Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Fremstilling av akutte menneskelige hippocampale skiver for elektrofysiologiske opptak

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/61085
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 3, 3, 1, 1,2
1Department of Neurology with Experimental Neurology, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 2NeuroCure Cluster of Excellence, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health, 3Department of Neurosurgery, Charité-Universitätsmedizin Berlin, Freie Universität Berlin, Humboldt-Universität zu Berlin, and Berlin Institute of Health

ERRATUM NOTICE

Summary

Den presenterte protokollen beskriver transport og fremstilling av resected human hippocampal vev med det endelige målet å bruke vitale hjerneskiver som et preklinisk evalueringsverktøy for potensielle antiepileptiske stoffer.

Abstract

Epilepsi påvirker ca 1% av verdens befolkning og fører til en alvorlig reduksjon i livskvaliteten på grunn av pågående anfall samt høy risiko for plutselig død. Til tross for en overflod av tilgjengelige behandlingstilbud, er ca 30% av pasientene resistente. Flere nye terapeutiske midler er utviklet ved hjelp av dyremodeller, selv om frekvensen av legemiddelresistente pasienter forblir uendret. En av sannsynlige årsaker er mangelen på oversettelse mellom gnagermodeller og mennesker, for eksempel en svak representasjon av menneskelig farmakolysistance i dyremodeller. Resected menneskelig hjernevev som et preklinisk evalueringsverktøy har fordelen av å bygge bro over dette translasjonelle gapet. Beskrevet her er en metode for høy kvalitet forberedelse av menneskelige hippocampal hjerneskiver og påfølgende stabil induksjon av epileptiform aktivitet. Protokollen beskriver induksjon av burst aktivitet under påføring av 8 mM KCl og 4-aminopyridin. Denne aktiviteten er følsom for etablerte AED lacosamide eller nye antiepileptiske kandidater, som dimetyletanolamin (DMEA). I tillegg beskriver metoden induksjon av anfallslignende hendelser i CA1 av menneskelige hippocampal hjerneskiver ved reduksjon av ekstracellulær Mg2 + og anvendelse av bikuculline, en GABAA reseptorblokker. Det eksperimentelle oppsettet kan brukes til å screene potensielle antiepileptiske stoffer for deres effekter på epileptiform aktivitet. Videre kan virkningsmekanismer postulert for bestemte forbindelser valideres ved hjelp av denne tilnærmingen i menneskelig vev (f.eks. ved hjelp av patch-clamp opptak). For å konkludere, vil undersøkelse av vital humant hjernevev ex vivo (her, resected hippocampus fra pasienter som lider av temporal lobe epilepsi) forbedre dagens kunnskap om fysiologiske og patologiske mekanismer i den menneskelige hjernen.

Introduction

Epilepsi er en av de vanligste nevrologiske lidelsene, som påvirker 1% av verdens befolkning, og er forbundet med økt sykelighet ogdødelighet 1,2. Dessverre er en tredjedel av pasientene som lider av epilepsi resistente, til tross for en overflod av tilgjengelige behandlingstilbud, inkludert mer enn 20 godkjente antiepileptiske legemidler (AEDer)3. Unnlatelse av å oversette resultater fra preklinisk dyreforskning til kliniske studier er en grunn til at lovende behandlingsstrategier ikke er effektive hos mange pasienter4. Nylig har nevropeptid Y (NPY) og galanin vist seg å ha antiepileptiske effekter i dyremodeller; skjønt, når testet i resected menneskelig hjernevev, bare NPY vareffektive 5.

Mesteparten av den eksisterende kunnskapen om grunnleggende nevrologiske mekanismer og sykdomsterapi tilnærminger stammer fra dyremodeller og cellekultureksperimenter. Selv om de er informative, representerer disse modellene bare enkeltaspekter ved komplekse menneskelige sykdommer og det voksne menneskelige hjernenettverket. Alternativt har menneskelig hjernevev potensial til å bygge bro over det translasjonelle gapet, men er sjelden tilgjengelig for funksjonelle studier. For eksempel har post mortem hjernevev vært et verdifullt verktøy for å undersøke proteinuttrykk, hjernemorfologi eller anatomiske forbindelser, selv om nevronal aktivitet ofte er kompromittert er dettevevet 6,7,8,9,10,11.

I motsetning har levende resected menneskelig hjernevev blitt undersøkt om preklinisk narkotikaevaluering, grunnleggende nevronale funksjoner og genuttrykksmønstre12,13,14,15,16,17. En stor fordel med menneskelige hjerneskiver sammenlignet med gnagerskiver er den lange levedyktigheten til nevronalt vev etter reseksjon og forberedelse. Sammenlignet med gnagerhjerneskiver, som vanligvis kan registreres i opptil 8 timer etter forberedelse, viser menneskelige hjerneskiver stabil nevronal aktivitet i opptil 72 timer, noe som muliggjør grundig undersøkelse av disse sjeldne og verdifulle prøvene12,18.

Flere studier har undersøkt egenskapene til epileptiform aktivitet i ulike områder av resected kortikale og hippocampal menneskelig vev og brukt ulike metoder for induksjon av epileptiform aktivitet. I gnagerskiver kan epileptiformaktivitet induseres ved flere metoder: elektrisk stimulering av DG hilarceller, økning av ekstracellulære K+ (8–12 mM KCl), blokkering av GABA A-reseptorer ved bikucullin (BIC), blokkering av kaliumkanaler ved 4-aminopyridin (4-AP), og fjerning eller reduksjon av Mg2+ i ekstracellulær oppløsningA 19. Induksjon av epileptiform aktivitet i humant vev krever imidlertid kombinasjonen av minst to av de ovennevnte metodene20,,21,,22.

Presentert her er en metode for fremstilling av menneskelige hippocampal hjerneskiver, som er levedyktige i opptil 20 timer og viser induksjon av epileptiform aktivitet ved påføring av høy K+ (8 mM) og 4-AP eller lav Mg2 + og BIC.

Protocol

Pasientene må gi informert skriftlig samtykke før drift, og nødvendige etiske avtaler må være på plass før forsøket. Når det gjelder de representative resultatene, ble alle studier som involverte menneskelige deltakere gjennomgått og godkjent av Charité-Universitätsmedizin, Berlin (EA2/111/14).

1. Utarbeidelse av 10x-løsninger

MERK: På grunn av vanskeligheter med å planlegge tilgang til menneskelig hjernevev, anbefales det å forberede 10x løsninger som beskrevet her. Alternativt kan endelige 1x-løsninger tilberedes nylig ved å tilsette individuelle stoffer i endelig konsentrasjon til dobbeltdestillert vann (ddH2O).

  1. For individuelle 10x-løsninger, tilsett stoffer til ddH2O i henhold til tabell 1 og rør til de er oppløst.
  2. Bruk 10x løsninger opp til 1 måned etter tilberedning (opptil 1 år for frossen 10x kolin aCSF).
  3. For 10x kolin aCSF, forberede 50 ml aliquots av 10x 1.1 kolin aCSF (Tabell 1) og fryse ved -20 °C eller -80 °C inntil videre bruk.
    MERK: Ikke tilsett glukose og CaCl2 til 10x 1,1 kolin aCSF for å forhindre kontaminering med bakterier og utfelling av kalsiumkarbonat.
  4. 10x løsning 2 kan brukes til alle 1x endelige løsninger, mens 10x løsninger 1.1-1.4 er tilpasset og navngitt tilsvarende (Tabell 1).

2. Utarbeidelse av 1x endelige løsninger

MERK: Endelige 1x-løsninger skal tilberedes friskt eller tidligst som mulig dagen før bruk. Alle endelige løsninger bør karbageneres med 5 % CO2 og 95 % O2 ved hjelp av en glassgassdisperger for å berike løsninger med oksygen, og justere pH-en til 7,4 (maks = 7,4 ± 0,2).

  1. Kolin aCSF for transport og forberedelse
    1. For den endelige 500 ml-løsningen, tin en 50 ml aliquot av 10x-løsningen 1,1 aliquot for kolin aCSF i 37 ° C vannbad.
    2. Tilsett den tinte 50 ml aliquot av 10x-oppløsningen 1,1 og 50 ml 10x oppløsning 2 til ca. 300 ml ddH2O.
    3. Tilsett endelige konsentrasjoner av glukose og CaCl2, rør deretter til oppløst (Tabell 1, løsning 1.1).
    4. Tilsett ddH2O i et endelig volum på 500 ml og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    5. Du kan eventuelt bruke et filter til å sterilisere løsningen (se diskusjon om langvarig skive levedyktighet under sterile forhold).
    6. Fyll en separat flaske med ca. 100 ml 1x kolin aCSF for transport fra operasjonsrommet til laboratoriet.
    7. Valgfritt: Avhengig av transporttiden fra operasjonsrommet til laboratoriet, bør du vurdere å bruke gasstette flaskehett for å sikre stabil pH for aCSF i lengre transportperioder.
    8. Oppbevar den endelige oppløsningen ved 4–8 °C til videre bruk.
    9. På operasjonsdagen, chill 1x kolin aCSF på is og karbagenat i minst 10-15 min ved hjelp av en glass gass dispergeringsmiddel koblet til karbagengass (5% CO2,95% O2).
      MERK: Vurder å holde en gassflaske tilgjengelig for operasjonsrommet i tilfelle lengre ventetider, noe som vil kreve re-karbagenering av transportløsningen. Vi har imidlertid transportert hippocampal vev uten re-karbaogenering før lange og korte transporttider (15 min vs. 60 min) og observerte ikke forskjeller i induksjon av epileptiform aktivitet.
  2. aCSF for lagring og opptak
    1. For en endelig 2 L-løsning, tilsett 200 ml 10x oppløsning 1,2 (aCSF) og 200 ml 10x løsning 2 og glukose (tabell 1) til ~ 1500 ml ddH2O.
      MERK: Volumer av de endelige løsningene avhenger av anvendte eksperimenter og hvilken type kammer som brukes til lagring og opptak.
    2. Legg ddH2O til et endelig volum på 2 L og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    3. Førvarm oppløsningen til 35 °C og karbagenat i minst 10–15 min før bruk.
  3. HighK++4-AP aCSF for induksjon av burst aktivitet
    1. For en endelig 1 L-løsning, legg til 100 ml 10x løsning 1,3 (highK++4-AP aCSF) og 100 ml 10x løsning 2 til ~ 700 ml ddH2O.
    2. Tilsett glukose og 4-AP (endelig konsentrasjon = 100 μM) i henhold til tabell 1.
    3. Legg ddH2O til endelig volum på 1 L og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Førvarm oppløsningen til 35 °C og karbagenat i minst 10–15 min før bruk.
  4. LowMg2++BIC aCSF for induksjon av anfallslignende hendelser (SLE)
    1. For en endelig 1 L-løsning, legg til 100 ml 10x løsning 1,4 (lowMg2++BIC aCSF) og 100 ml 10x løsning 2 til ~700 ml ddH2O.
    2. Tilsett glukose og BIC (endelig konsentrasjon = 10 μM) i henhold til tabell 1.
    3. Tilsett ddH2O i endelig volum på 1 L og mål osmolaritet (300 mOsm ± 10 mOsm).
    4. Førvarm oppløsningen til 35 °C og karbagenat i minst 10–15 min før bruk.

3. Utarbeidelse av grensesnittkammer

  1. I et grensesnittkammer hviler skiver på tre lag filterpapir for å sikre tilstrekkelig mengde løsning under skiven. For å gjøre dette, kutt to ~ 4 cm x ~ 2 cm stykker filterpapir for hvert skiveholderrom (det beskrevne grensesnittkammeret består av to rom) og plasserer dem oppå hverandre.
  2. Plasser tynne bomullsstrenger rundt 4 cm x 2 cm filterpapirene inne i rommene for å bryte spenningen i oppløsningen. Sørg for jevn strømning (her brukes svarte nylontights kuttet til tynne strenger ~ 10 cm i lengde; for plassering, se figur 1).
  3. Plasser små biter av filterpapir oppå de større filterpapirene inne i de skiveholderne. Små filtervevsstykker skal være omtrent på størrelse med en hjerneskive (~ 1,5 cm x ~ 1,0 cm) og vil muliggjøre videre håndtering av individuelle skiver. Plasser tre til fire små filterpapirstykker i hvert rom.
  4. Sikre en aCSF-strømningshastighet på 1,8 ml/min med en peristaltisk pumpe.
  5. Karbagenate og førkrigskammeret til ~35 °C (endelig temperatur på skiven skal være ~ 32 ° C).

4. Oppsett av forberedelsesområde

MERK: Forberedelse kan utføres under sterile forhold for å unngå kontaminering og forlenge skiveoverlevelse. Imidlertid passer ikke alle vibratomer under en steril hette, og andre tiltak er nødvendige for å redusere forurensning under tilberedning. Denne delen beskriver noen av disse tiltakene.

  1. Tørk av tilberedningsområdet med 70% EtOH og legg enten aluminiumsfolie eller sterile deksler på toppen av området.
  2. Forbered superlim, to skarpe pinsett, en slikkepott, en skalpell med blader og et blad for grov skjæring av hjernevevet. Verktøy kan steriliseres før prosedyren for å redusere forurensning.
  3. Tørk av bufferbrettet og prøveplaten på vibratomen med 70 % EtOH. Når bufferbrettet er helt tørt, dekk det med aluminiumsfolie og legg brettet i isbadet. Fyll isbadet med knust is og hold ved -20 °C til til tilberedning.
  4. Tørk av vibratomen og barberbladet med 70 % EtOH og kalibrer vibratomen for å minimere vertikale vibrasjoner og vevsskader under kuttingsprosedyren.

5. Vev slicing og lagring

  1. Rett etter reseksjon, plasser vevet umiddelbart i kaldt, karbagenert kolin aCSF og transport raskt til laboratoriet.
    FORSIKTIG: Bruk hansker og ansiktsmaske til enhver tid under tilberedning, siden menneskelig hjernevev kan inneholde potensielle patogener. I tillegg vil bruk av ansiktsmaske når du ikke arbeider under en steril hette, redusere forurensning av løsninger og hjernevev.
  2. Fjern vev fra kolin aCSF og kutte bort eventuelle brente deler av vev.
  3. Skjær en jevn overflate for å lime vevsstykket på prøveplaten, mens du vurderer skjærevinkelen og vevslagene. Ideelt sett inneholder en hippocampal skive DG, CA1-4, og (om mulig) subiculum.
  4. Skjær hjernevevet i 400 μm tykke skiver og juster amplituden og hastigheten under kutting. På grunn av mulig gjenværende pia mater, viser menneskelig hjernevev mer motstand og kan kreve langsommere skjæring.
    MERK: Slice tykkelse påvirker i stor grad enten det tilgjengelige nettverket (flere nevroner i tykkere skiver) eller levedyktighet av skiven (penetrasjon av oppløsning i skiven). Vi har brukt 500 μm skiver for å øke det potensielt tilgjengelige mikronettverket, og kunne ikke observere forskjeller i induksjon av epileptiform aktivitet. 300 μm skiver brukes ofte for patch-clamp eksperimenter, selv om induksjon av epileptiform aktivitet i disse skivene ennå ikke er testet her. Vi bruker 400 μm som en standard skivetykkelse, selv om 300–500 μm skiver kan være tilstrekkelige.
  5. Før du samler, bruk en skalpell for å redusere størrelsen på hjerneskiver for å passe inn i opptakskammeret. For bruk av membrankammeret (se avsnitt 6), bør skiver være maksimalt 1,5 cm x 1 cm. Mens du reduserer, bør du vurdere de spesifikke lagene og tilkoblingene som trengs for å være intakte for opptak (f.eks. for opptak i CA1 og DG, kutte bort subiculum og omkringliggende hvitt vev).
  6. Bruk en slikkepott og små tang, legg forsiktig skiver i grensesnittkammeret på små filterpapirer og la dem hvile i ~ 1 time i aCSF til opptak.
  7. Skiver kan registreres i opptil 20 timer (enda lenger når de er under sterile forhold).

6. Registrering av epileptiform aktivitet

  1. I membrankammeret (nedsenket type opptakskammer), plasser hjerneskiven på en gjennomsiktig halvgjennomtrengelig membran, som limes til en plastring24. For dette, bruk superlim for å feste plastringen til membranen til en cellekulturinnsats.
  2. Bruk en skalpell til å fjerne eventuelle membraner på utsiden av plastringen. Sørg for at membranen er jevn og helt festet til ringen før du plasserer membranen i kammeret.
    MERK: Membranen kan oppbevares i ddH2O ved 4–8 °C og brukes om igjen i opptil 1 måned. Hold membranen våt til enhver tid.
  3. Både tilstrømningen og utstrømningen av membrankammeret er koblet til rør for løsningsforsyning. Plasser rørene i en peristaltisk pumpe slik at tilsig og utstrømning beveger seg i motsatt retning.
  4. Plasser tilsig og utstrømningsrør i karbagenert, forvarmet aCSF til alle rør og kammeret er fylt med løsning. Juster hastigheten på den peristaltiske pumpen for å oppnå en jevn strømningshastighet på 10–13 ml/min.
    MERK: Membrankammeret som brukes her er en høy strømningshastighet, nedsenket type opptakskammer som muliggjør en løsningsstrøm på opptil 14 ml / min24. Ved bruk av et annet nedsenket type opptakskammer, må strømningshastighetene justeres. Men for induksjon av epileptiform aktivitet anbefales det sterkt å bruke membrankammeret.
  5. Bruk et varmeelement som er koblet til tilsiget i nærheten av membrankammeret for å sikre en stabil temperatur på 32 °C.
  6. Forbered 1–2 MΩ glasspipetter ved hjelp av en vertikal avtrekker. Fyll pipetter med 154 mM NaCl-løsning og plasser dem i en elektrodeholder.
  7. Bruk pinsett og en slikkepott, fjern en hippocampal skive fra grensesnittkammeret ved å ta skiven med det lille filterpapiret og plassere både i en petriskål fylt med karbagenert aCSF. Fjern det lille filterpapiret fra hippocampalskiven, og (om nødvendig) bruk litt kraft ved hjelp av en pipette for å skille skiven fra filterpapiret. Vær forsiktig så du ikke snu stykket.
  8. Plasser stykket i opptakskammeret og hold den på plass ved hjelp av skivenett.
    MERK: På grunn av Bernoullis prinsipp, i det brukte nedsenkede type membrankammeret, er skiver vanligvis stabile uten bruk av et ekstra skivenett.
  9. Plasser elektroder i regionen og lag av interesse (her, CA1) og begynn å spille inn.
  10. Registrer felt potensiell aktivitet i gjeldende klemmemodus med en samplingsfrekvens på 10–20 kHz og lavpass filtrert ved 2 kHz.
  11. Registrer basal aktivitet i aCSF i opptil 5 min.
  12. Bytt tilsigsrørene fra aCSF til highK++4AP eller lowMg2++BIC aCSF og utstrømningsrøret til en avfallsbeholder for å hindre blanding av løsninger. Etter 2 min plasserer du utstrømningsrøret i samme oppløsning som tilsig for å bevare løsningen.
  13. Burst aktivitet indusert av highK++4-AP bør være synlig 2-5 min etter innvasken. Induksjon av SLE ved lowMg2++BIC kan imidlertid ta opptil 30 min. Endre om nødvendig elektrodenes posisjoner nøye for å oppnå optimale resultater.
  14. En gang i sluttposisjon, registrere baseline aktivitet i minst 20 min. Hvis du registrerer slE-er, bør du vurdere lengre opptak ved baseline på grunn av lav frekvens av slE-er.
  15. I tilfelle at baseline aktivitet er stabil (platå av hendelsesfrekvens), vask i ønsket legemiddel. Merk at på grunn av den høye strømningshastigheten vask i narkotika tar bare 2-5 min, slik at rask løsning utveksling.
  16. Rekordaktivitet under påføring av narkotika på minst 20 min, etter utvasking. Aktiviteten skal være stabil i minst 60–90 min, noe som gir lengre opptak.

7. Analyse

  1. Analyse av frekvens og amplitude kan utføres med all tilgjengelig programvare. Så langt har vi ikke vært i stand til å etablere en pålitelig automatisk analyse av SLE eller burst aktivitet, og i stedet brukt en halvautomatisk analyse med visuell bekreftelse av identifisert aktivitet.
  2. Burst aktivitet er preget av bifasisk, positiv og negativ nedbøyning og en varighet på ≥ 100 ms. Alle hendelser visuelt identifisert som burst aktivitet (f.eks semi-automatisk av terskelanalyse) bør angis manuelt for videre analyse av hendelsesfrekvens (inter-event intervall, IEI), amplitude, og totalt antall hendelser i løpet av den analyserte tidsrammen.
    MERK: På grunn av den høye frekvensen av burst aktivitet, blir de siste 5 min av hver applikasjonsfase vanligvis analysert20.
  3. SlE kan analyseres som beskrevet i Heuzeroth et al. Identifiserte SLE kan analyseres ytterligere for varighet, amplitude, piggfrekvens og varighet av tonic (høyfrekvent spiking) vs. klonisk (lavfrekvent spiking) fase varighet. SlE-er som er <10 s i varighet, bør utelates fra analyse.
    MERK: For preklinisk evaluering av mulige antiepileptiske stoffer undersøkes effekter på burst aktivitet (indusert av highK++4AP), på grunn av etablert induksjon i resected hippocampal vev. Foreløpige resultater på induksjon av slEs ved bruk av lowMg2++BIC er rapportert (figur 2), selv om analyse av disse dataene ikke er inkludert her.

Representative Results

Epileptiform aktivitet har blitt registrert i resected human hippocampal vev stammer fra opptil 15 pasienter. Etablering av stabile transport- og forberedelsesprosedyrer er avgjørende for vellykket induksjon av epileptiformaktivitet i menneskelig hjernevev. Nylig publiserte resultater har vist 1) stabil induksjon av epileptiform aktivitet i resected vev av forskjellige pasienter samt 2) bruk av resected menneskelig hjernevev som et preklinisk verktøy for evaluering av nye antiepileptiskemekanismer 14,20.

Bruk av highK++4-AP indusert epileptiform aktivitet i form av burst aktivitet i løpet av få minutter (Figur 2A, B, C, D). På grunn av lav nevronal fordeling i humant hippocampalvev eller høyt nevronalt celletap på grunn av temporal lobe epilepsi (TLE), kan plassering av elektroder justeres i begynnelsen av opptaket. I tilfeller der sprengningsaktiviteten til skiver ikke er synlig i CA1-området etter 10 min (uavhengig av elektrodeplassering), kan skive levedyktighet bli kompromittert, og skiven må byttes ut.

SlEer, med en varighet på > 10 s, kan induseres ved påføring av lowMg2 ++BIC (Figur 2E,F). Figur 2E viser stabil induksjon av slE etter noen minutter og stabil frekvens gjennom hele opptaket. Her ble SLE-aktiviteten indusert i to av fire skiver fra den undersøkte pasienten. En skive viste bare burst aktivitet etter 15 min SLE aktivitet, mens den andre skiven ikke viste SLE selv etter 40 min.

For preklinisk evaluering av substanseffekter ble en potensiell antiepileptisk effekt på burst aktivitet indusert av highK++4-AP undersøkt. Kjente og potensielle antiepileptiske stoffer (lakosamid, DMEA, dynorfin14) ble testet, og eksempler er vist her for den konvensjonelle AED lacosamid (en natriumkanalblokker) samt DMEA (et nytt potensielt antiepileptisk stoff)20. Antall hendelser og inter-eventintervall (IEI) av burst hendelser redusert både under påføring av lakosamid og DMEA (Figur 3C), selv om amplituder var for det meste upåvirket (figur 3D). I et delsett av skiver, selv om induksjon av burst hendelser ble oppnådd i de første minuttene, hyppigheten av aktivitet ikke gjenopprette under vask ut av anvendte AEDer (data som ikke vises her, se Kraus et al.20). Her ble de anvendte stoffene ansett for å indusere effekter; Nedgangen i burst aktivitet kan imidlertid ha blitt påvirket av gradvis forfall i aktivitet under lange opptak. Dermed må resultatene tolkes nøye.

Figure 1
Figur 1: Grensesnittkammer. For lagring av menneskelige hippocampal hjerneskiver, brukes et grensesnittkammer med to hjerneskive holderom (A); spesielt et Haas-type grensesnittkammer23. Her hviler hippocampal hjerneskiver på (d) tre lag filterpapir, ( e )mindre stykkerfor å muliggjøre håndtering av individuelle hjerneskiver, og (f) større filterpapirstykker for å sikre et tilstrekkelig lag med løsning under skiven. (c) En bomullsstreng rundt hjerneskiver, på toppen av filterpapirene, sikrer jevn løsningsflyt fra vidlenepåtoppen av rommet. (b) Et dekklokk leder oksygen fra under rommet på skiven. (B) Øverste visning av ett skiveholderrom. (C) Sidevisning for å illustrere lagene med filterpapir. (g)Bunnen av kammeret. (h) Rør for tilsig av oppløsning, som er koblet til en peristaltisk pumpe (blå piler markerer retningen på oppløsningsstrømmen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Epileptiform aktivitet i menneskelige hippocampal skiver indusert av highK++4-AP og lowMg2 ++BIC. CA1 eksempel opptak og utdrag av anvendelse av highK+ (8 mM)+4-AP (100 μM) (A, B, C, D) og lowMg2 ++BIC (10 μM) (E, F). (A) Bad bruk av highK++4-AP induserer epileptiform aktivitet innen få minutter, og aktiviteten er stabil i minst 60 min. Detaljer om (A) kan sees i (B). To forskjellige typer aktivitet er indusert i CA1-området av menneskelige hippocampal skiver: interictal-lignende pigger (C, detaljer om [B]) og burst aktivitet (D, detaljer om [B]). Burst aktivitet ble vist å være følsom for antiepileptiske legemidler og derfor analysert for effekten av potensielle antiepileptiske stoffer (figur 3). (E,F) Påføring av lowMg2++BIC induserer SSE-er i en varighet på >10 s (F) i CA1 innen få minutter. Induksjon av E-slEs kan imidlertid ta opptil 30 min i andre skiver. Vektstenger = 0,2 mV, 2 min (A,E), 5 s (B), 500 ms (C,D), 5 min (E) og 2 s (F). Dette tallet er tilpasset fra Kraus et al.20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Reduksjon i epileptisk burst aktivitet av menneskelige skiver under påføring av lakosamid eller DMEA. Burst aktivitet redusert under påføring av (A) lacosamid og (B) DMEA, et potensielt nytt antiepileptisk molekyl. (A) og (B) viser eksemplariske opptak av CA1-området med utdrag av regioner som brukes til analyse i (C) og (D). Burst aktivitet redusert under lakosamid (100 μM) og DMEA (10 mM) søknad, sett av midten utdrag og øker igjen under utvasking. (C,D) Antall og amplitude av burst aktivitet ble analysert for de siste 5 min av hver applikasjonsfase (baseline, lakosamid / DMEA, vaske ut) og vist som oppsummerte resultater for alle pasienter (antall hendelser, C; amplitude, D) som gjennomsnitt ± SD. Hver prikk indikerer én pasient. Stjerner markerer betydelige forskjeller som vurderes av enten Friedman test og post-hoc med Dunnetts flere sammenligning av grupper for analyse av lakosamid søknad (* p < 0,05, n = 4) eller ved gjentatt måling ANOVA og post-hoc med Tukey sammenligning for analyse av DMEA søknad (** p < 0,01, n = 10). Skala stenger = 0,2 mV, 2 min (full opptak, A), 5 s (utdrag, A), 3 min (full opptak, B) og 1 s (utdrag, B). Dette tallet er tilpasset fra Kraus et al.20. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Løsning 1.1 kolin aCSF
Stoff 10x konsentrasjon (mM) 1x konsentrasjon (mM) Merk
kolin Cl 1100 110
(+)-Na L-askorbate 116 11.6
MgCl2x6H2O 70 7
Na pyruvat 31 3.1
KCl (andre 25 2.5
NaH2PO4 Gjestgiveri 12.5 1.25
NaHCO3 Gjestgiveri 260 26
CaCl2 - 0.5 legge til endelig løsning
Glukose - 10 legge til endelig løsning
Løsning 1.2 aCSF
Stoff 10x konsentrasjon (mM) 1x konsentrasjon (mM) Merk
Nacl 1290 129
NaH2PO4 Gjestgiveri 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl (andre 30 3
MgSO4 (andre personer) 18 1.8
Glukose - 10 legge til endelig løsning
Løsning 1,3 highK++4-AP aCSF
Stoff 10x konsentrasjon (mM) 1x konsentrasjon (mM) Merk
Nacl 1240 124
NaH2PO4 Gjestgiveri 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl (andre 80 8
MgSO4 (andre personer) 18 1.8
Glukose - 10 legge til endelig løsning
4-AP - 0.1 legge til endelig løsning
Løsning 1,4 lowMg2++BIC aCSF
Stoff 10x konsentrasjon (mM) 1x konsentrasjon (mM) Merk
Nacl 1300 130
NaH2PO4 Gjestgiveri 12.5 1.25
CaCl2 16 1.6
KCl (andre 30 3
Glukose - 10 legge til endelig løsning
Bic - 0.01 legge til endelig løsning
Løsning 2
Stoff 10x konsentrasjon (mM) 1x konsentrasjon (mM) Merk
NaHCO3 Gjestgiveri 210 21

Tabell 1: Utarbeidelse av 10x og endelige 1x løsninger for transport, forberedelse og opptak.

Discussion

Levende resected menneskelig hjernevev er et svært verdifullt verktøy i preklinisk evaluering av AEDer, som det riktig representerer en intakt menneskelig hjerne mikro-nettverk. Den presenterte protokollen beskriver en metode for vevstransport og forberedelse, som sikrer hippocampalskiver av høy kvalitet, samt en stabil induksjonsmetode for epileptiformaktivitet som er kritisk for AED-evaluering.

Undersøkelse av epileptiform aktivitet samt metoder for kjemisk eller elektrisk induksjon i menneskelige hjerneskiver har tidligere blitt vist av andregrupper 17,20,21,22. Denne protokollen beskriver induksjon av stabil burst aktivitet i skiver fra forskjellige pasienter via anvendelse av høy K++4-AP samt induksjon av SLEs i CA1-området via anvendelse av lav Mg2 ++BIC. Det ble funnet at induksjonen av burst aktivitet er mer konsekvent (80% av testede skiver hos 15 pasienter) enn induksjon av SSE (50% av testede skiver i en pasient). Men så langt har induksjonen av SN-er bare blitt testet hos én pasient. Likevel anbefales induksjon av SLE ved lav Mg2++BIC, da SN-er ennå ikke har vært i stand til å bli indusert ved hjelp av høy K++4-AP.

Flere studier har innført metoder for transport og fremstilling av menneskelig hjernevev og fremhever ofte tre faktorer som er kritiske for nevronal overlevelse: transporttid, brukte transportløsninger og lagringsforhold.

For optimal skive levedyktighet, noen grupper foreslår at transport av resected hjernevev være så kort som mulig. Operasjonsrom og laboratorier er imidlertid sjelden i nærheten, noe som betyr at skivekvaliteten kan bli kompromittert på grunn av lang transport. Noen grupper har overvunnet denne hindringen ved å bruke konstant O2 til løsningen under transport12. Vi har transportert hjernevev for kort (maks = 15 min) og lange (opptil 1 time) perioder uten konstant ekstra O2 forsyning under transport, lik andre grupper18,,25. I disse tilfellene ble forskjeller i vevskvalitet ikke observert under epileptiformopptak. I kommunikasjon med andre grupper ved vårt institutt, skiver kvalitet ikke endres for patch-klemme eksperimenter, heller. I motsetning, varians i vevkvalitet muligens stammer fra skade under operasjoner, langvarig reseksjon, og kutting prosedyre.

Når det gjelder transport- og skjæreløsning, utelater alle publiserte metoder NaCl fra løsninger for å redusere cellehevelse på grunn av osmotisk trykk, som ligner på standardprosedyren for gnagerpatch-klemmeeksperimenter. Imidlertid har flere substitunter blitt introdusert så langt (det vil vil vil at sukrose basert aCSF13,22, NMDG-baserte aCSF12,26og kolinbasert aCSF27). Ting og kolleger introduserte NMDG-baserte aCSF for skiveforberedelse i 201426 og senere lagt til en gjenopprettingsprotokoll, som sakte gjeninnfører NaCl til skiver28. Men, som beskrevet av Ting et al., nevroner av hjernevev tilberedt i NMDG-baserte aCSF viser høyere membran motstand, og dermed påvirker hele cellen segl under patch-klemme eksperimenter26. Derfor har vi gått fra NMDG-basert aCSF til bruk av kolinbasert aCSF20, som gir høy kvalitet skiver for både feltpotensial og patch-clamp opptak.

Når det gjelder lagring av skiver, er det allment akseptert at grensesnittforhold gir optimal oksygenering kritisk for lang skive overlevelse18. Andre grupper viser imidlertid skiveoverlevelse i opptil 72 timer under under nedsenkede forhold12. I motsetning til tidligere hypotese synes menneskelige hjerneskiver å være mer motstandsdyktige mot lav oksygenering eller oksidativt stress sammenlignet med gnagerskiver. Primært har grensesnittkamre tidligere blitt brukt til lagring av menneskelige hippocampalskiver, selv om nedsenkede forhold anbefales for vedlikehold av menneskelige hjerneskiver i patch-clamp eksperimenter.

Som det diskuteres av andre grupper, er et ekstra kritisk skritt for lang skiveoverlevelse (grensesnitt for <48 t18, nedsenket for <72 h12) forebygging av bakteriell forurensning. Gnagerhjerneskiver brukes vanligvis i elektrofysiologiske opptak i opptil 8 timer, og bakteriell forurensning anses ikke å påvirke skive levedyktighet i denne perioden. Høyt antall skiver tilberedt fra en reseksjon og den uvanlige tilgjengeligheten av menneskelig hjernevev understreker behovet for å forlenge levedyktigheten til menneskelige hjerneskiver. Denne metoden beskriver vellykket utarbeidelsen av levende menneskelige hippocampal hjerneskiver, som lett kan tilpasses sterile forhold. Men for opptakene som ble utført her, var skiveoverlevelse som strekker seg 20 timer ikke en prioritet.

Opptak i grensesnittkamre har også vist seg å være avgjørende for induksjon av epileptiform aktivitet som SlEs22. Nedsenkede forhold, på grunn av lav oksygenering, brukes sjelden til registrering av E-slEs; skjønt, de er nødvendige for optisk høy oppløsning som trengs for patch-klemme eksperimenter. Bruken av et optimalisert nedsenket type opptakskammer muliggjør registrering av epileptiform aktivitet (ekstracellulær felt eller enkelt neuron) i menneskelige hjerneskiver, på grunn av høy oksygenering og rask legemiddelapplikasjon29. Her er metoder og resultater for feltpotensiale opptak beskrevet, men det bør understrekes at patch-clamp-opptak har blitt utført i mus og menneskelige hjerneskiver ved hjelp av dette modifiserte opptakskammeret (data som ikke vises).

Resected menneskelig hjernevev har en høyere translasjonell verdi sammenlignet med gnagermodeller. Det representerer et voksent, sykt nevronalt nettverk som ikke kan reproduseres av iPSCer. Men som i alle in vitro-system representerer menneskelige hjerneskiver ikke en intakt menneskelig hjerne. I tillegg kan de registrerte nevronale nettverkene av resected hjernevev gjennomgå betydelige molekylære og funksjonelle endringer på grunn av skade under drift eller forberedelse. Kuttingsprosedyrer har vist seg å påvirke GABAergic-funksjonen og kan påvirke induksjon av epileptiformaktivitet30. Disse begrensningene bør vurderes mens du formulerer en hypotese. Ved testing av potensielle antiepileptiske legemidler bør bruk av ulike hjerneområder vurderes, da legemiddelmål kanskje ikke uttrykkes i alle menneskelige hjerneregioner eller alle pasienter. Spesielt viser hippocampi av TLE-pasienter ofte tegn på hippocampal sklerose ledsaget av alvorlig nevronalt celletap. Det anbefales å innhente pasientinformasjon om patologiske endringer og sykdomshistorie, for eksempel potensiell ildfast mot medisiner, og vurdere dette under datatolkning.

Til slutt beskriver denne metoden vellykket utarbeidelsen av levende menneskelige hippocampal hjerneskiver og induksjonsteknikker for å registrere to forskjellige typer epileptiformaktivitet. Siden tilgjengeligheten av levende menneskelig hjernevev er sjelden, bør optimaliserte transport- og opptaksforhold brukes til å sikre maksimal utgang fra eksperimenter ved hjelp av menneskelige hjerneskiver. Det foreslås at resected menneskelig hjernevev kan brukes som et preklinisk valideringsverktøy i tillegg til gnagermodeller og cellekultureksperimenter.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Mandy Marbler-Pötter (Charite-Unversitätsmedizin, Berlin) for utmerket teknisk assistanse. P.F. ble finansiert av German Research Foundation (DFG, Deutsche Forschungsgemeinschaft) under Tysklands Excellence Strategy-EXC-2049-390688087. Dette arbeidet har blitt støttet av QUEST Center for Transforming Biomedical Research ved Berlin Institute of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(+)-Na L-ascorbate Sigma Aldrich A4034
4-AP Sigma Aldrich 275875-5G
Blades eliteSERVE GmbH HW3 used for the vibratome
CaCl2 Merck 102382
Choline Cl Sigma Aldrich C1879
Filter paper Tiffen EK1546027T
Gas-tight bottle caps Carl Roth GmbH+Co.KG E694.1
Glass filaments Science Products GB150F-8P for recording electrodes
Glass gas disperser DWK Life Sciences GmbH 258573309
Glucose Sigma Aldrich G7528
Interface Chamber inhouse made - see Haas et al., 1979
KCl AppliChem 131494.1210
Membrane (Cell culture inserts) Merck PICM030050
Membrane chamber inhouse made - see Hill and Greenfield, 2011
MgCl2?6H2O Carl Roth HNO3.2
MgSO4 Sigma Aldrich M7506
Na pyruvate Sigma Aldrich P8574
NaCl Carl Roth 3957.1
NaH2PO4 Merck 106346
NaHCO3 Carl Roth HNO1.2
Peristaltic pump Gilson Minipuls 3
Slice holder Warner instruments SHD-41/15
Vertical puller Narishige PC-10
Vibratome Leica VT1200S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hirtz, D., et al. How common are the "common" neurologic disorders. Neurology. 68 (5), 326-337 (2007).
  2. Ngugi, A. K., Bottomley, C., Kleinschmidt, I., Sander, J. W., Newton, C. R. Estimation of the burden of active and life-time epilepsy: a meta-analytic approach. Epilepsia. 51 (5), 883-890 (2010).
  3. Kwan, P., Brodie, M. J. Early Identification of Refractory Epilepsy. New England Journal of Medicine. 342 (5), 314-319 (2000).
  4. Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
  5. Ledri, M., et al. Differential Effect of Neuropeptides on Excitatory Synaptic Transmission in Human Epileptic Hippocampus. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 35 (26), 9622-9631 (2015).
  6. Qi, X. R., et al. Alterations in the steroid biosynthetic pathways in the human prefrontal cortex in mood disorders: A post-mortem study. Brain Pathology. 28 (4), 536-547 (2018).
  7. Verwer, R. W. H., et al. Post-mortem brain tissue cultures from elderly control subjects and patients with a neurodegenerative disease. Experimental Gerontology. 38 (1-2), 167-172 (2003).
  8. Verwer, R. W. H., et al. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 16 (1), 54-60 (2002).
  9. Le Maître, T. W., Dhanabalan, G., Bogdanovic, N., Alkass, K., Druid, H. Effects of Alcohol Abuse on Proliferating Cells, Stem/Progenitor Cells, and Immature Neurons in the Adult Human Hippocampus. Neuropsychopharmacology. 43 (4), 690-699 (2018).
  10. Dennis, C. V., Suh, L. S., Rodriguez, M. L., Kril, J. J., Sutherland, G. T. Human adult neurogenesis across the ages: An immunohistochemical study. Neuropathology and Applied Neurobiology. 42 (7), 621-638 (2016).
  11. Verwer, R. W. H., et al. Mature astrocytes in the adult human neocortex express the early neuronal marker doublecortin. Brain. 130 (12), 3321-3335 (2007).
  12. Ting, J. T., et al. A robust ex vivo experimental platform for molecular-genetic dissection of adult human neocortical cell types and circuits. Scientific Reports. 8 (1), 8407 (2018).
  13. Le Duigou, C., et al. Imaging pathological activities of human brain tissue in organotypic culture. Journal of Neuroscience Methods. 298, 33-44 (2018).
  14. Agostinho, A. S., et al. Dynorphin-based "release on demand" gene therapy for drug-resistant temporal lobe epilepsy. EMBO molecular medicine. 11 (10), 9963 (2019).
  15. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  16. Beaulieu-Laroche, L., et al. Enhanced Dendritic Compartmentalization in Human Cortical Neurons. Cell. 175 (3), 643-651 (2018).
  17. Sandow, N., et al. Drug resistance in cortical and hippocampal slices from resected tissue of epilepsy patients: no significant impact of p-glycoprotein and multidrug resistance-associated proteins. Frontiers in Neurology. 6, 30 (2015).
  18. Wickham, J., et al. Prolonged life of human acute hippocampal slices from temporal lobe epilepsy surgery. Scientific Reports. 8 (1), (2018).
  19. Avoli, M., Jefferys, J. G. R. Models of drug-induced epileptiform synchronization in vitro. Journal of Neuroscience Methods. , (2015).
  20. Kraus, L., et al. Dimethylethanolamine Decreases Epileptiform Activity in Acute Human Hippocampal Slices in vitro. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 209 (2019).
  21. Antonio, L. L., et al. In vitro seizure like events and changes in ionic concentration. Journal of Neuroscience Methods. , (2016).
  22. Gabriel, S., et al. Stimulus and Potassium-Induced Epileptiform Activity in the Human Dentate Gyrus from Patients with and without Hippocampal Sclerosis. Journal of Neuroscience. 24 (46), 10416-10430 (2004).
  23. Haas, H. L., Schaerer, B., Vosmansky, M. A simple perfusion chamber for the study of nervous tissue slices in vitro. Journal of Neuroscience Methods. 1 (4), 323-325 (1979).
  24. Hill, M. R. H., Greenfield, S. A. The membrane chamber: a new type of in vitro recording chamber. Journal of neuroscience methods. 195 (1), 15-23 (2011).
  25. Andersson, M., et al. Optogenetic control of human neurons in organotypic brain cultures. Scientific Reports. 6, 24818 (2016).
  26. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods in molecular biology. 1183, Clifton, N.J. 221-242 (2014).
  27. Testa-Silva, G., et al. Human synapses show a wide temporal window for spike-timing-dependent plasticity. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 2, 12 (2010).
  28. Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  29. Morris, G., Jiruska, P., Jefferys, J. G. R., Powell, A. D. A New Approach of Modified Submerged Patch Clamp Recording Reveals Interneuronal Dynamics during Epileptiform Oscillations. Frontiers in Neuroscience. 10, 519 (2016).
  30. Valeeva, G., Valiullina, F., Khazipov, R. Excitatory actions of GABA in the intact neonatal rodent hippocampus in vitro. Frontiers in Cellular Neuroscience. , (2013).

Tags

Nevrovitenskap Utgave 159 elektrofysiologi epilepsi legemiddelutvikling menneskelig hippocampus ex vivo

Erratum

Formal Correction: Erratum: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings
Posted by JoVE Editors on 07/13/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. Step 2.1.3 in the Protocol was corrected.

Step 2.1.3 in the Protocol was updated from:

Add final concentrations of glucose and MgCl, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

to:

Add final concentrations of glucose and CaCl2, then stir until dissolved (Table 1, solution 1.1).

Fremstilling av akutte menneskelige hippocampale skiver for elektrofysiologiske opptak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U.… More

Kraus, L., Monni, L., Schneider, U. C., Onken, J., Spindler, P., Holtkamp, M., Fidzinski, P. Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings. J. Vis. Exp. (159), e61085, doi:10.3791/61085 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter