Summary
这里介绍的是原发性人类血液单细胞分离的协议，以及它们分化成巨噬细胞和树突状细胞，并组装上皮细胞成多细胞人类肺模型。比较了由免疫细胞组成的生物反应，这些细胞与新鲜分离或解冻的单核细胞不同，在接触刺激性刺激时。
Abstract
这里描述了一个人类肺活细胞共培养模型，用于模拟由肺活体上皮II型细胞和两种免疫细胞（即人类单细胞衍生巨噬细胞[MDMs]和树突状细胞[MDCs]）组成的肺活体上皮组织屏障。提供了一种组装多细胞模型的协议。在两室井的渗透插入物上，在水下条件下生长和分化的Alvelar上皮细胞（A549细胞系），然后与分化的MDM和MDDC结合。最后，这些细胞暴露在空气-液体界面上几天。由于人类原发性免疫细胞需要从人体的外衣中分离，因此比较了与新鲜或解冻的单核细胞不同的免疫细胞，以便根据实验需求定制方法。三维模型由具有新鲜分离或解冻的单细胞衍生免疫细胞的肺叶细胞组成，显示与未治疗的细胞相比，细胞因子（胰腺素6和8）在接触刺激性刺激（脂质糖和肿瘤坏死因因子+）时，释放量具有统计学上显著性。另一方面，在共培养中观察到的细胞因子释放之间没有统计学上显著的区别。这表明，在存在与新鲜或解冻的外周血单核细胞（PBM）不同的MD和MDDC的情况下，所提出的模型对刺激性刺激有反应。因此，它是研究对不同物质，包括气溶胶药物或纳米材料的急性生物反应的有力工具。
Introduction
体外肺细胞培养提供经济高效、健壮且控制良好的平台，以评估气溶胶1的危害。作为人类肺肺肺细胞的示范细胞系统，从肺腺癌中分离的上皮 A549 细胞系经常被使用2。这些细胞代表来自肺活体区域3的二型鳞状II上皮细胞，是用于危险和毒性评估,,,,,,1、4、5、6、7、8、9、104的广泛使用的肺细胞系。156789A549细胞系具有双维外皮II型细胞的相关特征，如含有密集包装磷脂3的特征性层体。
研究表明，当细胞在空气-液体界面（ALI）培养时，表面活性剂被释放在空暴露上皮细胞的面体一侧，减少表面张力11，12，13。11,12,13这一特性在纳米材料呼吸道危害和毒性研究中尤为重要。吸入的纳米材料/毒剂沉积在肺作用源区域后，它们首先与肺表面活性剂相互作用，然后由湿润力置换到水性低相中，与肺细胞的相互作用发生14，15。14,尽管A549细胞形成单层（在ALI培养时，在后期时间点可以过度生长成多层），并产生表面活性剂，但缺点是其紧密结形成不足，导致跨皮电电阻值低，但仍对细胞间（纳米）粒子转移16、17、18,17,18等功能屏障。
在肺部，有多种免疫细胞群，包括噬菌体和专业抗原呈现细胞（即巨噬细胞和树突状细胞），它们通过细胞细胞接触或细胞间信号直接进行通信，以控制和维持平衡。巨噬细胞和树突状细胞是适应免疫反应19的关键先天免疫效应源和启动器。位于上皮内或下方的树突状细胞可以在上皮上形成突起，形成到流明，以捕捉抗原。Alveolar 巨噬细胞位于上皮的面皮表面，充当哨点细胞，代表对异物以及细菌、病毒和真菌感染的第一个细胞防御。其表型可塑性允许快速诱导对此类刺激的刺激性反应，并转向触发抗炎（即抑制）反应20。
为了模拟人类肺活体上皮组织屏障，我们建立了一个三联培养模型，A549细胞辅以人类血液单细胞衍生巨噬细胞（MDMS）和树突状细胞（MDDC），分别17。这种模型在ALI的栽培之前已经报告16，甚至高达72小时后暴露21。与水下条件22相比，在接触ALI的细胞培养中，对碳纳米管暴露的急性免疫反应显著增强。在ALI的共培养模型，培养和暴露在不同的材料，以前曾用于研究细胞毒性，氧化应激和炎症反应时，暴露氧化锌，23石墨烯相关的材料24，金纳米粒子25，26，26碳纳米管21，和火山灰和柴油排气颗粒27。25
此外，巨噬细胞和树突状细胞作为免疫效应细胞在体外人类肺模型中的重要作用得到了证实。特别是，与单培养系统7相比，只有在免疫细胞存在的情况下，才观察到模型中的刺激反应增加。使用原发单核细胞衍生免疫细胞的潜在缺点是PBM的可访问性有限以及供体对捐赠者变异的有限。作为解决这些潜在缺点的解决方案，此处介绍一个协议，为细胞培养模型程序集引入新隔离的 PBM28 的低温保存。本研究的目的是演示3D人类肺泡上皮组织组装，包括从人类布皮大衣分离PBM。将对刺激性刺激的响应能力与由模组和 MDDC 组成的模型进行比较，该模型与新鲜 PBM 不同，或与冷冻/解冻 PBM 区分。
使用未经测试的人体血液样本涉及特定护理，以防止传染病的潜在传播，如艾滋病毒（人体免疫机能丧失病毒）、乙型肝炎和丙型肝炎。因此，使用个人防护措施（如手套、长袍、口罩和眼罩）至关重要，并且必须符合良好的实验室实践原则。这些保护可降低皮肤或粘膜暴露于潜在传染性液体的风险。此外，对于那些参与处理布衣和PBM的人，必须接种乙型肝炎病毒疫苗，抗乙型肝炎抗体的血液滴度水平必须高于100 IU/L（需要解决针对具体国家的立法要求）。此外，所有工作必须在生物安全二级实验室进行（需要解决针对具体国家的立法要求）。在执行整个协议时，应采取与在实验室环境中工作和处理哺乳动物细胞培养相关的标准健康和安全预防措施，包括处理废物。
Protocol
瑞士联邦公共卫生局委员会批准了从人体血液中分离出原发性单核细胞的工作（参考编号：611-1，Meldung A110635/2）为阿道夫·默克尔研究所。
1. 将外周血单核细胞（PBMs）与人皮大衣分离
注：以下部分介绍从瑞士伯尔尼的瑞士输血中心购买的一袋50 mL的布衣中免疫细胞的分离。
- 试剂的制备
- 每层制备 100 mL 的磁性分离缓冲液：0.5% [w/v] 牛血清白蛋白 （BSA; 在磷酸盐缓冲盐水 [PBS]） 中，用 2 mM 乙酰甲酸 （EDTA）， 并调整为 pH = 7.2，无菌过滤器，孔径为 0.22 μm。在整个过程中保持4°C。
- 准备细胞培养基 （CCM）： RPMI 1640 与 10% [v/v] 胎儿牛血清 （FBS）， 1% [v/v] L-谷氨酰胺 （这里， 2 mM L-谷氨酰胺）和 1% [v/v] 青霉素链霉素（此处，100 单位/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）。
注：每个试剂的所需量取决于在以下步骤中要播种的细胞数量。
- PPBM 的隔离
注：所有玻璃和塑料制品在使用前都需要消毒。出于安全考虑，在处理人体血液样本时，建议使用塑料制品，以减少玻璃器皿受伤的风险。- 用剪刀切开装有布衣的袋子的软管端。
- 通过将袋子内装物直接倒入两个锥形离心机 50 mL 管（每个±25 mL）来分配毛纸涂层。
- 轻轻倒入或移液器 PBS 放入管中，达到 50 mL 体积。通过将管子轻轻倒置 3 倍来混合内容物。
- 通过移液 25 mL 在每个新鲜管中的混合物，将毛涂层-PBS 混合物分成四个新的 50 mL 锥形离心管。
- 使用 10 mL 血清移液器，在布菲涂层-PBS 混合物下方缓慢铺设 13 mL 的密度梯度介质。将填充的移液器从移液器支架上拆下，并立即用拇指插入移液器的上部开口，以防止密度梯度介质的任何额外泄漏到布菲涂层-PBS 混合物中。
注：用拇指握住上部开口，将填充移液器放在锥形离心管底部，使密度梯度介质缓慢地流到吹毛糖气涂层-PBS混合物下面，将密度梯度介质留在移液器内约 1 mL。 - 重复步骤 1.2.5 与其他三个管子包含布衣 -PBS 混合物。
- 在 1，000 x g 和 25 °C 的慢制动模式下，将含有混合物的所有四管离心 20 分钟。使用带保护盖的支架进行离心。
- 打开每个管的盖子，使用血清移液器去除含有血浆和血小板的上层，并在生物危害液体废物容器中处理。
- 使用血清移液器收集外周血单核细胞层，该层在血浆和密度梯度介质层之间显示为白色浊度小段（厚度为±2~3 mm）。颗粒底部含有红血球。避免转移形成最底层的红细胞。对所有四个管重复此。
注：外周血单核细胞由PBM和淋巴细胞组成。在磁性 CD14+ 分离期间，PBM 稍后将从淋巴细胞分离。 - 将外周血单核细胞从四管汇集到两个50 mL管中。
- 用 PBS 填充两个管，以 50 mL 填充，并盖上盖子。
- 将原四管中剩余的红细胞和血浆丢弃在生物危害液体废物容器中。
- 在500 x g 和18~20°C的常规离心机速度下将两个管离心8分钟。
- 离心后，用血清移液器取出上清液，并丢弃在生物危害液体废物容器中。
- 使用血清移液器用 5 mL 的 PBS 重新暂停细胞。
- 将电池悬浮液池入一个 50 mL 锥形离心管中，用 PBS 填充至 50 mL。
- 使用 5 μL 的细胞悬浮液使用 trypan 蓝色 （45 μL） 排除方法使用细胞计数器计数细胞。
- 将 trypan Blue-PBM 溶液的移液 10 μL 放入细胞计数器室，并计算每个标准计数协议的细胞数。使用公式 1 计算总单元格数 CT。
- 计数细胞后，像步骤 1.2.13 中那样将 50 mL 管离心。
- CD14 正选
- 轻轻打开每个管的盖子，然后使用血清移液器取出和丢弃上一液，而不会干扰颗粒。
- 添加磁分离缓冲液的计算量（公式 2）（此处，每 1 x 107 个总细胞 80 μL 缓冲液），通过上下移液溶液重新悬浮细胞颗粒。
- 使用方程3（此处，每1 x 107 个总细胞10μL）计算CD14+磁珠的相应体积，并移液器适当的体积。
- 通过上下移液，合上盖子，在4°C下孵化溶液15分钟， 混合好。
- 孵育时，用磁性分离缓冲液填充高达50 mL的管。
- 离心机，如步骤1.2.13中完成。
- 使用血清移液器吸气并丢弃上流液，而不会干扰细胞颗粒。
- 移液相应数量的磁分离缓冲液（方程4;这里，每1 x 108 个细胞500μL的缓冲液），通过上下移液3倍轻轻混合。
- 使用消毒剂喷洒和擦拭磁分离站，对磁分离站进行消毒。将层流罩与用于磁性分离的柱放在一起。
- 将磁分离柱放在磁场中，将空的 50 mL 锥形离心管直接放在柱下，用于收集洗涤和未标记的电池（即废物）。
- 通过将 3 mL 的磁分离缓冲液移入磁分离缓冲液冲洗磁分离柱。不要让柱子在整个过程中干涸。
- 准备 15 mL 锥形离心管和移液器 1 mL 的磁性分离缓冲液。
- 将电池悬浮液（在步骤 1.3.8 中准备）应用于磁性分离柱。在过滤器下的50 mL锥形离心管中，收集通过的未标记的细胞。
注：不要超过每列 2 x10 9 个单元格，以避免阻塞该列。 - 一旦柱储液罐为空（即，当细胞通过柱时），使用血清移液器应用 3 mL 的磁分离缓冲液，让它穿过柱。重复此 3x。
- 用手轻轻拉扯，从磁分离器上取下磁分离柱，然后将其放入含有预管1 mL磁分离缓冲液的15 mL管中（在步骤1.3.12中准备）。
- 向柱中加入 5 mL 的磁性分离缓冲液，通过将柱塞牢固地推入柱体，冲出磁性标记的电池。
- MDM 和 MDDC 分化的试剂制备
- 使用步骤 1.2.17 中完成的 trypan 蓝色排除方法使用单元格计数器计数单元格。
- 计算所需的 CCM 或 FBS 体积，以执行如下步骤：与 1 x 10 6 个单元/mL（步骤 1.5.1）对应的 CCM 卷，或对应于每 0.9 mL6 6 个细胞密度的 FBS 卷（步骤 1.6.3）。6
- 合上盖子，将管子放在离心机中，然后像步骤 1.2.13 中那样使用离心机。取出并丢弃上一液，而不干扰细胞颗粒。继续执行步骤 1.5 进行细胞种子设定，步骤 1.6 用于细胞冻结。
- PBM 播种和分化为 MM 和 MDDC
- 按照步骤1.4.2（此处，最终浓度为1 x 106 6 细胞/mL）中计算，通过上下移液3倍，将细胞颗粒重新在计算体积CCM中。
- 使用血清移液器在单独的锥形离心管中分离成 MM 和 MDDC 的细胞数量移液器。
- 移液器将系数与 PBM 区分为 CCM，通过上下移液进行良好混合。区分因素应用如下：
- 对于MDC：最终浓度为10纳克/mL白细胞间素-4（IL-4）和10纳克/mL粒细胞-巨噬细胞-巨噬细胞群刺激因子（GM-CSF）。
- 对于 MM：最终浓度为 10 ng/mL 巨噬细胞群刺激因子 （M-CSF）。
- 通过每孔分配3 mL的悬浮液（对应于3 x 106 个细胞/孔，即1 x 106 个细胞/mL），将CCM中的细胞悬浮液与添加的区分因子移入6个孔板中。
- 将6个孔板放在细胞培养培养箱（37°C，5%CO2）中，让它们区分6天，无需刷新CCM。
注：差异化范围从5~8天不等，具体取决于当地可得性的布菲外套和实验装置，前提是使用适当的技术确定差异化效率（请参阅讨论部分）。
- Pbm 冻结
- 将细胞颗粒以9：1（v/v）的比例在低温保护介质中（此处，FBS和二甲基硫化物[DMSO;细胞毒性]）以9：1（v/v）的比例通过调理预警告的FBS体积。这相当于最终细胞浓度为6 x 106 细胞/mL，考虑进一步增加10%DMSO（v/v）。
- 标记层流罩中所需的低温数量（即记录日期、隔离代码和细胞数量）。
- 在纯 FBS 中移液 0.9 mL 细胞悬浮液（此处，6 x10 6 细胞在 0.9 mL 的 FBS 中）到每个冷冻。随后，缓慢移液 0.1 mL 的 DMSO 和混合悬浮井，通过上下转动 3 倍的低温。
- 将冷冻转移到细胞冷冻容器中，并立即将其设置为 -80°C 24 小时。
- 24小时后，从-80°C冰柜和容器中取出冷冻液，放入适合细胞储存的液氮罐中。
- PBM 解冻和分化为 MM 和 MDC
- 在水浴中将所有必需的试剂加热至37°C（约20~30分钟）。
- 准备与解冻细胞数对应的 6 个井板的适当数量（此处，每 1.8 x 107 个孔板一个板，即 3 个冷冻板）。在无菌条件下，将 2 mL 的 CCM 移液到每个井中。将板放在培养箱（5 % CO2，37°C）中 15 分钟，使 pH 值平衡。
- 从液氮罐中用冷冻细胞服用所需数量的冷冻细胞，并在 37 °C 水浴（1~2 分钟）中轻轻旋转，以确保细胞悬浮液均匀解冻。
- 从水浴中去除低温，用消毒剂去污，确保该剂不会与盖子和 O 环相互作用。
注：在此，所有步骤必须在无菌条件下完成。 - 准备适当数量的 15 mL 锥形离心管，对应于要解冻的冷冻体数量（此处，6 x 106 个 单元/管）。将 9 mL 的预预热 CCM 移入每个管中。
- 滴管缓慢（滴）冷冻物的内容到含有CCM的管子。合上盖子，重复每个管，以200 x g的离心机 在正常离心机速度下5分钟。
- 在不干扰颗粒的情况下丢弃上一液。
- 使用血清移液器（细胞密度对应于 3 x 106 个细胞/mL）上下移液，将每个管中的颗粒（包含来自一个冷冻的细胞）在 2 mL 的预预热 CCM 中重新应发颗粒。
- 从每个管，移液将重新暂停的细胞分成两个孔（每孔1 mL），包含2 mL先前准备的CCM，以达到3×106 细胞/孔的细胞密度（对应于1 x 106 6 细胞/mL的最终浓度）。对所有其他管重复此重复。
- 继续区分，如第 1.5.3 节所述。
- 将6个孔板放在细胞培养培养箱（37°C，5%CO2）中，让它们区分6天，无需刷新CCM。
2. 人类肺活骨上皮组织的三重细胞共培养模型
注：本节提供与12个井板插入物对应的体积和电池号的说明。图 1 总结了模型程序集的建议时间线。
- 上皮细胞（A549细胞系）播种
- 根据供应商 （ATTC） 提供的建议培养上皮细胞。简言之，在80%的细胞汇合下（大约每周2x~3倍）对CCM中的细胞进行亚培养。
注：亚培养 A549 用于共培养模型组合之前至少四个段落，使用 A549 细胞在 5~25 的通道范围内。 - 将预预热 CCM 移入 12 个井板（井数对应于所需型号数）的管道 1.5 mL。
- 使用灭菌钳将单个 12 孔细胞培养物插入 12 孔板的孔中。
- 根据子培养协议从烧瓶中分离细胞（即，使用分离剂，像步骤 1.2.13 中那样通过离心去除该剂）。在适当的CCM体积中重新悬浮，对应于A549的最终细胞浓度（此处，50 x 104 细胞/mL;每个插入的0.5 mL细胞悬浮液，即25 x 104个 细胞/插入，对应于27.8 x 104细胞 /厘米2的播种密度。
- 使用 1 mL 移液器将 0.5 mL 的细胞悬浮液（即 25 x10 4 个 单元/插入）移液器插入插入的边。
- 用盖子盖住盘子，并把它们放在细胞培养箱（37°C，5 % CO2）中4天。
注：定期检查相位对比显微镜下 A549 细胞的汇合。
- 根据供应商 （ATTC） 提供的建议培养上皮细胞。简言之，在80%的细胞汇合下（大约每周2x~3倍）对CCM中的细胞进行亚培养。
- MDDC 种子
- 在含有MDC的6个井板中用未连接的细胞吸附CCM。
- 在每个井中加入1 mL 的新鲜预预热 CCM。
- 使用电池刮刀，从每口井分离（刮）粘附MDDC，用现有的1 mL的CCM 3x轻轻清洗油井，并将它们组合成一个锥形离心管。
- 使用 trypan 蓝色排除方法使用 10 μL 的细胞悬浮液和 10 μL 的 trypan 蓝色溶液使用单元格计数器计数细胞。
- 像步骤 1.2.13 中那样将电池悬浮液离心。
- 计算重新计算所需的 CCM 体积（公式 5）：
所需的MDDC密度 = 42 x 104 个细胞/mL;每个插入需要 6.3 x 104 个单元，对应于种子细胞密度 7 x 104 细胞/cm2（ 此处，在步骤 2.2.10 中添加到 0.9 cm2 上 150 μL）。
用于细胞再彭的 CCM 体积 （Vm;等式5）：
- 轻轻吸气，从 12 个孔板的上腔中吸气并丢弃 CCM，刀片上不断生长 A549。
- 使用消毒的钳子将带 A549 细胞的刀片倒置放在无菌培养皿中。使用 PBS 准备锥形离心管 （50 mL），并预滋润细胞刮刀。
- 从刀片的基面（即倒置位置的上部）刮掉 A549 细胞，这些单元应通过刀片的毛孔生长。
注：在刮取单个样品之间用 PBS（用管子中准备）冲洗刮刀，并在整个过程中保持湿润。 - 离心（步骤2.2.5）后，吸气并丢弃上流水器，然后重新增发计算量CCM（步骤2.2.6）和移液器上下3倍的MDDC颗粒。
- 每个刀片顶部的单元悬浮液 150 μL，使刀片的整个基底表面均被液体覆盖，且不含气泡。
- 用盖子盖住盘子，放在细胞培养箱中70分钟。从细胞培养板中吸出CCM（最初放置的插件），将其丢弃在生物危害液体废物中，并移液器1.5 mL的新鲜CCM进入每个孔中。用盖子盖住盘子，放在细胞培养箱中（37°C，5% CO2）。
注：不要超过上述时间段，以免使细胞干燥。 - 孵育后，小心地用消毒钳子握住每个刀片，并将其放在包含CCM的板子中，放在一个普通的位置。用盖子盖住盘子，然后返回细胞培养箱（37°C，5% CO2）。
- 巨噬细胞 （MDM） 播种
- 拿 6 个包含预分化的 MM 的井板， 把它们从细胞培养箱放在层流罩上。
- 吸气和丢弃CCM与未连接的MM生长在6个井板，和移液器1 mL的新鲜预预热CCM在每个井。
- 使用细胞刮刀，轻轻地从单个孔中去除粘附的 MM（如 MDDC 的步骤 2.2.3 所示）。
- 将 10 μL 的锥板蓝色移入井或管中，并加入 10 μL 的 MDM 悬浮液，以实现 1：1 （v/v） 的最终稀释。使用适当的计数协议计算 MM 的数量。
- 像步骤 1.2.13 中那样将电池悬浮液离心。
- 计算所需的体积（公式 6）：
在 CCM 中所需的 MDM 密度 = 2.5 x10 4 4 细胞/mL（此处，每个插入在 0.5 mL CCM 中需要 1.25 x 104 个细胞，这相当于种子细胞密度 1.4 x10 4 细胞 /cm2）。
(6) - 离心后，吸气并丢弃上流水，在计算量CCM（步骤2.3.6）中重增MDM颗粒，并上下移液器3倍。
- 使用 1 mL 移液器小心移液器 0.5 mL MDM 悬浮液（在步骤 2.3.7 中准备）在细胞培养单元壁上使用 A549 和 MDDC（不直接在上皮细胞上）。盖上带盖子的盖子，放在细胞培养培养箱（37°C，5 % CO2）中，24小时。
- 将共培养模型转移到空液接口 （ALI）
- 在细胞培养培养箱中组装模型的24小时（±2小时）孵化期结束时，从细胞培养物插入物的脂肪和基础部分和井中吸气并丢弃CCM。
- 使用灭菌钳子，使用 1 mL 移液器将单个刀片从井中提起，并移液器 0.6 mL 的新鲜预预热 CCM 到每个孔。请勿将 CCM 添加到插入的边。
- 盖上带盖子的盖板，并放在细胞培养培养箱（37°C，5 % CO2）中，24小时前进一步使用。
(6)3. 接触选定的阳性对控（诱导刺激性反应的已知刺激）
注：将共培养模型暴露在已知前炎刺激内毒素脂质糖 （LPS）7 和蛋白炎细胞因子肿瘤坏死因子 +（TNF-+）7 中，用于说明模型的响应能力。此外，接触洗涤剂（Triton X-100）用于确认乳酸脱氢酶（LDH）测定的敏感性。
- 准备正控制解决方案：LPS 库存（蒸馏水中 1 mg/mL）、TNF-α 库存（蒸馏水中 100 μg/mL）和 Triton-X 100（PBS 中 2% [v/v]）。
- 在ALI条件下的共培养模型的24小时孵育时，从基底隔间中吸气并丢弃上经剂。使用灭菌钳子，从井中提起单独的刀片，将 0.6 mL 的新鲜预预热 CCM 提升到每个孔中。
- 通过稀释锥形离心管中的 CCM 库存，准备单独的正对控工作解决方案，如下所示：1 μg/mL LPS、1 μg/mL TNF-Ω 和 0.2% Triton-X 100。卷对应于测试插入数（此处为 100 μL/插入）。通过上下移液 3 倍，将解决方案混合好。
- 通过缓慢移液施加细胞培养插入的壁面，应用每个正对控制溶液的 100 μL。用盖子盖住井板，并放在细胞培养箱（37°C，5%CO2）中24小时。孵育时，使用钳子固定单独的刀片，吸气并丢弃刀片的面。
- 在基底隔间中收集CCM，储存在1）4°C，用于进一步LDH分析，表示细胞膜破裂介质的细胞毒性，和/或2）储存在-80°C，通过酶链接免疫吸附剂测定（ELISA）进一步分析蛋白质释放。根据套件供应商的建议运行检测。
- 去除CCM后，用PBS 3x清洗刀片，并将细胞培养中细胞培养物上细胞固定为4%（w/v）半成甲醛（在PBS中，室温下为15分钟），确保两个刀片两侧均用PFA溶液覆盖。随后用 PBS 洗涤 3x 以去除 PFA。将浸入PBS中的样品存放在4°C，以进行进一步的免疫污染（该方法的一个示例在17之前已经描述过）。
Representative Results
由肺活体上皮细胞和免疫细胞组成的人类肺共培养模型，由新鲜或冷冻的MDDDC和MDM祖细胞（这里，人类外周血衍生的单核细胞）组装。如图1所示，A549细胞在第一节涉及单细胞分离/解冻后3天播种。经过6天的分化后，分化的MM出现圆形，而MDDC形成一个更加拉长的形状，具有可观察到的突出。它们也以聚集物出现，特别是当与新鲜单核细胞有区别时（图2，图3）。在膜插入物上生长3天后，上皮细胞形成细胞的致密细胞层（图4），当共培养物被组装。经过24小时组装和额外的24小时受到ALI条件，共同培养准备暴露。
3D细胞培养模型的响应性被调查时，暴露于已知的前发刺激使用伪ALI方法，如前面所述29。刺激性刺激、LPS 和 TNF-α 以低体积（100 μL）添加到暴露细胞模型的面膜表面。同时，通过LDH测定评估膜破裂的缺乏作为细胞毒性的测量方法。在接触膜破裂的正对照（一种洗涤剂Triton-X100）时，观察到基层室CCM中的LDH释放显著增加（图5）。这些结果证明模型对细胞毒性物质的反应能力，而使用TNF-α或LPS进行刺激时未观察到LDH释放的增加。
使用新鲜或以前冻结的 PBM 组装的样品中 LDH 测量值不同的可能原因可以归因于样品存储。来自新鲜 PBM 的样品在 -80 °C 下储存时间更长;因此，LDH酶的活性可能下降。值得注意的是，LDH在CCM中仅稳定了4天;因此，建议在收集超级钠后最晚2天进行检测。或者，在收集后可以直接冻结超级纳特。然而，重要的是要考虑，冻结可以降低LDH的酶活性。
通过ELISA对基础CCM中分泌的刺激性调停器（此处、TNF-α和中间体6[IL-6]和8[IL-8]）进行量化。与各自的未处理细胞相比，在LPS-和TNF-α-处理的样品中，以及从任一PBM源组装的细胞培养模型中，在IL-6和IL-8的释放中观察到的统计显著（p < 0.05，双向ANOVA）增加。虽然在由新鲜 PBM 组成的共培养物中，基础 CCM 中所有被测试细胞因子的浓度 （pg/mL） 较高，但两种共培养和单一培养物之间的差异在统计学上并不显著（p > 0.05） （图 6）。为了确认共培养模型对2D上皮细胞培养的附加价值，A549单培养也接触LPS或TNF-α。正如预期的那样，与两种联合栽培模式相比，A549单一栽培中所有调查调解员的释放率都较低;虽然，它们之间的差值在统计上并不显著（p > 0.05，双向观测值）。
通过共声激光扫描显微镜（LSM）评估了3D人类肺活体上皮组织屏障的细胞形态。为了可视化每个模型的组成，共培养模型 （MMM） 内的巨噬细胞被染色于成熟的巨噬细胞标记 25F9。MDDC被染色CD83，这是激活的树突状细胞30的重要标记。关于细胞形态，使用MM和MDDC的共培养模型与使用解冻的PBM模型相比没有区别。在LPS-和TNF-+-α-暴露的共培养中，由新鲜和冷冻免疫细胞组成，观察到LSM图像中被破坏的上皮层，在未经治疗的细胞中并非如此（图7，图8）。
图 1：协议的架构时间线。3D 共培养模型的制备、组装和应用（暴露于测试物质）的演示。ALI = 空气-液体接口，MDDCs = 单细胞衍生树突状细胞，MDM = 单细胞衍生巨噬细胞，PBMs = 外周血单核细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：MM和MDC区别于新的PBM。从新鲜PBM（细胞隔离后6天）的分化（A）MM和（B）MDC的相位对比显微镜图像。多边用系统是圆形的，而MDDC经常被观测为聚集体。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：MM和MDDC与冻结的PBM不同。从解冻的PBM（解冻后6天）中区分（A）MM和（B）MDC的相差显微镜图像。MM 是圆形的，但可以观察到一些拉长的细胞。MDDC 也出现圆形与突起。请单击此处查看此图的较大版本。
图4：膜插入体上表皮细胞生长。在播种4天后，在膜插入物上生长的汇合S549的相对比显微镜图像，形成密集的细胞层。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：通过膜破裂（LDH）测定结果对细胞毒性结果进行了调查。数据与未经处理的细胞相比成折率增加（均值 = SD，n = 3，星号表示与未经处理的细胞相比具有统计显著性增加，**p < 0.01，***p < 0.0001）。在绿色模型中，来自新 PBM 的 MDDC 表示，在从解冻的 PBM 组装的紫色模型中表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：共培养和单一栽培中的易燃反应。在 24 小时与 LPS 或 TNF-α 挑战后，在联合培养中释放刺激性介质 （TNF-+、 IL-6 和 IL-8）。数据呈现为相对于未经处理的细胞（均值 = SD，n = 3，**p < 0.01，***p < 0.001，***p < 0.0001）。在绿色模型中，来自新 PBM 的 MDDC 表示，在从解冻的 PBM 组装的紫色模型中表示。灰色表示 A549 单一栽培。 请单击此处查看此图的较大版本。
图7：由新鲜免疫细胞组成的共培养的形态学。使用新 PBM 的 MDDC 使用模型的 pical 边和基础面的 LSM 图像，Cyan 表示核 （DAPI），品红色表示细胞骨架（罗丹-平度素），白色表示 MDM （25F9），绿色表示 MDDC （CD 83）。白色箭头表示 MDM，而绿色箭头表示 MDDC。 请单击此处查看此图的较大版本。
图8：由冷冻免疫细胞组成的共培养的形态学。具有相应 xz 投影的共培养模型的面的 LSM 图像，以及使用解冻 PBM 的 MDDC 模型的基面图像。Cyan 表示核 （DAPI），品红色表示细胞骨架 （罗丹-平罗丁）， 白色表示 MM （25F9）， 绿色表示 MDDC （CD 83）。白色箭头表示 MDM，而绿色箭头表示 MDDC。 请单击此处查看此图的较大版本。
Discussion
新兴生产新材料，包括化学品和药物，逐渐增加了对预测体外模型的需求。为了遵循动物试验32的替代、减少和完善三个原则，体外细胞模型已成为阐明药物,或材料,作用8、9、10、119的替换和还原机制的有力工具。10这里介绍的是使用免疫细胞组装多细胞模型的详细协议，这些免疫细胞是新鲜分离的，或者从以前冻结的单核细胞中解冻的。还介绍了ALI模型的培养。最后，该协议说明了接触刺激性刺激的示例，并比较了两个包含新鲜或冷冻单核细胞的模型的反应。
已进行各种研究，以确认和证明在ALI条件下生长和暴露的模型的附加值增加相比，传统的水下暴露7,7，22，31。,31与上皮细胞的单一培养相比，对共培养中较高的前发反应的观察证实了先前的研究。该研究使用所呈现的共培养模型（使用LPS刺激），与A549单培养等效模型7相比，TNF和IL1B的基因表达水平反应更高。另一方面，与 A549 单培养相比，两种模型在测量的消炎介质释放值内均表现出更高的变异。这可以通过在生物重复（即一次重复，一个捐赠者）中使用不同捐赠者的免疫细胞（布菲涂层）来解释，如前面所示。如果需要，可以通过 1） 使用来自同一捐赠者的解冻 PBM 或 2） 在冻结细胞之前将不同捐赠者的 PBM 集中，然后在每个重复中随后使用相同的池来克服复制之间的变异。也建议包括更多的生物重复。
细胞冷冻技术可视为关键步骤;然而，它是保存细胞进行表型和功能分析的常用实验室程序。各种研究表明，冷冻PBM的质量对它们的生存至关重要，而适当的冷冻技术是后续相同细胞28、32,的测定成功的关键。修改协议可以通过冻结PBM进行，这为实验设置提供了灵活性，因为布菲外套的可用性通常有限。使用冷冻PBM（在几个小瓶中）比新鲜隔离的PBM的另一个优点是，即使在1年后，它们也可以在随后的实验中使用。如果这是实验中所需的参数，这将减少捐助者对捐赠者变异性的潜在问题。
在长达13个月后进行的实验室间比较结果表明，PBM在液氮罐中正确储存时，可以长时间使用，而对细胞活力或细胞恢复没有任何影响。在进行实验之前，经过对细胞生存能力和细胞响应性进行仔细验证，可能会延长存储时间（超过 1 年）。此外，液氮罐中的温度必须始终保持稳定。影响低温保留PBM生存能力的主要因素是DMSO浓度，最佳浓度为10%~20%（v/v）28 。28为了尽量减少冷冻的潜在有害影响，蛋白质、FBS或BSA的不同来源（浓度范围从40%到100%34）经常被添加到冷冻介质中，作为可增加细胞存活率的天然保护成分。
由于 DMSO 的细胞毒性电位很高，建议首先在 FBS 中分散 PBM，然后将 DMSO 添加到已分散在 FBS 中的 PBM 中。值得注意的是，虽然FBS浓度较高（>40%）细胞生存能力未出现任何改善，同时，它们对细胞28没有造成伤害。然而，冷冻单核细胞是克服布衣可用性有限的问题的一种可能方法。然而，如果需要使用新PBM中的MDDC和MM，免疫细胞可以在隔离后,5-8天分化和使用7、16、17、35、36、37。16,36,3717,357如果实验规划允许，建议在MDDC和MM中至少区分6天。然而，在同一实验中不同重复的一致性，以及对它们特定的表面标记表达式的常规检查，都至关重要。分化时间后，还应定期检查对刺激刺激（如 LPS）的响应能力。
许多使用 A549 细胞系的调查在 ALI 进行了，无论是作为单培养，还是与其他细胞类型（巨噬细胞、树突状细胞或成纤维细胞）结合到 3D 共培养模型 22、24、29、3822,24,29,中。利用这种3D共培养模型，对（纳米）材料的细胞毒性、氧化应激或刺激效应进行了调查，研究,时间高达72小时1、17、21、24、29。17,24,29121该模型与体内组织相似，此前已根据模型16的共声激光扫描成像进行了调查。在组装模型时，必须考虑细胞增殖（这会影响此处介绍的模型中的 A549）以及原发（不增殖）免疫细胞（此处、MDDC 和 MMM）的性能。同样重要的是要考虑，并非所有CD14阳性单核细胞都区分为MDDC和MM，并且这些细胞可以同时以附加形式和悬浮形式存在。根据共培养体的性质（此处，两种细胞类型都需要附加到现有的上皮层），建议仅使用两种免疫细胞类型的粘附子群。此外，对单核细胞、MDDC 和 MDM 单培养对 LPS 的常规分析，以及特定表面标记（CD14、CD163、CD86、CD93 或 CD206，未显示的数据）的表达，都表明 6 天和 7 天的分化是最佳时间点。
虽然人类肺部的肺皮上皮细胞数量实数相当于+160，000细胞/厘米2，但模型中计数的 A549 细胞数量为+1，000，000细胞/厘米2，在插入体16、18,18上培养9天后培养。因此，需要考虑体外模型的局限性。首先，上皮细胞的密度是基于它们在生长膜上形成汇合层的能力而建立的。同样重要的是要提的是，A549代表一个上皮类型II细胞与一个立体形式，与上皮类型第一类型第一细胞，这是平坦和外向。另一方面，根据文献确定所需的免疫细胞数量，并在本协议中作为细胞数/表面积39、40、41,40,呈现。MDDC的细胞密度在400个细胞/毫米2（42个细胞/厘米2）16的范围内，与体内研究39报告的稳定状态细胞密度500~750细胞/mm2（5-7细胞/厘米222）相当。2该模型中的MM密度在人类阿尔维拉尔区域40的体内情况范围内。
成熟的巨噬细胞标记染色（25F9）在突如其来侧（存在MM的地方）和基底侧（即树突状细胞的位点）均观察到。免疫细胞通过膜插入孔隙的转移是可能的，也已经观察到使用这个模型16，这可以解释观察到的染色强度的差异。然而，另一个可能的解释是，成熟的巨噬细胞标记也可以表达在树突状细胞，但表达是高度供体特异性42。此外，25F9 表达式的强度在 MM 中要高得多（图 7，图8）。两种刺激（LPS和TNF-+）都影响了两种共培养物中肺上皮屏障的完整性（图7，图8）。根据先前的出版物43，44，,44这预期，前发性细胞因子和细菌产品会破坏上皮屏障的完整性。
人类肺皮上皮的3D多细胞模型，建立和特征以前17，已成为一个强大的和有用的工具，评估生物反应（即急性前火反应，氧化应激反应，粒子分布和细胞通信）在体外21，24，25，45。21,24,25,45结果证实了联合栽培模型对刺激性刺激（此处，LPS 和 TNF-+）的责任。使用新鲜PBM的免疫细胞时，反应略有增加;然而，使用新鲜和解冻的PBM的共培养在统计学上没有显著差异。此外，两种共培养模型的抗炎反应高于在同一（ALI）条件下培养的上皮细胞单培养反应。总之，该协议描述了3D人类肺骨上皮组织共培养模型的组装，该模型使用新鲜或解冻的PBM进行分化，以分化为MM和MDDC。表明两种型号对刺激性刺激反应灵敏;因此，它们可以作为潜在危害和毒性评估的有力工具。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢米格尔·斯库奇-卡尔瓦尔博士在图3中的联合栽培计划，感谢贝迪亚·贝古姆·卡拉科卡克博士的批判性阅读。这项研究得到了SWIN前项目、欧洲联盟"2020年地平线研究和创新方案"以及第760813号赠款协议的支持，并得到阿道夫·默克尔基金会的支持。B.D. 感谢彼得·德·特劳德尔·恩格尔霍恩基金会提供财政支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Benchmark microplate reader | does not have to be specific, for example BioRad, Cressier, Switzerland | ||
| Cell culture Incubator | does not have to be specific | ||
| Cell freezing container (for example Mr. Frosty) | does not have to be specific | ||
| Centrifuge | does not have to be specific | ||
| Confocal laser scanning microscope | does not have to be specific, for example | Zeiss LSM 710 meta | |
| Heamatocytometer, or automatic cell counter | does not have to be specific | ||
| Laminar bio-safety hood class II | does not have to be specific | ||
| MultiStand Macs (Macs Cell Separator) | Miltenyi, Germany | 130-042-303 | |
| pH meter | does not have to be specific | ||
| Phase contrast inverted light microscope | does not have to be specific | ||
| Pipette boy, pipettors (different volumes) | do not have to be specific | ||
| Scissors | do not have to be specific | ||
| Vacuum pump | does not have to be specific | ||
| Water bath | does not have to be specific | ||
| Disposable small equipment/glassware | Catalogue Number | ||
| 15 mL and 50 mL conical centrifuge tubes | does not have to be specific | ||
| 6- and 12-well cell culture plates, flat bottom, low evaporation lid, sterile | Falcon, Switzerland | 353046 and 353043 | |
| Cell culture inserts, transparent PET membrane, 12-well, 3 μm pore size | Falcon, Switzerland | 353181 | |
| Cell scrapper | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 353085 | |
| Cryovials | do not have to be specific | ||
| Glass autoclaved Petri Dishes | do not have to be specific | ||
| LS Columns | Miltenyi, Germany | 130-042-401 | |
| Sterile filtration cup for vacuum filtration, 0.2 μm pore size | does not have to be specific, for example VWR, Switzerland | 10040-446 | |
| Sterile Lab Bottle compatible with Filtration cup (min. 100 mL) | does not have to be specific | ||
| Sterile pipettes | do not have to be specific | ||
| Chemicals | |||
| Bovine serum albumine (BSA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | A7030-100g | |
| CD14+ MicroBeads human - magnetic beads | Miltenyi, Germany | 130-097-052 | |
| Deattachnig agent Trypsin-EDTA, 0.05%, phenol red | Gibco, Switzerland | 25300054 | |
| Density gradient medium Lymphoprep | Alere Technologies AS, Norway | 1114547 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich, Switzerland | D2438 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | E6758-100g | |
| Fetal bovine serum (heat inactivated) | Gibco, Switzerland | 10270-106 | |
| Human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-093-864 | |
| Human Interleukin 4 (IL-4), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-095-373 | |
| Human macrophage colony-stimulating factor (M-CSF), premium grade | Miltenyi, Germany | 130-096-485 | |
| L-glutamine | Gibco, Switzerland | 25030-024 | |
| Lipopolysaccharid (LPS) from Escherichia coli | Sigma-Aldrich, Switzerland | 4524-5mg | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Switzerland | 158127 | |
| Penicilin-Streptomycin | Gibco, Switzerland | 15140-122 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Gibco, Switzerland | 10010-015 | |
| Roswell Park Memorial Institute-1640 Medium (RPMI) | Gibco, Switzerland | 42401-018 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, Switzerland | T8787 | |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma Aldrich, Switzerland | ||
| Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) | Immunotools | 11343015 | |
| Assays used for cytotoxicity, (pro-)inflammatory response | |||
| Cytotoxicity Detection Kit (LDH) | Roche, Switzerland | 11644793001 | |
| Human IL-6 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY206 | |
| Human IL-8/CXCL8 DuoSet ELISA | R&D, Biotechne, Switzerland | DY208 | |
| Immunostaining | |||
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), concentration 2 μg/mL | Sigma-Aldrich, Switzerland | 10236276001 | |
| Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugated, concentration 20 μg/mL | Abcam, UK | ab150115 | |
| Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L) Dylight 488 conjugated, concentration 10 μg/mL | Agrisera, Sweden | AS09 633 | |
| Mature Macrophage Marker Monoclonal Antibody, concentration 50 μg/mL | eBioScience, Thermo Fischer, Switzerland | 14-0115-82 | |
| Phalloidin rhodamine, concentration 0.264 µM | Molecular Probes, Life Technologies, Switzerland | R415 | |
| Recombinant Anti-CD83 antibody, 1:50 dillution | Abcam, UK | ab244204 |
References
- Rothen-Rutishauser, B., Blank, F., Mühlfeld, C., Gehr, P. In vitro models of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of particulate matter. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (8), 1075-1089 (2008).
- Giard, D., et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. Journal of National Cancer Institute. 51 (5), 1417-1423 (1973).
- Ochs, M., Weibel, E. R., et al. Ch. 2: Functional Design of the Human Lung for Gas Exchange . Fishman's Pulmonary Diseases and Disorders, 5e. Grippi, M. A., et al. , McGraw-Hill Education. (2008).
- Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 Cell Line as a Type II Pulmonary Epithelial Cell Model for Drug Metabolism. Experimental Cell Research. 243 (2), 359-366 (1998).
- Guo, X. Y., Lu, M., Chen, X. Q., He, F. D., Li, A. Correlation study of biological characteristics of non-small cell lung cancer A549 cells after transfecting plasmid by microbubble ultrasound contrast agent. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 9 (6), 582-586 (2016).
- Cooper, J. R., et al. Long Term Culture of the A549 Cancer Cell Line Promotes Multilamellar Body Formation and Differentiation towards an Alveolar Type II Pneumocyte Phenotype. PLoS ONE. 11 (10), 0164438 (2016).
- Bisig, C., Voss, C., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B. The crux of positive controls - Proinflammatory responses in lung cell models. Toxicology In Vitro. 54, 189-193 (2019).
- Rothen-Rutishauser, B., et al. A newly developed in vitro model of the human epithelial airway barrier to study the toxic potential of nanoparticles. ALTEX. 25, (2008).
- Braakhuis, H. M., et al. Progress and future of in vitro models to study translocation of nanoparticles. Archives of Toxicology. 89 (9), 1469-1495 (2015).
- Thai, P., Chen, Y., Dolganov, G., Wu, R. Differential regulation of MUC5AC/Muc5ac and hCLCA-1/mGob-5 expression in airway epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 33 (6), 523-530 (2005).
- Wu, J., et al. Characterization of air-liquid interface culture of A549 alveolar epithelial cells. Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 51 (2), 6950 (2017).
- Shapiro, D. I., Nardone, L. L., Rooney, S. A., Motoyama, E. K., Munoz, J. L. Phospholipid biosynthesis and secretion by a cell line (A549) which resembles type II aleveolar epithelial cells. Biochimica and Biophysica Acta. 530 (2), 197-207 (1978).
- Balis, J., Bumgarner, S. D., Paciga, J. E., Paterson, J. F., Shelley, S. A. Synthesis of lung surfactant-associated glycoproteins by A549 cells: description of an in vitro model for human type II cell dysfunction. Experimental Lung Research. 6 (3-4), 197-213 (1984).
- Schurch, S., Gehr, P., Im Hof, V., Geiser, M., Green, F. Surfactant displaces particles toward the epithelium in airways and alveoli. Respiration Physiology. 80 (1), 17-32 (1990).
- Gehr, P., Schurch, S., Berthiaume, Y., Hof, V. I., Geiser, M. Particle Retention in Airways by Surfactant. Journal of Aerosol Medicine. 3 (1), 27-43 (2009).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B., Gehr, P. Dendritic Cells and Macrophages Form a Transepithelial Network against Foreign Particulate Antigens. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 36 (6), (2007).
- Rothen-Rutishauser, B. M., Kiama, S. G., Gehr, P. A three-dimensional cellular model of the human respiratory tract to study the interaction with particles. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 32, (2005).
- Blank, F., Rothen-Rutishauser, B. M., Schurch, S., Gehr, P. An optimized in vitro model of the respiratory tract wall to study particle cell interactions. Journal of Aerosol Medicine. 19, (2006).
- Jardine, L., et al. Lipopolysaccharide inhalation recruits monocytes and dendritic cell subsets to the alveolar airspace. Nature Communications. 10 (1), 1999 (2019).
- Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nature Immunology. 16 (1), 36-44 (2015).
- Chortarea, S., et al. Repeated exposure to carbon nanotube-based aerosols does not affect the functional properties of a 3D human epithelial airway model. Nanotoxicology. 9 (8), 983-993 (2015).
- Hilton, G., Barosova, H., Petri-Fink, A., Rothen-Rutishauser, B., Bereman, M. Leveraging proteomics to compare submerged versus air-liquid interface carbon nanotube exposure to a 3D lung cell model. Toxicology In Vitro. 54, 58-66 (2019).
- Brandenberger, C., et al. Effects and uptake of gold nanoparticles deposited at the air-liquid interface of a human epithelial airway model. Toxicology and Applied Pharmacology. 242, (2010).
- Drasler, B., et al. Single exposure to aerosolized graphene oxide and graphene nanoplatelets did not initiate an acute biological response in a 3D human lung model. Carbon. 137, 125-135 (2018).
- Durantie, E., et al. Carbon nanodots: Opportunities and limitations to study their biodistribution at the human lung epithelial tissue barrier. Biointerphases. 13, (2018).
- Brandenberger, C., et al. Quantitative evaluation of cellular uptake and trafficking of plain and polyethylene glycol-coated gold nanoparticles. Small. 6 (15), 1669-1678 (2010).
- Tomašek, I., et al. Combined exposure of diesel exhaust particles and respirable Soufrière Hills volcanic ash causes a (pro-)inflammatory response in an in vitro multicellular epithelial tissue barrier model. Particle and Fibre Toxicology. 13 (1), 67 (2016).
- Nazarpour, R., et al. Optimization of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) Cryopreservation. International Journal of Molecular and Cellular Medicine. 1 (2), 88-93 (2012).
- Endes, C., et al. An in vitro testing strategy towards mimicking the inhalation of high aspect ratio nanoparticles. Particle and Fibre Toxicology. 11 (1), (2014).
- Ju, X., et al. The Analysis of CD83 Expression on Human Immune Cells Identifies a Unique CD83+-Activated T Cell Population. Journal of Immunology. 197 (12), 4613-4625 (2016).
- Lenz, A. G., et al. Inflammatory and Oxidative Stress Responses of an Alveolar Epithelial Cell Line to Airborne Zinc Oxide Nanoparticles at the Air-Liquid Interface: A Comparison with Conventional, Submerged Cell-Culture Conditions. BioMed Research International. , 12 (2013).
- Germann, A., Schulz, J. C., Kemp-Kamke, B., Zimmermann, H., von Briesen, H. Standardized serum-free cryomedia maintain peripheral blood mononuclear cell viability, recovery, and antigen-specific T-cell response compared to fetal calf serum-based medium. Biopreservation and Biobanking. 9 (3), 229-236 (2011).
- Weinberg, A., et al. Optimization and Limitations of Use of Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cells for Functional and Phenotypic T-Cell Characterization. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (8), 1176 (2009).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. Freshney, R. I. , Wiley-Liss Inc. 321-334 (2005).
- Lehmann, A. B. C., Blank, F., Gehr, P., Rothen-Rutishauser, B. Alternatives to animal testing. Yarmush, M. L., Langer, R. S. , Artech House. 239-260 (2010).
- Steiner, S., et al. Reduction in (pro-)inflammatory responses of lung cells exposed in to diesel exhaust treated with a non-catalyzed diesel particle filter. Atmospheric Environment. 81, 117-124 (2013).
- Martinez, F. O., Gordon, S., Locati, M., Mantovani, A. Transcriptional Profiling of the Human Monocyte-to-Macrophage Differentiation and Polarization: New Molecules and Patterns of Gene Expression. The Journal of Immunology. 177 (10), 7303 (2006).
- Chortarea, S., et al. Profibrotic activity of multi-walled carbon nanotubes upon prolonged exposures in different human lung cell types. Applied In Vitro Toxicology. 5 (1), (2019).
- Holt, P. G. Pulmonary Dendritic Cells in Local Immunity to Inert and Pathogenic Antigens in the Respiratory Tract. Proceedings of the American Thoracic Society. 2 (2), 116-120 (2005).
- Pinkerton, K. E., Gehr, P., Castañeda, A., Crapo, J. D. Comparative Biology of the Normal Lung (Second Edition). Parent, R. A. , Academic Press. 105-117 (2015).
- Crapo, J., Barry, B., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
- Maniecki, M. B., Møller, H. J., Moestrup, S. K., Møller, B. K. CD163 positive subsets of blood dendritic cells: The scavenging macrophage receptors CD163 and CD91 are coexpressed on human dendritic cells and monocytes. Immunobiology. 211 (6), 407-417 (2006).
- Chignard, M., Balloy, V. Neutrophil recruitment and increased permeability during acute lung injury induced by lipopolysaccharide. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 279 (6), 1083-1090 (2000).
- Coyne, C. B., et al. Regulation of Airway Tight Junctions by Proinflammatory Cytokines. Molecular Biology of the Cell. 13 (9), 3218-3234 (2002).
- Durantie, E., et al. Biodistribution of single and aggregated gold nanoparticles exposed to the human lung epithelial tissue barrier at the air-liquid interface. Particle and Fibre Toxicology. 14 (49), (2017).
