Summary
ここで提示されるのは、アガロースパッドおよび細胞イメージングディッシュと組み合わせて、タイムラプス蛍光顕微鏡を使用した捕食細菌 Bdellovibrioバクテリオボルス の完全なライフサイクルのモニタリングを記述するプロトコルです。
Abstract
Bdellovibrio細菌は 、有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を殺す小さなグラム陰性、義務的な捕食細菌である。したがって、生きた抗生物質と考えられる。 B.バクテリオボルス を生きた抗生物質として適用するには、まず、その複雑なライフサイクルの主要な段階、特に獲物内での増殖を理解する必要があります。これまでのところ、捕食ライフサイクルの連続した段階をリアルタイムで監視することは困難でした。ここで提示されるB. バクテリオボルスの完全なライフサイクルのリアルタイムイメージングのための包括的なプロトコルは、特にホスト内での成長の間である。この目的のために、アガロースパッドからなるシステムは、捕食細胞がアガロースパッドの下を自由に移動し、固定化された獲物細胞がbdelloplastsを形成することができる細胞イメージング皿と組み合わせて使用される。DNAポリメラーゼIIIの蛍光タグ付きβサブユニットを産生する株の適用により 、B.バクテリオボルス のライフサイクルの再生段階で染色体複製を監視することがさらに可能になります。
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorusは、クレブシエラ・ニューモニエ、緑膿菌、シゲラ・フレックスネリ11,2,32,3などの有害な病原体を含む他のグラム陰性細菌を捕食する小さな(0.3-0.5 μm by 0.5-1.4 μm)グラム陰性細菌である。B.バクテリオボルスは病原体を殺すので、細菌感染症、特に多剤耐性株によって引き起こされる細菌感染と戦うために適用できる潜在的な生きている抗生物質と考えられている。
B. バクテリオボルスは、自由に生きている非複製的攻撃期と細胞内生殖期の2つの段階からなる独特のライフサイクルを示す(図1)。自由な生活段階では、最大160μm/sの速度で移動するこの高い運動性細菌は、獲物を探します。獲物の外膜に付着した後、それは、ペリプラズム44、5に入る。B.バクテリオボルスは、子宮間生殖段階で、多量の加水分解酵素を使用して宿主の高分子を分解し、それ自身の成長のために再利用する。ペリプラズムを侵略した直後、宿主細胞は死んで膨満感を放ち、その中に捕食細胞が伸び、染色体を複製する球形の構造である。複製処理は複製元(oriC)6から始まり、染色体のコピーが完全に合成されるまで続行します 7.興味深いことに、各染色体の複製は細胞分裂に続かない。代わりに、捕食者は、長い、多核及び糸状細胞を形成するために伸びる。栄養が枯渇すると、フィラメントは同期的な敗血症を受け、子孫細胞はbdelloplast8から放出される。
B.バクテリオボルスが細菌感染症に対する生きた抗生物質として使用される前に、そのライフサイクルの主要な段階、特に獲物内の増殖に関連するものを理解することが重要である。B.バクテリオボルスの生細胞イメージングは、複雑なライフサイクルの間に捕食者とその獲物の様々な形態学的形態のために困難であった。これまで、B.バクテリオボルスとその宿主細胞との相互作用は、主に電子顕微鏡法とスナップショット分析22、9、109,10によって研究されてきたが、これらは、特に捕食期の連続した段階を監視するために使用される場合、両方に限界がある。これらの方法は、B.バクテリオボルス細胞の高解像度画像を提供し、攻撃または成長段階で小さな捕食者の観察を可能にする。しかし、それらは両方のライフサイクル段階を通して単一のB.バクテリオボルス細胞の追跡を許可しません。
ここで提示されるのは、B. バクテリオボルスの完全なライフサイクルを監視するために、タイムラプス蛍光顕微鏡(TLFM)を使用するための包括的なプロトコルです。アガロースパッドからなるシステムは、細胞イメージング皿と組み合わせて使用され、捕食細胞がアガロースパッドの下を自由に移動し、固定化された獲物細胞がbdelloplastsを形成することができる(図2)。このセットアップは、 大腸菌 と B.バクテリオボルスの両方の特定の株に基づいて調製されますが、プロトコルはユーザーの個々の株に合わせて簡単に変更することができます(例えば、異なる選択マーカーを運ぶ、異なるフルオロフォアと融合したタンパク質など)。
この場合、攻撃段階中に B.バクテリオボルス を可視化するために、細胞質タンパク質の蛍光タグ付きバージョンであるPilZ(要求に応じて入手可能)を発現する特定の株(HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)を構築した。この株は、さらにDnaN(βスライディングクランプ)、DNAポリメラーゼIIIホロエンザイムのサブユニットを、蛍光タンパク質と融合して生成する。これにより、連続的なDNA複製を、bdelloplasts内で増殖する捕食細胞内で監視することができます。
画像取得に使用されるプロトコルおよびソフトウェアは、特定の製造業者が提供する反転顕微鏡を指しますが( 材料表を参照)、この技術は、環境室または他の外部加熱ホルダを備え、タイムラプスイメージングが可能な任意の反転顕微鏡に対して調整することができます。データ分析のために、ユーザーは個々の出力形式と互換性のある利用可能なソフトウェアを選択することができます。
図 1:B.バクテリオボルス のライフサイクルを宿主細胞として 大腸菌 で行う。攻撃段階では、自由に泳ぐ B.バクテリオボルス 細胞が宿主 大腸菌 細胞を探し、付着する。侵入後、捕食細胞は獲物の周囲に局在し、宿主細胞の形状を変化させ、bdelloplastを形成する。生殖段階は、ブデロプラススト形成から始まる。捕食細胞は獲物細胞を消化し、単純な化合物を再利用して独自の構造を構築します。 B. バクテリオボルス は、宿主のペリプラズム内の長い単一のフィラメントとして成長する。獲物細胞の資源が枯渇すると 、B.バクテリオボルス フィラメントは同期的に敗血を起させ、前立腺細胞を形成する。子孫の細胞が彼らの旗エラを発達した後、彼らは腺芽細胞をライスする。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 微視的分析のための B.バクテリオボルス リセートの調製
- 250 mL フラスコに、新鮮な 24 時間 B. バクテリオボルス 培養液の 1 mL を組み合わせて共培養を設定します( HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry)および3mLの一晩の獲物培養物(例えば、 大腸菌 S17-1 pZMR100)と50 mLのCa-HEPESバッファー(25 mM HEPES、2 mM CaCl2[pH = 7.6])が必要な場合に抗生物質を補った(ここでは50μg/mcml)。
- 200rpmで振盪して30°Cで24時間培養する。
- 獲物細胞が液体取り付け位相対相顕微鏡によって完全に取り付けられていることを確認してください。この時点で、多数のモチル攻撃相 B.バクテリオボルス 細胞が存在し、 大腸菌 細胞またはbdelloplastが見えるべきではない。
- B.バクテリオボルス培養を0.45 μmの細孔サイズフィルタでフィルターし、残りの宿主細胞を除去します。捕食細胞(0.3~0.5 μm x 0.5~1.4 μm)は0.45μmの気孔を自由に貫通し、宿主細胞はフィルター表面に保持されます。
- 捕食細胞を収集するために、2469 x g で 20 分間、50 mL 円錐管で 30°C の濾液をスピンダウンします。 B.バクテリオボルス ペレットをCa-HEPESバッファーの3mL(約0.2の最終OD600 まで)に再懸濁し、30°Cおよび200rpmで30分間インキュベートします。
2. B.バクテリオボルスの侵入に対する宿主細胞の調製
- 宿主株の単一コロニーを使用してください(大腸菌 S17-1 pZMR100は、不等サイズのbdelloplastsの形成をもたらす様々な細胞サイズのために推奨される)YT培地(0.8%バクトトリプトン、0.8%バクトトリプトン、 0.5%酵母エキス、0.5%NaCl [pH = 7.5])は、必要に応じて抗生物質を補充した(ここでは、50 μg/mLカナマイシン)。培養細胞を一晩37°Cおよび180rpmで培養した。
- 一晩大腸菌培養物2mL(OD600~3.0)を室温(RT)で2mL試験管と遠心分離機に移し、5分間2469xgに移す。600 gペレットをCa-HEPESバッファーの200 μLに再懸濁します。
3. 顕微鏡のセットアップ(材料表参照)
- 使用前に少なくとも1時間のために30°Cに100x油浸漬目的を持つ顕微鏡室を予熱する。この手順は、実験中にフォーカスを維持する際のエラーを防ぐために必要です。
- 顕微鏡と顕微鏡のオートメーションの両方をオンにします。コントロールソフトウェアを初期化し、必要に応じて、明視野/DIC/位相コントラストおよび蛍光画像を取得するための適切なフィルタを選択します(ここでは、BF画像、GFP/mCherryポリクロミックフィルタ、およびmCherryおよびGFPの発光/励起)。
4. タイムラプス蛍光顕微鏡用レイアウトの組み立て
- 200mgの低蛍光分子グレードアガロースを20mLのCa-HEPESバッファー(1%最終アガロース濃度)と混合し、電子レンジでアガロースを溶解します。バッチは固化後に数回再利用できるため、加熱手順を繰り返すだけです。
- 35mmガラス底皿に溶かしたアガロースの3mLを注ぎます(材料表)。アガロースを固めさせる。
- 実験室用のマイクロスパチュラを使用して、アガロースパッドの中心極を邪魔することなく、35mm皿からアガロースパッドを慎重に取り外します。パッド底面を上に向けて裏返し、ペトリ皿カバーに入れます(図2)。
- 濃縮された 大腸菌 懸濁液を反転パッドの上に5μL入れ、接種ループを使用して中央極のセルを広げます。5 μLの濃縮 B.バクテリオボルス 懸濁液(OD600~0.2) を 大腸菌コーティング面に加えます。細胞を広げないでください。
- アガロースゲルを35mmガラス底皿(上側は下向き)に素早く戻し、蓋をします。必要に応じて、プレートに対して寒天を軽く押し下げて気泡を取り除きます。
図2:実験ワークフローの概略描写アガロースパッドは35mm皿から取り出し、下側が上向きになるように反転します。捕食細胞の新鮮な懸濁液および獲物細胞の一晩培養は、「底」側をコーティングするために反転パッドに置かれる。アガロースパッドは、その後、元の向きに反転し、顕微鏡室の逆顕微鏡ステージに取り付けられている35ミリメートル皿に戻します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
5. タイムラプス蛍光顕微鏡の伝導
- 35mm皿をペトリ皿ホルダーに入れ、実験の過程で動かないようにします。35 mm皿の底部と同様に、目的に浸漬油(1.518屈折率)の1滴を置きます。
- ホルダーを顕微鏡室の反転顕微鏡のステージに取り付けます。
- 顕微鏡制御ソフトウェアのオプションを設定して、時間の経過とともに複数の段階の位置で複数の画像を収集します。
- 倍率(100x)とポリクロミックレンズ(GFP/mCherry)を設定します。アイピースとブライトフィールド(BF)を使用して、焦点面を見つけてポイントリストマネージャを開きます。
- ステージを移動し、 マークポイント ボタンをクリックして顕微鏡ソフトウェアの各位置の座標を保存することにより、対象の少なくとも10の位置を選択します。光の漂白や光毒性を防ぐために、互いに近い位置を避けてください。カメラバルブを接眼レンズからモニターに回し、焦点面を設定し、ポイントリストマネージャの [ポイントを置換 ]ボタンをクリックして、各ポイントをキャリブレーションします。
- 実験デザイナーを開き、各タブのすべての実験パラメーターを次のように設定します。
- Z-スタッキングボックスのマークを解除します。
- 蛍光チャンネルを選択し、最適な照明設定を行います。ここでは、次の設定が使用されました: mCherryチャンネル、mCherryフィルタセット(EX575/25;EM625/45)、50%の強度、および200 msの暴露時間;GFP チャネルの場合、GFP フィルタ セット(EX475/28;EM525/48)、50%の強度、および80ミリ秒。BF 画像、POL チャンネル、5% の強度、および 50 ミリ秒の場合。
- 画像の取得間隔と実験の合計時間を選択します。ここでは、実験の10時間にわたって5分間隔で実施した。
- 選択したポジションに対してフォーカスのメンテナンスを有効にします (ここで使用するシステムでは、[フォーカスを UltimateFocus で維持 ] チェックボックスをオンにします)。
- イメージ ファイルを自動的に保存するデータ フォルダを選択します。
- 顕微鏡ソフトウェアコントロールのすべての設定を再確認し、タイムラプス実験を開始します。
- 実験の最初の1時間後、すべてのステージ位置がフォーカスを持っていることを確認します。必要に応じて、画像取得の間隔の間にフォーカスを調整します。
- タイムラプス実験が終了したら、ペトリ皿を取り除き、バイオセーフティプロトコルに従ってアガロースパッドで35mm皿を利用します。
注: ステップ 5.2 以降のすべてのサブステップは、デルタビジョンエリートユーザーに固有です。他のシステムを使用している研究者は、個々のシステムに応じて設定を調整する必要があります。
6. フィジーソフトウェアを使用したタイムラプス画像と映画の生成の処理
- フィジーのソフトウェアを搭載したコンピュータに実験データを転送します。フィジープログラムを起動し、 ファイル を使用して画像を開く | 画像 ファイルを開くか、単にフィジーにドラッグアンドドロップします。
- [ バイオフォーマットインポートオプション] で、スタック表示オプションで [ハイパースタックを含むスタックを表示 ] を選択し、カラーオプションの [コンポジット カラー モード をクリック] を選択して、[ 自動スケール] をマークします。
- 画像スタックをスクロールして、細胞とbdelloplastsが実験の過程で焦点を合わせ続けているかどうかを評価します。DnaN-mNeonGreenの緑色蛍光スポットがB. バクテロボラス 細胞内に存在するかどうかを確認し、捕食ライフサイクルのすべての段階を視覚化できることを確認します。
- 特定の B. バクテリオボルス セル/bdelloplast を分析するには、フィジーメニュー (長方形、 楕円、 多角形、 または フリーハンド) の選択ツールを使用してマークします。画像を使用して選択した領域を複製 する | 複製 するか 、Ctrl + Shift + Dを使用します。
- 各蛍光チャネルの明るさとコントラストを次のように調整します。
- 1 つのチャンネルを選択するにはChannel tools、[画像 |色 |チャンネルツールまたはCtrl + Shift + Z、および興味のあるチャンネルを選択します(チャンネル1:mCherry、チャンネル2:mNeonGreen、チャンネル3:ブライトフィールド)。
- 画像の B&C メニューを開いて蛍光チャンネルの画像の明るさとコントラストを調整 する |調整 |明るさ/コントラストを 押すか 、Ctrl + Shift + Cをクリックします。
- 分析を使用してスケール バーを追加 する |ツール |スケールバー。画像にタイムスタンパーを追加するには、[ 画像] をクリックします。スタック |時間スタンパー.
- 変更した画像を保存するには、[ ファイル|[名前を付けて保存] を選択し 、TIFF を選択してイメージ シーケンスとして保存し 、AVI を選択してムービーを生成するか、現在のフレームの単一イメージを保存する場合は PNG を選択します。
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Representative Results
記載されたTLFM系システムは、B.バクテリオボルスの個々の細胞を時間で追跡することを可能にし(図3、Movie 1)、複雑な捕食ライフサイクルの各段階に関する貴重な情報を提供する。PilZ-mCherry融合により、捕食細胞全体を攻撃段階および成長段階の初期段階で標識することができます(図3)。攻撃から複製段階への移行は、宿主のbdelloplast形成だけでなく、DnaN-mNeonGreen蛍光病巣によってマークされた応答体(複製機械)の出現によっても可視化された(図3)。
先に示したように、このレタンコは、侵入細胞極(ピリポール)7で組み立てられ、再生相が進行するにつれて成長するB.バクテリオボルスフィラメント内で複数の応答体が観察された(図3)。染色体のコピーを数部合成した後、複製を終了した(DnaN-mNeonGreen病巣の消失として可視化)。最後に、多核体フィラメントは、敗血症を受け、そして、前立腺細胞は、bdelloplastから放出された(図3)。
フィジーのソフトウェアを使用して画像処理を記述する提示されたプロトコルは、取得したタイムラプスシリーズ(Movie 1)から公開のための映画を制作する方法を段階的に説明します。
図3:B.バクテリオボルスのライフサイクルに続いて、蛍光顕微鏡のタイムラプスを行った。(A)自由生き生き捕食(B. バクテリオボルスDnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) および宿主 (大腸菌) 細胞(B) 大腸菌へのB.バクテリオボルスの付着。(C) ベデロプラススト形成.(D,E)糸状成長および染色体複製。(F)染色体複製の終了。(G) 同期フィラメントのセプメントの開始。(H) Bdelloplast リシスおよび子孫細胞の放出。上のパネルは明視野のイメージを示し、下のパネルは結合された明視野および蛍光チャネルを表す。スケールバー = 1 μm、時間 = hh:min.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
動画1:B. バクテリオボルス のライフサイクルを宿主細胞として用いた大 腸菌 のタイムラプスイメージング。 株HD100 DnaN-mNeonGreen/ピルツ-ムチェリーにおけるDNAN-mNeonGreen(緑色)の細胞内局在化。赤チャネルは細胞質PilZ-mCherryを用いたプレデター細胞の標識を示す。グレーは明るいフィールドを示します。画像は5分ごとに収集されました。 このビデオをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
生きた抗生物質として B.バクテリオボルス を使用することに対する関心の高まりにより、捕食性のライフサイクル、特に捕食者と病原体の相互作用を観察するための新しいツールが必要です。提示されたプロトコルは 、B.バクテリオボルス のライフサイクル全体を、特にホスト内での成長中にリアルタイムで追跡するために使用されます。さらに、DNAポリメラーゼIIIホロ酵素の蛍光タグ付きベータクランプを産生する株の適用により 、B.バクテリオボルスの再生段階を通じて染色体複製進行のモニタリングが可能になった。
この方法の重要なステップは、35 mm皿のレイアウトの適切な準備です。 B.バクテリオボルス のライフサイクルを顕微鏡で観察する際の課題は、捕食増殖を支える状態(宿主細胞として他のグラム陰性細菌細胞を含む)を確立し、捕食細胞運動性を提供することである。効果的な顕微鏡観察の重要な側面の1つは、細胞を接種ループで広めることによって達成されるアガロースパッド上の獲物の均一な分布の必要性である。ホストセル密度が高すぎないようにして、選択した観測点に十分な数の別々のホストセルを含める必要があります。一方 、Bdellovibrio 細胞は、積極的に獲物を検索するのに十分なモタイルでなければなりません。したがって、パッドが裏返して皿に入れられる前に、広げたり風乾したりしてはいけません。時には、アガロースとガラス表面の間の薄い流体層に十分な運動性を提供するために、より大きな量の捕食者懸濁液が必要である。
ここでは、μ-ディッシュを使用しています。ただし、これはプロトコルにとって必須ではありません。ガラス底の皿はどれでも使える。μ-Dishの利点はアガロースの経路の最適な高さと容積であり、捕食と宿主の共培養をアガロースパッドの底側に置くことを可能にする。また、長期保存中に細胞の運動性が失われるため、実験で新鮮な B.バクテリオボルス 細胞を使用することも重要です。このプロトコルの制限は、単一視野で、ユーザーはおよそ100個の捕食者細胞と100個の宿主細胞を数えることができるが、MOIは50%~60%と見積もることができる点である。
Bdellovibrio細胞周期に関する現在の知識は、大腸菌またはP.エルギノーサを採用した研究に主に基づいています。このシステムは、サルモネラ属、S.フレックスネリ、プロテウス・ミラビリス、またはK.肺炎を含む様々な細菌病原体を捕食するB.バクテリオボルスのモニタリングを可能にする。さらに、このプラットフォームは、多剤耐性病原体を含む実験に有用であり得る。したがって、ヒトおよび獣医学における生きた抗生物質としてのB.バクテリオボルスの遺伝子工学の改善を促進し、特に多剤耐性病原体と戦うのに役立つ可能性がある。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立科学センターの助成金Opusによってサポートされました 2018/29/B/NZ6/00539 J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
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