Summary
Apresentado aqui é um protocolo que descreve o monitoramento do ciclo de vida completo da bactéria predatória Bdellovibrio bacteriovorus usando microscopia de fluorescência de lapso de tempo em combinação com uma almofada de agarose e pratos de imagem celular.
Abstract
Bdellovibrio bacteriovorus é uma pequena bactéria predatória obrigatória que mata outras bactérias gram-negativas, incluindo patógenos nocivos. Portanto, é considerado um antibiótico vivo. Para aplicar B. bacteriovorus como um antibiótico vivo, é primeiro necessário entender os principais estágios de seu complexo ciclo de vida, particularmente sua proliferação dentro da presa. Até agora, tem sido desafiador monitorar sucessivas etapas do ciclo de vida predatório em tempo real. Apresentado aqui é um protocolo abrangente para imagens em tempo real do ciclo de vida completo de B. bacteriovorus, especialmentedurante seu crescimento dentro do hospedeiro. Para isso, um sistema composto por uma almofada de agarose é usado em combinação com pratos de imagem celular, no qual as células predatórias podem se mover livremente sob a almofada de agarose enquanto as células de presas imobilizadas são capazes de formar bdelloplastos. A aplicação de uma cepa que produz uma β-subunidade fluorescente de DNA polimerase III permite ainda que a replicação do cromossomo seja monitorada durante a fase de reprodução do ciclo de vida B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bacteriovorus é uma pequena (0,3-0,5 μm por 0,5-1,4 μm) gram-negativo bactéria que caça outras bactérias gram-negativas, incluindo patógenos nocivos como Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa e Shigella flexneri1,2,3. Uma vez que b. bacteriovorus mata patógenos, é considerado um antibiótico vivo potencial que pode ser aplicado para combater infecções bacterianas, particularmente aquelas causadas por cepas multidroga resistentes.
B. bacteriovorus exibe um ciclo de vida peculiar composto por duas fases: uma fase de ataque não replicativo de vida livre e uma fase reprodutiva intracelular(Figura 1). Na fase de vida livre, esta bactéria altamente motile, que se move a velocidades de até 160 μm/s, procura por sua presa. Depois de anexar à membrana externa da presa, ela entra no periplasma4,5. Durante a fase reprodutiva interperiplasmática, B. bacteriovorus usa uma infinidade de enzimas hidrolíticas para degradar as macromoléculas do hospedeiro e reutilizá-las para seu próprio crescimento. Logo após invadir o periplasma, a célula hospedeira morre e incha em uma estrutura esférica chamada bdelloplast, dentro da qual a célula predatória alonga e replica seus cromossomos. O processo de replicação começa na origem de replicação (oriC)6 e prossegue até que várias cópias do cromossomo tenham sido completamente sintetizadas7. Curiosamente, a replicação de cada cromossomo não é seguida pela divisão celular. Em vez disso, o predador se alonga para formar uma célula longa, multinucleóide e filamentosa. Após o esgotamento dos nutrientes, o filamento sofre septação síncrola e as células progêneras são liberadas do bdelloplast8.
Antes que b. bacteriovorus possa ser usado como um antibiótico vivo contra infecções bacterianas, é crucial entender os principais estágios de seu ciclo de vida, particularmente aqueles relacionados à sua proliferação dentro da presa. A imagem de células vivas de B. bacteriovorus tem sido desafiadora, devido às várias formas morfológicas do predador e sua presa durante o complexo ciclo de vida. Até agora, as interações entre B. bacteriovorus e sua célula hospedeira têm sido estudadas principalmente por microscopia eletrônica e análise de snap-shot2,,9,,10, ambas com limitações, especialmente quando são usadas para monitorar estágios sucessivos do ciclo de vida predatório. Esses métodos fornecem imagens de alta resolução de células B. bacteriovorus e permitem a observação de um pequeno predador durante a fase de ataque ou crescimento. No entanto, eles não permitem o rastreamento de células b. bacteriovorus únicas ao longo de ambas as fases do ciclo de vida.
Apresentado aqui é um protocolo abrangente para o uso de microscopia de fluorescência de lapso de tempo (TLFM) para monitorar o ciclo de vida completo de B. bacteriovorus. Um sistema composto por uma almofada de agarose é usado em combinação com um prato de imagem celular, no qual as células predatórias podem se mover livremente sob a almofada de agarose enquanto as células de presas imobilizadas são capazes de formar bdelloplastos(Figura 2). Esta configuração é preparada com base em cepas específicas de E. coli e B. bacteriovorus,mas o protocolo pode ser facilmente alterado para se adequar às cepas individuais de um usuário (por exemplo, carregando diferentes marcadores de seleção, proteínas fundidas com fluoroforos diferentes, etc.).
Neste caso, para visualizar B. bacteriovorus durante a fase de ataque, foi construída uma cepa específica (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) que expressa uma versão fluorescente marcada da proteína citoplasmática, PilZ (disponível em nosso laboratório mediante solicitação)7. Esta cepa também produz DNAN (o grampo β-deslizante), uma subunidade de holoenzima de dna polimerase III, fundida com uma proteína fluorescente. Isso permite que a replicação contínua do DNA seja monitorada dentro das células predatórias à medida que crescem dentro de bdelloplastos.
Embora o protocolo descrito e o software utilizado para aquisição de imagens se refira a um microscópio invertido fornecido por um fabricante específico (ver Tabela de Materiais), esta técnica pode ser ajustada para qualquer microscópio invertido equipado com uma câmara ambiental ou outro suporte de aquecimento externo e capaz de imagens de lapso de tempo. Para análise de dados, os usuários podem escolher qualquer software disponível compatível com os formatos de saída individuais.
Figura 1: B. bacteriovorus ciclo de vida em E. coli como uma célula hospedeira. Durante a fase de ataque, uma célula B. bacteriovorus de natação livre procura e se conecta a uma célula E. coli hospedeira. Após a invasão, a célula predatória fica localizada no periplasma da presa, mudando a forma da célula hospedeira e formando um bdelloplasto. A fase reprodutiva começa com a formação de bdelloplast. A célula predatória digere a célula da presa e reutiliza compostos simples para construir suas próprias estruturas. B. bacteriovorus cresce como um longo filamento único dentro do periplasma do hospedeiro. Quando os recursos da célula presa estão esgotados, o filamento B. bacteriovorus sincronicamente septate e forma células descendentes. Depois que as células progêneras desenvolvem sua flagela, elas lise o bdelloplasto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Protocol
1. Preparação de B. bacteriovorus lysate para análise microscópica
- Em um frasco de 250 mL, configure a cocultura combinando 1 mL de cultura bacteriovorus fresca de 24 h B. (por exemplo, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) e 3 mL de cultura de presas durante a noite (por exemplo, E. coli S17-1 pZMR100) com 50 mL de tampão Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) complementado com antibióticos quando necessário (aqui, 50 μg/mL kanamycin).
- Incubar a cocultura por 24 h a 30 °C com agitação a 200 rpm.
- Verifique se as células presas estão totalmente lisadas por microscopia de contraste de fase montada líquida. Neste ponto, numerosas células de ataque motile fase B. bacteriovorus devem estar presentes, e nenhuma célula E. coli ou bdelloplast deve ser visível.
- Filtre a cultura B. bacteriovorus através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 μm para remover quaisquer células hospedeiras restantes. As células predatórias (0,3-0,5 μm x 0,5-1,4 μm) penetram livremente 0,45 poros, enquanto as células hospedeiras são retidas na superfície do filtro.
- Gire o filtrado por 20 minutos a 2469 x g e 30°C em um tubo cônico de 50 mL para coletar células predatórias. Resuspend a pelota B. bacteriovorus em 3 mL de tampão Ca-HEPES (a um ODfinal 600 de aproximadamente 0,2) e incubar a 30 °C e 200 rpm por 30 min.
2. Preparação de células hospedeiras para invasão b. bacteriovorus
- Use uma única colônia da cepa hospedeira (E. coli S17-1 pZMR100 é recomendado devido a vários tamanhos celulares que resultam na formação de bdelloplastas de tamanho desigual) para inocular 10 mL de YT médio (0,8% Bacto tryptone, Extrato de levedura de 0,5%, 0,5% NaCl [pH = 7,5]) que foi suplementado com antibióticos, se necessário (aqui, 50 μg/mL kanamycin). Células culturais durante a noite a 37 °C e 180 rpm.
- Transfira 2 mL de cultura E. coli durante a noite (OD600 de ~3,0) para um tubo de ensaio de 2 mL e centrífuga à temperatura ambiente (RT) e 2469 x g por 5 min. Resuspend a pelota em 200 μL de tampão Ca-HEPES.
3. Configuração do microscópio (ver Tabela de Materiais)
- Pré-aqueça uma câmara microscópica com um objetivo de imersão de óleo de 100x a 30 °C por pelo menos 1 h antes de usar. Esta etapa é necessária para evitar erros na manutenção do foco durante o experimento.
- Ligue tanto o microscópio quanto a automação de microscopia. Inicialize o software de controle e selecione os filtros apropriados para adquirir imagens de contraste e fluorescência de campo brilhante/DIC/fase e fluorescência, conforme necessário (aqui: imagens BF, filtro policrommico GFP/mCherry e emissão/excitação para mCherry e GFP).
4. Montagem de layouts para microscopia de fluorescência de lapso de tempo
- Misture 200 mg de baixa agarose de grau molecular fluorescente com 20 mL de tampão Ca-HEPES (concentração final de 1% de agarose) e dissolva a agarose em um micro-ondas. O lote pode ser reutilizado várias vezes depois de solidificar, então simplesmente repita a etapa de aquecimento.
- Despeje 3 mL de agarose derretida em um prato de fundo de vidro de 35 mm(Tabela de Materiais). Permita que a agarose se solidifique.
- Utilizando uma micro-espátula de laboratório, remova cuidadosamente a almofada de agarose da antena de 35 mm sem perturbar o polo central da almofada de agarose. Vire o lado inferior da almofada voltado para cima e coloque-o em uma tampa de placa de Petri(Figura 2).
- Coloque 5 μL de suspensão E. coli concentrada em cima da almofada virada e abra as células no polo central usando um laço de inoculação. Adicione 5 μL de suspensão concentrada B. bacteriovorus (OD600 de ~0,2) na superfície revestida de E. coli. Não espalhe as células.
- Retorne rapidamente o gel de agarose para o prato de fundo de vidro de 35 mm (lado superior voltado para baixo), em seguida, cubra com uma tampa. Se necessário, remova as bolhas de ar pressionando suavemente o ágar contra a placa.
Figura 2: Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. A almofada de agarose é removida do prato de 35 mm e virada para que o lado inferior fique virado para cima. Novas suspensões de células predatórias e cultura noturna de células presas são colocadas na almofada virada para revestir o lado "inferior". A almofada de agarose é então virada para sua orientação original e colocada de volta no prato de 35 mm, que é montado no estágio de microscópio invertido na câmara de microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
5. Condução da microscopia de fluorescência de lapso de tempo
- Coloque a placa de 35 mm no suporte da placa de Petri de tal forma que não se mova durante o experimento. Coloque uma gota de óleo de imersão (1.518 índice refrativo) no objetivo, bem como na parte inferior do prato de 35 mm.
- Monte o suporte no palco do microscópio invertido na câmara do microscópio.
- Configure as opções no software de controle de microscópio para coletar várias imagens em várias posições de estágio ao longo do tempo.
- Defina a ampliação (100x) e a lente policrômica (GFP/mCherry). Usando uma peça de olho e brightfield (BF), encontre o plano focal e abra o gerente da lista de pontos.
- Selecione pelo menos 10 posições de interesse movendo o palco e armazenando as coordenadas para cada posição no software de microscópio clicando no botão ponto de marcação. Evite posições localizadas próximas umas das outras para evitar fotobleaching e fototoxicidade. Gire a válvula da câmera da ocular para o monitor e calibra cada ponto definindo o plano focal e clicando no botão Substituir ponto no gerenciador de pontos.
- Abra o designer de experimentos e defina todos os parâmetros experimentais em cada guia da seguinte forma:
- Sem marcar a caixa de empilhamento Z.
- Escolha canais fluorescentes e defina as configurações de iluminação ideais. Aqui, foram utilizadas as seguintes configurações: para o canal mCherry, conjuntos de filtros mCherry (EX575/25; EM625/45), intensidade de 50% e tempo de exposição de 200 ms; para o canal GFP, conjunto de filtroS GFP (EX475/28; EM525/48), 50% de intensidade e 80 ms; e para as imagens BF, canal POL, 5% de intensidade e 50 ms.
- Selecione intervalos entre a aquisição de imagens e o tempo total do experimento. Aqui, foram realizados intervalos de 5 minutos ao longo do período de 10h do experimento.
- Habilite a manutenção do foco para as posições escolhidas (para o sistema utilizado aqui, marcando o foco Manter com a caixa de seleção UltimateFocus).
- Selecione a pasta de dados na qual os arquivos de imagem devem ser salvos automaticamente.
- Verifique novamente todas as configurações no controle de software do microscópio e inicie o experimento de lapso de tempo.
- Após a primeira hora do experimento, verifique se todas as posições do palco ainda estão em foco. Ajuste o foco durante intervalos de tempo entre a aquisição de imagem, se necessário.
- Quando o experimento de lapso de tempo estiver concluído, remova a placa de Petri e utilize a placa de 35 mm com uma almofada de agarose de acordo com o protocolo de biossegurança.
NOTA: Todos os subpassos após a etapa 5.2 são específicos para usuários do DeltaVision Elite. Os pesquisadores que usam outros sistemas precisam ajustar as configurações de acordo com sistemas individuais.
6. Processamento de imagens de lapso de tempo e geração de filmes usando o software Fiji
- Transfira dados experimentais para um computador carregado com o software Fiji. Inicie o programa Fiji e abra uma imagem usando File | Abra ou simplesmente arrastando e soltando o arquivo de imagem em Fiji.
- Em Opções de importação de bioformitos,escolha exibir pilha com Hyperstack nas opções de visualização de pilhas, Clique no modo de cor Composto nas opções de cores e marque Autoescala.
- Ao percorrer as pilhas de imagens, avalie se as células e bdelloplastos permaneceram em foco ao longo do experimento. Verifique se as manchas fluorescentes verdes do DnaN-mNeonGreen estão presentes dentro de células B. bacteriovorus dentro de bdelloplastos durante toda a fase de crescimento, e certifique-se de que todas as etapas do ciclo de vida predatório possam ser visualizadas.
- Para analisar uma célula B. bacteriovorus/bdelloplast, marque-a usando as ferramentas de seleção no menu Fiji (Retângulo, Oval, Polígono ou Freehand). Duplicar a região escolhida usando imagem | Duplicar ou usando Ctrl + Shift + D.
- Ajuste o brilho e o contraste para cada canal de fluorescência da seguinte forma:
- Para escolher um único canal, abra as ferramentas do Canal clicando em Imagem | Cor | Ferramentas de canais ou Ctrl + Shift + Z, e selecione o canal de interesse (Canal 1: mCherry, Canal 2: mNeonGreen, Canal 3: brightfield).
- Ajuste o brilho e o contraste das imagens no canal de fluorescência abrindo o menu B&C na Imagem | Ajuste | Brilho/Contraste ou clicando em Ctrl + Shift + C.
- Adicionar barra de escala usando Analyze | Ferramentas | Barra de escala. Adicione o carimbo de tempo às imagens clicando em Imagens | Pilhas | Carimbo de tempo.
- Para salvar imagens modificadas, vá para File | Salve Como e escolha TIFF para salvar como uma sequência de imagem, AVI para produzir um filme ou PNG para salvar uma única imagem do quadro atual.
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Representative Results
O sistema baseado em TLFM descrito permite que células individuais de B. bacteriovorus sejam rastreadas a tempo (Figura 3, Filme 1) e fornece informações valiosas sobre cada estágio do complexo ciclo de vida predatório. A fusão PilZ-mCherry permite que toda a célula predatória seja rotulada na fase de ataque, bem como no estágio inicial da fase de crescimento(Figura 3). A transição do ataque para a fase replicativa foi visualizada não apenas pela formação de bdelloplastia hospedeira, mas também pelo aparecimento do replisome (máquina de replicação), que foi marcado por focos fluorescentes DnaN-mNeonGreen(Figura 3).
Como demonstrado anteriormente, o replisome foi montado no polo celular invasor (pili-pólo)7, e mais de um replisome foi observado dentro de um crescente filamento B. bacteriovorus à medida que a fase de reprodução progredia(Figura 3). Depois que várias cópias do cromossomo foram sintetizadas, a replicação foi encerrada (visualizada como o desaparecimento de focos DnaN-mNeonGreen). Finalmente, o filamento multinucleóide sofreu septação, e as células progêneras foram liberadas do bdelloplast(Figura 3).
O protocolo apresentado descrevendo o processamento de imagens usando o software Fiji fornece uma explicação passo a passo de como produzir um filme para publicação da série time-lapse adquirida(Filme 1).
Figura 3: B. bacteriovorus ciclo de vida seguido de microscopia de fluorescência de lapso de tempo. (A) Células predatórias de vida livre (B. bacteriovorus DNAN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) e células hospedeiras(E. coli). (B) Apego de B. bacteriovorus a E. coli. (C) Formação de bdelloplast. (D,E) Crescimento filamentoso e replicação do cromossomo. (F) Término da replicação do cromossomo. (G) Início da septação de filamento síncrono. (H) Lise de bdelloplast e liberação de células descendentes. Os painéis superiores mostram imagens de campo brilhante, os painéis inferiores representam canais de brilho e fluorescência fundidos. Barra de escala = 1 μm, tempo = hh:min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme 1: Imagem de lapso de tempo do ciclo de vida B. bacteriovorus em E. coli como uma célula hospedeira. Localização subcelular de DnaN-mNeonGreen (verde) na cepa HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. Canal vermelho indica rotulagem das células predadoras com PilZ-mCherry citoplasmica. Grey indica brightfield. As imagens foram coletadas a cada 5 minutos. Clique aqui para baixar este vídeo.
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Discussion
Devido ao crescente interesse em usar b. bacteriovorus como antibiótico vivo, novas ferramentas para observar o ciclo de vida predatório, particularmente interações predador-patógeno, são necessárias. O protocolo apresentado é usado para acompanhar todo o ciclo de vida B. bacteriovorus, especialmente durante seu crescimento dentro do hospedeiro, em tempo real. Além disso, a aplicação de uma cepa produzindo grampo beta fluorescente de holoenzima de DNA polimerase III permitiu o monitoramento da progressão da replicação do cromossomo durante toda a fase de reprodução de B. bacteriovorus.
Um passo crítico neste método é a preparação adequada dos layouts no prato de 35 mm. Um desafio na observação do ciclo de vida de B. bacteriovorus sob o microscópio é estabelecer condições que apoiem o crescimento predatório (envolvendo outras células bacterianas gram-negativas como células hospedeiras) e prover motilidade celular predatória. Um dos aspectos cruciais das observações microscópicas eficazes é a necessidade de uma distribuição uniforme de presas na almofada de agarose, que é alcançada pela disseminação das células com um laço inoculante. A densidade das células hospedeiras não pode ser muito alta, e os pontos de observação escolhidos devem conter um número suficiente de células hospedeiras separadas. Enquanto isso, as células Bdellovibrio devem ser motile o suficiente para procurar ativamente por suas presas. Assim, eles não devem ser espalhados ou secos ao ar antes que a almofada seja virada para trás e colocada no prato. Às vezes, maiores volumes de suspensão predadora são necessários para fornecer motilidade suficiente em uma fina camada de fluido entre a ágarose e a superfície de vidro.
Um μ-Dish é usado aqui; no entanto, isso não é essencial para o protocolo. Qualquer prato de fundo de vidro poderia ser usado. Uma vantagem do μ-Dish é a altura e o volume ideal do caminho agarose, que permite que a cocultura de predatório e hospedeiro seja colocada no lado inferior da almofada agarose. Também é importante usar células B. bacteriovorus frescas nos experimentos, pois as células perdem sua motilidade durante o armazenamento prolongado. Uma limitação deste protocolo é que, no campo de visão único, os usuários podem contar aproximadamente 100 células predadoras e 100 células hospedeiras, mas o MOI pode ser estimado em 50%-60%.
O conhecimento atual sobre o ciclo celular Bdellovibrio é em grande parte baseado em estudos que empregaram E. coli ou P. aeruginosa. Este sistema permite o monitoramento de B. bacteriovorus caçando uma variedade de patógenos bacterianos, incluindo Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis ou K. pneumoniae. Além disso, esta plataforma pode ser útil em experimentos envolvendo patógenos multirresistentes. Assim, pode ajudar a facilitar melhorias na engenharia genética de B. bacteriovorus como um antibiótico vivo na medicina humana e veterinária, particularmente para combater patógenos multidroga resistentes.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Centro Nacional de Ciências grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 a J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
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