Summary
Электрохимилюминесценционный иммуноанализ (ECLIA) является новым подходом к количественному выявлению эндогенных и экзогенно применяемых белков meCP2 вариантов, который производит высококоличественные, точные и воспроизводимые измерения с низкой внутри- и межанализу ошибки в широком рабочем диапазоне. Здесь описан протокол MeCP2-ECLIA в формате 96 скважин.
Abstract
ECLIA является универсальным методом, который способен количественно эндогенных и рекомбинантных белков в формате 96-наилучшим образом. Чтобы продемонстрировать эффективность ECLIA, этот анализ был использован для анализа внутренних уровней MeCP2 в ткани мозга мыши и поглощения TAT-MeCP2 в человеческих кожных фибробластов. MeCP2-ECLIA производит высокоточные и воспроизводимые измерения с низкой погрешностью внутри- и межанализа. Таким образом, мы разработали количественный метод для оценки вариантов белка MeCP2, которые могут быть использованы в высокопроизводительных экранах.
Introduction
Электрохимилюминесценция иммуноанализ (ECLIA) основана на процессе, который использует этикетки, предназначенные для испускания люминесценции, когда электрохимически стимулировали. Это широко применимый метод количественного обнаружения биологических аналитов в основных отраслях промышленности и научных исследованиях, пищевой промышленности, а также в клинической диагностике1. Обычно используется одноразовая 96-колодная пластина с углеродными чернилами. Эти электроды выступают в качестве твердой фазы носителя для иммуноанализ. Вторичное антитело спрягается с электрохимилюминесцентной этикеткой, и при применении электричества к системе срабатывает световое излучение химической этикетки. Ультра-низкий шум заряда связаны устройства (CCD) записывает интенсивность света, который прямо пропорциональна антигена связаны с захватом антитела в результате количественной оценки целевого анализ образца2. По сравнению с фермент-связанных иммуносорбент анализа (ELISA), ECLIA считается выгодным, поскольку он предлагает более высокую чувствительность и воспроизводимость, а также лучшую автоматизацию и консистенцию3.
Здесь мы проанализировали уровень связывающего белка метил-CpG 2 (MeCP2) в образцах происхождения человека и мурина, а также различные варианты рекомбинантного белка с использованием недавно разработанной системы ECLIA. MecP2 — это x-связанный нуклеиновой кислотно-связывающий белок, который, как известно, взаимодействует с метилированными последовательностями ДНК. Этот белок был вовлечен в регуляцию экспрессии генов4,,5. Потеря функции мутаций в гене, который кодирует этот белок являются основными виновниками вызывая синдром Ретт (RTT), тяжелое расстройство нервнойсистемы 6. Другой MeCP2 связанных расстройство, синдром дублирования MECP2, также приводит к неврологическим симптомам, которые могут перекрываться с RTT7. Примечательно, что женщины в основном страдают от RTT в то время как мужчины в основном страдают от синдрома дублирования MECP2 6,7.
Эти расстройства связаны с недостаточным или избыточным уровнем MeCP2 соответственно в центральной нервной системе (ЦНС). Таким образом, варианты лечения RTT, которые включают повышение уровня MeCP2 в ЦНС необходимо, чтобы избежать пагубных последствий, связанных с превышением MeCP27. В связи с этим, очень чувствительныи и точные количественной оценки уровня белка MeCP2, как это предусмотрено системой ECLIA, имеет решающее значение для развития RTT, а также MECP2 исследования синдрома дублирования. Точные измерения эндогенных и экзогенных уровней MeCP2 из клеточных линий человека и образцов тканей мыши, а также рекомбинантный белок, состоящий из изоформы человека MeCP2 (также известный как изоформный e1), и минимальный N-терминальный ВИЧ-TAT трансдукционный домен (TAT-MeCP2), который имеет потенциал, чтобы пересечь гематоген-барьер8,представлены в этой работе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Разрешение на закупку биопсии кожи в исследовательских целях было получено от Комитета по этике исследований человека Детской больницы в Вестмиде, Австралия. Согласие на эксперименты на животных было получено от Федерального министерства науки, исследований и экономики Австрии, которые были выполнены в соответствии с местными правилами защиты животных (ГЗ: 66.009/0218-II/3b/2015).
ПРИМЕЧАНИЕ: Принцип системы ECLIA изображен на рисунке 1.
1. Выбор антител
- Оцените соотношение сигнала к шуму для ряда различных антител MeCP2 и определите наилучшую силу сигнала и самую высокую специфичность в сочетании первичного моноклонального антитела MeCP2 мыши (клон Mec-168) и антитела обнаружения обнаружения кролика Polyclonal MeCP2 (обычное). Для вторичного антитела, используйте системно-специфические антитела (Таблица материалов), который также был экспериментально проверен.
ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица 1 дает обзор всех проверенных антител во время разработки MeCP2-ECLIA и их проверенных диапазонов разбавления.
| Функции | Имя | Клон | Разбавления |
| Основной | Мышь, анти-MeCP2 | Mec-168 | 1:500-1:10,000 |
| Основной | Мышь, анти-MeCP2 | 4B6 | 1:250-1:4,000 |
| Основной | Мышь, анти-MeCP2 | Мужчины-8 | 1:500-1:4,000 |
| Основной | Мышь, анти-MeCP2 | 1B11 | 1:500-1:4,000 |
| Основной | Кролик, анти-MeCP2 | D4F3 | 1:500-1:4,000 |
| Вторичного | Кролик, анти-MeCP2 | Поликлональных | 1:2,000-1:20,000 |
| Вторичного | Кролик, анти-MeCP2 | Поликлональных | 1:2,000-1:20,000 |
| Обнаружения | SULFO-TAG помечены анти-кролик | Поликлональных | 1:500-1:1,000 |
Таблица 1: Список антител и используемых рабочих разбавлений.
- Кроме того, используйте каждую пару meCP2-антител, которые хорошо работают с обычными ELISA.
2. Лечение HdFs с белком синтеза TAT-MeCP2
ПРИМЕЧАНИЕ: TAT-MeCP2 был рекомбинантно выражен в escherichia coli и очищен с помощью стандартных хроматографических методов, как ранее описано8 и хранится при -80 градусов по Цельсию.
- Плита 1 х 106 человека дермальной фибробласт (HDF) клетки в 100 мм блюд и расти клетки на ночь при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2, пока они не достигнут около 90% confluency.
- Вынвейте один флакон белка синтеза TAT-MeCP2. Оттепель на льду и аккуратно перемешать.
- Разбавить TAT-MeCP2 до конечной концентрации 500 нм в 50 мл носителей культуры HDF.
- Удалите средства массовой информации из 100 мм посуды и инкубировать клетки с 500 нм TAT-MeCP2 при 37 градусах Цельсия для различных инкубационных периодов до 24 ч.
- Удалите раствор TAT-MeCP2 из ячеек. Вымойте клетки 2x с предварительно подогретых Dulbecco в фосфат-буферный солен (DPBS).
- Лечить клетки с 2 мл 0,05% трипсин-EDTA раствор в течение 5 мин при 37 КС10.
- Добавьте 6 мл средств массовой информации культуры HDF, чтобы инактивировать трипсин и собрать клетки в трубках 15 мл.
- Пелле клетки центрифугации при 500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и мыть клетки 2x с ледяной DPBS. Храните гранулы на льду и приступайте к подготовке образца.
3. Подготовка образцов
- Лисаты HDF
- Определите самые высокие уровни белка MeCP2 с помощью метода REAP для субклеточной фракционирования в цитоплазмамические и ядерные субклеточные отсеки в соответствии с Suzuki et al.11. Ограничьте фракционирование не более чем шестью образцами за эксперимент.
- Мышиные мозговые лисаты
- Приготовьте 100 мл каждого гипотонного лисисового реагента и буфера извлечения.
- Для гипотонического лисис-реагента хорошо перемешайте 10 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния и 10 мм хлористого калия.
- Для буфера извлечения хорошо смешайте 20 мМ HEPES, 1,5 мм хлорида магния, 0,42 М хлористого натрия, 0,2 мм ЭДТА и 25% (v/v) глицерола.
- Отрегулируйте рН обоих буферов до 7,9.
- Добавьте 1 мМ дитиотрейтол (DTT) и 1x коктейль-ингибитор протеазы в оба буфера свежего. Охладите на льду перед использованием.
- Приостановить 100 мг общего мозга мыши (напряжение: C57BL/6J, дикий тип мужчины и женщины и B6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous мужского и гетерозиготного женского пола; возраст: 4'8 недель) в 1 мл ледяного гипототониса реагент.
- Гомогенизировать мозг с предварительно охлажденной Dounce все стекла ткани гомогенизатор 15 ударов гомогенизатора А (свободный, для большого клиренса) и B (жесткий, для небольшого зазора), соответственно.
- Перенесите гомогенизированные клетки в чистую трубку и центрифугу при 10 000 х г в течение 20 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта (или держите его в качестве цитоплазматической фракции для дальнейшего использования).
- Приостановите гранулы в 140 л из буфера экстракции на 100 мг исходного материала. Поместите трубку в предварительно охлажденный термоблок и аккуратно перемешайте в течение 30 мин при 4 градусах Цельсия.
- Центрифуга трубки при 16000 г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант (т.е. ядерную фракцию) в новую предварительно охлажденный трубку и храните при -80 градусов до использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация белка лизатов, полученных из мозга мыши и HDFs может быть оценена по анализу белка BCA.
- Приготовьте 100 мл каждого гипотонного лисисового реагента и буфера извлечения.
4. Протокол MeCP2-ECLIA
- Приготовление стирального раствора, блокирование буфера и асси разбавите (день 1)
- Добавьте 500 л Tween от 20 до 1 л PBS, чтобы подготовить 0,05% Tween 20 в растворе PBS, энергично перемешайте и наметите как «стиральное решение».
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что используется только свежеприготовленный буфер для стирки. - Подготовьте блокирующее решение 3% блокатора A(Таблица материалов)в фосфатно-буферизированном сольнике (PBS). Смешайте нежным помешивая, фильтр стерилизовать и держать их в холодильнике до использования в течение максимум двух недель.
- Добавьте 5 мл блокирующего раствора в 10 мл PBS для подготовки разбавителя (1% блокатор а в PBS).
- Добавьте 500 л Tween от 20 до 1 л PBS, чтобы подготовить 0,05% Tween 20 в растворе PBS, энергично перемешайте и наметите как «стиральное решение».
- Покрытие высокосвязных пластин
- Выньте 96-хорошо многослойной одной пластины высокой связывания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокосвязные пластины имеют большую связывающую способность и, следовательно, больший динамический диапазон, чем стандартные пластины с гидрофобными поверхностями. - Оттепели моноклональные мыши анти-MeCP2 антитела на льду и смешать 0,67 л антитела с 4 мл PBS (1:6,000 разбавления антител в PBS). Vortex антитела решение хорошо перемешать и этикетки трубки как "покрытие решение".
- Тщательно распределите 25 зл покрытия раствора в нижнем углу каждой скважины с помощью многоканального пипетатора; это называется методом покрытия раствора. Нажмите 96-ну хорошо пластины осторожно с каждой стороны, чтобы убедиться, что покрытие решение охватывает дно каждого колодца.
- Запечатать тарелку клейкой фольгой и инкубировать тарелку в холодильнике при цене 4 градусов по Цельсию на ночь (12–16 ч).
- Выньте 96-хорошо многослойной одной пластины высокой связывания.
- Блокировка (день 2)
- Вынуть тарелку из холодильника и удалить фольгу.
- Удалите раствор покрытия антител, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите на тарелку на бумажном полотенце, чтобы удалить все покрытие раствор из колодцев.
- Добавьте 125 л блокирующего раствора на скважину. Запечатайте пластину снова и поместите ее на орбитальный микроплитный шейкер.
- Инкубировать тарелку в течение 90 минут при комнатной температуре при постоянной тряске при 800 об/мин.
- Подготовка стандартов и образцов
- Во время инкубации подготовьте стандарты белка MeCP2 и/или TAT-MeCP2 и различные образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Lysis буфер, используемый для стандартного разбавления, должен быть таким же, как и в исследуемых образцах. - Выняйте один флакон из раствора протеинового запаса MePC2 и/или TAT-MeCP2 (250 мкг/мл), щелочаций мозга мыши и лисатов HDF от -80 градусов по Цельсию. Оттепель их на льду.
- Разбавить стандартный складраствор (MeCP2 и/или TAT-MeCP2) в чистых трубках в соответствии с таблицей 2.
- Разбавить образцы в буфере лисиса следующим образом: 1–20 мкг щели мозга мыши на 25 л буфера из лисиса и 0,25-1 мкг лизата HDF на 25 л буфера лисиса. Подготовьте достаточный объем каждого образца для проведения анализа в тройном.
- Во время инкубации подготовьте стандарты белка MeCP2 и/или TAT-MeCP2 и различные образцы.
| Стандартный | Концентрации | Разбавления |
| Стандарт 1 | 1800 нг/мл | 1,08 л стандартный фондовый раствор 148,92 л люсиса буфера |
| Стандарт 2 | 600 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 1 100 Л Люсиса |
| Стандарт 3 | 200 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 2 и 100 л люсиса |
| Стандарт 4 | 66,67 нг/мл | 50 зЛ Стандартный 3 й 100 l L Lysis буфер |
| Стандарт 5 | 22.22 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 4 и 100 л люсиса |
| Стандарт 6 | 7,41 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 5 и 100 л люсиса |
| Стандарт 7 | 2,47 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 6 и 100 л люсиса |
| Стандарт 8 | 0,82 нг/мл | Буфер 50 Зл Стандарт 7 и 100 Л Люсиса |
| Стандарт 9 | 0,27 нг/мл | 50 зЛ Стандарт 8 и 100 л люсиса буфер |
| Стандарт 10 | 0 нг/мл | Буфер 150 Л Lysis |
Таблица 2: Стандартная серия от 0 до 1800 нг/мл.
- Добавление образцов и стандартных решений
- Удалите блокирующее решение, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце, чтобы удалить все блокирующие растворы из колодцев.
- Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
- Добавьте 25 ул стандартов и образцов в нижний угол скважины с помощью одного канала пипетки.
- Печать пластины и инкубировать пластину в течение 4 ч при комнатной температуре с постоянной тряски на 800 об/мин.
- Антитела немаркированного обнаружения
- Оттепель поликлональных кролика анти-MeCP2 антитела на льду. Разбавить антитела 1:6,000 в расса разбавить раствор.
- Удалите стандарты и образцы, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
- Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
- Добавьте 25 зл немаркированных антител обнаружения к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать его в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
- Специфические конъюгированные антитела
- Вынизить из холодильника специфическое вторичное антитело(Таблица материалов)и поместите его на лед. Разбавить антитела 1:666.67 в ассе разбавитель раствора и аккуратно перемешать.
- Удалите свободные немаркированные вторичные антитела, щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
- Вымойте тарелку 3x с 150 л стирального раствора, добавив стиральный раствор и немедленно удалите его.
- Добавьте 25 зл и специфические конъюгированные антитела(Таблица материалов)к каждому колодцу с многоканальным пипеттором. Печать пластины и инкубировать в течение 1 ч с постоянной тряски при 800 об/мин при комнатной температуре.
- Чтение тарелки
- Удалите свободные спряжение антитела (Таблица материалов), щелкнув его в корзину для мусора и нажмите тарелку на бумажное полотенце.
- Вымойте тарелку 3x с 150 зл стирки раствора.
- Добавьте 150 зл 1x Tris основе золото читать буфер (Таблица материалов) с сурфактант, содержащий трипропиламин в качестве со-реценгенанта для светогенерации на пластину. Избегайте любых пузырьков воздуха, используя обратные методы пипетки.
- Поместите пластину на платформу обнаружения микроплит(Таблица материалов)и немедленно начните измерение. Используйте настройки для приобретения пластины 96 колодцев.
- Захват электрохимилуминеционных сигналов встроенной камерой CCD в системе обнаружения электрохимилуминесценции(Таблица материалов)и запись количества сигналов, которые соответствуют относительному световому агрегату (RLU) и прямо пропорциональны интенсивности света.
ПРИМЕЧАНИЕ: При электрохимической стимуляции метка рутения, привязанная к углеродовому электроду, излучает свет люминесценции на уровне 620 нм. Анализ данных с помощью программного обеспечения, сопровождаемого инструментом(Таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Принцип системы ECLIA описан на рисунке 1. Стандартные кривые для двух вариантов MeCP2 отображаются на рисунке 2. Точная количественная оценка была возможна в широком диапазоне концентраций (1–1800 нг/мл). На рисунке 3были проанализированы уровни lysates MeCP2, полученные из мозга мыши и HDFs. Выражение MeCP2 в ядерных лисатах мозга от гетерозиготных, диких и нокаутовых мышей сравнивалось на рисунке 3A,в то время как на рисунке 3B не был обнаружен белок MECP2-дефицитных человеческих фибробластов (c.806delG) с использованием ECLIA. Поглощение TAT-MeCP2 по MECP2-дефицитной клеточной линии (c.806delG) также было исследовано с течением времени(рисунок 4). Наконец, точность меж- и внутри-асса была продемонстрирована, как показано в таблице 3.
Рисунок 1: Диаграмма электронно-химилуминесценции MeCP2. Эта цифра была адаптирована из www.meso-scale.com. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Стандартная кривая MeCP2, полученная из человеческого MeCP2 в нескольких измерениях. Нижний предел обнаружения (LLOD), определяемый как 2,5 стандартных отклонений (SD) выше пробела, составляет 1,00 нг/мл. Рекомбинантный человек MeCP2 (Abnova) может быть точно количественно в диапазоне от 1,00 нг/мл (LLOD) до 1800 нг/мл (верхний предел обнаружения «ULOD») с R2 и 0,996. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку n No 3. Цифра была изменена от Steinkellner и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: уровни MeCP2 в мозге мыши и HDFs. (A) Уровни MeCP2-белка были измерены в ядерных лисатах мозга от гетерозиготных (серый, HET) и самок диких мышей типа (черный, дикий тип) (n No 4) и один Mecp2-нокаут мыши (RTT); (B) Сотовые lysates от MeCP2-дефицитной линии клетки фибробласта (c.806delG) выведено от мыжского пациента с neonatal энцефалопатией как модель для синдрома RTT были дирижированы для того чтобы определить уровни протеина MeCP2 в людях и здорового управления (черного цвета). Представленные данные являются средними - SD тройных скважин (n No 3). Нет meCP2 белка была обнаружена (ниже диапазона обнаружения) в мутантных клеточных линий иммунофлуоресценции или с помощью ECLIA, далее демонстрируя, что это очень чувствительная система для дальнейшего поглощения исследований с белками TAT-фьюжн. Эта цифра была изменена от Steinkellner и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Зависимость от времени поглощения TAT-MeCP2. Уровни MeCP2 ядерных фракций в C.806delG HDFs были обработаны 500 нм рекомбинантным белком TAT-MeCP2. Анализ проводился с помощью MeCP2-ECLIA. В оговоренные временные моменты, клетки были промыты DPBS и инкубировали с 0,05% трипсин-EDTA в течение 5 минут, чтобы устранить внеклеточной связаны TAT-MeCP2. Трипсинизация была остановлена путем добавления носителей сыворотки. Суспензия клетки была центрифугировалась при 500 х г в течение 5 мин. После мытья клеточной гранулы 2x с ледяной DPBS, образец был подготовлен для извлечения ядерной фракции, как описано в разделе протокола. Эта цифра была изменена от Steinkellner и др.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| ИНТРА-АССАЙ | ИНТЕР АСССЕ | ||||||||||
| ng MeCP2 на белок мл | ng MeCP2 на белок мл | ||||||||||
| Ну 1 | Ну 2 | Ну 3 | Означает | SDa | SEMb | %CVc | Означает | SDa | SEMb | %CVc | |
| Фибробласты человека | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Мышь мозга lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a Стандартное отклонение, bСтандартная ошибка Средняя, cКоэффициент вариации | |||||||||||
Таблица 3: Определение точности межассоса в три дня подряд HDF и диких мышиных мозговых лисатов. На скважину применялся белок клеточного лизата в размере 1,10 мкг. a SD, стандартное отклонение; b SEM, стандартное среднее погрешность; c CV, коэффициент вариации. Эта таблица была изменена от Steinkellner и др.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для измерения эндогенных уровней MeCP2, рекомбинантных MeCP2 и TAT-MeCP2 была разработана 96-колодная пластина ECLIA. Было показано, что потеря функции белка MeCP2 приводит к синдрому RTT6, для которого лечение в настоящее время ограничивается симптомам управления и физической терапии. Одним из перспективных путей лечения является так называемая белковая заместительная терапия, где уровни MeCP2 могут быть тистрированы до их необходимой концентрации12,,13,,14,15. Потенциал tAT-фьюжн белков пересечь гематоэнцефалический барьер оказался успешным в течение последних двух десятилетий12,13,14,15. Таким образом, этот метод для доставки MeCP2 может быть полезен в контексте введения белковой заместительной терапии. Для того, чтобы оценить потенциал белков TAT-фьюжн и других методов лечения для восстановления уровня белка MeCP2, разработка эффективного и доступного анализа, который может количественно их значение имеет первостепенное значение. Ассеи, описанный в этой работе, ECLIA, способен точно, а также последовательно определять уровни MeCP2 с благоприятными внутри- и меж-ассаевыми значениями(Таблица 3).
Для следующего протокола MeCP2-ECLIA, мышиные мозговые лисаты и HDFs были использованы в качестве клеток, представляющих интерес. Тем не менее, этот протокол может быть использован со всеми другими типами клеток, по крайней мере человека и мурина происхождения. Кроме того, HDFs были обработаны с tAT-MePC2 синтез агенства для того чтобы показать способность этого анализа для того чтобы измерить различные варианты протеина MeCP2. Во время подготовки к образу образец, избегая или минимизации сокращения агентов в буфере лизиса, таких как DTT или -mercaptoethanol, имеет решающее значение для сохранения эффективности техники. Дополнительные критические шаги в этом методе включают покрытие пластины с антителами мыши anti-MeCP2, блокирование плиты, и добавление образца, последовано за инкубации 4 h с антителом anti-MeCP2 кролика. Последующее инкубацию с конкретным вторичным антителом(Таблица материалов)и добавление реагентов, необходимых для реакции люминесценции, составляют заключительные важные шаги этой процедуры.
В целях оптимизации производительности ECLIA могут быть предприняты следующие шаги. Максимальный выход сигнала для этого ассоцизмненей не должен превышать одного миллиона пунктов. Для того, чтобы жидкость не распространилась за пределы электрода, метод, называемый пятно покрытие может быть использован для введения покрытия решение в скважину. Этот метод требует высокой точности пипетки или использования робота-пипетки. Кроме того, тестирование различных концентраций антител может быть полезно как для увеличения специфики анализа и снижения фонового сигнала. Для решения последних, различные блокаторы (например, MSD, Blocker D-M) также могут быть использованы для окончательной концентрации 0,1%. Для оптимизации качества сигнала рекомендуется тестирование различных инкубационных времен (тряска при 300 об/мин или выше 300 об/мин). Наконец, для увеличения восстановления и разбавления линейности в конкретных носителях, таких как сыворотка, плазма, моча или спинномозговой жидкости, несколько разбавителей могут быть проверены.
Полуколичественные западные позывные и коммерчески доступные MeCP2-ELISA обычно используются для изучения уровней белка MeCP2. Принцип работы, лежащий в основе ELISA, аналогичен принципу нашего ECLIA, при этом заметным отличием является режим обнаружения. По сравнению с этими методами, MeCP2-ECLIA быстрее и удобнее. ECLIA был использован для анализа для wildtype, heterozygous и Mecp2-нокаут мыши образцы мозга(Рисунок 3A), с выводами по сравнению с MeCP2 суммы из тех же образцов, полученных западной blotting (данные не показаны). Заметная разница наблюдалась в meCP2 уровнях женского дикого типа и гетерозиготных образцов мозга мыши, измеренных ECLIA, который не был обнаружен как статистически значимый западным пятном. Это более высокая точность ecLIA анализ может быть важным в поиске новых соединений, которые могут поднять meCP2 белков.
Кроме того, MeCP2-ECLIA является менее дорогостоящим, чем его коллега MeCP2-ELISA и из-за его высокой динамической дальности от 1 нг/мл до 1800 нг/мл (R2 и 0,996), могут быть использованы с образцами, содержащими низкие количества MeCP2. По сравнению со всеми коммерчески доступными комплектами ELISA, ECLIA значительно превосходит их. ECLIA обладает более благоприятным динамическим диапазоном от 1–1800 нг/мл по сравнению с его аналогами ELISA, которые, как было установлено, составляли 0,312-20 нг/мл (мышь, Облако-Клон Корп.) и 0,156-10 нг/мл (человек, Cloud-Clone Corp.). Из-за отсутствия четкого определения нижнего предела обнаружения его прямое сравнение между этими двумя анализами невозможно для целей этой работы.
Таким образом, было показано, что MeCP2-ECLIA может точно определить meCP2 суммы в vivo и in vitro. В то время как пополнение уровня белка MeCP2 в нейронах ПАЦИЕНТОв, пострадавших от RTT, действительно является перспективным способом лечения, наличие чрезмерного MeCP2 может также привести к тяжелым неврологическим симптомам, связанным с синдромом дублирования MECP216,17,18. Таким образом, этот метод может быть неотъемлемым значением в оптимизации количества экзогенно введенных MeCP2 во время заместительной белка терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы очень благодарны доктору Брижит Штурм за ее поддержку инструментом ECLIA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H.
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
