Summary
此处介绍的是一个协议，它描述了使用延时荧光显微镜与 agarose 垫和细胞成像盘相结合的掠夺性细菌 Bdellovibrio 细菌的完整生命周期的监测。
Abstract
Bdellovibrio 细菌是一 种小克阴性，强制性掠夺性细菌，可以杀死其他克阴性细菌，包括有害的病原体。因此，它被认为是一种活的抗生素。为了 将B.细菌作为一种 活抗生素，首先需要了解其复杂生命周期的主要阶段，特别是其在猎物体内的增殖。到目前为止，实时监控掠夺性生命周期的连续阶段一直具有挑战性。这里介绍的是一个全面的协议，用于 实时成像B.细菌的整个生命周期，特别是在它生长在宿主体内。为此，一个由阿加罗斯垫组成的系统与细胞成像盘结合使用，其中掠夺性细胞可以在阿加罗斯垫下自由移动，而固定猎物细胞能够形成白细胞。产生荧光标记的β-亚基的DNA聚合酶III的菌株的应用进一步允许在 B.细菌生命周期 的繁殖阶段监测染色体复制。
Introduction
Bdellovibrio细菌是一种小（0.3±0.5μm ×0.5±1.4μm）克阴性细菌，可捕食其他克阴性细菌，包括有害的病原体，如肺炎克勒布西拉、伪多莫纳斯aeruginosa和Shigella弹性神经1，2，3。2,3由于B.细菌杀死病原体，它被认为是一种潜在的活抗生素，可以用于对抗细菌感染，特别是那些由耐多药菌株引起的细菌感染。
B. 细菌具有一个奇特的生命周期，由两个阶段组成：自由生命的非复制性攻击阶段和细胞内生殖阶段（图1）。在自由生活阶段，这种高度移动的细菌，其移动速度高达160μm/s，搜索其猎物。附着在猎物的外膜上后，它进入4，5的内膜5。在白细胞间生殖阶段，B.细菌使用大量的水解酶来降解宿主的大分子，并重复使用它们以促进自身的生长。在入侵腹膜后不久，宿主细胞死亡并膨胀成一个球形结构，称为bdelloplast，其中掠夺性细胞拉长并复制其染色体。复制过程从复制源（oriC）6开始，一直持续到染色体的几个副本被完全合成7。有趣的是，每个染色体的复制后面不跟随细胞分裂。相反，捕食者拉长形成一个长，多核和丝状细胞。当营养枯竭时，灯丝经过同步隔膜，后代细胞从bdelloplast8中释放。
在B.细菌可以用作对抗细菌感染的活抗生素之前，了解其生命周期的主要阶段，特别是与猎物内增殖有关的阶段至关重要。由于在复杂的生命周期中，由于捕食者及其猎物的各种形态形式，B.细菌的活细胞成像一直具有挑战性。到目前为止，B.细菌与其宿主细胞之间的相互作用主要通过电子显微镜和,捕捉分析2、9、10进行了研究，9这两者都有局限性，特别是当它们被用来监测掠食性生命周期的连续阶段时。10这些方法提供B.细菌细胞的高分辨率图像，并使我们能够在攻击或生长阶段观察一个小捕食者。然而，它们不允许在两个生命周期阶段跟踪单个B.细菌。
这里介绍的是一个全面的协议，使用延时荧光显微镜（TLFM）来监测B.细菌的整个生命周期。由阿加罗斯垫组成的系统与细胞成像盘结合使用，其中掠夺性细胞可以在阿加罗斯垫下自由移动，而固定化的猎物细胞能够形成白杨拉斯特（图2）。此设置是根据大肠杆菌和B.细菌的特定菌株准备的E. coli，但协议可以很容易地改变，以适应用户的个人菌株（例如，携带不同的选择标记，蛋白质与不同的荧光团融合，等等）。
在这种情况下，为了在攻击 阶段可视化B.细菌 ，构建了一种特定的菌株（HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry），它表达了细胞质蛋白的荧光标记版本，PilZ（可应要求在我们的实验室中提供）7。该菌株还产生DnaN（+滑动夹），DNA聚合酶III全息酶的亚基，与荧光蛋白融合。这使得正在进行的DNA复制在掠食性细胞内被监测，因为它们在bdelloplast中生长。
虽然所述用于图像采集的协议和软件是指特定制造商提供的倒置显微镜（参见材料 表），但该技术可针对任何配备环境室或其他外部加热支架且能够延时成像的倒置显微镜进行调整。对于数据分析，用户可以选择与单个输出格式兼容的任何可用软件。
图1： 大肠杆菌作为宿主 细胞的B. 细菌 生命周期。在攻击阶段，自由游 的B.细菌沃鲁斯 细胞搜索并附着在宿主 大肠杆菌细胞上 。入侵后，掠食性细胞在猎物的周围质中变得局部化，改变宿主细胞的形状，形成一个卵母细胞。生殖阶段从 bdelloplast 形成开始。掠夺性细胞消化猎物细胞，并重复使用简单的化合物来构建自己的结构。 B. 细菌作为 长丝生长在宿主的内皮。当猎物细胞的资源耗尽时 ，B.细菌丝 同步分裂并形成后代细胞。后代细胞发育后，它们就使白细胞发育成白细胞。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Protocol
1. B. 细菌纤维素 的制备，用于微观分析
- 在250 mL烧瓶中，通过结合1 mL的新鲜24 小时B.细菌 培养（例如，HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry）和3mL的隔夜猎物培养（例如， 大肠杆菌 S17-1 pZMR100）与50 mL的Ca-HEPES缓冲液（25 mM HEPES，2 mM CaCl2 [pH = 7.6]）根据需要补充抗生素（这里，50μg/mL卡那霉素）。
- 在 30°C 下孵育共培养 24 小时，在 200 rpm 时摇动。
- 检查猎物细胞是否完全由液体安装的相对比显微镜进行。此时，应存在大量动体攻击 阶段 B. 细菌杆菌细胞， 并且 不应可见大肠杆菌细胞或大肠杆菌。
- 通过 0.45μm孔 径过滤器过滤B.细菌培养，以去除任何剩余的宿主细胞。捕食性细胞（0.3±0.5 μm x 0.5±1.4 μm）可自由穿透0.45 μm毛孔，而宿主细胞则保留在过滤表面。
- 在 2469 x g 和 30°C 的圆锥管中旋转滤土 20 分钟，以收集捕食性细胞。将 B. 细菌沃 鲁斯颗粒重新在 3 mL 的 Ca-HEPES 缓冲液中（最终 OD600 约为 0.2），并在 30 °C 和 200 rpm 下孵育 30 分钟。
2. 为 B.细菌入侵准备宿主 细胞
- 使用宿主菌株的单一群体（大肠杆菌 S17-1 pZMR100由于各种细胞大小导致形成大小不等的bdelloplast）接种10 mL的YT介质（0.8%巴托尝试酮， 0.5% 酵母提取物， 0.5% NaCl [pH = 7.5]）， 已补充抗生素， 如果需要 （这里， 50 μg /mL 卡那霉素）.培养细胞在37°C和180 rpm过夜。
- 将 2 mL 的 隔夜大肠杆菌 培养（OD600 的 ±3.0）转移到室温 （RT） 和 2469 x g 的 2 mL 试管和离心机 5 分钟。将颗粒重新在 200 μL 的 Ca-HEPES 缓冲液中。
3. 显微镜的设置（参见材料表）
- 使用前，将100倍油浸没目标的显微室预热至30°C，至少1小时。此步骤是为了防止在实验期间保持焦点时出错。
- 打开显微镜和显微镜自动化。初始化控制软件并选择适当的滤波器，根据需要获取亮场/DIC/相位对比度和荧光图像（此处：BF图像、GFP/mCherry多色滤波器以及mCherry和GP的发射/激发）。
4. 延时荧光显微镜布局的组装
- 将200毫克低荧光分子级琼糖与20 mL的Ca-HEPES缓冲液（1%的最终琼糖浓度）混合，并在微波炉中溶解琼糖。该批在凝固后可以重复使用多次，因此只需重复加热步骤即可。
- 将3 mL的熔化的阿加罗斯倒入35毫米的玻璃底盘（材料表）。让加糖凝固。
- 使用实验室微铲，小心地从 35 mm 盘上取出 agarose 垫，而不会干扰 agarose 垫的中心极。将垫底部朝上翻转，并放在培养皿盖中（图 2）。
- 将 5 μL 的浓缩大肠杆菌悬浮 液放在翻转垫的顶部，并使用接种回路在中心极中扩散细胞。将 5 μL 浓缩 B. 细菌悬浮液悬浮液（OD600 的 ±0.2） 添加到大肠杆菌涂层表面。不要传播细胞。
- 快速将 agarose 凝胶返回 35 mm 玻璃底盘（顶部朝下），然后用盖子盖住。如有必要，轻轻将搅拌器压在板上，以清除任何气泡。
图2：实验工作流程的示意图描述。从 35 mm 盘上拆下 agarose 垫并翻转，使底部朝上。捕食者细胞的新鲜悬浮和猎物细胞的隔夜培养被放置在翻转垫上，以覆盖"底部"的一面。然后将 agarose 垫翻转到其原始方向，并放回 35 mm 盘中，该盘安装在显微镜室的倒置显微镜台上。 请单击此处查看此图的较大版本。
5. 延时荧光显微镜的传导
- 将 35 mm 的盘子放在培养皿支架中，以便在实验过程中不会移动。将一滴浸入油（1.518折射率）放在目标以及35毫米盘的底部。
- 将支架安装在显微镜室中倒置显微镜的舞台上。
- 在显微镜控制软件中设置选项，以随着时间的推移在多个阶段位置收集多个图像。
- 设置放大倍率（100 倍）和多色透镜（GFP/mCherry）。使用眼片和亮场 （BF），找到焦点平面并打开点列表管理器。
- 通过移动舞台并单击"标记点"按钮，在显微镜软件中存储每个位置的坐标，选择至少 10 个感兴趣的 位置。避免靠近彼此的位置，以防止光漂白和光毒性。将相机阀从目镜转向监视器，通过设置焦平面并单击点列表管理器中的 "替换点 "按钮来校准每个点。
- 打开实验设计器，并设置每个选项卡中的所有实验参数，如下所示：
- 取消标记 Z 堆叠 框。
- 选择荧光通道并设置最佳照明设置。此处使用了以下设置：对于 mCherry 通道，mCherry 滤波器集 （EX575/25;对于 mCherry 通道，mCherry 滤波器集 （EX575/25）;对于 mCherry 通道，mCherry 滤波器集 （EX575/25;对于 mCherry 通道，mCherry 滤波器集（EX575/25;EM625/45），50%的强度和200ms的曝光时间;用于 GFP 通道，GFP 滤波器组 （EX475/28;EM525/48），50%的强度和80ms;和 BF 图像、POL 通道、5% 的强度和 50 ms。
- 选择获取图像和实验总时间之间的间隔。在这里，在实验的10小时期间内进行了5分钟的间隔。
- 为所选位置启用对焦维护（此处使用的系统，通过使用终极 焦点标记"保持焦点" 复选框）。
- 选择应自动保存图像文件的数据文件夹。
- 重新检查显微镜软件控制中的所有设置，然后开始延时实验。
- 实验的第一个小时后，检查所有阶段位置是否仍在聚焦中。如果需要，在图像采集之间的时间间隔内调整焦点。
- 延时实验完成后，取出培养皿，根据生物安全协议使用35毫米的盘和加糖垫。
注：步骤 5.2 之后的所有子步骤都特定于 DeltaVision 精英用户。使用其他系统的研究人员需要根据单个系统调整设置。
6. 使用斐济软件处理延时图像和生成电影
- 将实验数据传输到加载了斐济软件的计算机。启动斐济程序并使用文件打开 图像 | 打开 或只是将图像文件拖下斐济。
- 在"生物格式导入选项"中，在堆栈查看选项中选择"使用 Hyperstack 的视图堆栈"，在颜色选项中单击"复合颜色模式"，并标记"自动缩放"。
- 通过滚动浏览图像堆栈，评估细胞和 bdelloplast 在实验过程中是否仍然保持焦点。检查DnaN-mNeonGreen的绿色荧光点是否存在于 B.细菌 沃鲁斯细胞中，在整个生长阶段，并确保掠夺性生命周期的所有阶段都可以可视化。
- 要分析特定的B. 细菌沃鲁斯细胞/bdelloplast，请使用斐济菜单中的选择工具（矩形、椭圆形、多边形或手绘）标记它。使用图像复制所选区域|重复或使用Ctrl + Shift = D。
- 调整每个荧光通道的亮度和对比度，如下所示：
- 要选择单个通道，请单击 "图像 " 打开 通道工具 |颜色 |通道工具 或 Ctrl + Shift + Z， 并选择感兴趣的频道（频道1：mCherry， 通道2：mNeonGreen， 频道3：光明场）。
- 通过打开图像中的贝加莱菜单，调整荧光通道中 图像的 亮度和 对比度 |调整 |亮度/对比度 或单击 Ctrl + Shift = C。
- 使用"分析" 添加 比例条 |工具 |比例条。单击"图像"将时间戳添加到图像 |堆栈 |时间戳.
- 要保存修改后的图像，请转到 "文件 " |"保存为 " 并选择 TIFF 作为图像序列保存 ，AVI 以生成影片， 或 PNG 保存当前帧的单个图像。
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Representative Results
所述的基于TLFM的系统允许及时跟踪B.细菌的单个细胞（图3，电影1），并提供有关复杂掠夺性生命周期每个阶段的宝贵信息。PilZ-mCherry融合使整个掠食细胞在攻击阶段以及生长阶段的早期阶段被标记（图3）。从攻击阶段到复制阶段的过渡不仅由宿主的 bdelloplast 形成，而且由以 DnaN-mNeonGreen 荧光源为标志的复方体（复制机械）的外观所可视化（图3）。
如前所述，在入侵的细胞极（皮利极）7中组装的爬行动物，随着繁殖阶段的推进，在生长的B.细菌纤维丝中观察到不止一个爬行动物（图3）。在合成了几份染色体后，复制被终止（被想象成DnaN-mNeonGreen foci的消失）。最后，多核丝经过隔膜，后代细胞从白细胞中释放（图3）。
提供的协议描述图像处理使用斐济软件提供了如何制作电影从收购的延时系列（电影1） 的分步说明。
图3：B.细菌沃鲁斯生命周期，然后是延时荧光显微镜。（A） 自由活的掠夺性 （B. 细菌Dnan-mNeonGreen /PilZ-mCherry） 和宿主 （大肠杆菌） 细胞.（B） B. 细菌附着在大肠杆菌上。（C） 布德洛普拉斯特形成.（D， E）纤维生长和染色体复制。（F） 染色体复制的终止。（G） 同步丝隔膜的开始。（H） 纤维细胞解解和释放的后代细胞.上面板显示亮场图像，下面板表示合并的亮场和荧光通道。比例线 = 1 μm，时间 = hh：min.请单击此处查看此图的较大版本。
电影1：大肠杆菌作为宿主细胞的B.细菌生命周期的延时成像。 B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen（绿色）在株HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry中的亚细胞定位。红色通道表示与细胞质PilZ-mCherry标记的捕食者细胞。灰色表示亮场。图片每5分钟收集一次，请点击这里下载此视频。
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Discussion
由于人们越来越有兴趣使用 B.细菌 作为活抗生素，因此需要新的工具来观察掠夺性生命周期，特别是捕食者-病原体相互作用。所提出的协议用于实时跟踪整个 B.细菌 生命周期，特别是在宿主内部生长过程中。此外，利用一种产生荧光标记β夹的DNA聚合酶III全息酶的菌株的应用，能够监测染色体复制进展在整个 B.细菌的繁殖阶段。
此方法的关键步骤是正确准备 35 mm 培养皿中的布局。在显微镜下观察 B.细菌 的生命周期的挑战是建立支持掠夺性生长的条件（包括其他克阴性细菌细胞作为宿主细胞），并提供掠夺性细胞的活力。有效微观观察的一个关键方面是需要在红糖垫上统一分布猎物，这是通过通过接种循环传播细胞实现的。宿主细胞密度不能过高，所选观测点应包含足够数量的独立宿主细胞。同时， 布德洛维布里 奥细胞应该足够运动，以积极寻找他们的猎物。因此，在垫翻转回来并放入盘中之前，它们不应被分散或风干。有时需要更大的捕食者悬浮量，以在气糖和玻璃表面之间的薄流体层中提供足够的动力。
此处使用 μ-dish;但是，这对协议来说不是必不可少的。任何玻璃底盘都可以使用。α-Dish 的优点是红玫瑰路径的最佳高度和体积，这使得捕食者和宿主的共培养能够放置在红玫瑰垫的底部。在实验中使用新鲜的 B.细菌细胞 也很重要，因为细胞在长期储存过程中会失去活性。该协议的一个限制是，在单个视野中，用户可以计算大约 100 个掠食细胞和 100 个宿主细胞，但 MOI 可以估计为 50%-60%。
目前关于Bdellovibrio细胞周期的知识主要基于使用大肠杆菌或P.aeruginosa的研究。该系统允许监测以各种细菌病原体为食的B.细菌，包括沙门氏菌、S.flexneri、Proteus米拉比利斯或K.肺炎。此外，该平台在涉及耐多药病原体的实验中可能有用。因此，它可能有助于改进B.细菌作为人类和兽医医学中一种活抗生素的基因工程，特别是对抗耐多药病原体。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了国家科学中心授予Opus 2018/29/B/NZ6/00539给J.Z.C的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
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