ved romtemperatur.
- Spesifikt konjugert antistoff
- Ta ut det spesifikke sekundære antistoffet (Table of Materials) fra kjøleskapet og legg det på is. Fortynn antistoffet 1:666.67 i analysefortynningsvæske og bland forsiktig.
- Fjern det frie, umerkede sekundære antistoffet ved å sveipe det inn i avfallskurven og bank på platen på et papirhåndkle.
- Vask platen 3x med 150 μL vaskeløsning ved å tilsette vaskeløsningen og fjern den umiddelbart.
- Tilsett 25 μL av spesifikt konjugert antistoff (Materialtabellen) til hver brønn med flerkanals pipettor. Forsegle platen og inkuber i 1 t med konstant risting ved 800 rpm ved romtemperatur.
- Lese platen
- Fjern det frie konjugerte antistoffet (Materialbordet) ved å sveipe det inn i avfallskurven og trykk på platen på et papirhåndkle.
- Vask platen 3x med 150 μL vaskeløsning.
- Tilsett 150 μL 1x Tris-basert Gulllesebuffer (Materialbord) med overflateaktivt middel som inneholder tripropylamin som en co-reactant for lysgenerering til platen. Unngå luftbobler ved hjelp av omvendt pipetteringsteknikker.
- Plasser platen på mikroplatedeteksjonsplattformen (Materialtabell) og start målingen umiddelbart. Bruk innstillingene for 96-brønnplateanskaffelse.
- Fang opp elektrochemiluminescenssignalene med et innebygd CCD-kamera i et elektrochemiluminescence deteksjonssystem (Materialtabellen) og registrer signalantallet, som tilsvarer relative lysenheter (RLU) og er direkte proporsjonal med lysintensiteten.
MERK: Ved elektrokjemisk stimulering avgir rutheniumetiketten som er bundet til karbonelektroden, luminescenslys ved 620 nm. Analyser data med den instrumentfulgte programvaren (Materialtabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Prinsippet i ECLIA-systemet er beskrevet i figur 1. Standardkurver for to MeCP2-varianter vises i figur 2. Nøyaktig kvantifisering var mulig over et bredt spekter av konsentrasjoner (1-1800 ng/ml). I figur 3ble MeCP2-nivåene av lysater avledet fra mushjerne og HDF-er analysert. MeCP2-uttrykk i hjernens kjernefysiske lysater fra heterozygotere, villtype og knockoutmus ble sammenlignet i figur 3A, mens det i figur 3B ble det ikke påvist noe MeCP2-protein i MECP2-mangelfulle humane fibroblaster (ca. 806delG) ved hjelp av ECLIA. Opptaket av TAT-MeCP2 av MECP2-mangelfull cellelinje (ca. 806delG) ble også undersøkt over tid (figur 4). Til slutt ble inter- og intraanalysepresisjon vist som vist i tabell 3.
Figur 1: Diagram av MeCP2 elektrochemiluminescence analyse. Dette tallet ble tilpasset fra www.meso-scale.com. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: MeCP2-standardkurve generert fra human MeCP2 i flere målinger. Den nedre registreringsgrensen (LLOD), definert som 2,5 standardavvik (SD-er) over det tomme, er 1,00 ng/ml. Rekombinant human MeCP2 (Abnova) kan kvantifiseres nøyaktig over et område fra 1,00 ng/ml (LLOD) til 1800 ng/ml (øvre deteksjonsgrense [ULOD]) med R2 = 0,996. Feilfelt representerer standardfeilen til n = 3. Figuren er endret fra Steinkellner et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: MeCP2-nivåer i mushjerne og HDFer. (A) MeCP2-proteinnivåer ble målt i hjernenkjernefysiske lysater fra heterozygot (grå, HET) og kvinnelige villtypemus (svart, villtype) (n = 4) og en Mecp2-knockout mus (RTT); (B) Cellelysater fra MeCP2-mangelfull fibroblastcellelinje (ca. 806delG) avledet fra en mannlig pasient med neonatal encefalopati som modell for RTT syndrom ble utført for å vurdere MeCP2 proteinnivåer hos mennesker og en sunn kontroll (svart). De presenterte dataene er gjennomsnittlige ± SD av triplicate brønner (n = 3). Ingen MeCP2-protein ble påvist (under deteksjonsområdet) i de muterte cellelinjene ved immunfluorescens eller bruk av ECLIA, noe som viser videre at det er et svært følsomt system for videre opptaksstudier med TAT-fusjonsproteiner. Dette tallet er endret fra Steinkellner et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidsavhengig opptak av TAT-MeCP2. MeCP2 nivåer av kjernefysiske fraksjoner i c.806delG HDFs ble behandlet med 500 nM rekombinant TAT-MeCP2 fusjonprotein. Analysen ble utført med MeCP2-ECLIA. Ved fastsatte tidspunkter ble cellene vasket med DPBS og inkubert med 0,05% trypsin-EDTA i 5 min for å eliminere ekstracellulær-bundet TAT-MeCP2. Trypsinisering ble stoppet ved å legge til medier med serum. Cellesuspensjonen ble sentrifugert på 500 x g i 5 min. Etter å ha vasket cellepellet 2x med iskald DPBS, ble prøven forberedt for utvinning av kjernefysisk fraksjon som beskrevet i protokollseksjonen. Dette tallet er endret fra Steinkellner et al.8. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| INTRA ANALYSE | INTER ANALYSE | ||||||||||
| ng MeCP2 per ml protein | ng MeCP2 per ml protein | ||||||||||
| Vel 1 | Vel 2 | Vel 3 | Mener | SDa | SEMb | %CVc | Mener | SDa | SEMb | %CVc | |
| Menneskelige fibroblaster | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Mus hjernen lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a. Standardavvik, bStandardfeilgjennomsnitt, cVariasjonskoeffisient | |||||||||||
Tabell 3: Fastsettelse av inter-analyse presisjon på tre påfølgende dager med HDF og wildtype mus hjerne lysates. Per brønn 1-10 μg protein av cellelysat ble påført. a. SD, standardavvik; B (andre kan være SEM, standard feil bety; C (andre kan være CV, variasjonskoeffisient. Denne tabellen er endret fra Steinkellner et al.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å måle endogene MeCP2- og TAT-MeCP2-nivåer ble det utviklet en 96-brønnplate ECLIA. Det har vist seg at tap av MeCP2 proteinfunksjon fører til RTT syndrom6, for hvilken behandling er for tiden begrenset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsvei er den såkalte proteinerstatningsterapien, hvor MeCP2-nivåer kan titreres opp til deres nødvendige konsentrasjon12,,13,14,15. Potensialet til TAT-fusjonsproteiner for å krysse blod-hjernebarrieren har vist seg å være vellykket i løpet av de siste to tiårene12,13,14,15. Som sådan kan denne metoden for MeCP2-levering være nyttig i sammenheng med administrasjon av proteinerstatningsbehandling. For å vurdere potensialet til TAT-fusjonsproteiner og andre behandlinger for å gjenopprette MeCP2 proteinnivåer, er det av største betydning å utvikle en effektiv og rimelig analyse som kan kvantifisere dem. Analysen som er beskrevet i dette arbeidet, ECLIA, er i stand til å bestemme nivåene av MeCP2 nøyaktig så vel som konsekvent, med gunstige intra- og inter-analyseverdier (tabell 3).
For følgende MeCP2-ECLIA-protokoll ble mushjernelysater og HDF-er ansatt som de interessante cellene. Denne protokollen kan imidlertid brukes sammen med alle andre celletyper av minst menneskelig og murine opprinnelse. Videre ble HDFs behandlet med TAT-MePC2 fusjonsprotein for å vise evnen til denne analysen for å måle ulike MeCP2-proteinvarianter. Under prøveforberedelse, unngå eller minimere reduksjon smidler i lysis buffer som DTT eller β-mercaptoetanol, er avgjørende for å bevare effektiviteten av teknikken. Ytterligere kritiske trinn i denne metoden innebærer platebelegg med et musanti-MeCP2 antistoff, plateblokkering og prøvetillegg, etterfulgt av en 4 h inkubasjon med et kaninanti-MeCP2 antistoff. Påfølgende inkubasjon med et spesifikt sekundært antistoff (Table of Materials) og tillegg av reagenser som er nødvendige for at luminescensreaksjonen skal finne sted, utgjør de siste viktige trinnene i denne prosedyren.
For å optimalisere ECLIA-ytelsen kan følgende trinn utføres. Maksimal effekt for signalet for denne analysen bør ikke overstige en million tellinger. For å hindre at væsken sprer seg utover elektroden, kan en teknikk som kalles flekkbelegg brukes til å introdusere beleggløsningen i brønnen. Denne teknikken krever høy presisjon pipettering eller bruk av en pipette robot. I tillegg kan testing av ulike antistoffkonsentrasjoner være nyttig for både å øke analysens spesifisitet og redusere bakgrunnssignalet. For å løse sistnevnte kan ulike blokkere (for eksempel MSD, Blocker D-M) også brukes til en endelig konsentrasjon på 0,1%. For å optimalisere signalkvaliteten anbefales testing av ulike inkubasjonstider (risting på eller over 300 o/min). Til slutt, for å øke utvinning og fortynning linearitet i spesifikke medier som serum, plasma, urin eller cerebrospinalvæske, kan flere fortynningsmidler testes.
Semi-kvantitativ vestlig blot og kommersielt tilgjengelig MeCP2-ELISA brukes vanligvis til å studere MeCP2 proteinnivåer. Arbeidsprinsippet bak ELISA er lik vår ECLIA med den bemerkelsesverdige forskjellen er deteksjonsmodus. Sammenlignet med disse metodene er MeCP2-ECLIA raskere og mer praktisk. ECLIA ble brukt til å analysere for wildtype, heterozygous og Mecp2-knockout mus hjerneprøver (Figur 3A), med funn sammenlignet med MeCP2 mengder fra de samme prøvene oppnådd av vestlige blotting (data ikke vist). En markert forskjell ble observert i MeCP2 nivåer av kvinnelig wildtype og heterozygous mus hjerneprøver målt av ECLIA som ikke ble oppdaget som statistisk signifikant av den vestlige flekken. Denne høyere ECLIA analyse nøyaktighet kan være viktig i søket etter nye forbindelser som kan heve MeCP2 protein nivåer.
I tillegg er MeCP2-ECLIA mindre kostbart enn mecp2-ELISA-motparten, og på grunn av det høye dynamiske området fra 1 ng/ml til 1800 ng/ml (R2 = 0,996), kan brukes med prøver som inneholder lave MeCP2-beløp. Sammenlignet med alle de kommersielt tilgjengelige ELISA-settene, overgår ECLIA dem sterkt. ECLIA har et gunstigere dynamisk område fra 1-1800 ng/ml sammenlignet med sine ELISA-kolleger, som ble funnet å være 0,312−20 ng/ml (mus, Cloud-Clone Corp.) og 0,156–10 ng/ml (menneskelig, Cloud-Clone Corp.). På grunn av fravær av en eksplisitt definisjon av en lavere grense for deteksjon, er den direkte sammenligningen mellom disse to analysene ikke mulig i forbindelse med dette arbeidet.
Oppsummert har det blitt vist at MeCP2-ECLIA nøyaktig kan bestemme MeCP2-beløp i vivo og in vitro. Mens etterfylling av MeCP2 proteinnivåer i nevronene til RTT-berørte pasienter er faktisk en lovende behandlingsvei, kan tilstedeværelse av overdreven MeCP2 også føre til alvorlige nevrologiske symptomer, forbundet med MECP2 dupliseringssyndrom16,17,18. Som sådan kan denne metoden være av integrert betydning for å optimalisere mengden eksogene introdusert MeCP2 under proteinerstatningsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi er veldig takknemlige til Dr. Brigitte Sturm for hennes støtte til ECLIA-instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
