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Neuroscience

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए तीव्र मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस की तैयारी

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61085
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

प्रस्तुत प्रोटोकॉल संभावित एंटीएपिप्टिक पदार्थों के लिए एक प्रीक्लिनिकल मूल्यांकन उपकरण के रूप में महत्वपूर्ण मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करने के अंतिम लक्ष्य के साथ पुनः प्राप्त मानव हिप्पोकैम्पस ऊतक के परिवहन और तैयारी का वर्णन करता है।

Abstract

मिर्गी दुनिया की आबादी के बारे में 1% को प्रभावित करता है और चल रहे दौरे के साथ-साथ अचानक मौत के लिए उच्च जोखिम के कारण जीवन की गुणवत्ता में गंभीर कमी की ओर जाता है। उपलब्ध उपचार विकल्पों की बहुतायत के बावजूद, लगभग 30% रोगी दवा प्रतिरोधी हैं। कई उपन्यास चिकित्सा पशु मॉडल का उपयोग कर विकसित किया गया है, हालांकि दवा प्रतिरोधी रोगियों की दर अनछुए रहता है । संभावित कारणों में से एक कृंतक मॉडल और मनुष्यों के बीच अनुवाद की कमी है, जैसे पशु मॉडल में मानव फार्मासियों का कमजोर प्रतिनिधित्व। एक पूर्व नैदानिक मूल्यांकन उपकरण के रूप में मानव मस्तिष्क ऊतक को फिर से उठाया इस अनुवाद अंतर को पाटने के लिए लाभ है। यहां वर्णित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की उच्च गुणवत्ता की तैयारी और मिर्गी गतिविधि के बाद स्थिर प्रेरण के लिए एक विधि है। प्रोटोकॉल में 8 एमएमएम केसीएल और 4-अमीनोपिरिन के आवेदन के दौरान फट गतिविधि को शामिल करने का वर्णन किया गया है। यह गतिविधि स्थापित एईड लैकोसमाइड या उपन्यास एंटीपाइप्टिक उम्मीदवारों, जैसे डाइमेथाइलेथेनथेनमाइन (डीएमईए) के प्रति संवेदनशील है। इसके अलावा, विधि एक्सट्रासेलुलर एमजी2 + और बाइकक्यूलिन, एक गाबाए रिसेप्टर अवरोधक के आवेदन में कमी करके मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस के CA1 में जब्ती जैसी घटनाओं को शामिल करने का वर्णन करती है। प्रयोगात्मक सेट-अप का उपयोग मिर्गी गतिविधि पर उनके प्रभाव के लिए संभावित एंटीपाइप्टिक पदार्थों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विशिष्ट यौगिकों के लिए पोस्ट किए गए कार्रवाई के तंत्र को मानव ऊतक में इस दृष्टिकोण का उपयोग करके मान्य किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग का उपयोग करके)। समाप्त करने के लिए, महत्वपूर्ण मानव मस्तिष्क ऊतक पूर्व वीवो की जांच (यहां, लौकिक पालि मिर्गी से पीड़ित रोगियों से हिप्पोकैम्पस को पुनः प्राप्त किया गया) मानव मस्तिष्क में शारीरिक और रोग तंत्र के वर्तमान ज्ञान में सुधार करेगा।

Introduction

मिर्गी दुनिया की आबादी के 1% को प्रभावित करने वाले सबसे आम न्यूरोलॉजिकल विकारों में से एक है, और बढ़ी हुई रुग्णता और मृत्यु दर1,,2से जुड़ा हुआ है। दुर्भाग्य से, मिर्गी से पीड़ित रोगियों में से एक तिहाई दवा प्रतिरोधी हैं, 20 से अधिक अनुमोदित एंटीएपिप्टिक दवाओं (AEDs)3सहित उपलब्ध उपचार विकल्पों की एक बहुतायत के बावजूद । पूर्व नैदानिक पशु अनुसंधान से नैदानिक परीक्षणों के लिए परिणामों का अनुवाद करने में विफलता एक कारण है कि कई रोगियों में आशाजनक उपचार रणनीतियां प्रभावी नहीं हैं4. हाल ही में, न्यूरोपेप्टाइड वाई (एनपीआई) और गैलेनिन को पशु मॉडलों में एंटीपाइप्टिक प्रभाव दिखाया गया है; हालांकि, जब पुनर्जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक में परीक्षण किया, केवल NPY प्रभावी5था .

मौजूदा बुनियादी तंत्रिका विज्ञान तंत्र और रोग चिकित्सा दृष्टिकोण दृष्टिकोण के विषय में ज्ञान के अधिकांश पशु मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों से स्टेम । हालांकि जानकारीपूर्ण, इन मॉडलों केवल जटिल मानव रोगों और वयस्क मानव मस्तिष्क नेटवर्क के एक पहलुओं का प्रतिनिधित्व करते हैं । वैकल्पिक रूप से, मानव मस्तिष्क ऊतक में ट्रांसलेशनल गैप को पाटने की क्षमता है लेकिन कार्यात्मक अध्ययन के लिए शायद ही कभी उपलब्ध है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति, मस्तिष्क आकृति विज्ञान, या शारीरिक कनेक्शन की जांच करने में पोस्टमार्टम मस्तिष्क ऊतक एक मूल्यवान उपकरण रहा है, हालांकि न्यूरोनल गतिविधि अक्सर समझौता किया जाता है यह ऊतक6,,7,,8,,9,10, 11,11है।,

इसके विपरीत, जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क के ऊतकों की जांच प्रीक्लिनिकल दवा मूल्यांकन, बुनियादी न्यूरोनल कार्यों और जीन,अभिव्यक्ति पैटर्न12, 13,14,,,15,,16,,17से संबंधित की गई है ।17 कृंतक स्लाइस की तुलना में मानव मस्तिष्क स्लाइस का एक बड़ा लाभ रीसेक्शन और तैयारी के बाद न्यूरोनल ऊतक की लंबी व्यवहार्यता है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस की तुलना में, जिसे आमतौर पर तैयारी के बाद 8 घंटे तक दर्ज किया जा सकता है, मानव मस्तिष्क स्लाइस 72 घंटे तक के लिए स्थिर न्यूरोनल गतिविधि दिखाते हैं, जिससे इन दुर्लभ और मूल्यवान नमूनों की पूरी जांच को सक्षम किया जाता है12,,18।

कई अध्ययनों ने पुनः प्राप्त कॉर्टिकल और हिप्पोकैम्पस मानव ऊतक के विभिन्न क्षेत्रों में मिर्गी गतिविधि के गुणों की जांच की है और मिर्गी गतिविधि को शामिल करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया है। कृंतक स्लाइस में, मिर्गी गतिविधि को कई तरीकों से प्रेरित किया जा सकता है: डीजी हिलर कोशिकाओं की विद्युत उत्तेजना, बाह्य के+ (8-12 mM KCl) की वृद्धि, बाइकक्यूक्लिन (बीआईसी) द्वारा गाबाए रिसेप्टर्स को अवरुद्ध करना, पोटेशियम चैनलों को 4-अमीनोपीरिडीन (4-एपी) द्वारा अवरुद्ध करना, और अतिरिक्त समाधानमें2 + को हटाना या कम करना। तथापि, मानव ऊतक में मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए उपरोक्त विधियों में से कम से कम दो के संयोजन की आवश्यकता होती है20,21,22.

यहां प्रस्तुत मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी के लिए एक विधि है, जो 20 घंटे तक के लिए व्यवहार्य हैं और उच्च K+ (8 mM) और 4-एपी या कम एमजी2 + और बीआईसी के आवेदन पर मिर्गी के रूप गतिविधि के शामिल दिखाने के लिए ।

Protocol

रोगियों को ऑपरेशन से पहले सूचित लिखित सहमति देनी चाहिए, और प्रयोग से पहले आवश्यक नैतिक समझौते लागू होने चाहिए । प्रतिनिधि परिणामों के संबंध में, मानव प्रतिभागियों से जुड़े सभी अध्ययनों की समीक्षा की गई और Charité-Universitätsmedizin, बर्लिन (EA2/111/14) द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. 10x समाधान की तैयारी

नोट: मानव मस्तिष्क के ऊतकों तक पहुंच की योजना बनाने में कठिनाइयों के कारण, यहां वर्णित 10x समाधान तैयार करने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, अंतिम 1x समाधान डबल-आसुत पानी (डीडीएच2ओ) में अंतिम एकाग्रता में व्यक्तिगत पदार्थों को जोड़कर हौसले से तैयार किया जा सकता है।

  1. व्यक्तिगत 10x समाधानों के लिए, टेबल 1 के अनुसार डीडीएच2ओ में पदार्थ जोड़ें और भंग होने तक हिलाएं।
  2. तैयारी के बाद 1 महीने तक 10x समाधानों का उपयोग करें (जमे हुए 10x कोलीन एसीएसएफ के लिए 1 वर्ष तक)।
  3. 10x कोलीन एसीएसएफ के लिए, 10x 1.1 कोलीन एसीएसएफ (टेबल 1) के 50 एमएल एलिकोट तैयार करें और आगे के उपयोग तक-20डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    नोट: बैक्टीरिया और कैल्शियम कार्बोनेट की वर्षा के साथ संदूषण को रोकने के लिए ग्लूकोज और सीएसीएल2 से 10x 1.1 कोलीन aCSF न जोड़ें।
  4. 10x समाधान 2 का उपयोग सभी 1x अंतिम समाधानों के लिए किया जा सकता है, जबकि 10x समाधान 1.1-1.4 अनुकूलित और तदनुसार नामित(तालिका 1)।

2. 1x अंतिम समाधान की तैयारी

नोट: अंतिम 1x समाधान उपयोग से पहले दिन पर जितनी जल्दी हो सके ताजा या जल्द से जल्द तैयार किया जाना चाहिए । ऑक्सीजन के साथ समाधान को समृद्ध करने के लिए ग्लास गैस छितर का उपयोग करके 5% सीओ2 और 95% ओ2 के साथ सभी अंतिम समाधान ों को कार्बोजोनेटेड किया जाना चाहिए, और पीएच को 7.4 (अधिकतम = 7.4 ± 0.2) में समायोजित किया जाना चाहिए।

  1. परिवहन और तैयारी के लिए कोलीन aCSF
    1. अंतिम 500 एमएल समाधान के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में कोलीन aCSF के लिए 10x समाधान 1.1 aliquot के एक 50 एमएल aliquot गल।
    2. 10x समाधान 1.1 और 10x समाधान 2 के 50 एमएल के गल 50 एमएल एलिकोट को डीडीएच2ओ के लगभग 300 मिलियन एमएल में जोड़ें।
    3. ग्लूकोज और सीएसीएल 2 की अंतिम सांद्रताजोड़ें, फिर भंग होने तक हलचल करें(टेबल 1,समाधान 1.1)।
    4. 500 एमएल की अंतिम मात्रा में डीडीएच2ओ जोड़ें और ओस्मोलएरिटी (300 mOsm ± 10 mOsm) को मापें।
    5. वैकल्पिक रूप से, समाधान को बाँझ बनाने के लिए फ़िल्टर का उपयोग करें (बाँझ परिस्थितियों में लंबे समय तक स्लाइस व्यवहार्यता पर चर्चा देखें)।
    6. ऑपरेशन रूम से प्रयोगशाला तक परिवहन के लिए 1x कोलीन aCSF के लगभग 100 एमएल के साथ एक अलग बोतल भरें।
    7. वैकल्पिक: ऑपरेशन कक्ष से प्रयोगशाला तक परिवहन समय के आधार पर, लंबे समय तक परिवहन अवधि के दौरान एसीएसएफ के स्थिर पीएच सुनिश्चित करने के लिए गैस-तंग बोतल टोपियां का उपयोग करने पर विचार करें।
    8. आगे के उपयोग तक अंतिम समाधान 4-8 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. ऑपरेशन के दिन, कार्बोजन गैस (5% सीओ2,95% ओ2)से जुड़े ग्लास गैस तितर-बितर का उपयोग करके कम से कम 10-15 मिनट के लिए बर्फ और कार्बोजेनेट पर 1x कोलीन aCSF ठंडा करें।
      नोट: लंबे समय तक प्रतीक्षा समय के मामले में ऑपरेशन रूम के लिए गैस की बोतल को सुलभ रखने पर विचार करें, जिसके लिए परिवहन समाधान के फिर से कार्बोजेनेशन की आवश्यकता होगी। हालांकि, हमने लंबे और छोटे परिवहन समय (15 मिनट बनाम 60 मिनट) से पहले फिर से कार्बोजेनेशन के बिना हिप्पोकैम्पस ऊतक पहुंचाया है और मिर्गी गतिविधि को शामिल करने में अंतर का पालन नहीं किया है।
  2. भंडारण और रिकॉर्डिंग के लिए aCSF
    1. अंतिम 2 एल समाधान के लिए, 10x समाधान 1.2 (एसीएसएफ) के 200 एमएल और 10x समाधान 2 के 200 एमएल और ग्लूकोज(टेबल 1)को डीडीएच2ओ के ~ 1500 मिलियन में जोड़ें।
      नोट: अंतिम समाधानों की मात्रा लागू प्रयोगों और भंडारण और रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कक्ष के प्रकार पर निर्भर करती है।
    2. 2एल की अंतिम मात्रा में डीडीएच 2 ओ जोड़ें और ओस्मोलएरिटी (300 mOsm ± 10 mOsm) को मापें।
    3. उपयोग से पहले कम से कम 10-15 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस और कार्बोजेनेट के लिए समाधान को पूर्वापार्म करें।
  3. फट गतिविधि को शामिल करने के लिए हाईके++4-एपी एसीएसएफ
    1. अंतिम 1 एल समाधान के लिए, 10x समाधान 1.3 (हाईके++ 4-एपी एसीएसएफ) के 100 एमएल और 10x समाधान 2 से ~ 700 एमएल डीडीएच2ओ के 100 एमएल जोड़ें।
    2. टेबल 1 के अनुसार ग्लूकोज और 4-एपी (अंतिम एकाग्रता = 100 माइक्रोन)जोड़ें।
    3. 1 एल की अंतिम मात्रा में डीडीएच2ओ जोड़ें और ओस्मोलएरिटी (300 mOsm ± 10 mOsm) को मापें।
    4. उपयोग से पहले कम से कम 10-15 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस और कार्बोजेनेट के लिए समाधान को पूर्वापार्म करें।
  4. जब्ती जैसी घटनाओं (SLEs) को शामिल करने के लिए LowMg2 ++ बीआईसी aCSF
    1. अंतिम 1 एल समाधान के लिए, 10x समाधान 1.4 (lowMg2 + +BIC aCSF) के 100 एमएल और 10x समाधान22 से ~ 700 एमएल के 100 एमएल जोड़ें।
    2. टेबल 1 के अनुसार ग्लूकोज और बीआईसी (अंतिम एकाग्रता = 10μM) जोड़ें।
    3. 1 एल की अंतिम मात्रा में डीडीएच2ओ जोड़ें और ओस्मोलएरिटी (300 mOsm ± 10 mOsm) को मापें।
    4. उपयोग से पहले कम से कम 10-15 मिनट के लिए 35 डिग्री सेल्सियस और कार्बोजेनेट के लिए समाधान को पूर्वापार्म करें।

3. इंटरफेस चैंबर की तैयारी

  1. एक इंटरफ़ेस कक्ष में, स्लाइस स्लाइस के नीचे पर्याप्त मात्रा में समाधान सुनिश्चित करने के लिए फिल्टर पेपर की तीन परतों पर आराम करते हैं। ऐसा करने के लिए, प्रत्येक स्लाइस-होल्डिंग डिब्बे (वर्णित इंटरफ़ेस चैंबर में दो डिब्बे होते हैं) के लिए फिल्टर पेपर के दो ~ 4 सेमी x ~ 2 सेमी टुकड़े काटें और उन्हें एक दूसरे के ऊपर रखें।
  2. समाधान की टेंशन को तोड़ने के लिए डिब्बों के अंदर 4 सेमी x 2 सेमी फिल्टर पेपर्स के आसपास पतले कॉटन के तार रखें। यहां तक कि प्रवाह सुनिश्चित करें (यहां, काले नायलॉन चड्डी पतली कटौती तार करने के लिए कटौती ~ लंबाई में 10 सेमी का उपयोग किया जाता है; प्लेसमेंट के लिए, चित्रा 1देखें) ।
  3. स्लाइस-होल्डिंग डिब्बों के अंदर बड़े फिल्टर पेपर के ऊपर फिल्टर पेपर के छोटे टुकड़े रखें। छोटे फिल्टर ऊतक टुकड़े मोटे तौर पर एक मस्तिष्क टुकड़ा (~ 1.5 सेमी x ~ 1.0 सेमी) का आकार होना चाहिए और व्यक्तिगत स्लाइस की आगे की हैंडलिंग में सक्षम हो जाएगा। प्रत्येक डिब्बे में तीन से चार छोटे फिल्टर पेपर के टुकड़े रखें।
  4. एक पेरिस्टाल्टिक पंप के साथ 1.8 एमएल/न्यूनतम की एक एसीएसएफ प्रवाह दर सुनिश्चित करें।
  5. कार्बोजोनेट और प्रीवार्म इंटरफेस चैंबर को ~ 35 डिग्री सेल्सियस (स्लाइस का अंतिम तापमान ~ 32 डिग्री सेल्सियस होना चाहिए)।

4. तैयारी क्षेत्र का सेट-अप

नोट: संदूषण से बचने और स्लाइस जीवित रहने से बचने के लिए बाँझ परिस्थितियों में तैयारी की जा सकती है। हालांकि, सभी वाइब्रेटम एक बाँझ हुड के नीचे फिट नहीं होते हैं, और तैयारी के दौरान संदूषण को कम करने के लिए अन्य उपायों की आवश्यकता होती है। यह धारा इनमें से कुछ उपायों का वर्णन करती है ।

  1. 70% एटोह के साथ तैयारी क्षेत्र को मिटा दें और क्षेत्र के शीर्ष पर एल्यूमीनियम पन्नी या बाँझ कवर रखें।
  2. सुपर गोंद, दो तेज चिमटी, एक स्पैटुला, ब्लेड के साथ एक स्केलपेल, और मस्तिष्क के ऊतकों के किसी न किसी काटने के लिए एक ब्लेड तैयार करें। संदूषण को कम करने की प्रक्रिया से पहले उपकरणों को निष्फल किया जा सकता है।
  3. 70% एटोह के साथ वाइब्रेटोम की बफर ट्रे और नमूना प्लेट को पोंछें। एक बार बफर ट्रे पूरी तरह से सूखी है, यह एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर और आइस बाथ में ट्रे जगह है । कुचल बर्फ के साथ बर्फ स्नान भरें और तैयारी तक -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. वाइब्रेटम और रेजर ब्लेड को 70% एटोह के साथ पोंछें और स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान ऊर्ध्वाधर कंपन और ऊतक क्षति को कम करने के लिए वाइब्रेटोम को कैलिब्रेट करें।

5. ऊतक टुकड़ा करने की क्रिया और भंडारण

  1. रीसेक्शन के बाद सीधे, ऊतक को ठंड, कार्बोजेनेटेड कोलीन एसीएसएफ में तुरंत रखें और प्रयोगशाला में जल्दी से परिवहन करें।
    सावधानी: तैयारी के दौरान हर समय दस्ताने और एक चेहरा मुखौटा पहनें, क्योंकि मानव मस्तिष्क ऊतक में संभावित रोगजनक हो सकते हैं। इसके अलावा, एक बाँझ हुड के नीचे काम नहीं करते समय फेस मास्क पहनने से समाधान और मस्तिष्क के ऊतकों के प्रदूषण में काफी कमी आएगी।
  2. कोलीन aCSF से ऊतक निकालें और ऊतक के किसी भी जला भागों को काट लें।
  3. काटने के कोण और ऊतक परतों पर विचार करते हुए, नमूना प्लेट पर गोंद ऊतक टुकड़ा करने के लिए एक भी सतह काटें। आदर्श रूप में, एक हिप्पोकैम्पल स्लाइस में डीजी, CA1-4, और (यदि संभव हो तो) उपिकुलम होता है।
  4. मस्तिष्क के ऊतकों को 400 माइक्रोन मोटी स्लाइस में स्लाइस करें और काटने के दौरान आयाम और गति को समायोजित करें। संभावित शेष पिया मेटर के कारण, मानव मस्तिष्क ऊतक अधिक प्रतिरोध दिखाता है और धीमी काटने की आवश्यकता हो सकती है।
    नोट: स्लाइस मोटाई या तो उपलब्ध नेटवर्क (मोटे स्लाइस में अधिक न्यूरॉन्स) या स्लाइस की व्यवहार्यता (स्लाइस में समाधान की पैठ) को बहुत प्रभावित करती है। हमने संभावित रूप से उपलब्ध माइक्रो-नेटवर्क को बढ़ाने के लिए 500 माइक्रोम स्लाइस का उपयोग किया है, और मिर्गी गतिविधि को शामिल करने में अंतर का पालन नहीं कर सकता है। 300 माइक्रोन स्लाइस आमतौर पर पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयोग किए जाते हैं, हालांकि इन स्लाइस में मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने का यहां अभी तक परीक्षण नहीं किया गया है। हम एक मानक टुकड़ा मोटाई के रूप में 400 माइक्रोन का उपयोग करते हैं, हालांकि 300-500 माइक्रोन स्लाइस पर्याप्त हो सकते हैं।
  5. इकट्ठा करने से पहले, रिकॉर्डिंग कक्ष में फिट करने के लिए मस्तिष्क स्लाइस के आकार को कम करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। झिल्ली कक्ष (धारा 6 देखें) के उपयोग के लिए, स्लाइस अधिकतम 1.5 सेमी x 1 सेमी होना चाहिए। कम करते समय, रिकॉर्डिंग के लिए बरकरार रहने के लिए आवश्यक विशिष्ट परतों और कनेक्शनों पर विचार करें (उदाहरण के लिए, CA1 और डीजी में रिकॉर्डिंग के लिए, सुमिकुलम और आसपास के सफेद ऊतक को काट दें)।
  6. एक स्पैटुला और छोटे संदंश का उपयोग करके, छोटे फ़िल्टर पेपर्स पर इंटरफेस कक्ष में स्लाइस को सावधानी से रखें और उन्हें रिकॉर्डिंग तक एसीएसएफ में ~ 1 एच के लिए आराम करने दें।
  7. स्लाइस को 20 घंटे तक (बाँझ परिस्थितियों में भी लंबे समय तक) के लिए रिकॉर्ड किया जा सकता है।

6. मिर्गी गतिविधि की रिकॉर्डिंग

  1. झिल्ली कक्ष (जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष) में, मस्तिष्क के टुकड़े को एक पारदर्शी अर्धपर्य योग्य झिल्ली पर रखें, जो प्लास्टिक की अंगूठी24से चिपका हुआ है। इसके लिए, एक सेल कल्चर डालने की झिल्ली में प्लास्टिक की अंगूठी को संलग्न करने के लिए सुपर गोंद का उपयोग करें।
  2. प्लास्टिक की अंगूठी के बाहर किसी भी झिल्ली को हटाने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें। सुनिश्चित करें कि झिल्ली कक्ष में झिल्ली रखने से पहले झिल्ली भी और पूरी तरह से अंगूठी से जुड़ी हुई है।
    नोट: झिल्ली को4-8डिग्री सेल्सियस पर डीडीएच 2 ओ में संग्रहीत किया जा सकता है और 1 महीने तक पुन: इसया जा सकता है। झिल्ली को हर समय गीला रखें।
  3. झिल्ली कक्ष के प्रवाह और बहिर्वाह दोनों समाधान आपूर्ति के लिए ट्यूबों से जुड़े हुए हैं। ट्यूबों को पेरिस्टाल्टिक पंप में रखें ताकि अंतर्वाह और बहिर्वाह विपरीत दिशाओं में चले जाएं।
  4. सभी ट्यूबों और कक्ष समाधान से भर रहे हैं जब तक कार्बोजोनेटेड, prewarmed aCSF में प्रवाह और बहिर्वाह ट्यूब रखें। 10-13 एमएल/मिनट की एक भी प्रवाह दर प्राप्त करने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप की गति को समायोजित करें।
    नोट: यहां इस्तेमाल किया झिल्ली कक्ष एक उच्च प्रवाह दर, जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग चैंबर 14 एमएल/न्यूनतम24तक के एक समाधान प्रवाह को सक्षम करने के लिए है । एक अलग जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग करने के मामले में, प्रवाह दरों को समायोजित करने की आवश्यकता है। हालांकि, मिर्गी गतिविधि को शामिल करने के लिए, झिल्ली कक्ष का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है।
  5. 32 डिग्री सेल्सियस के स्थिर तापमान को सुनिश्चित करने के लिए झिल्ली कक्ष के निकट निकटता में प्रवाह से जुड़े एक हीटिंग तत्व का उपयोग करें।
  6. वर्टिकल पुलर का उपयोग करके 1-2 एमΩ ग्लास पिपेट तैयार करें। 154 mm NaCl समाधान के साथ पिपेट भरें और उन्हें एक इलेक्ट्रोड धारक में रखें।
  7. चिमटी और एक स्पैटुला का उपयोग करके, छोटे फिल्टर पेपर के साथ स्लाइस लेकर और कार्बोजनेटेड एसीएसएफ से भरे पेट्री डिश में दोनों को रखकर इंटरफेस चैंबर से एक हिप्पोकैम्पल स्लाइस को हटा दें। हिप्पोकैम्पल स्लाइस से छोटे फिल्टर पेपर को हटा दें, और (यदि आवश्यक हो) फिल्टर पेपर से स्लाइस को अलग करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके कुछ बल लागू करें। स्लाइस फ्लिप न करें, इसका ध्यान रखें।
  8. रिकॉर्डिंग कक्ष में टुकड़ा रखें और टुकड़ा जाल का उपयोग कर जगह में पकड़।
    नोट: बर्नौली के सिद्धांत के कारण, उपयोग किए गए जलमग्न प्रकार के झिल्ली कक्ष में, स्लाइस आमतौर पर अतिरिक्त स्लाइस जाल के उपयोग के बिना स्थिर होते हैं।
  9. क्षेत्र और ब्याज की परत (यहां, CA1) में इलेक्ट्रोड रखें और रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
  10. 10-20 किलोहर्ट्ज की नमूना दर और 2 किलोहर्ट्ज पर फ़िल्टर किए गए कम पास के साथ वर्तमान क्लैंप मोड में रिकॉर्ड क्षेत्र संभावित गतिविधि।
  11. 5 मिनट तक के लिए एसीएसएफ में रिकॉर्ड बेसल गतिविधि।
  12. समाधान के मिश्रण को रोकने के लिए एसीएफ से हाईके+4एपी या लोमजी2 + +बीआईसी एसीएसएफ और आउटफ्लो ट्यूब को अपशिष्ट कंटेनर में प्रवाह ट्यूब स्विच करें। 2 मिनट के बाद, समाधान को संरक्षित करने के लिए प्रवाह के समान समाधान में बहिर्वाह ट्यूब रखें।
  13. हाईके+ +4-एपी द्वारा प्रेरित फट गतिविधि धोने के बाद 2-5 मिनट दिखाई देना चाहिए । हालांकि, lowMg2+ +बीआईसी द्वारा SLEs को शामिल करने में 30 मिनट तक का समय लग सकता है। यदि आवश्यक हो, तो इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोड की स्थिति को सावधानीपूर्वक बदलें।
  14. एक बार अंतिम स्थिति में, कम से कम 20 मिनट के लिए रिकॉर्ड बेसलाइन गतिविधि। यदि आप SLEs रिकॉर्ड करते हैं, तो SLEs की कम आवृत्ति के कारण लंबी बेसलाइन रिकॉर्डिंग पर विचार करें।
  15. इस मामले में कि बेसलाइन गतिविधि स्थिर है (घटना आवृत्ति का पठार), वांछित दवा में धोएं। ध्यान दें कि दवाओं में उच्च प्रवाह दर धोने के कारण केवल 2-5 मिनट लगते हैं, जो तेजी से समाधान विनिमय की अनुमति देते हैं।
  16. कम से कम 20 मिनट के दवा आवेदन के दौरान रिकॉर्ड गतिविधि, धोने के बाद। गतिविधि कम से कम 60-90 मिनट के लिए स्थिर होनी चाहिए, जो लंबी रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देती है।

7. विश्लेषण

  1. आवृत्ति और आयाम का विश्लेषण किसी भी उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है। अब तक, हम SLEs या फट गतिविधि का एक विश्वसनीय स्वचालित विश्लेषण स्थापित करने में सक्षम नहीं किया गया है, और इसके बजाय पहचान गतिविधि के दृश्य पुष्टि के साथ एक अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण का इस्तेमाल किया ।
  2. फट गतिविधि बिफेसिक, सकारात्मक, और नकारात्मक विक्षेप और 100 एमएस की अवधि की विशेषता है। नेत्रहीन रूप से फट गतिविधि के रूप में पहचानी जाने वाली सभी घटनाओं (उदाहरण के लिए, अर्ध-स्वचालित रूप से दहलीज विश्लेषण द्वारा) को घटना आवृत्ति (अंतर-घटना अंतराल, आईईआई), आयाम और विश्लेषण समय सीमा के दौरान घटनाओं की कुल संख्या के आगे विश्लेषण के लिए मैन्युअल रूप से इंगित किया जाना चाहिए।
    नोट: फट गतिविधि की उच्च आवृत्ति के कारण, प्रत्येक आवेदन चरण के अंतिम 5 मिनट आम तौर पर20का विश्लेषण किया जाता है ।
  3. SLEs का विश्लेषण किया जा सकता है जैसा कि Heuzeroth et al में वर्णित है। पहचाने गए SLEs को अवधि, आयाम, स्पाइक आवृत्ति और टॉनिक (उच्च आवृत्ति स्पाइकिंग) बनाम क्लोनिक (कम आवृत्ति स्पाइकिंग) चरण अवधि की अवधि के लिए आगे विश्लेषण किया जा सकता है। एसएलईएस जो अवधि में <10 एस हैं, उन्हें विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
    नोट: संभावित एंटीपिप्टिक पदार्थों के प्रीक्लीनिकल मूल्यांकन के लिए, फट गतिविधि (हाईके+ +4AP द्वारा प्रेरित) पर प्रभाव की जांच की जा रही है, क्योंकि पुनः प्राप्त हिप्पोकैम्पस ऊतक में स्थापित प्रेरण के कारण। lowMg2+ + बीआईसीका उपयोग करके SLEs को शामिल करने पर प्रारंभिक परिणाम(चित्रा 2)की रिपोर्ट की गई है, हालांकि इस डेटा का विश्लेषण यहां शामिल नहीं है।

Representative Results

मिर्गी गतिविधि सफलतापूर्वक 15 रोगियों तक से उद्भव मानव हिप्पोकैम्पस ऊतक में दर्ज किया गया है । मानव मस्तिष्क के ऊतकों में मिर्गी की गतिविधि के सफल प्रेरण के लिए स्थिर परिवहन और तैयारी प्रक्रियाओं की स्थापना महत्वपूर्ण है। हाल ही में प्रकाशित परिणामों से पता चला है 1) विभिन्न रोगियों के पुनः प्राप्त ऊतकों में मिर्गी के रूप में गतिविधि के स्थिर प्रेरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से 2) उपन्यास एंटीपाइप्टिक तंत्र14,,20के मूल्यांकन के लिए एक पूर्व नैदानिक उपकरण के रूप में मानव मस्तिष्क ऊतक का उपयोग ।

कुछ ही मिनटों के भीतर फट गतिविधि के रूप में हाईके+ +4-एपी प्रेरित मिर्गी गतिविधि का आवेदन(चित्रा 2 A,B, C, D)। लौकिक पालि मिर्गी (TLE) के कारण मानव हिप्पोकैम्पस ऊतक या उच्च न्यूरोनल सेल हानि में कम न्यूरोनल वितरण के कारण, इलेक्ट्रोड की नियुक्ति रिकॉर्डिंग की शुरुआत में समायोजित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में जहां 10 मिनट (इलेक्ट्रोड प्लेसमेंट से स्वतंत्र) के बाद CA1 क्षेत्र में स्लाइस की फट गतिविधि दिखाई नहीं देती है, स्लाइस व्यवहार्यता से समझौता किया जा सकता है, और स्लाइस को प्रतिस्थापित करने की आवश्यकता होगी।

एसएलईएस, जिसकी अवधि और जीटी;10 एस है, को lowMg2++ बीआईसी(चित्रा 2E,एफ) के आवेदन के साथ प्रेरित किया जा सकताहै। चित्रा 2E रिकॉर्डिंग के दौरान कुछ मिनट और स्थिर आवृत्ति के बाद SLEs के स्थिर प्रेरण से पता चलता है । यहां, SLE गतिविधि सफलतापूर्वक जांच रोगी से चार स्लाइस में से दो में प्रेरित किया गया था । एक टुकड़ा 15 मिनट की SLE गतिविधि के बाद केवल फट गतिविधि दिखाया, जबकि अंय टुकड़ा ४० मिनट के बाद भी SLEs नहीं दिखा ।

पदार्थ प्रभावों के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन के लिए, हाईके+ ++ 4-एपी द्वारा प्रेरित फट गतिविधि पर संभावित एंटीपिलेप्टिक प्रभाव की जांच की गई। ज्ञात और संभावित एंटीएपिप्टिक पदार्थ (लैकोसमाइड, डीएमईए, डाइनोर्फिन14)का परीक्षण किया गया था, और पारंपरिक एडी एड लैकोसमाइड (सोडियम चैनल अवरोधक) के साथ-साथ डीएमईए (एक उपन्यास संभावित एंटीपापिप्टिक पदार्थ)20के लिए उदाहरण दिखाए गए हैं। लैकोसमाइड और डीएमईए(चित्रा 3 सी)के आवेदन के दौरान फट घटनाओं की घटनाओं और अंतर-घटना अंतराल (आईईआई) की संख्या में कमी आई, हालांकि आयाम ज्यादातर अप्रभावित थे(चित्रा 3 डी)। स्लाइस के सबसेट में, भले ही फट घटनाओं का प्रेरण पहले कुछ मिनटों में हासिल किया गया था, गतिविधि की आवृत्ति लागू AEDs से बाहर धोने के दौरान ठीक नहीं हुआ (डेटा यहां नहीं दिखाया गया है, Kraus एट अल20देखें) । यहां, लागू दवाओं को प्रभाव को प्रेरित करने के लिए माना जाता था; हालांकि, फट गतिविधि में कमी लंबी रिकॉर्डिंग के दौरान गतिविधि में क्रमिक क्षय से प्रभावित हो सकती है। इस प्रकार, परिणामों की सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: इंटरफेस चैंबर। मानव हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस के भंडारण के लिए, दो मस्तिष्क स्लाइस होल्डिंग डिब्बों के साथ एक इंटरफेस कक्ष(ए); विशेष रूप से, एक हास प्रकार इंटरफेस चैंबर23। यहां, हिप्पोकैम्पल मस्तिष्क स्लाइस पर आराम(घ)फिल्टर पेपर की तीन परतों,(ई)छोटे टुकड़े व्यक्तिगत मस्तिष्क स्लाइस की हैंडलिंग सक्षम करने के लिए, और(एफ)बड़ा फिल्टर कागज टुकड़े टुकड़े के नीचे समाधान की एक पर्याप्त परत सुनिश्चित करने के लिए । (ग)फिल्टर पेपर्स के शीर्ष पर मस्तिष्क स्लाइस के आसपास एक कपास स्ट्रिंग, डिब्बे के ऊपर(क)ऊपर से इनलेट्स से भी समाधान प्रवाह सुनिश्चित करता है । (ख)एक कवर ढक्कन डिब्बे के नीचे से ऑक्सीजन को स्लाइस पर निर्देशित करता है । (ख) एक स्लाइस-होल्डिंग डिब्बे का शीर्ष दृश्य । (ग) फ़िल्टर पेपर्स की परतों को स्पष्ट करने के लिए साइड व्यू। (छ)कक्ष के नीचे। (ज)समाधान प्रवाह के लिए ट्यूब, जो एक पेरिस्टाल्टिक पंप से जुड़ा हुआ है (नीले तीर समाधान प्रवाह की दिशा को चिह्नित करते हैं)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: हाईके + + 4-एपी और lowMg2+ +बीआईसी द्वारा प्रेरित मानव हिप्पोकैम्पस स्लाइस में मिर्गी गतिविधि। CA1 उदाहरण रिकॉर्डिंग और हाईके+ (8 mM) + 4-एपी (१०० μM) (A, B, C, D) और lowMg2 +बीआईसी (10 μM) (ई, एफ) केआवेदन के कुछ अंशः । (क) हाईके+ +4-एपी का स्नान अनुप्रयोग कुछ ही मिनटों के भीतर मिर्गी गतिविधि को प्रेरित करता है, और गतिविधि कम से ६० मिनट के लिए स्थिर है । (ए) का विवरण (बी) में देखा जा सकता है । मानव हिप्पोकैम्पस स्लाइस के CA1 क्षेत्र में दो अलग-अलग प्रकार की गतिविधि प्रेरित की जाती है: इंटरेक्टल जैसे स्पाइक्स (सी, [बी] काविवरण) और फट गतिविधि (डी, [बी] काविवरण)। फट गतिविधि को एंटीपाइप्टिक दवाओं के प्रति संवेदनशील दिखाया गया था और इसलिए संभावित एंटीपीलेप्टिक पदार्थों(चित्र 3)के प्रभाव के लिए विश्लेषण किया गया था। (ई,एफ) lowMg2+ +BIC का आवेदन कुछ ही मिनटों के भीतर CA1 में >10 s(F)की अवधि में SLEs लाती है । हालांकि, SLEs के शामिल अन्य स्लाइस में 30 मिनट तक ले जा सकते हैं । स्केल बार = 0.2 एमवी, 2 मिनट (ए, ई), 5 एस (बी), 500 एमएस (सी, डी), 5 मिनट (ई), और 2 एस (एफ)। यह आंकड़ा क्राउस एट अलसेअनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: लैकोसमाइड या डीएमईए के आवेदन के दौरान मानव स्लाइस की मिर्गी फट गतिविधि में कमी। एक)लैक्ओसमाइड और(बी)डीएमईए, एक संभावित नए एंटीएपिप्टिक अणु के आवेदन के दौरान फट गतिविधि में कमी आई। (क) और (ख) में विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले क्षेत्रों के अंशों के साथ CA1 क्षेत्र की अनुकरणीय रिकॉर्डिंग दिखाई देती है ( सी) और (डी) । लैकोसमाइड (100 माइक्रोन) और डीएमईए (10 एमएम) एप्लिकेशन के दौरान फट गतिविधि में कमी आई, जैसा कि मध्य अंशों द्वारा देखा गया है और धोने के दौरान फिर से बढ़ जाता है। (C,D) प्रत्येक आवेदन चरण (बेसलाइन, लैकोसमाइड/डीएमईए, वॉश आउट) के अंतिम 5 मिनट के लिए फट गतिविधि की संख्या और आयाम का विश्लेषण किया गया था और सभी रोगियों (घटनाओं की संख्या, सी; आयाम, डी) के लिए संक्षेप में परिणाम के रूप में दिखाया गया था जैसा कि मतलब ± एसडी। प्रत्येक डॉट एक रोगी को इंगित करता है। एस्टेरिस ने लैकोसमाइड आवेदन के विश्लेषण के लिए डुनेट के समूहों की कई तुलना के साथ फ्राइडमैन परीक्षण और पोस्ट-हॉक द्वारा मूल्यांकन किए गए महत्वपूर्ण मतभेदों को चिह्नित किया (*p< 0.05, एन = 4) या डीएमईए आवेदन के विश्लेषण के लिए तुकी की तुलना के साथ बार-बार मापन एवं पोस्ट-हॉक द्वारा (**पी एंड एलटी; 0.01, एन = 10)। स्केल बार = 0.2 एमवी, 2 मिनट (पूर्ण रिकॉर्डिंग, ए), 5 एस (अंश, ए), 3 मिनट (पूर्ण रिकॉर्डिंग, बी), और 1 एस (अंश, बी)। यह आंकड़ा क्राउस एट अलसेअनुकूलित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

समाधान 1.1 कोलीन एसीएसएफ
पदार्थ 10x एकाग्रता (mM) 1x एकाग्रता (mM) नोट
कोलीन सीएल 1100 110
(+) - ना एल-एस्कॉर्बेट 116 11.6
MgCl2x6H2O 70 7
ना पायरुवेट 31 3.1
केसीएल 25 2.5
NaH2PO4 12.5 1.25
नाहको3 260 26
CaCl2 - 0.5 अंतिम समाधान में जोड़ें
ग्लूकोज - 10 अंतिम समाधान में जोड़ें
समाधान 1.2 एसीएसएफ
पदार्थ 10x एकाग्रता (mM) 1x एकाग्रता (mM) नोट
Nacl 1290 129
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
केसीएल 30 3
एमजीएसओ4 18 1.8
ग्लूकोज - 10 अंतिम समाधान में जोड़ें
समाधान 1.3 हाईके++4-एपी एसीएसएफ
पदार्थ 10x एकाग्रता (mM) 1x एकाग्रता (mM) नोट
Nacl 1240 124
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
केसीएल 80 8
एमजीएसओ4 18 1.8
ग्लूकोज - 10 अंतिम समाधान में जोड़ें
4-एपी - 0.1 अंतिम समाधान में जोड़ें
समाधान 1.4 lowMg2++ बीआईसी aCSF
पदार्थ 10x एकाग्रता (mM) 1x एकाग्रता (mM) नोट
Nacl 1300 130
NaH2PO4 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
केसीएल 30 3
ग्लूकोज - 10 अंतिम समाधान में जोड़ें
बिक - 0.01 अंतिम समाधान में जोड़ें
समाधान 2
पदार्थ 10x एकाग्रता (mM) 1x एकाग्रता (mM) नोट
नाहको3 210 21

तालिका 1: परिवहन, तैयारी और रिकॉर्डिंग के लिए 10x और अंतिम 1x समाधान की तैयारी।

Discussion

जीवित पुनः प्राप्त मानव मस्तिष्क ऊतक AEDs के पूर्व नैदानिक मूल्यांकन में एक अत्यधिक मूल्यवान उपकरण है, क्योंकि यह ठीक से एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क माइक्रो नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है । प्रस्तुत प्रोटोकॉल ऊतक परिवहन और तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो उच्च गुणवत्ता वाले हिप्पोकैम्पस स्लाइस के साथ-साथ एईड मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण मिर्गी गतिविधि के लिए एक स्थिर प्रेरण विधि सुनिश्चित करता है।

मिर्गी की गतिविधि की जांच के साथ - साथ मानव मस्तिष्क के स्लाइस में रासायनिक या विद्युत प्रेरण के तरीकों की जांच पहले अन्य समूहोंद्वारा 17, 20,21,2221को22दिखाई गई है । यह प्रोटोकॉल उच्च के+ +4-एपी के आवेदन के माध्यम से विभिन्न रोगियों से स्लाइस में स्थिर फट गतिविधि के शामिल होने के साथ-साथ कम एमजी2 + +बीआईसी के आवेदन के माध्यम से CA1 क्षेत्र में SLEs के शामिल होने का वर्णन करता है । यह पाया गया कि फट गतिविधि का प्रेरण SLEs (एक रोगी में परीक्षण स्लाइस का 50%) के शामिल होने की तुलना में अधिक सुसंगत है (15 रोगियों में परीक्षण स्लाइस का 80%)। हालांकि, इस प्रकार अब तक, SLEs के शामिल केवल एक मरीज में परीक्षण किया गया है । फिर भी, कम एमजी2 + +बीआईसी द्वारा SLEs के शामिल करने की सिफारिश की जाती है, क्योंकि SLEs अभी तक उच्च कश्मीर+ ++ 4-एपी का उपयोग करके प्रेरित नहीं किया जा सका है ।

कई अध्ययनों ने मानव मस्तिष्क के ऊतकों के परिवहन और तैयारी के तरीके शुरू किए हैं और अक्सर न्यूरोनल अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण तीन कारकों को उजागर करते हैं: परिवहन समय, परिवहन समाधान का उपयोग किया जाता है, और शर्तों का भंडारण होता है।

इष्टतम टुकड़ा व्यवहार्यता के लिए, कुछ समूहों का सुझाव है कि पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के परिवहन के रूप में संभव के रूप में कम हो । हालांकि, ऑपरेशन रूम और प्रयोगशालाएं शायद ही कभी निकटता में होती हैं, जिसका अर्थ है कि स्लाइस गुणवत्ता को लंबे परिवहन के कारण समझौता किया जा सकता है। कुछ समूहों ने परिवहन12के दौरान समाधान के लिए निरंतर O2 लागू करके इस बाधा को दूर किया है । हमने परिवहन के दौरान लगातार अतिरिक्त ओ2 आपूर्ति के बिना कम (अधिकतम = 15 मिनट) और लंबी (1 घंटे तक) अवधि के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को ले जाया है, जो अन्य समूहों18,,25के समान है। इन मामलों में, मिर्गी रिकॉर्डिंग के दौरान ऊतक की गुणवत्ता में अंतर नहीं देखा गया था। हमारे संस्थान में अन्य समूहों के साथ संचार में, स्लाइस गुणवत्ता पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए नहीं बदली, या तो। इसके विपरीत, ऊतक की गुणवत्ता में भिन्नता संभवतः संचालन, लंबे समय तक पुनर्सेक्शन और स्लाइसिंग प्रक्रिया के दौरान नुकसान से उपजी है।

परिवहन और काटने के समाधान के संबंध में, सभी प्रकाशित तरीके एनएसीएल को ओएस्मोटिक दबाव के कारण कोशिका सूजन को कम करने के लिए समाधानों से छोड़ देते हैं, जो कृंतक पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए मानक प्रक्रिया के समान होते हैं। हालांकि, अब तक कई विकल्प पेश किए गए हैं (यानी सुक्रोज आधारित एसीसीएफ13,,22,एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ12,,26और कोलीन आधारित एसीएसएफ27)। टिंग और सहयोगियों ने 201426 में स्लाइस तैयारी के लिए एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ पेश किया और बाद में एक रिकवरी प्रोटोकॉल जोड़ा, जो धीरे-धीरे एनएसीएल को स्लाइस28में फिर से पेश करता है। हालांकि, जैसा कि टिंग एट अल द्वारा वर्णित है, एनएमडीजी-आधारित aCSF में तैयार मस्तिष्क ऊतक के न्यूरॉन्स उच्च झिल्ली प्रतिरोध दिखाते हैं, इस प्रकार पैच-क्लैंप प्रयोगों26के दौरान पूरे सेल सील को प्रभावित करते हैं। इसलिए, हमने एनएमडीजी आधारित एसीएसएफ से कोलीन-आधारित एसीएसएफ20के उपयोग में संक्रमण किया है, जो क्षेत्र की क्षमता और पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग दोनों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले स्लाइस पैदा करता है।

स्लाइस के भंडारण के संबंध में, यह आम तौर पर स्वीकार किया जाता है कि इंटरफ़ेस की स्थिति लंबे स्लाइस अस्तित्व18के लिए महत्वपूर्ण इष्टतम ऑक्सीजन प्रदान करती है। हालांकि, अन्य समूह जलमग्न परिस्थितियों में 72 घंटे तक के लिए स्लाइस अस्तित्व दिखाते हैं12। पिछली परिकल्पना के विपरीत, मानव मस्तिष्क स्लाइस कृंतक स्लाइस की तुलना में कम ऑक्सीजन या ऑक्सीडेटिव तनाव के लिए अधिक प्रतिरोधी प्रतीत होते हैं। मुख्य रूप से, इंटरफ़ेस कक्षों का उपयोग पहले मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस के भंडारण के लिए किया गया है, हालांकि पैच-क्लैंप प्रयोगों में मानव मस्तिष्क स्लाइस के रखरखाव के लिए जलमग्न स्थितियों की सिफारिश की जाती है।

जैसा कि अन्य समूहों द्वारा चर्चा की गई है, लंबे स्लाइस सर्वाइवल (इंटरफ़ेस फॉर &48 एच18,के लिए जलमग्न <72 h12)के लिए एक अतिरिक्त महत्वपूर्ण कदम बैक्टीरियल संदूषण की रोकथाम है। कृंतक मस्तिष्क स्लाइस आमतौर पर 8 घंटे तक के लिए इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग में उपयोग किए जाते हैं, और इस अवधि के दौरान बैक्टीरियल संदूषण को स्लाइस व्यवहार्यता को प्रभावित करने के लिए नहीं माना जाता है। एक resection से तैयार स्लाइस की उच्च संख्या और मानव मस्तिष्क ऊतक की असामान्य उपलब्धता मानव मस्तिष्क स्लाइस की व्यवहार्यता को लम्बा करने की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया । यह विधि सफलतापूर्वक जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस की तैयारी का वर्णन करती है, जिसे आसानी से बाँझ स्थितियों के अनुकूल किया जा सकता है। हालांकि, यहां प्रदर्शन की रिकॉर्डिंग के लिए, स्लाइस अस्तित्व 20 एच का विस्तार एक प्राथमिकता नहीं थी ।

एसएलएस22जैसी मिर्गी की गतिविधि को शामिल करने के लिए इंटरफेस कक्षों में रिकॉर्डिंग भी आवश्यक दिखाई गई है । कम ऑक्सीजन के कारण जलमग्न स्थितियों, शायद ही कभी SLEs की रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किया जाता है; हालांकि, वे पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए आवश्यक ऑप्टिकल उच्च संकल्प के लिए आवश्यक हैं। एक अनुकूलित जलमग्न प्रकार रिकॉर्डिंग कक्ष का उपयोग उच्च ऑक्सीजन और तेजी से दवा आवेदन29के कारण, मानव मस्तिष्क स्लाइस में मिर्गी गतिविधि (बाह्य क्षेत्र या एकल न्यूरॉन) की रिकॉर्डिंग को सक्षम बनाता है। यहां, क्षेत्र संभावित रिकॉर्डिंग के लिए तरीकों और परिणामों का वर्णन किया जाता है, लेकिन इस बात पर जोर दिया जाना चाहिए कि इस संशोधित रिकॉर्डिंग कक्ष (डेटा नहीं दिखाए गए) का उपयोग करके माउस और मानव मस्तिष्क स्लाइस में पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग सफलतापूर्वक की गई है।

कृंतक मॉडल की तुलना में मानव मस्तिष्क के ऊतकों का पुनर्संरस्रीय मूल्य अधिक होता है। यह एक वयस्क, रोगग्रस्त न्यूरोनल नेटवर्क का प्रतिनिधित्व करता है जिसे आईपीएससी द्वारा पुन: पेश नहीं किया जा सकता है। हालांकि, किसी भी इन विट्रो सिस्टम की तरह, मानव मस्तिष्क स्लाइस एक अक्षुण्ण मानव मस्तिष्क का प्रतिनिधित्व नहीं करते हैं। इसके अतिरिक्त, पुनः प्राप्त मस्तिष्क ऊतक के रिकॉर्ड किए गए न्यूरोनल नेटवर्क ऑपरेशन या तैयारी के दौरान नुकसान के कारण पर्याप्त आणविक और कार्यात्मक परिवर्तनों से गुजर सकते हैं। टुकड़ा करने की प्रक्रियाओं को गाबैर्जिक कार्य को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है और मिर्गी की गतिविधि30को शामिल करने पर प्रभाव पड़ सकता है । परिकल्पना तैयार करते समय इन सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। संभावित एंटीएपिप्टिक दवाओं का परीक्षण करते समय, विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों के उपयोग पर विचार किया जाना चाहिए, क्योंकि सभी मानव मस्तिष्क क्षेत्रों या सभी रोगियों में दवा लक्ष्य व्यक्त नहीं किए जा सकते हैं। विशेष रूप से, TLE रोगियों के हिप्पोकैम्पी अक्सर गंभीर न्यूरोनल सेल हानि के साथ हिप्पोकैम्पल स्क्लेरोसिस के लक्षण दिखाते हैं। रोग परिवर्तन और रोग के इतिहास पर रोगी की जानकारी प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है, जैसे दवाओं के प्रति संभावित रिफ्रैक्टरी, और डेटा व्याख्या के दौरान इस पर विचार करें।

अंत में, यह विधि सफलतापूर्वक दो अलग-अलग प्रकार की मिर्गी गतिविधि को रिकॉर्ड करने के लिए जीवित मानव हिप्पोकैम्पस मस्तिष्क स्लाइस और प्रेरण तकनीकों की तैयारी का वर्णन करती है। चूंकि जीवित मानव मस्तिष्क ऊतक की उपलब्धता दुर्लभ है, इसलिए मानव मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके प्रयोगों से अधिकतम उत्पादन सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित परिवहन और रिकॉर्डिंग शर्तों का उपयोग किया जाना चाहिए। यह सुझाव दिया जाता है कि मानव मस्तिष्क ऊतक को कृंतक मॉडल और सेल संस्कृति प्रयोगों के अलावा एक प्रीक्लीनिकल सत्यापन उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं ।

Acknowledgments

हम उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए मैंडी मार्बलर-पोटर (चार्नाइट-अनवर्सिट्समेडिन, बर्लिन) का शुक्रिया अदा करते हैं। पीएफ को जर्मनी की उत्कृष्टता रणनीति-EXC-2049-390688087 के तहत जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (डीएफजी, ड्यूश फोर्स्चुंग्सगेमेस्चैफ्ट) द्वारा वित्त पोषित किया गया था । इस काम को बर्लिन इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ में बायोमेडिकल रिसर्च को बदलने के लिए क्वेस्ट सेंटर द्वारा समर्थित किया गया है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made - see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made - see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 159 इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी मिर्गी दवा विकास मानव हिप्पोकैम्पस पूर्व वीवो

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 07/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल रिकॉर्डिंग के लिए तीव्र मानव हिप्पोकैम्पल स्लाइस की तैयारी
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Kraus, L., Monni, L., Schneider, U.… More

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).

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