Summary
Presenteras här är ett protokoll som beskriver övervakning av den fullständiga livscykeln för underprissättning bakterie bdellovibrio bakteriovorus med hjälp av time-lapse fluorescens mikroskopi i kombination med en agaros pad och cell-imaging rätter.
Abstract
Bdellovibrio bakterienovorus är en liten gramnegativ, obligate rovgiriga bakterie som dödar andra gramnegativa bakterier, inklusive skadliga patogener. Därför anses det vara en levande antibiotika. För att applicera B. bacteriovorus som ett levande antibiotikum är det först nödvändigt att förstå de stora stadierna av dess komplexa livscykel, särskilt dess spridning inuti byte. Hittills har det varit en utmaning att övervaka successiva stadier av den rovgiriga livscykeln i realtid. Presenteras här är ett omfattande protokoll för realtidsavbildning av den kompletta livscykeln för B. bacteriovorus, särskilt under sin tillväxt inuti värden. För detta ändamål används ett system bestående av en agarospad i kombination med cellavbildningsrätter, där rovcellerna kan röra sig fritt under agarospaden medan immobiliserade bytesceller kan bilda bdelloplaster. Tillämpningen av en stam som producerar en fluorescerande taggade β-subenhet av DNA-polymeras III ytterligare tillåter kromosom replikering övervakas under reproduktionsfasen av B. bacteriovorus livscykel.
Introduction
Bdellovibrio bakteriovorus är en liten (0,3– 0,5 μm med 0,5–1,4 μm) gramnegativ bakterie som lever på andra gramnegativa bakterier, inklusive skadliga patogener som Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa och Shigella flexneri1,2,3. Eftersom B. bacteriovorus dödar patogener, det anses vara en potentiell levande antibiotikum som kan tillämpas för att bekämpa bakteriella infektioner, särskilt de som orsakas av multiresistenta stammar.
B. bacteriovorus uppvisar en säregen livscykel som består av två faser: en fri-levande icke-replikiv attack fas och en intracellulär reproduktiv fas (Figur 1). I den fria levande fasen söker denna mycket motila bakterie, som rör sig med hastigheter på upp till 160 μm/s, efter sitt byte. Efter att ha fäst på bytets yttre membran kommer den in i periplasmen4,5. Under interperiplasmic reproduktiv fas, B. bacteriovorus använder en uppsjö av hydrolytiska enzymer för att försämra värdens makromolekyler och återanvända dem för sin egen tillväxt. Strax efter att ha invaderat periplasmen dör värdcellen och svällar in i en sfärisk struktur som kallas en bdelloplast, inuti vilken rovdjurscellen förlänger och replikerar sina kromosomer. Replikeringsprocessen startar vid replikeringsursprunget (oriC)6 och för fortlöper tills flera kopior av kromosomen har syntetiserats helt7. Intressant nog är replikering av varje kromosom inte följt av celldelning. Istället, rovdjuret elongates att bilda en lång, multinucleoid och fintrådiga cell. Vid näringsutarmning genomgår glödtråden synkron septation och avkommaceller frigörs från bdelloplasten8.
Innan B. bacteriovorus kan användas som en levande antibiotika mot bakteriella infektioner, är det viktigt att förstå de stora stadierna av sin livscykel, särskilt de som rör dess spridning inuti bytet. Live-cell imaging av B. bacteriovorus har varit utmanande, på grund av de olika morfologiska former av rovdjur och dess byte under den komplexa livscykeln. Hittills har interaktionerna mellan B. bacteriovorus och dess värdcell huvudsakligen studerats av elektronmikroskopi och snap-shot analys2,9,10, som båda har begränsningar, särskilt när de används för att övervaka successiva stadier av den rovgiriga livscykeln. Dessa metoder ger högupplösta bilder av B. bacteriovorus celler och möjliggöra observation av en liten rovdjur under attacken eller tillväxtfasen. De tillåter dock inte spårning av enstaka B. bacteriovorus celler under båda livscykelfaserna.
Presenteras här är ett omfattande protokoll för att använda time-lapse fluorescens mikroskopi (TLFM) för att övervaka den kompletta livscykeln för B. bacteriovorus. Ett system bestående av en agarospad används i kombination med en cell-avbildningsskål, där rovcellerna kan röra sig fritt under agarospaden medan de immobiliserade bytescellerna kan bilda bdelloplaster (Figur 2). Denna uppbyggnad är förberedd utifrån specifika stammar av både E. coli och B. bacteriovorus, men protokollet kan lätt ändras för att passa en användares individuella stammar (t.ex. bär olika selektion markörer, proteiner smält med olika fluoroforer, etc.).
I detta fall, att visualisera B. bacteriovorus under attacken fasen, en specifik stam (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) konstruerades som uttrycker en fluorescerande taggade version av cytoplasmatiskt protein, PilZ (finns i vårt laboratorium på begäran)7. Detta anstränger dessutom jordbruksprodukter DnaN (denskjutna klämman för β-glidning), en subunit av DNA-polymerase III holoenzym, fixerat med ett fluorescerande protein. Detta gör det möjligt för pågående DNA-replikering att övervakas inuti de rovgiriga cellerna när de växer inom bdelloplaster.
Även om det beskrivna protokollet och programvara som används för bildanskaffning avser ett inverterat mikroskop som tillhandahålls av en specifik tillverkare (se Table of Materials), kan denna teknik justeras för alla inverterade mikroskop utrustad med en miljökammare eller annan extern värme hållare och kan time-lapse imaging. För dataanalys kan användare välja all tillgänglig programvara som är kompatibel med de enskilda utdataformaten.
Figur 1: B. bacteriovorus livscykel i E. coli som värdcell. Under attackfasen söker en fritt simmande B. bacteriovoruscell efter och fäster vid en värd E. coli-cell. Efter invasionen blir rovdjurscellen lokaliserad i bytets periplasm, vilket ändrar värdcellens form och bildar en bdelloplast. Reproduktionsfasen börjar med bdelloplastbildning. Rovcellen smälter bytescellen och återanvänder enkla föreningar för att bygga sina egna strukturer. B. bacteriovorus växer som en lång enda glödtråd inuti värdens periplasm. När bytescellens resurser är uttömda, septaterar och bildar B. bacteriovorusfilament och bildar avkommaceller. Efter avkomman celler utveckla sin flagella, de lyse bdelloplast. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av B. bacteriovorus lysate för mikroskopisk analys
- I en 250 mL-kolv, sätt upp kokulturen genom att kombinera 1 mL färsk 24 h B. bakteriovoruskultur (t.ex. HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) och 3 ml av byteskultur över natten (t.ex. E. coli S17-1 pZMR100) med 50 mL Ca-HEPES buffert (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) kompletteras med antibiotika när det behövs (här, 50 μg/mL kanamycin).
- Inkubera kokulturen i 24 h vid 30 °C med skakningar vid 200 rpm.
- Kontrollera att bytescellerna är helt och hållet överbyggda av vätskemonterad faskontrastmikroskopi. Vid denna punkt, bör många motile attack fas B. bakteriovorus celler vara närvarande, och ingen E. coli cell eller bdelloplast bör vara synlig.
- Filtrera B. bacteriovoruskulturen genom ett 0,45 μm porstorleksfilter för att ta bort eventuella kvarvarande värdceller. Predatory celler (0.3–0.5 μm x 0.5–1.4 μm) tränger fritt igenom 0.45 μm pores, eftersom värdceller behålls på filtrera ytbehandlar.
- Snurra ner filtratet i 20 min vid 2469 x g och 30°C i ett koniskt rör på 50 mL för att samla upp rovceller. Resuspend B. bacteriovorus pellet i 3 mL av Ca-HEPES buffert (till en slutlig OD600 på cirka 0,2) och inkubera vid 30 °C och 200 rpm för 30 min.
2. Beredning av värdceller för B. bacteriovorus invasion
- Använd en enda koloni av värdstammen (E. coli S17-1 pZMR100 rekommenderas på grund av olika cellstorlekar som resulterar i bildandet av ojämlikt stora bdelloplaster) för att inokulera 10 mL YT-medium (0,8% Bacto tryptone, 0,5% jästextrakt, 0,5% NaCl [pH = 7,5]) som har kompletterats med antibiotika, om det behövs (här, 50 μg/mL kanamycin). Kulturceller över natten vid 37 °C och 180 rpm.
- Överför 2 mL av över natten E. coli kultur (OD600 av ~ 3.0) till en 2 mL provrör och centrifug vid rumstemperatur (RT) och 2469 x g för 5 min. Resuspend pelleten i 200 μL av Ca-HEPES buffert.
3. Uppställda mikroskopet (se Tabell över material)
- Värm en mikroskopisk kammare med ett mål för oljebadning på 100x till 30 °C i minst 1 h före användning. Det här steget krävs för att förhindra fel i att behålla fokus under experimentet.
- Slå på både mikroskopet och mikroskopiautomatisering. Initiera styrprogramvaran och välj lämpliga filter för att förvärva brightfield/DIC/phase-contrast och fluorescensbilder, efter behov (här: BF-bilder, GFP/mCherry polykromt filter, och emission/excitation för mCherry och GFP).
4. Montering av layouter för time-lapse fluorescensmikroskopi
- Blanda 200 mg låg fluorescerande molekylkvalitets agaros med 20 mL Ca-HEPES buffert (1% slutlig agaroskoncentration) och lös upp agaros i en mikrovågsugn. Partiet kan återanvändas flera gånger efter det stelnar, så helt enkelt upprepa värmesteget.
- Häll 3 mL smält agaros i en 35 mm glas-botten skålen (Tabell of Materials). Låt agaros att stelna.
- Med hjälp av en laboratorium mikro-spatel, försiktigt bort agaros pad från 35 mm skålen utan att störa centrum polen av agaros pad. Vänd pad bottensidan vänd uppåt och placera den i en Petriskål täcka (Figur 2).
- Sätt 5 μL koncentrerad E. coli suspension ovanpå den vända dynan och sprida celler i mittpolen med hjälp av en inokulering slinga. Tillsätt 5 μL koncentrerad B. bakteriovorus suspension (OD600 av ~ 0,2) på E.coli-belagd yta. Sprid inte cellerna.
- Snabbt tillbaka agarosgeln till 35 mm glas-botten skålen (övre sidan vänd nedåt), sedan täcka med lock. Ta vid behov bort eventuella luftbubblor genom att försiktigt trycka ner agaren mot plattan.
Bild 2: Schematisk skildring av det experimentella arbetsflödet. Agarospaden tas bort från 35 mm-skålen och vänds så att nedersidan är vänd uppåt. Färska suspensioner av rovgiriga celler och övernattningskultur av bytesceller placeras på den vända dynan för att belägga "botten"-sidan. Agarospaden vänds sedan till sin ursprungliga orientering och placeras tillbaka i 35 mm skålen, som monteras på det inverterade mikroskopet scenen i mikroskopet kammaren. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
5. Ledning av tidsförloppsfluorescensmikroskopi
- Placera 35 mm skålen i Petriskålshållaren så att den inte kommer att röra sig under försökets gång. Placera en droppe nedsänkning olja (1,518 brytningsindex) på målet samt botten av 35 mm skålen.
- Montera hållaren på scenen i det inverterade mikroskopet i mikroskopkammaren.
- Ställ in alternativen i mikroskopet styr mjukvaran för att samla flera bilder på flera steg positioner över tiden.
- Ställ in förstoringsgraden (100x) och polykrom lins (GFP/mCherry). Med hjälp av en ögonbit och brightfield (BF), hitta fokalplanet och öppna punktlistan manager.
- Välj minst 10 positioner av intresse genom att flytta scenen och lagra koordinaterna för varje position i mikroskopmjukvaran genom att klicka på Knappen Markera punkten. Undvik positioner som är placerade nära varandra för att förhindra fotoblekning och fototoxicitet. Vrid kameraventilen från okularet till bildskärmen och kalibrera varje punkt genom att ställa in fokalplanet och klicka på knappen Ersätt punkt i punktlistehanteraren.
- Öppna experimentdesignern och ange alla experimentella parametrar i varje flik enligt följande:
- Omarkera Z-staplingslådan.
- Välj lysrörskanaler och ställ in de optimala belysningsinställningarna. Här användes följande inställningar: för mCherry-kanalen, mCherry filteruppsättningar (EX575/25; EM625/45), 50 % intensitet, och 200 ms exponeringstid; för GFP-kanalen, GFP-filteruppsättningen (EX475/28; EM525/48), 50% intensitet, och 80 ms; och för BF-bilderna, POL-kanalen, 5 % intensitet och 50 ms.
- Välj intervall mellan att inhämta bilder och experimentets totala tid. Här utfördes 5 min intervaller under 10 h perioden av experimentet.
- Aktivera fokusunderhåll för de valda positionerna (för det system som används här, genom att markera kryssrutan Bibehåll fokus med UltimateFocus).
- Välj den datamapp som bildfilerna ska sparas i automatiskt.
- Kontrollera om alla inställningar i mikroskopet programvara kontroll, starta sedan time-lapse experiment.
- Efter experimentets första timme kontrollerar du att alla scenpositioner fortfarande är i fokus. Justera fokus under tidsintervall mellan bildinhämtning, om det behövs.
- När timelapse-experimentet är färdigt, ta bort Petri-skålen och utnyttja 35 mm-skålen med en agarospad enligt biosäkerhetsprotokollet.
OBS: Alla understeg efter steg 5.2 är specifika för DeltaVision Elite-användare. Forskare som använder andra system måste justera inställningarna enligt enskilda system.
6. Behandling av timelapse-bilder och generering av filmer med hjälp av Fiji-programvara
- Överför experimentella data till en dator laddad med Fiji-programvaran. Starta Fiji programmet och öppna en bild med File | Öppna eller genom att helt enkelt dra och släppa bildfilen till Fiji.
- I Importalternativ för Bio-Formatsväljer du Visa stack med Hyperstack i alternativen för stapelvisning, Klicka på sammansatt färgläge i färgalternativen och markera Autoskala.
- Genom att bläddra igenom bildstackarna, bedöma om cellerna och bdelloplasterna förblev i fokus under experimentets gång. Kontrollera om gröna fluorescerande fläckar från DnaN-mNeonGreen finns inom B. bacteriovorus celler inuti bdelloplasts hela tillväxtfasen, och se till att alla stadier av den rovgiriga livscykeln kan visualiseras.
- Om du vill analysera en viss B. bacteriovoruscell/bdelloplast markerar du den med hjälp av markeringsverktygen i Fiji-menyn (Rektangel, Oval, Polygon eller Freehand). Duplicera den valda regionen med hjälp av Bild | Duplicera eller genom att använda Ctrl + Skift + D.
- Justera ljusstyrka och kontrast för varje fluorescenskanal enligt följande:
- Om du vill välja en enskild kanal öppnar du Channel-verktyg genom att klicka på Bild | Färg | Kanaler verktyg eller Ctrl + Skift + Z, och välj kanal av intresse (Kanal 1: mCherry, Kanal 2: mNeonGreen, Kanal 3: brightfield).
- Justera ljusstyrka och kontrast för bilder i fluorescenskanalen genom att öppna B&C-menyn i Bild | Justera | Ljusstyrka/Kontrast eller genom att klicka på Ctrl + Skift + C.
- Lägg till skalstreck med Hjälp av Analysera | Verktyg | Skallist. Lägg till tidsstämplingen på bilderna genom att klicka på Bilder | Staplar | Tid Stamper.
- Om du vill spara ändrade bilder går du till Arkiv | Spara som och välj TIFF att spara som en bildsekvens, AVI för att producera en film, eller PNG för att spara en enda bild av den aktuella bildrutan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det beskrivna TLFM-baserade systemet gör att enskilda celler av B. bacteriovorus kan spåras i tid (Figur 3, Film 1) och ger värdefull information om varje steg i den komplexa rovlivscykeln. PilZ-mCherry-fusionen gör det möjligt att märka hela rovdjurscellen i attackfasen samt tidigt stadium av tillväxtfasen (figur 3). Övergången från attacken till replikativ fas visualiserades inte bara av värdbdelloplastbildningen utan också av utseendet på den svarade (replikeringsmaskineriet), som präglades av DnaN-mNeonGreen fluorescerande högborgar (Figur 3).
Som tidigare visats, den replisom var sammansatt vid den invaderande cell polen (pili-pole)7, och mer än en replisome observerades inom en växande B. bacteriovorus glödtråden som reproduktionsfasen fortskred (Figur 3). Efter flera kopior av kromosomen var syntetiserade, replikeringen avslutades (visualiseras som försvinnandet av DnaN-mNeonGreen högborgar). Slutligen genomgick multinucleoid glödtråd septation, och avkommacellerna frisläpptes från bdelloplasten (Figur 3).
Det presenterade protokollet som beskriver bildbehandlingen med hjälp av Fiji-programvaran ger en steg-för-steg-förklaring av hur man producerar en film för publicering från den förvärvade time-lapse-serien (Movie 1).
Figur 3: B. bacteriovorus livscykel följt av tidsförlopp fluorescensmikroskopi. (A) Fritt levande rovgirigt (B. bacteriovorus DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) och värd (E. coli) celler. (B) Fastsättning av B. bacteriovorus till E. coli. (C) Bdelloplastbildning. (D,E) Fintrådig tillväxt och kromosomreplikation. (F) Avslutande av kromosomreplikation. (G) Start av synkron filament septation. (H) Bdelloplastlys och frisättning av avkommaceller. Övre paneler visar brightfield bilder, lägre paneler representerar sammanslagna brightfield och fluorescens kanaler. Skala bar = 1 μm, tid = hh:min. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.
Film 1: Time-lapse imaging av B. bacteriovorus livscykel i E. coli som en värd cell. Subcellulär lokalisering av DnaN-mNeonGreen (grön) i stam HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry. Röd kanal anger märkning av de predatorceller med cytoplasmatisk PilZ-mCherry. Grått indikerar brightfield. Bilder samlades varje 5 min. Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund av det ökade intresset för att använda B. bacteriovorus som ett levande antibiotikum behövs nya verktyg för att observera den rovlevande livscykeln, särskilt rovdjurspatogenaktioner. Det presenterade protokollet används för att spåra hela B. bacteriovorus livscykel, särskilt under sin tillväxt inuti värden, i realtid. Dessutom tillämpning av en stam som producerar fluorescerande taggade beta klämma av DNA polymeras III holoenzym aktiverat övervakning av kromosom replikering progression under hela reproduktionsfasen av B. bacteriovorus.
Ett kritiskt steg i denna metod är korrekt beredning av layouter i 35 mm skålen. En utmaning i att observera livscykeln för B. bacteriovorus under mikroskopet är att fastställa förhållanden som stöder predatory tillväxt (involvera andra gramnegativa bakterieceller som värdceller) och ge för predatory cell motility. En av de avgörande aspekterna av effektiva mikroskopiska observationer är behovet av en enhetlig fördelning av byte på agarospaden, vilket uppnås genom att sprida cellerna med en inokulerande slinga. Värdcellstätheten kan inte vara för hög, och de valda observationspunkterna bör innehålla ett tillräckligt antal separata värdceller. Under tiden bör Bdellovibrio cellerna vara motila nog att aktivt söka efter sitt byte. Således bör de inte spridas ut eller lufttorkas innan dynan vänds tillbaka över och placeras i skålen. Ibland behövs större volymer av rovdjursupphängning för att ge tillräcklig motilitet i ett tunt vätskelager mellan agaros och glasytan.
En μ-Dish används här; detta är dock inte väsentligt för protokollet. Alla glas-botten skålen kan användas. En fördel med μ-Skålen är den optimala höjden och volymen av agarosvägen, vilket möjliggör kokultur av rov- och värd för att placeras på bottensidan av agarospaden. Det är också viktigt att använda färska B. bakteriovorusceller i experimenten, eftersom cellerna förlorar sin motilitet under långvarig lagring. En begränsning av detta protokoll är att användarna vid det enda synfältet kan räkna ungefär 100 rovdjursceller och 100 värdceller, men MOI:en kan uppskattas till 50%–60 %.
Nuvarande kunskap om Bdellovibrio cellcykeln bygger till stor del på studier som har anställt E. coli eller P. aeruginosa. Detta system möjliggör övervakning av B. bacteriovorus jagar på en mängd bakteriella patogener, inklusive Salmonella spp., S. flexneri, Proteus mirabilis, eller K. pneumoniae. Denna plattform kan dessutom vara användbar i experiment som involverar multiresistenta patogener. Således kan det bidra till att underlätta förbättringar i genteknik av B. bacteriovorus som en levande antibiotika i human-och veterinärmedicin, särskilt för att bekämpa multiresistenta patogener.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av National Science Centre grant Opus 2018/29/B/NZ6/00539 till J.Z.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Centrifuge | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiedMolecular Biology Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | low fluorescence agarose for agarose pad |
| Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Open source image processing package |
| Glass Bottom Dish 35 mm | ibidi | 81218-200 | uncoated glass |
| Microscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, ultimate focus laser module, DV Elite CoolSnap HQ2 Camera, SSI assembly FP DV, kit obj. Oly 100x oil 1.4 NA, prism Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µm | Sartorius | 16555----------K | Cellulose Acetate, Sterile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Manufacturer-supplied imaging software |
References
- Shatzkes, K., et al. Predatory Bacteria Attenuate Klebsiella pneumoniae Burden in Rat Lungs. mBio. 7 (6), (2016).
- Iebba, V., et al. Bdellovibrio bacteriovorus directly attacks Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus Cystic fibrosis isolates. Frontiers in Microbiology. 5, (2014).
- Willis, A. R., et al. Injections of Predatory Bacteria Work Alongside Host Immune Cells to Treat Shigella Infection in Zebrafish Larvae. Current biology: CB. 26 (24), 3343-3351 (2016).
- Lambert, C., et al. Characterizing the flagellar filament and the role of motility in bacterial prey-penetration by Bdellovibrio bacteriovorus. Molecular Microbiology. 60 (2), 274-286 (2006).
- Lambert, C., et al. A Predatory Patchwork: Membrane and Surface Structures of Bdellovibrio bacteriovorus. Advances in Microbial Physiology. 54, 313-361 (2008).
- Makowski, Ł, et al. Initiation of Chromosomal Replication in Predatory Bacterium Bdellovibrio bacteriovorus. Frontiers in Microbiology. 7, 1898 (2016).
- Makowski, Ł, et al. Dynamics of Chromosome Replication and Its Relationship to Predatory Attack Lifestyles in Bdellovibrio bacteriovorus. Applied and Environmental Microbiology. 85 (14), (2019).
- Fenton, A. K., Kanna, M., Woods, R. D., Aizawa, S. I., Sockett, R. E. Shadowing the actions of a predator: backlit fluorescent microscopy reveals synchronous nonbinary septation of predatory Bdellovibrio inside prey and exit through discrete bdelloplast pores. Journal of Bacteriology. 192 (24), 6329-6335 (2010).
- Kuru, E., et al. Fluorescent D-amino-acids reveal bi-cellular cell wall modifications important for Bdellovibrio bacteriovorus predation. Nature Microbiology. 2 (12), 1648-1657 (2017).
- Dashiff, A., Junka, R. A., Libera, M., Kadouri, D. E. Predation of human pathogens by the predatory bacteria Micavibrio aeruginosavorus and Bdellovibrio bacteriovorus. Journal of Applied Microbiology. 110 (2), 431-444 (2011).
