Summary
Electrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) är en ny metod för kvantitativ detektion av endogena och exogent tillämpas MeCP2 protein varianter, som producerar mycket kvantitativa, exakta och reproducerbara mätningar med låg inom- och inter-assay fel över ett brett arbetsområde. Här beskrivs protokollet för MeCP2-ECLIA i ett 96-brunnsformat.
Abstract
ECLIA är en mångsidig metod som kan kvantifiera endogena och rekombinanta proteinmängder i ett 96-brunnsformat. För att visa ECLIA effektivitet, denna analys användes för att analysera inneboende nivåer av MeCP2 i mus hjärnvävnad och upptag av TAT-MeCP2 i mänskliga dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA producerar mycket exakta och reproducerbara mätningar med lågt intra- och inter-assay-fel. Sammanfattningsvis utvecklade vi en kvantitativ metod för utvärdering av MeCP2 proteinvarianter som kan användas i skärmar med hög genomströmning.
Introduction
Elektrochemiluminescence immunoassay (ECLIA) är baserad på en process som använder etiketter som är utformade för att avge luminescence när elektrokemiskt stimuleras. Det är en allmänt tillämplig teknik för kvantitativ påvisande av biologiska analyter inom basindustri och akademisk forskning, livsmedelsindustrin samt klinisk diagnostik1. Vanligen används en engångsplatta med 96-brunnsplatta med kolbläckelektroder. Dessa elektroder fungerar som en solid-fas bärare för immunoassay. En sekundär antikropp konjugeras till en elektroketuminescerande etikett och när elektricitet appliceras på systemet utlöses ljusemission av kemikalieetiketten. En extremt låg ljudladdningskopplad anordning (CCD) registrerar den ljusintensitet som är direkt proportionell mot det antigen som är bundet till avskiljningsantikroppen, vilket leder till kvantifiering av den riktade analyten av provet2. Jämfört med den enzymrelaterade immunosorbentanalysen (ELISA) anses ECLIA vara fördelaktigt eftersom det ger högre känslighet och reproducerbarhet samt bättre automatisering och konsekvens3.
Här analyserade vi metyl-CpG bindande protein 2 (MeCP2) nivåer i prover av mänskligt och murin ursprung samt olika varianter av rekombinanta proteinet med hjälp av det nyutvecklade ECLIA-systemet. MecP2 är ett X-linked nukleinsyrabindande protein som är känt för att interagera med metylerade DNA-sekvenser. Detta protein har varit inblandad i regleringen av genuttryck4,5. Förlust av funktion mutationer i genen som kodar detta protein är de största syndarna som orsakar Rett syndrom (RTT), en allvarlig neurodevelopmental disorder6. En annan MeCP2-relaterad sjukdom, MECP2 dubbelarbete syndrom, leder också till neurologiska symtom som kan överlappa med dem i RTT7. Särskilt kvinnor påverkas främst av RTT medan män är mest drabbade av MECP2 dubbelarbete syndrom6,7.
Dessa sjukdomar är associerade med otillräckliga eller överskott MeCP2 nivåer respektive i centrala nervsystemet (CNS). Därför skulle behandlingsalternativ för RTT som innebär att öka MeCP2-nivåerna i CNS måste undvika de skadliga effekterna i samband med överskott av MeCP27. På grund av detta faktum är en mycket känslig och exakt kvantifiering av MeCP2-proteinnivåer, i enlighet med ECLIA-systemet, avgörande för utvecklingen av forskning om RTT och MECP2 dubbelarbete. De exakta mätningarna av endogena och exogena MeCP2-nivåer från mänskliga cellinjer och musvävnadsprover samt ett rekombinant protein bestående av humant MeCP2 isoform B (även känd som isoform e1), och en minimal N-terminal HIV-TAT transduktionsdomän (TAT-MeCP2) som har potential att passera blod-hjärnbarriären8,9 presenteras i detta arbete.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkännande för hudbiopsi upphandling för forskningsändamål erhölls från Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australien. Samtycke till djurförsök erhölls från det österrikiska förbundsministeriet för vetenskap, forskning och ekonomi, som utfördes i enlighet med lokala djurskyddsbestämmelser (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
OBS: Principen om ECLIA-systemet finns i figur 1.
1. Antikroppsval
- Utvärdera signal-brusförhållandet för en rad olika MeCP2-antikroppar och identifiera den bästa signalstyrkan och högsta specificiteten i kombinationen av en primär musmonklonal MeCP2-antikropp (klon Mec-168) och kaninpolyklonal MeCP2-detektionsantikropp (skräddarsydd). För den sekundära antikroppen, använd en systemspecifik antikropp (Tabell över material), som också kontrollerades experimentellt.
OBS: Tabell 1 ger en översikt över alla verifierade antikroppar under meCP2-ECLIA utveckling och deras testade utspädningsområden.
| Funktion | Namn | Klon | Utspädning |
| Primära | Mus, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500−1:10 000 |
| Primära | Mus, anti-MeCP2 | 4B6 (4B6) | 1:250−1:4 000 |
| Primära | Mus, anti-MeCP2 | Män-8 | 1:500−1:4 000 |
| Primära | Mus, anti-MeCP2 | 1B11 (På andra sätt) | 1:500−1:4 000 |
| Primära | Kanin, anti-MeCP2 | D4F3 | 1:500−1:4 000 |
| Sekundära | Kanin, anti-MeCP2 | Polyklonala | 1:2 000−1:20 000 |
| Sekundära | Kanin, anti-MeCP2 | Polyklonala | 1:2 000−1:20 000 |
| Upptäckt | SULFO-TAG märkt anti-kanin | Polyklonala | 1:500−1:1 000 |
Tabell 1: Förteckning över antikroppar och använd arbetsspädning.
- Alternativt kan du använda varje par MeCP2-antikroppar som fungerar bra med konventionell ELISA.
2. Behandling av HDFs med TAT-MeCP2 fusionsprotein
OBS: TAT-MeCP2 uttrycktes rekombinantt i Escherichia coli och renas med hjälp av standard kromatografiska tekniker som tidigarebeskrivits 8 och lagras vid -80 °C.
- Platta 1 x 106 mänskliga dermal fibroblaster (HDF) celler i 100 mm rätter och odla cellerna över natten vid 37 °C med 5% CO2 tills de når ca 90% confluency.
- Ta ut en flaska TAT-MeCP2 fusionsprotein. Tina på is och blanda försiktigt.
- Späd TAT-MeCP2 till en slutlig koncentration av 500 nM i 50 ml HDF kultur media.
- Ta bort mediet från 100 mm rätter och inkubera cellerna med 500 nM TAT-MeCP2 vid 37 °C under olika inkubationstider upp till 24 timmar.
- Ta bort TAT-MeCP2-lösningen från cellerna. Tvätta cellerna 2x med förvärmd Dulbeccos fosfatbuffertade koksaltlösning (DPBS).
- Behandla cellerna med 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-lösning i 5 min vid 37 °C10.
- Tillsätt 6 ml HDF-odlingsmedia för att inaktivera trypsin och samla cellerna i 15 ml-rör.
- Pellet cellerna genom centrifugering vid 500 x g i 5 min vid rumstemperatur.
- Ta bort supernatanten och tvätta cellerna 2x med iskall DPBS. Förvara pelleten på is och fortsätt med provberedningen.
3. Provberedning
- HDF lysates
- Bestäm de högsta proteinnivåerna av MeCP2 med hjälp av REAP-metoden för subcellulär fraktionering i de cytoplasmatiska och nukleära subcellulära facken enligt Suzuki et al.11. Begränsa fraktionationen till högst sex samplingar per experiment.
- Mus hjärna lysates
- Förbered 100 ml av varje hypotonisk lysreagens och extraktionsbuffert.
- För hypotonisk lysreagens, blanda väl 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid och 10 mM kaliumklorid.
- För extraktionsbufferten, blanda väl 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumklorid, 0,42 M natriumklorid, 0,2 mM EDTA och 25% (v/v) glycerol.
- Justera pH-värdet för båda buffertarna till 7,9.
- Tillsätt 1 mM dithiothreitol (DTT) och 1x proteashämmare cocktail till båda buffertarna nyligen. Chill på is före användning.
- Suspend 100 mg totala mus hjärnan (stam: C57BL/6J, vildtyp manliga och kvinnliga och B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Bird/J, hemizygous manliga och heterozygous kvinna; ålder: 4−8 veckor gammal) i 1 ml iskall hypotononisk lysis reagens.
- Homogenisera hjärnan med en förkyld Dounce helt glas vävnad homogenisator med 15 slag av homogenisator A (lös, för stor clearance) och B (tight, för små clearance), respektive.
- Överför de homogeniserade cellerna till ett rent rör och centrifug vid 10 000 x g i 20 min vid 4 °C. Kassera supernatanten (eller håll den som cytoplasmatisk fraktion för vidare användning).
- Resuspend pelleten i 140 μL extraktionsbuffert per 100 mg utgångsmaterial. Placera röret i ett förkylt termoblock och blanda försiktigt i 30 min vid 4 °C.
- Centrifugera röret vid 16 000 g i 10 min vid 4 °C. Överför supernatanten (dvs. kärnkraftsfraktionen) till ett nytt förkylt rör och förvara det vid -80 °C tills det används.
OBS: Proteinkoncentrationen av lysates som härrör från mushjärna och HDFs kan bedömas med BCA-proteinanalysen.
- Förbered 100 ml av varje hypotonisk lysreagens och extraktionsbuffert.
4. MeCP2-ECLIA-protokollet
- Beredning av tvättlösning, blockerande buffert och analysspädningslösning (dag 1)
- Tillsätt 500 μl Tween 20 till 1 L PBS för att förbereda en 0,05% Tween 20 i PBS-lösning, blanda kraftigt och märk som "tvättlösning".
OBS: Se till att endast nyberedd tvättbuffert används. - Förbered en blockerande lösning på 3 % blockerare A (Tabell över material) i fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS). Blanda genom skonsam omrörning, filtrera sterilisera och förvara dem i kylen tills de används i högst två veckor.
- Tillsätt 5 ml blockerande lösning till 10 ml PBS för att förbereda analysspädningslösningen (1 % blockerare A i PBS).
- Tillsätt 500 μl Tween 20 till 1 L PBS för att förbereda en 0,05% Tween 20 i PBS-lösning, blanda kraftigt och märk som "tvättlösning".
- Beläggning av höga bindplattor
- Ta ut en 96-brunn multi-array enda plats hög bindning platta.
OBS: Höga bindningsplattor har en större bindningskapacitet och därmed ett större dynamiskt omfång än standardplattor med hydrofoba ytor. - Tina den monoklonala musantikroppen anti-MeCP2 på is och blanda 0,67 μL av antikroppen med 4 ml PBS (1:6 000 antikroppsutspädning i PBS). Vortex antikroppslösningen för att blanda väl och märka röret som "beläggningslösning".
- Fördela försiktigt 25 μL beläggningslösning i det nedre hörnet av varje brunn med hjälp av en flerkanalig pipettor; Detta kallas lösningsbeläggningsmetoden. Knacka försiktigt på 96-brunnsplattan på varje sida för att säkerställa att beläggningslösningen täcker botten av varje brunn.
- Försegla plattan med en självhäftande folie och ruva plattan i kylskåpet vid 4 °C över natten (12−16 h).
- Ta ut en 96-brunn multi-array enda plats hög bindning platta.
- Blockering (dag 2)
- Ta ut tallriken från kylskåpet och ta bort folien.
- Ta bort antikroppsbeläggningslösningen genom att snärta in den i papperskorgen och knacka på plattan på en pappershandduk för att ta bort all beläggningslösning från brunnarna.
- Tillsätt 125 μL blockerande lösning per brunn. Försegla plattan igen och placera den på en orbital microplate shaker.
- Inkubera plattan i 90 min vid rumstemperatur med konstant skakning vid 800 varv/min.
- Beredningar av standarder och prover
- Under inkubationstiden bereder du meCP2- och/eller TAT-MeCP2-proteinstandarder och olika prover.
OBS: Lysbuffert som används för standardutspädning måste vara densamma som i de analyserade proverna. - Ta ut en flaska MePC2 och/eller TAT-MeCP2 proteinbuljonglösning (250 μg/ml), mushjärnelyetter och HDF-lyst från -80 °C. Tina upp dem på is.
- Späd standardlagerlösningen (MeCP2 och/eller TAT-MeCP2) i rena rör enligt tabell 2.
- Späd proverna i lysbuffert enligt följande: 1−20 μg mushjärna lysate per 25 μL lysbuffert och 0,25−1 μg HDF lysate per 25 μL lysbuffert. Förbered tillräckligt med volym av varje prov för att utföra analyser i tre exemplar.
- Under inkubationstiden bereder du meCP2- och/eller TAT-MeCP2-proteinstandarder och olika prover.
| Standard | Koncentration | Utspädning |
| Standard 1 | 1 800 ng/ml | 1,08 μL Standardlagerlösning + 148,92 μL Lysbuffert |
| Standard 2 | 600 ng/ml | 50 μL standard 1 + 100 μl Lysbuffert |
| Standard 3 | 200 ng/ml | 50 μL standard 2 + 100 μl Lysbuffert |
| Standard 4 | 66.67 ng/ml | 50 μL Standard 3 + 100 μL Lysis buffert |
| Standard 5 | 22.22 ng/ml | 50 μL Standard 4 + 100 μL Lysis buffert |
| Standard 6 | 7.41 ng/ml | 50 μL Standard 5 + 100 μL Lysis buffert |
| Standard 7 | 2.47 ng/ml | 50 μL Standard 6 + 100 μL Lysis buffert |
| Standard 8 | 0,82 ng/ml | 50 μL standard 7 + 100 μl Lysbuffert |
| Standard 9 | 0.27 ng/ml | 50 μL standard 8 + 100 μl Lysbuffert |
| Standard 10 | 0 ng/ml | 150 μL Lysis buffert |
Tabell 2: Standardserie från 0 till 1 800 ng/ml.
- Lägga till prover och standardlösningar
- Ta bort blockeringslösningen genom att snärta in den i papperskorgen och knacka på plattan på en pappershandduk för att ta bort alla blockeringslösningar från brunnarna.
- Tvätta plattan 3x med 150 μL tvättlösning genom att tillsätta tvättlösningen och omedelbart ta bort den.
- Lägg till 25 ul av standarder och prover i det nedre hörnet av brunnen med hjälp av en enda kanal pipett.
- Försegla plattan och inkubera plattan i 4 timmar vid rumstemperatur med konstant skakning vid 800 varv/min.
- Omärkt detektionsantikropp
- Tina polyklonal kanin anti-MeCP2 antikroppar på is. Späd antikroppen 1:6 000 i analysspädningslösning.
- Ta bort standarder och prover genom att snärta in den i papperskorgen och knacka på plattan på en pappershandduk.
- Tvätta plattan 3x med 150 μL tvättlösning genom att tillsätta tvättlösningen och omedelbart ta bort den.
- Tillsätt 25 μL omärkt detektionsantikropp till varje brunn med flerkanalsröret. Försegla plattan och inkubera den i 1 h med konstant skakning vid 800 varv/min i rumstemperatur.
- Specifik konjugerad antikropp
- Ta ut den specifika sekundära antikroppen (Table of Materials) från kylskåpet och placera den på is. Späd antikroppen 1:666.67 i analysspädningslösningen och blanda försiktigt.
- Ta bort den fria omärkta sekundära antikroppen genom att snärta in den i papperskorgen och knacka på plattan på en pappershandduk.
- Tvätta plattan 3x med 150 μL tvättlösning genom att tillsätta tvättlösningen och omedelbart ta bort den.
- Tillsätt 25 μL specifik konjugerad antikropp(Tabell över material)till varje brunn med flerkanalsröret. Täta plattan och inkubera i 1 h med konstant skakning vid 800 varv/min i rumstemperatur.
- Läsa plattan
- Ta bort den fria konjugerade antikroppen (Table of Materials) genom att snärta in den i papperskorgen och knacka på plattan på en pappershandduk.
- Tvätta plattan 3x med 150 μl tvättlösning.
- Tillsätt 150 μL 1x Tris-baserad guldavläsningsbuffert(Tabell över material)med ytaktivt material som innehåller tripropylamin som co-reactant för ljusgenerering till plattan. Undvik luftbubblor med hjälp av omvänd pipettering tekniker.
- Placera plattan på mikroplattans detekteringsplattform(Tabell över material)och starta mätningen omedelbart. Använd inställningarna för 96-brunnsförvärv.
- Fånga elektrochemiluminescence signaler av en inbyggd CCD-kamera i en elektrochemiluminescence detektionssystem (Tabell över material) och registrera signalantal, som motsvarar relativa ljusenheter (RLU) och är direkt proportionell mot intensiteten av ljus.
OBS: Vid elektrokemisk stimulering avger ruteniumetiketten som är bunden till kolelektroden luminescensljuset vid 620 nm. Analysera data med den instrument-medföljande programvaran (Tabell över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Principen i ECLIA-systemet beskrivs i figur 1. Standardkurvor för två MeCP2-varianter visas i figur 2. Exakt kvantifiering var möjligt över ett brett spektrum av koncentrationer (1−1 800 ng/ml). I figur 3analyserades MeCP2 nivåer av lysates som härrör från mushjärna och HDFs. MeCP2 uttryck i hjärnan nukleära lysates från heterozygous, wildtype och knockout möss jämfördes i figur 3A, medan i figur 3B ingen MeCP2 protein upptäcktes i MECP2-brist mänskliga fibroblaster (c.806delG) med ECLIA. Mecp2-bristcelllinjens (c.806delG) har också undersökts med tiden (figur 4). Slutligen visades precision mellan och inom analysen på det sätt som visas i tabell 3.
Figur 1: Diagram över meCP2 electrochemiluminescence analys. Denna siffra anpassades från www.meso-scale.com. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: MeCP2 standardkurva som genereras från mänskliga MeCP2 i flera mätningar. Den nedre detektionsgränsen (LLOD), definierad som 2,5 standardavvikelser (SD) över ämnet, är 1,00 ng/ml. Rekombinant human MeCP2 (Abnova) kan exakt kvantifieras över ett intervall från 1,00 ng/ml (LLOD) till 1 800 ng/ml (övre detektionsgräns [ULOD]) med R2 = 0,996. Felstaplar representerar standardfelet i n = 3. Siffran har ändrats från Steinkellner et al.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MeCP2 nivåer i mus hjärnan och HDFs. (A)MeCP2-proteinnivåer mättes i hjärnans kärnlystetter från heterozygous (grå, HET) och vilda möss av typen för kvinnor (svart, vildtyp) (n = 4) och en Mecp2-knockout mus (RTT). (B)Cell lysates från MeCP2-bristfällig fibroblast cellinje (c.806delG) härrör från en manlig patient med neonatal encefalopati som modell för RTT syndrom genomfördes för att bedöma MeCP2 proteinnivåer hos människor och en hälsosam kontroll (svart). De presenterade uppgifterna är medelvärdet ± SD för tredubblar brunnar (n = 3). Inget MeCP2-protein upptäcktes (under detektionsområdet) i de muterade cellinjerna genom immunofluorescens eller användning av ECLIA, vilket ytterligare visar att det är ett mycket känsligt system för ytterligare upptagsstudier med TAT-fusionsproteiner. Denna siffra har ändrats från Steinkellner et al.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tidsberoende upptag av TAT-MeCP2. MeCP2 nivåer av nukleära fraktioner i c.806delG HDFs behandlades med 500 nM rekombinanta TAT-MeCP2 fusion protein. Analys utfördes med MeCP2-ECLIA. Vid föreskrivna tidpunkter tvättades cellerna med DPBS och inkuberades med 0,05% trypsin-EDTA i 5 min för att eliminera extracellulära bundna TAT-MeCP2. Trypsinization stoppades genom att lägga till media med serum. Cellfjäsningen centrifugerades vid 500 x g i 5 min. Efter tvättning av cellpellet 2x med iskall DPBS, provet var beredd för utvinning av nukleära fraktion som beskrivs i protokollet avsnitt. Denna siffra har ändrats från Steinkellner et al.8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| INTRA-ANALYS | INTER ANALYS | ||||||||||
| ng MeCP2 per mL protein | ng MeCP2 per mL protein | ||||||||||
| Brunn 1 | Brunn 2 | Brunn 3 | Menar | SDen | SEMb | %CVc | Menar | SDen | SEMb | %CVc | |
| Mänskliga fibroblaster | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Mus hjärna lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a a Standardavvikelse, bStandardfelmedelvärde, cVariationskoefficient | |||||||||||
Tabell 3: Bestämning av precision mellan analyser under tre på varandra följande dagar av HDF och vildtypsmushjärna lysates. Per brunn applicerades 1−10 μg protein av cell lysate. a a SD, standardavvikelse; b. SEM, standardfel medelvärde; c. CV, variationskoefficient. Denna tabell har ändrats från Steinkellner et al.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att mäta endogena MeCP2, rekombinanta MeCP2 och TAT-MeCP2 nivåer, en 96-väl plattan ECLIA utvecklades. Det har visat sig att förlust av MeCP2 protein funktion leder till RTT syndrom6, för vilka behandlingen är för närvarande begränsad till symptom förvaltning och sjukgymnastik. En lovande behandlingsaveny är den så kallade proteinersättningsterapin, där MeCP2-nivåer kan titreras upp till den nödvändiga koncentrationen12,,13,,14,15. Potentialen hos TAT-fusion proteiner att passera blod - hjärnbarriären har visat sig vara framgångsrik under de senaste två decennierna12,13,14,15. Som sådan kan denna metod för MeCP2 leverans vara användbar i samband med protein substitutionsterapi administration. För att bedöma potentialen hos TAT-fusionsproteiner och andra behandlingar för att återställa MeCP2-proteinnivåer är det av yttersta vikt att utveckla en effektiv och prisvärd analys som kan kvantifiera dem. Den analys som beskrivs i detta arbete, ECLIA, kan bestämma nivåerna av MeCP2 exakt och konsekvent, med gynnsamma intra- och inter-analysvärden (tabell 3).
För följande MeCP2-ECLIA-protokoll användes mushjärnans lysates och HDFs som celler av intresse. Detta protokoll kan dock användas med alla andra celltyper av minst mänskligt och muriniskt ursprung. Dessutom behandlades HDFs med TAT-MePC2 fusion protein för att visa förmågan hos denna analys att mäta olika MeCP2 protein varianter. Att undvika eller minimera reduktionsmedel i lysbufferten, såsom DTT eller β-mercaptoetanol, är avgörande för att tekniken ska kunna bevaras för att bevara teknikens effektivitet. Ytterligare kritiska steg i denna metod innebär plåt beläggning med en mus anti-MeCP2 antikroppar, platta blockering och prov tillägg, följt av en 4 h inkubation med en kanin anti-MeCP2 antikroppar. Efterföljande inkubation med en specifik sekundär antikropp (Register över material) och tillsats av reagenser som är nödvändiga för att luminescensreaktionen ska kunna äga rum, omfattar de sista viktiga stegen i detta förfarande.
För att optimera ECLIA-prestanda kan följande steg vidtas. Den maximala effekten för signalen för denna analys bör inte överstiga en miljon antal. För att förhindra att vätskan sprids bortom elektroden kan en teknik som kallas spotbeläggning användas för att föra in beläggningslösningen i brunnen. Denna teknik kräver hög precision pipettering eller användning av en pipett robot. Dessutom kan testning av olika antikroppskoncentrationer vara användbart för att både öka analysens specificitet och minska bakgrundssignalen. För att ta itu med det senare kan olika blockerare (t.ex. För att optimera signalkvaliteten rekommenderas testning av olika inkubationstider (skakningar vid eller över 300 varv/min). Slutligen, för att öka återhämtning och utspädning linjäritet i specifika medier såsom serum, plasma, urin eller ryggmärgsvätska, kan flera spädningsmedel testas.
Semikvantitativ western blot och kommersiellt tillgängliga MeCP2-ELISA används normalt för att studera MeCP2 proteinnivåer. Arbetsprincipen bakom ELISA liknar vår ECLIAs, och den anmärkningsvärda skillnaden är detektionsläget. Jämfört med dessa metoder är MeCP2-ECLIA snabbare och bekvämare. ECLIA användes för att analysera för vildtyp, heterozygous och Mecp2-knockout mus hjärnprover (figur 3A), med resultat jämfört med MeCP2 belopp från samma prover som erhållits genom västra blotting (data visas inte). En markant skillnad observerades i MeCP2 nivåer av kvinnliga wildtype och heterozygous mus hjärnan prover mätt med ECLIA som inte upptäcktes som statistiskt signifikant av västra blot. Denna högre ECLIA-analysnoggrannhet kan vara viktig i sökandet efter nya föreningar som kan höja MeCP2-proteinnivåerna.
Dessutom är MeCP2-ECLIA billigare än sin motsvarighet i MeCP2-ELISA och på grund av dess höga dynamiska omfång från 1 ng/ml till 1 800 ng/ml (R2 = 0,996) kan den användas med prover som innehåller låga MeCP2-mängder. Jämfört med alla kommersiellt tillgängliga ELISA-kit överträffar ECLIA dem kraftigt. ECLIAEN äger en gynnsammare dynamiskt spänner från 1−1.800 ng/mL som jämförs till dess ELISA motstycken, som befanns för att vara 0.312−20 ng/mL (mus, Cloud-Clone Corp.) och 0.156−10 ng/mL (människa, Cloud-Clone Corp.). På grund av avsaknaden av en uttrycklig definition av en lägre detektionsgräns är det inte möjligt att direkt jämföra dessa två analyser i detta arbete.
Sammanfattningsvis har det visat sig att MeCP2-ECLIA exakt kan fastställa MeCP2-belopp in vivo och in vitro. Samtidigt fylla meCP2 proteinnivåer i nervceller av RTT-drabbade patienter är verkligen en lovande behandling avenue, förekomsten av överdriven MeCP2 kan också resultera i allvarliga neurologiska symtom, i samband med MECP2 dubbelarbete syndrom16,17,18. Som sådan kan denna metod vara av integrerad betydelse för att optimera mängden exogent introducerade MeCP2 under proteinersättningsterapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är mycket tacksamma mot dr Brigitte Sturm för hennes stöd med ECLIA-instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H.
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
