Summary
यहां प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल है जो एक एगर उठे पैड और सेल-इमेजिंग व्यंजनों के संयोजन में समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके शिकारी जीवाणु Bdellovibrio बैक्टीरियोवोरस के पूर्ण जीवन चक्र की निगरानी का वर्णन करता है।
Abstract
Bdellovibrio जीवाणु एक छोटा ग्राम नकारात्मक, अनिवार्य शिकारी जीवाणु है कि हानिकारक रोगजनकों सहित अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया को मारता है। इसलिए इसे लिविंग एंटीबायोटिक माना जाता है। बी बैक्टीरियोवरस को जीवित एंटीबायोटिक के रूप में लागू करने के लिए, सबसे पहले इसके जटिल जीवन चक्र के प्रमुख चरणों को समझना आवश्यक है, विशेष रूप से शिकार के अंदर इसका प्रसार। अब तक, वास्तविक समय में शिकारी जीवन चक्र के लगातार चरणों की निगरानी करना चुनौतीपूर्ण रहा है । यहां प्रस्तुत बी बैक्टीरियोवरसके पूर्ण जीवन चक्र के वास्तविक समय इमेजिंग के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है, विशेष रूप से मेजबान के अंदर इसके विकास के दौरान। इस उद्देश्य के लिए, एक एगरेग्मेंट पैड से मिलकर एक प्रणाली का उपयोग सेल-इमेजिंग व्यंजनों के संयोजन में किया जाता है, जिसमें शिकारी कोशिकाएं एगर उठे पैड के नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकती हैं जबकि स्थिर शिकार कोशिकाएं bdelloplasts बनाने में सक्षम हैं। डीएनए पॉलीमरेज III के फ्लोरोसेंटी टैग किए गए एक तनाव का अनुप्रयोग बी बैक्टीरियोवोरस जीवन चक्र के प्रजनन चरण के दौरान गुणसूत्र प्रतिकृति की निगरानी करने की अनुमति देता है।
Introduction
Bdellovibrio जीवाणु एक छोटा है (0.3-0.5 माइक्रोन द्वारा 0.5-1.4 माइक्रोन) ग्राम-नकारात्मक जीवाणु जो अन्य ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया पर शिकार करता है, जिसमें हानिकारक रोगजनकों जैसे क्लेबसिला निमोनिया, स्यूडोमोनास एरुगिनोसा और शिगेला फ्लेक्सनेरी1,2,,3शामिल हैं।, चूंकि बी बैक्टीरियोवरस रोगजनकों को मारता है, इसलिए इसे एक संभावित जीवित एंटीबायोटिक माना जाता है जिसे बैक्टीरियल संक्रमणों का मुकाबला करने के लिए लागू किया जा सकता है, विशेष रूप से मल्टीड्रग प्रतिरोधी उपभेदों के कारण।
B. बैक्टीरियोवरस दो चरणों से मिलकर एक अजीब जीवन चक्र प्रदर्शित करता है: एक मुक्त रहने वाले गैर-प्रतिकृति हमले का चरण और एक इंट्रासेलुलर प्रजनन चरण(चित्रा 1)। मुक्त रहने वाले चरण में, यह अत्यधिक मोती जीवाणु, जो 160 माइक्रोन/एस तक की गति से चलता है, अपने शिकार की खोज करता है। शिकार की बाहरी झिल्ली से जुड़ने के बाद, यह पेरिप्लाज्म4,,5में प्रवेश करता है। इंटरपरिपिप्लाज्मिक प्रजनन चरण के दौरान, बी बैक्टीरियोवोरस मेजबान के मैक्रोमॉलिक्यूल्स को नीचा दिखाने और अपने स्वयं के विकास के लिए उनका पुन: उपयोग करने के लिए हाइड्रोलिटिक एंजाइमों की अधिकता का उपयोग करता है। पेरिप्लाज्म पर हमला करने के तुरंत बाद, मेजबान कोशिका मर जाती है और एक गोलाकार संरचना में फूल जाती है जिसे एक ब्लाडेलोप्लास्ट कहा जाता है, जिसके अंदर शिकारी कोशिका अपने गुणसूत्रों को बढ़ाती है और प्रतिकृति बनाती है। प्रतिकृति प्रक्रिया प्रतिकृति मूल(ORIC)6 से शुरू होती है और तब तक आय होती है जब तक गुणसूत्र की कई प्रतियां पूरीतरहसे संश्लेषित नहीं हो जातीं . दिलचस्प बात यह है कि प्रत्येक गुणसूत्र की प्रतिकृति कोशिका विभाजन के बाद नहीं होती है। इसके बजाय, शिकारी एक लंबी, बहुनीय और फिलामेंटस सेल बनाने के लिए आगे बढ़ जाता है। पोषक तत्वों की कमी पर, फिलामेंट सिंक्रोनस सेप्टेशन से गुजरता है और संतान कोशिकाओं को 5डेलोप्लास्ट 8 से जारी कियाजाताहै।
इससे पहले कि बी बैक्टीरियोवरस बैक्टीरिया संक्रमण के खिलाफ एक जीवित एंटीबायोटिक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, यह अपने जीवन चक्र के प्रमुख चरणों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से शिकार के अंदर इसके प्रसार से संबंधित उन । जटिल जीवन चक्र के दौरान शिकारी और उसके शिकार के विभिन्न रूपात्मक रूपों के कारण बी बैक्टीरियोवरस की लाइव-सेल इमेजिंग चुनौतीपूर्ण रही है। अब तक, बी बैक्टीरियोवोरस और इसके मेजबान सेल के बीच बातचीत मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और स्नैप-शॉट,विश्लेषण2,,9,10द्वारा अध्ययन की गई है, जिनमें से दोनों की सीमाएं हैं, खासकर जब उनका उपयोग शिकारी जीवन चक्र के क्रमिक चरणों की निगरानी के लिए किया जाता है। ये विधियां बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करती हैं और हमले या विकास चरण के दौरान एक छोटे शिकारी के अवलोकन को सक्षम करती हैं। हालांकि, वे दोनों जीवन चक्र चरणों में एकल बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं की ट्रैकिंग की अनुमति नहीं देते हैं।
यहां प्रस्तुत बी बैक्टीरियोवोरसके पूर्ण जीवन चक्र की निगरानी के लिए समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (टीएमएफएम) का उपयोग करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है। एक प्रणाली जिसमें एक एग्राजिंग पैड होता है, जिसका उपयोग सेल-इमेजिंग डिश के संयोजन में किया जाता है, जिसमें शिकारी कोशिकाएं एगर उठे पैड के नीचे स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित हो सकती हैं जबकि स्थिर शिकार कोशिकाएं bdelloplasts(चित्रा 2)बनाने में सक्षम हैं। यह सेट-अप ई कोलाई और बी बैक्टीरियोवरसदोनों के विशिष्ट उपभेदों के आधार पर तैयार किया जाता है, लेकिन प्रोटोकॉल को उपयोगकर्ता के व्यक्तिगत उपभेदों (उदाहरण के लिए, विभिन्न चयन मार्कर, विभिन्न फ्लोरोफोरस आदि के साथ जुड़े प्रोटीन) को फिट करने के लिए आसानी से बदला जा सकता है।
इस मामले में, हमले के चरण के दौरान बी बैक्टीरियोवरस की कल्पना करने के लिए, एक विशिष्ट तनाव (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) का निर्माण किया गया था जो साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन, पिल्ज़ (अनुरोध पर हमारी प्रयोगशाला में उपलब्ध)7के फ्लोरोसेंटली टैग किए गए संस्करण को व्यक्त करता है। यह तनाव अतिरिक्त रूप से डीएनएन (ए-स्लाइडिंग क्लैंप), डीएनए पॉलीमरेज III होलोएंजाइम का एक उपइकान, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ जुड़ा हुआ है। यह चल रहे डीएनए प्रतिकृति को शिकारी कोशिकाओं के अंदर निगरानी करने में सक्षम बनाता है क्योंकि वे bdelloplasts के भीतर बढ़ते हैं ।
यद्यपि छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्णित प्रोटोकॉल और सॉफ्टवेयर एक विशिष्ट निर्माता (सामग्री की तालिकादेखें) द्वारा प्रदान किए गए उल्टे माइक्रोस्कोप को संदर्भित करते हैं, इस तकनीक को पर्यावरण कक्ष या अन्य बाहरी हीटिंग धारक से लैस किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के लिए समायोजित किया जा सकता है और समय-चूक इमेजिंग में सक्षम हो सकता है। डेटा विश्लेषण के लिए, उपयोगकर्ता व्यक्तिगत आउटपुट प्रारूपों के साथ संगत किसी भी उपलब्ध सॉफ्टवेयर का चयन कर सकते हैं।
चित्रा 1: बी बैक्टीरियोवरस जीवन चक्र ई. कोलाई में एक मेजबान सेल के रूप में । हमले के चरण के दौरान, एक मुक्त तैराकी बी बैक्टीरियोवरस सेल के लिए खोज करता है और एक मेजबान ई. कोलाई सेल को देता है । आक्रमण के बाद, शिकारी कोशिका शिकार के पेरिप्लाज्म में स्थानीयकृत हो जाती है, मेजबान सेल के आकार को बदल देती है और एक 5डेलोप्लास्ट बनाती है। प्रजनन चरण bdelloplast गठन के साथ शुरू होता है। शिकारी कोशिका शिकार कोशिका को पचाती है और अपनी संरचनाओं का निर्माण करने के लिए सरल यौगिकों का पुन: उपयोग करती है। बी बैक्टीरियोवरस मेजबान के पेरिप्लाज्म के अंदर एक लंबे एकल फिलामेंट के रूप में बढ़ता है । जब शिकार सेल के संसाधन समाप्त हो जाते हैं, तो बी बैक्टीरियोवरस फिलामेंट समकालिक रूप से सेप्ट करता है और संतान कोशिकाओं का निर्माण करता है। संतान कोशिकाओं के बाद उनके फ्लैगेला विकसित होते हैं, वे ब्लाडेलोप्लास्ट को lyse करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Protocol
1. सूक्ष्म विश्लेषण के लिए बी बैक्टीरियोवोरस की तैयारी
- एक 250 मिलीलीटर फ्लास्क में, ताजा 24 एच बी बैक्टीरियोवरस संस्कृति (जैसे, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) और रात भर शिकार संस्कृति के 3 एमएल (जैसे, ई. कोलाई S17-1 pZMR100) सीए-HEPES बफर (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [पीएच = 7.6]) के 50 एमएल के साथ जरूरत पड़ने पर एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक (यहां, 50 μg/mL kanamycin)।
- 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 30 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सहसंस्कृति इनक्यूबेट।
- जांच करें कि शिकार कोशिकाओं को पूरी तरह से तरल घुड़सवार चरण-विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा lysed हैं। इस बिंदु पर, कई मोटिवल अटैक चरण बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाएं मौजूद होनी चाहिए, और कोई ई कोलाई सेल या ब्लाडेलोप्लास्ट दिखाई नहीं देना चाहिए।
- किसी भी शेष मेजबान कोशिकाओं को हटाने के लिए 0.45 माइक्रोन पोर आकार फिल्टर के माध्यम से बी बैक्टीरियोवरस संस्कृति को फ़िल्टर करें। शिकारी कोशिकाएं (0.3-0.5 माइक्रोन x 0.5-1.4 माइक्रोन) स्वतंत्र रूप से 0.45 माइक्रोन छिद्रों में प्रवेश करती हैं, जबकि मेजबान कोशिकाओं को फिल्टर सतह पर बनाए रखा जाता है।
- शिकारी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए 2469 x ग्राम और 30 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल शंकु नली में फिल्ट्रेट को नीचे स्पिन करें। सीए-हेपेट्स बफर के 3 एमएल में बी बैक्टीरियोवरस पेलेट को फिर से खर्च करें (लगभग0.2 के अंतिम ओडी 600 तक) और 30 मिनट के लिए 30 डिग्री सेल्सियस और 200 आरपीएम पर इनक्यूबेट करें।
2. बी बैक्टीरियोवरस आक्रमण के लिए मेजबान कोशिकाओं की तैयारी
- मेजबान तनाव की एक कॉलोनी का उपयोग करें(ई. कोलाई S17-1 pZMR100 विभिन्न सेल आकारों के कारण सिफारिश की जाती है जिसके परिणामस्वरूप असमान आकार के bdelloplasts का गठन होता है) वाईटी माध्यम (0.8% बैक्टो ट्राइप्टोन) के 10 एमएल टीका लगाने के लिए, 0.5% खमीर निकालने, 0.5% NaCl [पीएच = 7.5]) है कि एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक किया गया है, अगर जरूरत है (यहां, 50 μg/ संस्कृति कोशिकाओं 37 डिग्री सेल्सियस और 180 आरपीएम पर रात भर।
- रात भर ई. कोलाई संस्कृति के 2 एमएल (~ 3.0 के ओडी600) को 2 एमएल टेस्ट ट्यूब और कमरे के तापमान (आरटी) पर सेंट्रलाइज और 5 मिनट के लिए 2469 x ग्राम स्थानांतरित करें। सीए-हेपेट्स बफर के 200 माइक्रोल में गोली को फिर से रीसुंड करें।
3. माइक्रोस्कोप का सेट-अप (सामग्री की तालिका देखें)
- उपयोग से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए 100x तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक सूक्ष्म कक्ष को 30 डिग्री सेल्सियस तक प्री-वार्म करें। प्रयोग के दौरान ध्यान बनाए रखने में त्रुटियों को रोकने के लिए यह कदम आवश्यक है।
- माइक्रोस्कोप और माइक्रोस्कोपी ऑटोमेशन दोनों को चालू करें। नियंत्रण सॉफ्टवेयर को आरंभ करें और ब्राइटफील्ड/डीआईसी/चरण-कंट्रास्ट और फ्लोरेसेंस छवियों को प्राप्त करने के लिए उपयुक्त फिल्टर का चयन करें, जैसा कि आवश्यक है (यहां: बीएफ छवियां, जीएफपी/मचेरी पॉलीक्रोमिक फिल्टर, और एमिशन/उत्तेजना mCherry और GFP के लिए) ।
4. समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए लेआउट की विधानसभा
- 200 मिलीग्राम कम फ्लोरोसेंट आणविक ग्रेड एगर उठे सीए-एचईपीईएस बफर (1% अंतिम एगरेग्रेट एकाग्रता) के साथ और एक माइक्रोवेव में एग्राज को भंग करें। बैच को जमने के बाद कई बार पुन: इस् तेम किया जा सकता है, इसलिए बस हीटिंग चरण को दोहराएं।
- पिघले हुए एग्रास के 3 एमएल को 35 एमएम ग्लास-बॉटम डिश(टेबल ऑफ मैटेरियल्स)में डालें। अगम को जमने दें।
- प्रयोगशाला माइक्रो-स्पैटुला का उपयोग करके, एगर उठे पैड के केंद्र ध्रुव को परेशान किए बिना 35 मिमी डिश से एगरेग्डेड पैड को सावधानी से हटा दें। पैड नीचे की ओर ऊपर का सामना करना पड़ फ्लिप और यह एक पेट्री डिश कवर(चित्रा 2)में जगह है ।
- फ़्लिप पैड के शीर्ष पर केंद्रित ई. कोलाई निलंबन के 5 माइक्रोन रखो और एक टीका पाश का उपयोग कर केंद्र ध्रुव में कोशिकाओं का प्रसार । ई. कोलाई-लेपित सतह पर केंद्रित बी बैक्टीरियोवरस निलंबन (~ 0.2 के ओडी600) के 5 माइक्रोन जोड़ें। कोशिकाओं को न फैलाएं।
- जल्दी से 35 मिमी ग्लास-बॉटम डिश (ऊपर की ओर नीचे का सामना करना पड़ रहा है) के लिए agarose जेल वापस, तो एक ढक्कन के साथ कवर। यदि आवश्यक हो, तो प्लेट के खिलाफ आगर को धीरे-धीरे दबाकर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
चित्रा 2: प्रायोगिक कार्यप्रवाह का योजनाबद्ध चित्रण। एग्रास पैड को 35 मिमी डिश से हटा दिया जाता है और फ़्लिप किया जाता है ताकि नीचे की ओर ऊपर की ओर सामना किया जा सके। शिकारी कोशिकाओं और शिकार कोशिकाओं की रातोंरात संस्कृति के ताजा निलंबन "नीचे" पक्ष कोट करने के लिए फ़्लिप पैड पर रखा जाता है । एगर उठे पैड को तब अपने मूल अभिविन्यास में फ़्लिप किया जाता है और 35 मिमी डिश में वापस रखा जाता है, जिसे माइक्रोस्कोप कक्ष में उल्टे माइक्रोस्कोप चरण पर रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
5. समय-चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का संचालन
- पेट्री डिश होल्डर में 35 एमएम की डिश इस तरह रखें कि प्रयोग के दौरान यह आगे न बढ़ जाए। विसर्जन तेल (1.518 अपवर्तक सूचकांक) की एक बूंद उद्देश्य के साथ-साथ 35 मिमी पकवान के नीचे रखें।
- धारक को माइक्रोस्कोप कक्ष में उल्टे माइक्रोस्कोप के चरण पर माउंट करें।
- समय के साथ कई चरण पदों पर कई छवियों को इकट्ठा करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर में विकल्प स्थापित करें।
- आवर्धन (100x) और पॉलीक्रोमिक लेंस (GFP/mCherry) सेट करें । एक आंख टुकड़ा और ब्राइटफील्ड (BF) का उपयोग करना, फोकल प्लेन ढूंढें और पॉइंट लिस्ट मैनेजर खोलें।
- स्टेज को आगे बढ़ाते हुए और मार्क पॉइंट बटन पर क्लिक करके माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में प्रत्येक स्थिति के लिए निर्देशांक को संग्रहीत करके ब्याज की कम से कम 10 पदों का चयन करें। फोटोब्लैचिंग और फोटोटॉक्सीसिटी को रोकने के लिए एक-दूसरे के करीब स्थित पदों से बचें। कैमरा वाल्व को आईपीस से मॉनिटर में बदल दें और फोकल प्लेन सेट करके और पॉइंट लिस्ट मैनेजर में रिप्लेस पॉइंट बटन पर क्लिक करके हर पॉइंट को कैलिब्रेट करें ।
- प्रयोग डिजाइनर खोलें और प्रत्येक टैब में सभी प्रयोगात्मक मापदंडों को इस प्रकार सेट करें:
- जेड-स्टैकिंग बॉक्स को अनमार्क करें।
- फ्लोरोसेंट चैनल चुनें और इष्टतम रोशनी सेटिंग्स सेट करें। यहां, निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया गया था: रीचेरी चैनल, रीचेरी फिल्टर सेट (EX575/25; EM625/45), 50% तीव्रता, और 200 एमएस एक्सपोजर समय; जीएफपी चैनल के लिए, जीएफपी फ़िल्टर सेट (EX475/28; EM525/48), 50% तीव्रता, और 80 एमएस; और BF छवियों, पीओएल चैनल, 5% तीव्रता, और 50 एमएस के लिए।
- छवियों को प्राप्त करने और प्रयोग के कुल समय के बीच अंतराल का चयन करें। यहां प्रयोग की 10 घंटे की अवधि में 5 मिनट के अंतराल का प्रदर्शन किया गया ।
- चुने गए पदों के लिए फोकस रखरखाव सक्षम करें (यहां उपयोग की जाने वाली प्रणाली के लिए, अल्टीमेटफोकस चेक बॉक्स के साथ बनाए रखने के फोकस को चिह्नित करके)।
- डेटा फ़ोल्डर चुनें जिसमें इमेज फ़ाइलों को स्वचालित रूप से सेव किया जाना चाहिए।
- माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर कंट्रोल में सभी सेटिंग्स को रीच करें, फिर टाइम लैप्स एक्सपेरिमेंट शुरू करें।
- प्रयोग के पहले घंटे के बाद, जांच करें कि सभी चरण की स्थिति अभी भी ध्यान में है। यदि आवश्यक हो तो छवि अधिग्रहण के बीच समय अंतराल के दौरान ध्यान समायोजित करें।
- जब समय-चूक प्रयोग समाप्त हो जाता है, तो पेट्री डिश को हटा दें और बायोसेफ्टी प्रोटोकॉल के अनुसार एग्राजिंग पैड के साथ 35 मिमी डिश का उपयोग करें।
नोट: चरण 5.2 के बाद सभी उप-कदम डेल्टाविजन एलीट उपयोगकर्ताओं के लिए विशिष्ट हैं। अन्य प्रणालियों का उपयोग करने वाले शोधकर्ताओं को व्यक्तिगत प्रणालियों के अनुसार सेटिंग्स को समायोजित करने की आवश्यकता है।
6. फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके समय-चूक छवियों और फिल्मों की पीढ़ी का प्रसंस्करण
- फिजी सॉफ्टवेयर से भरे कंप्यूटर में प्रायोगिक डेटा स्थानांतरित करें। फिजी कार्यक्रम लॉन्च करें और फ़ाइल का उपयोग करके एक छवि खोलें। फिजी में छवि फ़ाइल को खींचकर और गिराकर खोलें या छोड़कर।
- बायो-फॉर्मेट इम्पोर्ट ऑप्शनमें स्टैक व्यू व्यू ऑप्शन में हाइपरस्टैक के साथ व्यू स्टैक चुनें, कलर ऑप्शन में कंपोजिट कलर मोड पर क्लिक करें और ऑटोस्केलको मार्क करें ।
- छवि के ढेर के माध्यम से स्क्रॉल करके, यह आकलन करें कि क्या कोशिकाएं और bdelloplasts प्रयोग के दौरान ध्यान में रहे। जांच करें कि क्या डीएनएन-mNeonGreen से हरे फ्लोरोसेंट स्पॉट विकास चरण के दौरान bdelloplasts के अंदर बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं के भीतर मौजूद हैं, और यह सुनिश्चित करें कि शिकारी जीवन चक्र के सभी चरणों की कल्पना की जा सकती है ।
- किसी विशेष बी बैक्टीरियोवरस सेल/बडेलोप्लास्ट का विश्लेषण करने के लिए, फिजी मेनू(आयत, अंडाकार, बहुभुज, या फ्रीहैंड)में चयन उपकरणों का उपयोग करके इसे चिह्नित करें। छवि का उपयोग कर चुने हुए क्षेत्र को डुप्लिकेट करें । डुप्लीकेट या Ctrl + शिफ्ट + डीका उपयोग करके ।
- प्रत्येक फ्लोरेसेंस चैनल के लिए चमक और विपरीत को समायोजित करें:
- एक ही चैनल चुनने के लिए, इमेज पर क्लिक करके चैनल टूल खोलें । रंग । चैनल टूल या सीटीआरएल + शिफ्ट + जेड, और रुचि के चैनल का चयन करें(चैनल 1:mCherry, चैनल 2:mNeonGreen, चैनल 3:ब्राइटफील्ड)।
- छवि में बी एंड सी मेनू खोलकर फ्लोरेसेंस चैनल में छवियों की चमक और विपरीत को समायोजित करें । समायोजित करें । ब्राइटनेस/कंट्रास्ट या सीटीआरएल + शिफ्ट + सीपर क्लिक करके ।
- विश्लेषण का उपयोग कर स्केल बार जोड़ें । उपकरण । स्केल बार। छवियों पर क्लिक करके छवियों के लिए समय स्टैम्पर जोड़ें । ढेर । टाइम स्टैम्परर।
- संशोधित छवियों को बचाने के लिए, फ़ाइल पर जाएं । वर्तमान फ्रेम की एक छवि को बचाने के लिए एक फिल्म, या पीएनजी का उत्पादन करने के लिए एक छवि अनुक्रम के रूप में बचाने के लिए झगड़ा चुनें और झगड़ा चुनें।
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Representative Results
वर्णित टीएलएफएम-आधारित प्रणाली बीबैक्टीरियोवरस की व्यक्तिगत कोशिकाओं को समय पर ट्रैक करने की अनुमति देतीहै (चित्रा 3, मूवी 1)और जटिल शिकारी जीवन चक्र के प्रत्येक चरण के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करती है। पिल्ज़-रीचेरी फ्यूजन पूरे शिकारी कोशिका को हमले के चरण के साथ-साथ विकास चरण(चित्रा 3)के प्रारंभिक चरण में लेबल करने में सक्षम बनाता है। हमले से प्रतिकृति चरण में संक्रमण की कल्पना न केवल मेजबान ब्लाडेलोप्लास्ट गठन द्वारा की गई थी, बल्कि रिपलिसोम (प्रतिकृति मशीनरी) की उपस्थिति से भी की गई थी, जिसे डीएनएन-एमनग्रीन फ्लोरोसेंट फोसी(चित्रा 3)द्वारा चिह्नित किया गया था।
जैसा कि पहले प्रदर्शित किया गया था, रिपलिसोम को हमलावर सेल पोल (पिली-पोल)7में इकट्ठा किया गया था, और प्रजनन चरण प्रगति के रूप में बढ़ते बी बैक्टीरियोवरस फिलामेंट के भीतर एक से अधिक प्रतिशोध देखा गया था(चित्र 3)। गुणसूत्र की कई प्रतियों के संश्लेषण के बाद, प्रतिकृति को समाप्त कर दिया गया था (डीएनएन-एमनेग्रीन फोसी के गायब होने के रूप में कल्पना की गई थी)। अंत में, मल्टीन्यूक्लियॉइड फिलामेंट सेप्टेशन हुआ, और संतान कोशिकाओं को ब्लाडेलोप्लास्ट(चित्रा 3)से जारी किया गया।
फिजी सॉफ्टवेयर का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण का वर्णन करने वाला प्रस्तुत प्रोटोकॉल अधिग्रहीत समय-चूक श्रृंखला(मूवी 1)से प्रकाशन के लिए एक फिल्म का उत्पादन करने के तरीके का एक कदम-दर-कदम स्पष्टीकरण प्रदान करता है।
चित्र 3: बी बैक्टीरियोवरस जीवन चक्र समय चूक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के बाद । (A)फ्री-लिविंग शिकारी(बी बैक्टीरियोवरस डीएनएन-एमनॉनग्रीन/पिल्ज़-मचेरी) और होस्ट(ई कोलाई)कोशिकाएं । (ख) ई. कोलाईके लिए बी बैक्टीरियोवोरस का लगाव । (ग)ब्लाडेलोप्लास्ट गठन। (D,E) फिलामेंटस ग्रोथ और क्रोमोसोम प्रतिकृति। (च)गुणसूत्र प्रतिकृति की समाप्ति। (जी)समकालिक फिलामेंट सेप्टेशन की शुरुआत । (ज)Bdelloplast लाइसिस और संतान कोशिकाओं की रिहाई । ऊपरी पैनल उज्ज्वल क्षेत्र छवियों को दिखाते हैं, निचले पैनल विलय वाले ब्राइटफील्ड और फ्लोरेसेंस चैनलों का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 1 μm, समय = hh: मिनट कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
फिल्म 1: एक मेजबान सेल के रूप में ई. कोलाई में बी बैक्टीरियोवरस जीवन चक्र की समय-चूक इमेजिंग । तनाव HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry में DnaN-mNeonGreen (हरे) के उपकोशिकीय स्थानीयकरण । लाल चैनल साइटोप्लाज्मिक पिल्ज़-रीचेरी के साथ शिकारी कोशिकाओं की लेबलिंग को इंगित करता है। ग्रे ब्राइटफील्ड को इंगित करता है। हर 5 मिनट में चित्र एकत्र किए गए. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें.
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Discussion
एक जीवित एंटीबायोटिक के रूप में बी बैक्टीरियोवरस का उपयोग करने में बढ़ी हुई रुचि के कारण, शिकारी जीवन चक्र, विशेष रूप से शिकारी-रोगजनक बातचीत को देखने के लिए नए उपकरणों की आवश्यकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग पूरे बी बैक्टीरियोवरस जीवन चक्र को ट्रैक करने के लिए किया जाता है, विशेष रूप से मेजबान के अंदर इसके विकास के दौरान, वास्तविक समय में। इसके अलावा, डीएनए पॉलीमरेज III होलोएंजाइम के फ्लोरोसेंटी टैग बीटा क्लैंप का उत्पादन करने वाले तनाव के अनुप्रयोग ने बी बैक्टीरियोवोरसके प्रजनन चरण में गुणसूत्र प्रतिकृति प्रगति की निगरानी सक्षम की।
इस विधि में एक महत्वपूर्ण कदम 35 मिमी पकवान में लेआउट की उचित तैयारी है। माइक्रोस्कोप के तहत बी बैक्टीरियोवरस के जीवन चक्र को देखने में एक चुनौती ऐसी स्थितियां स्थापित करना है जो शिकारी विकास (मेजबान कोशिकाओं के रूप में अन्य ग्राम-नकारात्मक जीवाणु कोशिकाओं को शामिल करते हैं) का समर्थन करती हैं और शिकारी कोशिका गतिशीलता प्रदान करती हैं। प्रभावी सूक्ष्म टिप्पणियों के महत्वपूर्ण पहलुओं में से एक एगरेजर पैड पर शिकार के एक समान वितरण की आवश्यकता है, जो कोशिकाओं को एक इनोक्यूलेशन लूप के साथ फैलाकर हासिल किया जाता है। मेजबान सेल घनत्व बहुत अधिक नहीं हो सकता है, और चुने हुए अवलोकन बिंदुओं में पर्याप्त संख्या में अलग मेजबान कोशिकाएं होनी चाहिए। इस बीच, Bdellovibrio कोशिकाओं को सक्रिय रूप से अपने शिकार के लिए खोज करने के लिए पर्याप्त गतिशील होना चाहिए । इस प्रकार, वे बाहर नहीं फैलाया जाना चाहिए या हवा सूख से पहले पैड पर वापस फ़्लिप किया है और पकवान में रखा है । कभी-कभी एगर उठे और कांच की सतह के बीच तरल पदार्थ की पतली परत में पर्याप्त गतिशीलता प्रदान करने के लिए शिकारी निलंबन की अधिक मात्रा की आवश्यकता होती है।
यहां एक μ-डिश का उपयोग किया जाता है; हालांकि, यह प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक नहीं है। किसी भी ग्लास-बॉटम डिश का इस्तेमाल किया जा सकता है । μ-डिश का एक लाभ इष्टतम ऊंचाई और agarose पथ की मात्रा है, जो शिकारी और मेजबान के सहसंस्कृति को सक्षम बनाता है agarose पैड के नीचे की ओर रखा जाएगा । प्रयोगों में ताजा बी बैक्टीरियोवरस कोशिकाओं का उपयोग करना भी महत्वपूर्ण है, क्योंकि कोशिकाएं लंबे समय तक भंडारण के दौरान अपनी गतिशीलता खो देती हैं। इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि, देखने के एकल क्षेत्र में, उपयोगकर्ता लगभग 100 शिकारी कोशिकाओं और 100 मेजबान कोशिकाओं की गिनती कर सकते हैं, लेकिन एमओआई का अनुमान 50%-60% लगाया जा सकता है।
Bdellovibrio सेल चक्र के बारे में वर्तमान ज्ञान काफी हद तक अध्ययन है कि ई. कोलाई या पी aeruginosa कार्यरत है पर आधारित है । यह प्रणाली बी बैक्टीरियोवरस की निगरानी की अनुमति देती है, जिसमें साल्मोनेला स्प्प, एस फ्लेक्सनेरी, प्रोटियस मिराबिलिस या के निमोनिया सहित विभिन्न जीवाणु रोगजनक शामिल हैं। इसके अलावा, यह मंच मल्टीड्रग प्रतिरोधी रोगजनकों से जुड़े प्रयोगों में उपयोगी हो सकता है। इस प्रकार, यह मानव और पशु चिकित्सा में एक जीवित एंटीबायोटिक के रूप में बी बैक्टीरियोवरस की जेनेटिक इंजीनियरिंग में सुधार की सुविधा में मदद कर सकता है, विशेष रूप से मल्टीड्रग प्रतिरोधी रोगजनकों का मुकाबला करने के लिए।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र अनुदान रचना 2018/29/B/NZ6/00539 से J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
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