Summary
Elektrochemiluminescensensimmunoassay (ECLIA) er en ny metode til kvantitativ påvisning af endogene og eksogent anvendte MeCP2-proteinvarianter, som producerer meget kvantitative, præcise og reproducerbare målinger med lav intra- og analysefejl over et bredt arbejdsområde. Her er protokollen for MeCP2-ECLIA i et 96-godt format beskrevet.
Abstract
ECLIA er en alsidig metode, der er i stand til at kvantificere endogene og rekombinant proteinmængder i et 96-brøndformat. For at demonstrere ECLIA effektivitet, denne analyse blev brugt til at analysere iboende niveauer af MeCP2 i mus hjernevæv og optagelse af TAT-MeCP2 i menneskelige dermal fibroblaster. MeCP2-ECLIA producerer meget nøjagtige og reproducerbare målinger med lave intra- og interassayfejl. Sammenfattende udviklede vi en kvantitativ metode til evaluering af MeCP2 proteinvarianter, der kan anvendes i skærme med høj gennemløb.
Introduction
Elektrochemiluminescensimmunassay (ECLIA) er baseret på en proces, der udnytter etiketter designet til at udsende luminescens, når elektrokemisk stimuleret. Det er en bredt anvendelig teknik til kvantitativ påvisning af biologiske analysander i grundindustrien og akademisk forskning, fødevareindustrien samt i klinisk diagnostik1. Almindeligt, en engangs 96-brønd plade med carbon blæk elektroder anvendes. Disse elektroder fungerer som en solid fase bærer for immunassay. Et sekundært antistof er konjugeret til en elektrokælumescerende etiket, og når elektricitet påføres systemet, udløses der en letemission af kemikalieetiketten. En enhed med ultralav støj (CCD) registrerer den lysintensitet, der er direkte proportional med det antigen, der er bundet til opsamlingsantistoffet, hvilket resulterer i kvantificering af den målrettede analysand af prøven2. Sammenlignet med den enzymforbundne immunosorbentassay (ELISA) anses ECLIA for at være fordelagtig, da det giver større følsomhed og reproducerbarhed samt bedre automatisering og konsistens3.
Her analyserede vi methyl-CpG-bindingsprotein 2 (MeCP2) i prøver af human og murine oprindelse samt forskellige varianter af rekombinantproteinet ved hjælp af det nyudviklede ECLIA-system. MecP2 er et X-forbundet nukleinsyrebindende protein, der er kendt for at interagere med methylerede DNA-sekvenser. Dette protein har været involveret i reguleringen af genekspression4,5. Tab-of-funktion mutationer i genet, som koder dette protein er de største syndere forårsager Rett syndrom (RTT), en alvorlig neurodevelopmental lidelse6. En anden MeCP2-relateret lidelse, MECP2 dobbeltarbejde syndrom, fører også til neurologiske symptomer, der kan overlappe med dem af RTT7. Især, kvinder er for det meste påvirket af RTT, mens mænd er for det meste ramt af MECP2 dobbeltarbejde syndrom6,7.
Disse lidelser er forbundet med utilstrækkelige eller overskydende MeCP2 niveauer henholdsvis i centralnervesystemet (CNS). Behandlingsmuligheder for RTT, der indebærer stigende MeCP2-niveauer i CNS, vil derfor skulle undgå de skadelige virkninger, der er forbundet med over mecp27. På grund af dette er en meget følsom og nøjagtig kvantificering af MeCP2-proteinniveauer, som fastsat i ECLIA-systemet, afgørende for fremme af forskning i RTT samt MECP2-duplikering. MECP2 De præcise målinger af endogene og eksogene MeCP2 niveauer fra humane cellelinjer og mus vævsprøver samt en rekombinant protein bestående af menneskelige MeCP2 isoform B (også kendt som isoform e1), og en minimal N-terminal HIV-TAT transduktion domæne (TAT-MeCP2), der har potentiale til at krydse blod-hjerne-barrieren8,,9 præsenteres i dette arbejde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Godkendelse af indkøb af hudbiopsi til forskningsformål blev indhentet fra Human Research Ethics Committee of the Children's Hospital i Westmead, Australien. Samtykke til dyreforsøg blev indhentet fra det østrigske forbundsministerium for videnskab, forskning og økonomi, som blev udført i overensstemmelse med lokale dyrevelfærdsbestemmelser (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
BEMÆRK: EcLIA-systemets princip er vist i figur 1.
1. Valg af antistoffer
- Vurder signal-støj-forholdet for en række forskellige MeCP2-antistoffer, og identificer den bedste signalstyrke og højeste specificitet inden for kombinationen af et enkeltstående MeCP2-antistof fra primær mus (klon Mec-168) og inlandspolyklonale MeCP2-detektionsantistof (specialfremstillet). For det sekundære antistof anvendes et systemspecifikt antistof (Materialetabel), som også blev eksperimentelt verificeret.
BEMÆRK: Tabel 1 giver et overblik over alle verificerede antistoffer under MeCP2-ECLIA-udviklingen og deres testede fortyndingsområder.
| Funktion | Navn | Klon | Fortynding |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | Mec-168 | 1:500−1:10.000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | kr. | 1:250−1:4.000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | Mænd-8 | 1:500−1:4.000 |
| Primære | Mus, anti-MeCP2 | 1B11 | 1:500−1:4.000 |
| Primære | Kanin, anti-MeCP2 | Kr. | 1:500−1:4.000 |
| Sekundære | Kanin, anti-MeCP2 | Polyklonale | 1:2.000−1:20.000 |
| Sekundære | Kanin, anti-MeCP2 | Polyklonale | 1:2.000−1:20.000 |
| Påvisning | SULFO-TAG mærket anti-kanin | Polyklonale | 1:500−1:1.000 |
Tabel 1: Liste over antistoffer og anvendte arbejdsfortyndinger.
- Alternativt kan du bruge hvert par MeCP2-antistoffer, der fungerer godt sammen med konventionel ELISA.
2. Behandling af HDF'er med TAT-MeCP2 fusionsprotein
BEMÆRK: TAT-MeCP2 blev rekombinant udtrykt i Escherichia coli og renset ved hjælp af standardkromatografiske teknikker som tidligere beskrevet8 og opbevaret ved -80 °C.
- Plade 1 x 106 humane dermal fibroblast (HDF) celler i 100 mm retter og vokse cellerne natten over ved 37 °C med 5% CO2, indtil de når omkring 90% sammenflydende.
- Tag et hætteglas med TAT-MeCP2 fusionsprotein ud. Tø op på is og bland forsigtigt.
- Fortynd TAT-MeCP2 til en endelig koncentration på 500 nM i 50 ml HDF-kulturmedier.
- Mediet fjernes fra 100 mm opvasken, og cellerne inkuberes med 500 nM TAT-MeCP2 ved 37 °C i forskellige inkubationsperioder på op til 24 timer.
- Fjern TAT-MeCP2-opløsningen fra cellerne. Cellerne vaskes 2x med forvarmet Dulbeccos fosfat-buffered saltvand (DPBS).
- Cellerne behandles med 2 ml 0,05% trypsin-EDTA-opløsning i 5 min ved 37 °C10.
- Tilføj 6 ml HDF-kulturmedier for at inaktivere trypsinen og opsamle cellerne i 15 ml rør.
- Pellet cellerne ved centrifugering ved 500 x g i 5 min ved stuetemperatur.
- Supernatanten fjernes, og cellerne vaskes 2x med iskold DPBS. Opbevar pellet på is og fortsæt med prøveforberedelse.
3. Forberedelse af prøver
- HDF lysates
- Bestemme de højeste proteinniveauer af MeCP2 ved hjælp af REAP metode til subcellulær fraktionering i cytoplasmatiske og nukleare subcellulære rum i henhold til Suzuki et al.11. Begræns fraktionering til højst seks prøver pr. eksperiment.
- Mus hjerne lysates
- Der fremstilles 100 ml af hvert hypotonisk lysisreagens og ekstraktionsbuffer.
- For det hypotoniske lysisreagens blandes godt 10 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchlorid og 10 mM kaliumchlorid.
- For ekstraktionsbufferen blandes godt 20 mM HEPES, 1,5 mM magnesiumchlorid, 0,42 M natriumchlorid, 0,2 mM EDTA og 25% (v/v) glycerol.
- PH-værdien for begge buffere justeres til 7,9.
- Tilføj 1 mM dithiothreitol (DTT) og 1x protease hæmmer cocktail til begge buffere frisk. Chill på is før brug.
- 100 mg af den samlede musehjerne (stamme: C57BL/6J, vildtype han- og hun- og B6.129P2(C)-Mecp2tm1.1Fugl/J, hemizygous han- og heterozygotkvinde; alder: 4−8 uger gammel) i 1 ml iskold hypotonisk lysisreagensator.
- Homogeniser hjernen med en forkølet Dounce all-glas væv homogenizer med 15 slag homogenisator A (løs, for stor clearance) og B (stram, for små clearance), hhv.
- Homogeniserede celler overføres til et rent rør og centrifugeres ved 10.000 x g i 20 min ved 4 °C. Supernatanten kasseres (eller opbevar det som cytoplasmatisk fraktion til videre brug).
- Resuspender pellet i 140 μL ekstraktionsbuffer pr. 100 mg udgangsmateriale. Røret anbringes i en forkølet termoblok, og blandes forsigtigt i 30 minutter ved 4 °C.
- Røret centrifugeres ved 16.000 g i 10 min ved 4 °C. Supernatanten (dvs. den nukleare fraktion) overføres til et nyt forkølet rør, og det oplagres ved -80 °C indtil brug.
BEMÆRK: Proteinkoncentrationen af lysater, der stammer fra musehjernen og HDF'er, kan vurderes ved hjælp af BCA-proteinanalysen.
- Der fremstilles 100 ml af hvert hypotonisk lysisreagens og ekstraktionsbuffer.
4. MeCP2-ECLIA-protokollen
- Tilberedning af vaskeopløsning, blokeringsbuffer og analysefortyndingsopløsning (dag 1)
- Der tilsættes 500 μL Tween 20 til 1 L PBS for at fremstille en 0,05% Tween 20 i PBS-opløsning, blandes kraftigt og mærkes som "vaskeopløsning".
BEMÆRK: Sørg for, at der kun anvendes friskfremstillet vaskebuffer. - Der fremstilles en blokerende opløsning på 3% bloka (Materialetabel) i fosfat-bufferet saltvand (PBS). Bland ved blid omrøring, filter sterilisere og holde dem i køleskabet, indtil brug i højst to uger.
- Der tilsættes 5 ml blokerende opløsning til 10 ml PBS for at klargøre analysefortyndingsopløsningen (1% blokker A i PBS).
- Der tilsættes 500 μL Tween 20 til 1 L PBS for at fremstille en 0,05% Tween 20 i PBS-opløsning, blandes kraftigt og mærkes som "vaskeopløsning".
- Belægning af høj binde plader
- Tag en 96-brønd multi-array enkelt punkt høj binde plade.
BEMÆRK: Høje bindeplader har en større bindingskapacitet og derfor et større dynamisk område end standardplader med hydrofobe overflader. - Optø det monoklonale muse anti-MeCP2 antistof på is og bland 0,67 μL af antistoffet med 4 ml PBS (1:6.000 antistoffortynding i PBS). Vortex antistof opløsningen til at blande godt og mærke røret som "belægning løsning".
- Aflad forsigtigt 25 μL belægningsopløsning i det nederste hjørne af hver brønd ved hjælp af en multikanalpipettor; dette kaldes løsningen belægning metode. Bank forsigtigt på 96-brøndspladen på hver side for at sikre, at belægningsopløsningen dækker bunden af hver brønd.
- Forsegl pladen med en selvklæbende folie, og pladen inkuberes i køleskabet ved 4 °C natten over (12−16 timer).
- Tag en 96-brønd multi-array enkelt punkt høj binde plade.
- Blokering (dag 2)
- Tag pladen ud af køleskabet og tag folien af.
- Fjern antistofbelægningsopløsningen ved at svippe den ind i affaldskurven, og bank pladen på en køkkenrulle for at fjerne al belægningsopløsningen fra brøndene.
- Der tilsættes 125 μL blokerende opløsning pr. brønd. Forsegl pladen igen og læg den på en orbital mikroplade shaker.
- Pladen inkuberes i 90 minutter ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 800 omdrejninger i minuttet.
- Præparater af standarder og prøver
- I inkubationstiden forberedes MeCP2- og/eller TAT-MeCP2-proteinstandarderne og forskellige prøver.
BEMÆRK: Lysisbuffer, der anvendes til standardfortynding, skal være den samme som den, der anvendes i de analyserede prøver. - Der udtages et hætteglas MePC2 og/eller TAT-MeCP2-proteinstamopløsning (250 μg/ml), musehjernelysater og HDF-lysater fra -80 °C. Tø dem op på is.
- Standardstamopløsningen (MeCP2 og/eller TAT-MeCP2) fortyndes i rene rør i henhold til tabel 2.
- Prøverne fortyndes i lysisbufferen på følgende måde: 1−20 μg musehjernelysat pr. 25 μL lysisbuffer og 0,25−1 μg HDF-lysat pr. 25 μL lysisbuffer. Der fremstilles tilstrækkelig volumen af hver prøve til at foretage analyse i tre eksemplarer.
- I inkubationstiden forberedes MeCP2- og/eller TAT-MeCP2-proteinstandarderne og forskellige prøver.
| Standard | Koncentration | Fortynding |
| Standard 1 | 1.800 ng/ml | 1,08 μL Standardstamopløsning + 148,92 μL Lysis-buffer |
| Standard 2 | 600 ng/ml | 50 μL Standard 1 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 3 | 200 ng/ml | 50 μL Standard 2 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 4 | 66.67 ng/ml | 50 μL Standard 3 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 5 | 22.22 ng/ml | 50 μL Standard 4 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 6 | 7.41 ng/ml | 50 μL Standard 5 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 7 | 2.47 ng/ml | 50 μL Standard 6 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 8 | 0.82 ng/ml | 50 μL Standard 7 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 9 | 0.27 ng/ml | 50 μL Standard 8 + 100 μL Lysis buffer |
| Standard 10 | 0 ng/ml | 150 μL Lysis-buffer |
Tabel 2: Standardserie fra 0 til 1.800 ng/ml.
- Tilføjelse af prøver og standardopløsninger
- Fjern blokeringsopløsningen ved at svippe den ind i affaldskurven, og bank pladen på en køkkenrulle for at fjerne al blokeringsopløsning en fra brøndene.
- Pladen 3x vaskes med 150 μL vaskeopløsning ved at tilsætte vaskeopløsningen og straks fjerne den.
- Tilføj 25 ul af standarder og prøver til det nederste hjørne af brønden ved hjælp af en enkelt kanal pipette.
- Pladen forsegles, og pladen inkuberes i 4 timer ved stuetemperatur med konstant omrystning ved 800 omdrejninger i minuttet.
- Ikke-mærket detektionsantistof
- Optø polyklonale kanin anti-MeCP2 antistof på is. Antistoffet fortyndes 1:6.000 i analysefortyndingsopløsning.
- Fjern standarder og prøver ved at svippe den ind i affaldskurven og bank på pladen på en køkkenrulle.
- Pladen 3x vaskes med 150 μL vaskeopløsning ved at tilsætte vaskeopløsningen og straks fjerne den.
- Der tilsættes 25 μL ikke-mærket detektionsantistof til hver brønd med multikanalpipettoren. Forsegl pladen, og inkuber den i 1 time med konstant omrystning ved 800 omdrejninger i minuttet ved stuetemperatur.
- Specifikt konjugeret antistof
- Tag det specifikke sekundære antistof (Materialebord) ud af køleskabet og læg det på is. Antistoffet fortyndes 1:666,67 i analysefortyndingsopløsningen, og det blandes forsigtigt.
- Fjern det frie, ikke-mærkede sekundære antistof ved at svippe det ind i affaldskurven, og bank på pladen på en køkkenrulle.
- Pladen 3x vaskes med 150 μL vaskeopløsning ved at tilsætte vaskeopløsningen og straks fjerne den.
- Der tilsættes 25 μL specifikt konjugeret antistof (Materialetabel) til hver brønd med multikanalpipettoren. Pladen forsegles og inkuberes i 1 time med konstant omrystning ved 800 omdrejninger i minuttet ved stuetemperatur.
- Aflæsning af pladen
- Fjern det frie konjugerede antistof (Materialebord) ved at svippe det ind i affaldskurven og bank på pladen på en køkkenrulle.
- Pladen 3x vaskes med 150 μL vaskeopløsning.
- Der tilsættes 150 μL 1x Tris-baseret guldlæsebuffer (Materialetabel) med overfladeaktivt stof, der indeholder tripropylamin som co-reactant til lysgenerering på pladen. Undgå luftbobler ved hjælp af omvendt pipetteringsteknikker.
- Pladen anbringes på mikropladedetektionsplatformen (Materialebord) og straks påbegyndes. Brug indstillingerne for 96-brønd plade erhvervelse.
- Optag elektrokæminescenssignalerne med et indbygget CCD-kamera i et elektrochemiluminescensdetektionssystem (Materialetabel)og optag signaltællingen, som svarer til relative lysenheder (RLU) og er direkte proportionale med lysets intensitet.
BEMÆRK: Ved elektrokemisk stimulering udsender rutheniumetiketten, der er bundet til carbonelektroden, luminescenslys ved 620 nm. Analysér data med den instrumentledsagede software (Materialetabel).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Princippet om ECLIA-systemet er beskrevet i figur 1. Standardkurver for to MeCP2-varianter er vist i figur 2. Nøjagtig kvantificering var mulig over en lang række koncentrationer (1−1.800 ng/ml). I figur 3blev MeCP2-niveauet af lysater afledt af musehjerne og HDF'er analyseret. MeCP2-ekspression i hjernenukleare lysater fra heterozygote, vilde type- og knockoutmus blev sammenlignet i figur 3A, mens der i figur 3B ikke blev påvist noget MeCP2-protein i MECP2-mangelfulde humane fibroblaster (ca.806delG) ved hjælp af ECLIA. Udbredelsen af TAT-MeCP2 efter mecp2-mangelfuld cellelinje (ca. 806delG) blev også undersøgt over tid (figur 4). Endelig blev der påvist inter- og intraanalysepræcision som vist i tabel 3.
Figur 1: Diagram over MeCP2 elektrochemiluminescensassay. Dette tal blev tilpasset fra www.meso-scale.com. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: MeCP2-standardkurve genereret fra humant MeCP2 i flere målinger. Den nedre detektionsgrænse (LLOD), defineret som 2,5 standardafvigelser (SD'er) over det tomme felt, er 1,00 ng/ml. Rekombinant humant MeCP2 (Abnova) kan kvantificeres nøjagtigt over et interval fra 1,00 ng/ml (LLOD) til 1.800 ng/ml (øvre detektionsgrænse [ULOD]) med R2 = 0,996. Fejllinjer repræsenterer standardfejlen på n = 3. Tallet er blevet ændret fra Steinkellner et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: MeCP2-niveauer i musehjerne og HDF'er. (A) MeCP2-proteinniveauer blev målt i hjernens nukleare lysater fra heterozygote (grå, HET) og hunvilde type mus (sort, wildtype) (n = 4) og en Mecp2-knockout mus (RTT); (B) Cellelysater fra MeCP2-mangelfuld fibroblast celle linje (c.806delG) stammer fra en mandlig patient med neonatal encephalopati som model for RTT syndrom blev udført for at vurdere MeCP2 protein niveauer hos mennesker og en sund kontrol (sort). De præsenterede data er gennemsnit ± SD af treeksemplarsbrønde (n = 3). Der blev ikke påvist noget MeCP2-protein (under detektionsområdet) i de mutante cellelinjer ved immunfluorescens eller ved hjælp af ECLIA, hvilket yderligere viser, at det er et meget følsomt system til yderligere optagelsesundersøgelser med TAT-fusionsproteiner. Dette tal er blevet ændret fra Steinkellner et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Tidsafhængig optagelse af TAT-MeCP2. MeCP2-niveauerne af nukleare fraktioner i c.806delG HDF'er blev behandlet med 500 nM rekombinant TAT-MeCP2 fusionsprotein. Analysen blev udført med MeCP2-ECLIA. På fastsatte tidspunkter blev cellerne vasket med DPBS og inkuberet med 0,05% trypsin-EDTA i 5 minutter for at eliminere ekstracellulær-bundet TAT-MeCP2. Trypsinization blev stoppet ved at tilføje medier med serum. Cellesuspensionen blev centrifugeret ved 500 x g i 5 min. Efter vask af cellepellet 2x med iskold DPBS blev prøven forberedt til ekstraktion af nuklear fraktion som beskrevet i protokolafsnittet. Dette tal er blevet ændret fra Steinkellner et al.8. Klik her for at se en større version af dette tal.
| INTRA-ANALYSE | INTER ASSAY | ||||||||||
| ng MeCP2 pr. mL-protein | ng MeCP2 pr. mL-protein | ||||||||||
| Godt 1 | Godt 2 | Godt 3 | Mener | SDa | SEMb | %CVc | Mener | SDa | SEMb | %CVc | |
| Menneskelige fibroblaster | 6.42 | 6.30 | 6.45 | 6.39 | 0.08 | 0.05 | 1.24 | 6.61 | 0.64 | 0.37 | 9.71 |
| Mus hjerne lysate | 9.92 | 10.16 | 10.36 | 10.14 | 0.22 | 0.13 | 2.17 | 11.22 | 0.94 | 0.54 | 8.33 |
| a Standardafvigelse, bStandardfejlgennemsnit, cVariationskoefficient | |||||||||||
Tabel 3: Bestemmelse af inter-assay præcision på tre på hinanden følgende dage af HDF og wildtype mus hjerne lysates. Per brønd blev der anvendt 1−10 μg protein cellelysat. a SD, standardafvigelse; b. SEM, standardfejlgennemsnit; c. CV, variationskoefficient. Denne tabel er blevet ændret fra Steinkellner et al.8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at måle endogenme MeCP2, rekombinant MeCP2 og TAT-MeCP2 niveauer, en 96-brønd plade ECLIA blev udviklet. Det er blevet påvist, at tab af MeCP2 proteinfunktion fører til RTT syndrom6, for hvilken behandlingen i øjeblikket er begrænset til symptombehandling og fysioterapi. En lovende behandlingsmulighed er den såkaldte proteinsubstitutionsterapi, hvor MeCP2-niveauerne kan titreres op til den nødvendige koncentration12,13,14,15. TAT-fusionsproteiners potentiale til at krydse blod- og hjernebarrieren har vist sig at være vellykket i løbet af de sidste to årtier12,13,14,15. Som sådan kan denne metode til MeCP2-levering være nyttig i forbindelse med administration af proteinerstatningsterapi. For at vurdere potentialet i TAT-fusion proteiner og andre behandlinger til at genoprette MeCP2 protein niveauer, udvikle en effektiv og overkommelig analyse, der kan kvantificere dem er af allerstørste betydning. Den analyse, der er beskrevet i dette arbejde, ECLIA, er i stand til at bestemme niveauet af MeCP2 præcist såvel som konsekvent, med gunstige intra- og inter-assay værdier (Tabel 3).
I følgende MeCP2-ECLIA-protokol blev musehjernelysater og HDF'er anvendt som interessante celler. Denne protokol kan dog anvendes sammen med alle andre celletyper af mindst human og murineoprindelse. Desuden blev HDF'er behandlet med TAT-MePC2 fusionsprotein for at vise denne analyses evne til at måle forskellige MeCP2-proteinvarianter. Under prøveforberedelse er det afgørende at undgå eller minimere reduktionsmidler i lysisbufferen såsom DTT eller β-mercaptoethanol for at bevare teknikkens effektivitet. Yderligere kritiske trin i denne metode omfatter pladebelægning med et museanti-MeCP2-antistof, pladeblokering og udsætning af prøver efterfulgt af en 4 timers inkubation med et kaninanti-MeCP2-antistof. Efterfølgende inkubation med et specifikt sekundært antistof ( Materialetabel ) og tilsætningaf reagenser,der er nødvendige for luminescensreaktionen, omfatter de sidste vigtige trin i denne procedure.
For at optimere ECLIA's ydeevne kan følgende trin udføres. Den maksimale udgang for signalet for denne analyse må ikke overstige en million tællinger. For at forhindre væsken i at sprede sig ud over elektroden, kan en teknik kaldet spotbelægning bruges til at indføre belægningsopløsningen i brønden. Denne teknik kræver høj præcision pipettering eller brug af en pipette robot. Desuden kan test af forskellige antistofkoncentrationer være nyttige til både at øge analysens specificitet og reducere baggrundssignalet. For at løse sidstnævnte kan forskellige blokkere (f.eks. For at optimere signalkvaliteten anbefales det at teste forskellige inkubationstider (omrystning ved eller over 300 omdr./min.). Endelig, at øge inddrivelse og fortynding linearitet i specifikke medier såsom serum, plasma, urin eller cerebrospinalvæske, flere fortyndingsmidler kan testes.
Semi-kvantitative vestlige blot og kommercielt tilgængelige MeCP2-ELISA bruges normalt til at studere MeCP2 proteinniveauer. Arbejdsprincippet bag ELISA svarer til vores ECLIA med den bemærkelsesværdige forskel er detektionstilstanden. Sammenlignet med disse metoder er MeCP2-ECLIA hurtigere og mere praktisk. ECLIA blev anvendt til analyse af mushjerneprøver af vildtypen, heterozygot og Mecp2-knockout (figur 3A) med fund sammenlignet med MeCP2-mængder fra de samme prøver fra western blotting (data ikke vist). Der blev observeret en markant forskel i MeCP2-niveauerne for kvindelige vilde og heterozygote musehjerneprøver målt af ECLIA, som ikke blev påvist som statistisk signifikante ved den vestlige blot. Denne højere ECLIA assay nøjagtighed kan være vigtigt i jagten på nye forbindelser, der kan ophøje MeCP2 proteinniveauer.
Desuden er MeCP2-ECLIA billigere end mecp2-ELISA-modstykket, og på grund af dets høje dynamiske område fra 1 ng/ml til 1.800 ng/ml (R2 = 0,996) kan der anvendes prøver, der indeholder lave MeCP2-mængder. Sammenlignet med alle de kommercielt tilgængelige ELISA-sæt overgår ECLIA dem i høj grad. ECLIA har et mere gunstigt dynamisk område fra 1−1.800 ng/ml sammenlignet med dets ELISA-modstykker, som viste sig at være 0,312−20 ng/ml (mus, Cloud-Clone Corp.) og 0,156−10 ng/ml (human, Cloud-Clone Corp.). Da der ikke findes en eksplicit definition af en lavere detektionsgrænse, er det ikke muligt at foretage en direkte sammenligning mellem disse to analyser i forbindelse med dette arbejde.
Sammenfattende har det vist sig, at MeCP2-ECLIA nøjagtigt kan bestemme MeCP2-mængderne in vivo og in vitro. Mens genopfyldning MeCP2 protein niveauer i neuroner af RTT-ramte patienter er faktisk en lovende behandlingsvej, tilstedeværelsen af overdreven MeCP2 kan også resultere i alvorlige neurologiske symptomer, forbundet med MECP2 dobbeltarbejde syndrom16,17,18. Som sådan kan denne metode være af integreret betydning for at optimere mængden af eksogent indført MeCP2 under proteinsubstitutionsbehandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er dr. Brigitte Sturm meget taknemmelige for hendes støtte til ECLIA-instrumentet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate | Bio-Rad Laboratories Inc. | 500-0006 | Sample preperation |
| Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | Antibody |
| Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Sample preperation |
| Dulbecco’s PBS (sterile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Sample preperation, Washing solution, Coating solution |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Extraction Buffer |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Sample preperation |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Extraction Buffer |
| Gold Read Buffer T (1x) with surfactant | Meso Scale Diagnostics | R92TG | MeCP2 ECLIA protocol |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| KIMBLE Dounce tissue grinder set | Sigma-Aldrich | D8938 | Sample preperation |
| Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) | GFL | 3014 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Cell treatment |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | for plate sealing |
| Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin | Sigma-Aldrich | M6818-100UL; RRID:AB_262075 | Antibody, Coating solution |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 ECLIA protocol |
| Penicillin-Streptomycin | gibco by Life Technologies | 15140122 | Sample preperation |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit | Eurogentec S.A. | custom-designed | Antibody |
| Potassium chloride (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Hypotonic lysis reagent |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063; RRID:AB_10737296 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1; RRID:AB_1842411 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818; RRID:AB_262075 | Antibody |
| Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443; RRID:AB_477235 | Antibody |
| Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Cell Signaling Technology | 3456S; RRID:AB_2143849 | Antibody |
| Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | custom | Antibody |
| Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Antibody |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | Extraction Buffer |
| SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | Antibody |
| TAT-MeCP2 fusion protein | in-house production | Cell treatment | |
| Trypsin EDTA 0.25% (1X) | gibco by Life Technologies | 25200-056 | Cell treatment |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Washing solution |
References
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electrochemiluminescence Immunoassay Using the Ruthenium Chelate-Labeled Antibody Bound on the Magnetic Micro Beads. Analytical Sciences. 15 (11), 1087-1093 (1999).
- Liu, W., Hu, Y., Yang, Y., Hu, T., Wang, X. Comparison of two immunoassays for quantification of hepatitis B surface antigen in Chinese patients with concomitant hepatitis B surface antigen and hepatitis B surface antibodies. Archives of Virology. 160 (1), 191-198 (2015).
- Shah, R. R., Bird, A. P. MeCP2 mutations: progress towards understanding and treating Rett syndrome. Genome Medicine. 9 (1), 17 (2017).
- Chahrour, M., et al. MeCP2, a key contributor to neurological disease, activates and represses transcription. Science. 320 (5880), 1224-1229 (2008).
- Lyst, M. J., Bird, A. Rett syndrome: a complex disorder with simple roots. Nature Reviews Genetics. 16 (5), 261-275 (2015).
- Katz, D. M., et al. Rett Syndrome: Crossing the Threshold to Clinical Translation. Trends in Neurosciences. 39 (2), 100-113 (2016).
- Steinkellner, H., et al. An electrochemiluminescence based assay for quantitative detection of endogenous and exogenously applied MeCP2 protein variants. Scientific Reports. 9 (1), 7929 (2019).
- Laccone, F. A. Synthetic MeCP2 sequence for protein substitution therapy. , Canada. CA2647125C (2007).
- Koutsokeras, A., Kabouridis, P. S. Secretion and uptake of TAT-fusion proteins produced by engineered mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects. 1790 (2), 147-153 (2009).
- Suzuki, K., Bose, P., Leong-Quong, R. Y., Fujita, D. J., Riabowol, K. R. E. A. P. REAP: A two minute cell fractionation method. BMC Research Notes. 3, 294 (2010).
- Xia, H., Mao, Q., Davidson, B. L. The HIV Tat protein transduction domain improves the biodistribution of beta-glucuronidase expressed from recombinant viral vectors. Nature Biotechnology. 19 (7), 640-644 (2001).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Nagahara, H., et al. Transduction of full-length TAT fusion proteins into mammalian cells: TAT-p27Kip1 induces cell migration. Nature Medicine. 4 (12), 1449-1452 (1998).
- Trazzi, S., et al. CDKL5 protein substitution therapy rescues neurological phenotypes of a mouse model of CDKL5 disorder. Human Molecular Genetics. 27 (9), 1572-1592 (2018).
- Van Esch, H. MECP2 Duplication Syndrome. Molecular Syndromology. 2 (3-5), 128-136 (2012).
- Collins, A. L., et al. Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice. Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).
- Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).
