Summary
חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים באמצעות הליך ג'ל סול לא רקיקי ומצוידים במולקולות קצרות אניוניות או פולימר. השימוש מגנטומטריה לניטור התאגדות ו biotransformations של חלקיקים מגנטיים בתוך תאי גזע אנושיים מודגם באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM).
Abstract
חלקיקים מגנטיים, עשוי תחמוצת ברזל, מציגים עניין מוזר עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים שעבורם הם מופנמים לעתים קרובות בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים. אתגר אחד הוא להעריך את גורלם בסביבה תאית עם מתודולוגיות אמינות ומדויקות. בזאת, אנו מציגים את השימוש מגנטומטר מדגם רוטט (VSM) כדי לכמת במדויק את השלמות של חלקיקים מגנטיים בתוך התאים על ידי מדידת הרגע המגנטי שלהם. תאי גזע מסומנים לראשונה עם שני סוגים של חלקיקים מגנטיים; חלקיקים יש את אותה הליבה המיוצר באמצעות סינתזה מהירה ויעילה מבוססי מיקרוגל nonaqueous סול ג'ל ושונים בציפוי שלהם: מולקולת חומצת לימון נפוץ מושווה חומצה פוליאקרילית. היווצרות של ספירואידים תאים 3D מושגת לאחר מכן באמצעות צנטריפוגה ואת הרגע המגנטי של כדוריות אלה נמדד בזמנים שונים עם VSM. הרגע המתקבל הוא טביעת אצבע ישירה של שלמות הננו-חלקיקים, עם ערכים יורדים המעידים על השפלה של חלקיקים. עבור שני הננו-חלקיקים, הרגע המגנטי פוחת עם הזמן התרבותי וחושף את ההתכלה שלהם. השפעה מגנה של ציפוי חומצה פוליאקרילית מוצג גם, בהשוואה לחומצה ציטרית.
Introduction
יש עניין מוגבר בתכונות המגנטיות של חלקיקי תחמוצת ברזל עבור מגוון רחב של יישומים ביו-רפואיים. התגובה שלהם תהודה מגנטית עושה אותם סוכני ניגודיות אמינים עבור הדמיית תהודה מגנטית (MRI), יתרון ברפואה רגנרטיבית שבו תאים המסומנים עם חלקיקים מגנטיים ניתן לעקוב ב vivo לאחר ההשתלה1. באמצעות שדות מגנטיים, תאים יכולים גם להיות מונחים במרחק; בדרך זו, spheroids הסלולר2,3, טבעות4, אוגיליונות 5 ניתן להנדס מגנטי וגם מגורה מרחוק6, נכס בפיתוח של רקמות ללא פיגומים. מגוון האפשרויות עבור חלקיקים אלה כולל גם מערכות משלוח תרופות7,8 וטיפול היפרתרמי מגנטי פוטואין להרוג תאים סרטניים9,10,11. עבור כל היישומים האלה, חלקיקים משולבים בסביבה הביולוגית או על ידי הזרקה תוך ורידי או באמצעות הפנמה ישירה בתאים ולאחר מכן נשארים בפנים, אשר מטיל ספק גורלם תאיים.
בניתוחי vivo נמסרה הבנה כללית של גורל הננו-חלקיקים באורגניזם: עם הזרקת זרם הדם, הם נלכדים לראשונה בעיקר על ידי מקרופאגים של הכבד (תאי קופפר), טחול ומח עצם, מתפרקים בהדרגה, ומצטרפים לבריכת הברזל של האורגניזם12,13,14,15,16,17,18,19. תצפיות איכותיות אפשריות רק בשל זרימת הננו-חלקיקים ברחבי האורגניזם. בדרך כלל, העברת מיקרוסקופ אלקטרונית (TEM) ניתן להשתמש כדי לצפות ישירות את חלקיקים ואת נוכחותו של ברזל באיברים ניתן לקבוע באמצעות מינון. לאחרונה, גורלם הוערך ישירות על מאגר של תאים, כלומר במעגל קרוב ללא בריחה ברזל, המאפשר מדידה כמותית של biotransformations שלהם ברמת התא20,21,22. מדידות כאלה אפשריות באמצעות ניתוח התכונות המגנטיות של הננו-חלקיקים הקשורים קשר הדוק לשלמות המבנית שלהם. מגנטומטריה מדגם רוטט (VSM) היא טכניקה שבה המדגם רוטט מעת לעת, כך מדידת הסליל של השטף המושרה מספק את הרגע המגנטי של המדגם בשדה המגנטי להחיל. זיהוי סינכרוני כזה מאפשר מדידה מהירה, המהווה נכס לקביעת הרגעים המגנטיים של מספר רב של דגימות20,21,22,23. החתימה המגנטית המקרוסקופית שאוחזרה על ידי VSM נותנת סקירה כמותית של כל המדגם הביולוגי בקורלציה ישירה לגודל ולמבנה של הננו-חלקיקים. בפרט, הוא מספק את הרגע המגנטי ברוויה (לידי ביטוי אמו) של הדגימות, שהוא כימות ישיר של מספר חלקיקים מגנטיים הנמצאים במדגם, בהתאמה לתכונות המגנטיות הספציפיות שלהם.
הוכח כי העיבוד תאיים של חלקיקים מגנטיים קשורה קשר הדוק לתכונות המבניות שלהם20. ניתן לשלוט בתכונות אלה באמצעות פרוטוקולי סינתזה אופטימליים. כל פרוטוקול מציג יתרונות ומגבלות. חלקיקי תחמוצת ברזל מסונתזים בדרך כלל בתמיסות מימיות באמצעות coprecipitation של יוני ברזל24. כדי להתגבר על המגבלות של polydispersity גודל חלקיקים, שיטות סינתזה אחרות כגון שיטות סול-ג'ל בתיווך פוליול פותחו25. גישות nonaqueous על ידי פירוק תרמי מוביל לייצור של חלקיקי תחמוצת ברזל מכויל היטב26. עם זאת, השימוש בכמויות עצומות של פעילי שטח כמו אוליאמין או חומצה אולאית מסבך את הפונקציונליזציה שלהם ואת העברת המים עבור יישומים ביו-רפואיים. מסיבה זו, אנו לסנתז חלקיקים מגנטיים כאלה דרך מסלול ג'ל סול nonaqueous המוביל גבישות גבוהה, טוהר רבייה27. פרוטוקול זה מייצר חלקיקי גודל מבוקרים היטב שניתן לכוונן באמצעות וריאציית טמפרטורה28. עם זאת, מסלול סול-ג'ל לא מימי בסיוע מיקרוגל יש מגבלת גודל עליון של חלקיקים המתקבלים של סביב 12 ננומטר. הליך זה לא יותאם ליישומים המשתמשים בחלקיקים פרומגנטיים בטמפרטורת החדר. בנוסף לסינתזת הליבה, תכונה עיקרית נוספת שיש לקחת בחשבון היא הציפוי. שוכב על פני השטח של חלקיק, הציפוי פועל כמולקולה עיגון, עוזר הפנמה ממוקדת של חלקיקים, או שזה יכול להגן על חלקיק מפני השפלה. מאז בנזיל אלכוהול משמש כמקור חמצן ליגנד באותו זמן, חלקיקים חשופים מיוצרים ללא צורך פעילי שטח נוספים או ליגנדים. חלקיקים לאחר מכן בקלות פני השטח פונקציונלי לאחר סינתזה ללא תהליך חילופי פעילי שטח.
בזאת, שני סוגים של חלקיקים מוערכים בעלי אותה ליבה ושונים בציפוי. הליבה מסונתזת בטכניקה מהירה ויעילה ביותר המבוססת על מיקרוגל. שני הציפויים בהשוואה מורכבים מחומצת לימון, אחד הנפוצים ביותר כסוכן ציפוי ביישומיםביו-רפואיים 29,30, וחומצה פוליאקרילית (PAA), ציפוי פולימרי עם מספר גבוה של פונקציות כלאט. מדידות מגנטומטריה VSM משמשים לאחר מכן תחילה כדי לכמת את ספיגת הננו-חלקיקים על ידי התאים, ולאחר מכן כהערכה ישירה של השלמות המבנית הננו-חלקיקית עם הפנמה בתאי גזע. התוצאות מראות כי ריכוז הדגירה משפיע על ספיגת הננו-חלקיקים וכי הציפוי משפיע על השפלתם, כאשר המספר הגדול של מולקולות עיגון של PAA מגינות על הליבה מפני השפלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. סינתזה של חלקיקים מגנטיים
- סינתזת ליבה – בסיוע מיקרוגל
- להמיס 400 מ"ג ברזל (III) אצטילצטונט (>99.9%) ב 10 מ"ל של בנזיל אלכוהול (BA, 99.8%) בתוך בקבוקון זכוכית מונווייב 30 מ"ל.
- להגדיל את הטמפרטורה של ההשעיה מ 25 °C (70 °F) ב 20 דקות (בקצב של 11°C/min) ולשמור אותו ב 250 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמצעות כור מיקרוגל.
- להעביר את חלקיקים וכתוצאה מכך מושעה באלכוהול בנזיל בקבוקון זכוכית להפריד את חלקיקים באמצעות מגנט ניאודימיום במשך 30 דקות.
- לשטוף את המשקעים בעברית זכוכית 100 מ"ל הקודם עם 10 מ"ל של dichloromethane, 1 M נתרן הידרוקסיד, אתנול, pH 7 מים (שלוש פעמים) באמצעות מגנט ניאודימיום במשך 5 דקות בכל שלב כדי גלולות חלקיקים ולהסיר את supernatant.
- התאם את המתלה ננו-חלקיקים במים ל- pH 2 באמצעות חומצה הידרוכלורית 1 M, ולאחר מכן צנטריפוגה במסננים ultracentrifugal 100 kDa ב 2,200 x גרם במשך 10 דקות.
- הסר את הסינון, להוסיף 12 מ"ל של 10-2 M חומצה הידרוכלורית לפתרון חלקיקים צנטריפוגה ב 100 kDa מסננים ultracentrifugal ב 2,200 x g במשך 10 דקות (שלוש פעמים). לאחר מכן לדלל את פתרון חלקיקים בתוך 10 מ"ל של10-2 M חומצה הידרוכלורית לפני הציפוי.
- ציפוי
- לדלל 175 מ"ג של חומצת לימון וחומצה פוליאקרילית במים ב- pH 2 בבקבוקון זכוכית 100 מ"ל והתאים את ה- pH ל -2 עם תמיסת חומצה הידרוכלורית 1 מ '.
- מוסיפים את פיזור מימית חלקיקי 10 מ"ל לתמיסת מולקולת הציפוי, בהתאם ליחס מסה של 5 בין מולקולת הציפוי לננו-חלקיקים. להתסיס במשך 2 שעות תחת ערבוב מגנטי בטמפרטורת החדר.
- לאחר התגובה, להתאים את ה- pH ל 7 עם 1 M נתרן הידרוקסידי.
- צנטריפוגה פתרון חלקיקים 3 פעמים עם מים deionized (DI) ב 100 kDa אולטרה צנטריפוגלי מסננים ב 2,200 x גרם במשך 10 דקות; להסיר את הסינון לדלל את פתרון חלקיקים ב 12 מ"ל של מים DI.
2. תרבות ותיוג מגנטי של תאי גזע
- תרבות תאי גזע mesenchymal אנושי (MSC) במדיום צמיחת תאי גזע Mesenchymal מלא (MSCGM) ב 37 °C (70 °F) ו 5% CO2. כאשר התאים הם ב 90% מפגש, להוסיף 10 מ"ל של טריפסין-EDTA מראש מחומם ב 37 ° C לכל בקבוק 150 ס"מ רבוע ולהשאיר במשך 2-3 דקות כדי לנתק את התאים.
- כדי לדעת מתי התאים מנותקים, להתבונן בהם עם מיקרוסקופ שדה בהיר. השוהים מחדש את התאים המנותקים ב- MSCGM ומחלקים אותם בארבעה בקבוקונים בגודל 150 ס"מ רבועים. להגביר את התאים בדרך זו עד המעבר 4 עד 5.
- הכינו את הפתרון של חלקיקים מגנטיים לתיוג תאים: לפזר את הריכוז הנבחר של חלקיקי תחמוצת ברזל במדיום מכון הזיכרון רוזוול פארק ללא סרום (RMPI-1640) ללא גלוטמין. RPMI משמש דגירה חלקיקים (ואת שלבי שטיפה הקשורים) כפי שיש לו חוזק יוני נמוך יותר מאשר DMEM ומונע טוב יותר אירועי צבירת חלקיקים.
- כאשר התאים נמצאים במעבר 4 או 5 ו 90% confluent, להסיר את המדיום MSCGM, לשטוף את התאים עם RPMI ללא סרום (ללא גלוטמין) ולהוסיף 10 מ"ל של תחמוצת ברזל ננו חלקיקים פתרון לכל 150 ס"מ2 בקבוק תרבות, שהוא נפח המינימום הנדרש כדי לכסות את כל התאים.
- דגירה ב 37 °C (69 °F) ו 5% CO2 במשך 30 דקות ולאחר מכן להשליך את פתרון חלקיקים. לשטוף פעם אחת עם סרום חינם RPMI-1640 (ללא גלוטמין) ואת הדגירה עם בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין (25 מ"ל לכל 150 ס"מ2 בקבוק) לילה ב 37 °C ו 5% CO2 כדי לאפשר הפנמה מלאה של חלקיקים.
3. היווצרות של תאי גזע-ספרואידים
- הכן טרי תא ספרואידי תרבית בינוני מורכב DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין בתוספת 50 μM L-ascorbic חומצה 2-פוספט, 0.1 μM dexamethasone, 1 מ"מ נתרן פירובט, 0.35 מ"מ L-פרולין, ו 1% תוסף תרבות אוניברסלי המכיל אינסולין, טרנספרין אנושי וחומצה סלנית (ITS-Premix).
- נתק את ה-MSCs המגנטיים על-ידי הוספת 10 מ"ל של 0.05% טריפסין-EDTA שהתחממו מראש ב-37°C ל-150 ס"מ2 בקבוקים למשך 2-3 דקות. כאשר התאים מנותקים, מיד להשבית את טריפסין על ידי הוספת 1/3 של נפח של DMEM בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין סטרפטומיצין שחומם מראש ב 37 °C (77 °FBS).
- צנטריפוגה התאים מנותקים ב 260 x g במשך 5 דקות, לשאוף את המדיה להשעות מחדש את התאים בנפח קטן (פחות מ 1 מ"ל לכל 150 ס"מ רבוע בקבוק) של תא ספרואידי תרבות בינוני כגון שיש 200,000 תאים בערך 50 μL של בינוני. לספור את מספר התא באמצעות hemocytometer ולהתאים את עוצמת הקול במידת הצורך.
- הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות תאים-spheroid שהוכן טרי בצינור צנטריפוגה סטרילי 15 מ"ל ולהוסיף את נפח הפתרון בשימוש חוזר המתאים 200,000 תאים.
- צנטריפוגה אלה תאים מסומנים מגנטית ב 180 x g במשך 3 דקות כגון יצירת גלולה תא בתחתית הצינור ולשמור על supernatant, שהוא מדיום תרבות התא.
- מעט לפתוח את הצינורות כדי לאפשר חילופי אוויר דגירה ב 37 °C (60 °F) עם 5% CO2 עד 21 ימים, זמן תרבות שבו התאים יוצרים מבנה 3D מגובש שתוצאתו ספירואיד מעוצב במלואו. לשנות את המדיום פעמיים בשבוע.
- בימים נתון, לשטוף את spheroids פעמיים עם חיץ cacodylate עשוי 0.2 M cacodylate מדולל במים demineralized ולתקן אותם באמצעות 2% glutaraldehyde ב 0.1 M מאגר cacodylate מדולל במים מזוקקים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. אחסן את הכדורים הקבועים ב- PBS עד לשימוש למדידת VSM או הדמיית TEM. שלב קיבוע זה עוצר את כל התהליכים הביולוגיים ומאפשר שימור ארוך טווח.
4. כימות של חלקיקים מגנטיים בתמיסה ובצלולו באמצעות מגנטומטר מדגם רוטט (VSM)
- מקם נפח נתון של פתרון חלקיקים מגנטיים (מקסימום 10 μL) או תא יחיד-ספרואיד לתוך מחזיק המדגם שתוכנן במיוחד כדי להתאים VSM.
- הכנס את הדגימה ל- VSM וסרוק להיסט לדוגמה. מקם את המדגם במיקום המתאים למקסימום המגנטיזציה.
- בצע את המדידה הראשונה בשדה מגנטי נמוך (בין -1500 Oe ו- +1500 Oe) בקצב של 20 Oe/s.
- בצע מדידה שנייה בשדה מגנטי גבוה (בין -30 000 Oe ו- +30 000 Oe) בקצב של 200 Oe/s.
5. ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM)
- עבור פתרונות חלקיקים, להפקיד 10 μL של הפתרון מימית על רשת נחושת מצופה פחמן ולתת לו להתייבש בטמפרטורת החדר.
- עבור חלקיקים מופנמים בתאים, בניגוד תא קבוע ספרואידים עם תמצית תה Oolong (OTE) ב 0.5% מדולל 0.1 M מאגר cacodylate, פוסט לתקן עם 1% אוסמיום tetroxide המכיל 1.5% אשלגן ציאנופרט ולאחר מכן להתייבש באמבטיות אתנול מדורגים, כלול Epon. פורסים אולטרה-קטעים של 70 ננומטר ומפקידים אותם ברשתות קופר.
- קח תמונות באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים ב 80 kV עם הגדלה מ 1k לתצפית של תאים שלמים ל 40k לתצפית של תאים אנדוסומליים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות סינתזה בסיוע מיקרוגל, חלקיקים מגנטיים עם מונודיספרס 8.8 ± 2.5 ננומטר גודל הליבה מיוצרים מצופים או ציטראט או PAA (איור 1A). תאי גזע אז הם דגירה עם חלקיקים אלה מפוזרים במדיום תרבות בריכוז נתון במשך 30 דקות, וכתוצאה מכך אנדוציטוזיס שלהם כליאה בתוך אנדוזומים הסלולר (איור 1B). תאי הגזע המגנטיים מושעים לאחר מכן במדיום, צנטריפוגות, וכדור התא שנוצר מתורבת עד 21 ימים (איור 1C). הכדורואידים המתקבלים קבועים, כגון עצירת תהליכים ביולוגיים, ונשמרים ב- PBS עד שנמדדים באמצעות VSM.
ראשית, הרגע המגנטי של פתרון הננו-חלקיקים נמדד באמצעות VSM: 10 μL של פיזור מימית ננו-חלקיקים המכיל 7 מיקרוגרם ברזל נמדד, והעקומה המתקבלת מוצגת באיור 2A. בשל נוכחותם של מים בתמיסה זו, ועל מחזיק המדגם, אות diamagnetic נלכד בנוסף לאות superparamagnetic של חלקיקים. ניתן למדוד קבוע דיאמגנטי (Mdia)המתאים לשיפוע החלק השני של העקומה, כפי שמוצג באיור 2A, וקבוע זה ניתן להפחתה כגון קבלת הרגע המגנטי של הננו-חלקיקים בלבד(מדגם M = M - Mdia). לאחר מכן ניתן לחלץ את מגנטיזציית הרוויה של הננו-חלקיקים (Ms); זה מתאים 518 μemu עבור פיזור מימית, כלומר הפתרון הוא ב 74 אמו / גרם של ברזל (פה) המתאים 52 אמו / גרם של חלקיקים (Fe3O4).
הרגע המגנטי של ספירואידים של תאים ניתן להשיג באופן דומה. במקרה זה, תא-ספרואיד (המורכב מ- 200,000 תאים) מוכנס למחזיק הדגימה, ממוקם ב- VSM ונמדד (איור 2B). ערכי הרגע המגנטי המתקבלים כאן נמוכים בהרבה מאלה של פתרון הננו-חלקיקים הראשוני; עם זאת, הם נשארים בטווח הגילוי. מגנטיזציה רוויה של מדגם מסוים זה הוא של 69 μemu. חוץ מזה, ספרואיד זה מכיל 1.3 מיקרוגרם של חלקיקים (6.7 pg של חלקיקים לכל תא), עולה בקנה אחד עם ערך הרוויה ב 52 emu / gFe3O4. ערך זה יכול לשמש אפוא כדי לקבוע את כמות חלקיקים בדגימות הסלולר. באיור 2C, ספרואידים המתאימים לתאים המסומנים בשלושה ריכוזים של חלקיקים מצופים ציטראט נמדדים יום אחד לאחר התיוג. התוצאות מראות בבירור כי ספיגת הננו-חלקיקים תלויה בריכוז הדגירה, עם ריכוזים של 0.125, 0.25 ו-0.5 מ"מ המובילים לספיגות של 0.3, 0.7 ו-1.3 מיקרוגרם ברזל לספרואיד, כלומר 1.3, 3,3 ו-6.7 pg של ברזל לכל, בהתאמה.
תשומת לב הובאה על החשיבות של ציפוי פני השטח, אשר אינטראקציה ישירה עם הסביבה הביולוגית20. כאן יוצרו שני ציפויים: ציפוי ציטראט, המשמש בדרך כלל ליישומים ביו-רפואיים, וציפוי PAA, עם מספר גבוה יותר של פונקציות כלאט. תאי גזע מסומנים בשני סוגים אלה של חלקיקים וצנטריפוגות כגון יצירת גלולת תא שהופכת לאחר מכן לספרואיד תא מגובש(איור 3A). מגנטיות של ספירואידים תאים אלה נמדדת באמצעות VSM ביום הראשון וביום 21(איור 3B ואיור 3C). התוצאות ממחישות ירידה במגנטיות ב-21 ימי התרבות, מה שמצביע על התכלית הננו-חלקיקים, השפלה זו חשובה יותר עבור הננו-חלקיקים מצופי הציטראט (איור 3B) מאשר הננו-חלקיקים מצופי ה-PAA(איור 3C). תמונות TEM מאשרות את השפלת הננו-חלקיקים ומראות את המראה של נקודות אפורות בהירות קטנות יותר (בגודל 6 ננומטר), האופייניות לפריטין עמוסות ברזל. חלקיקים מסוימים שנותרו שלמים ניתן לראות גם, במיוחד עם ציפוי PAA.
איור 1: סינתזה בסיוע מיקרוגל של תחמוצת ברזל (Fe3O4) חלקיקים, הפנמתם בתאי גזע והתרבות הבאה של התאים כספרואידים. (A)סכמטי של השלבים השונים של סינתזת הננו-חלקיקים. ראשית, הליבה מסונתזת באמצעות הליך ג'ל סול לא מימי. מולקולת הציפוי, ציטראט (Cit) או חומצה פוליאקרילית (PAA), מושתלת לאחר מכן על פני ליבת תחמוצת הברזל. תמונת TEM מייצגת מציגה את הננו-חלקיקים המסונתזים עם ציפוי ציטראט. (B)סכמטי של הפנמת הננו-חלקיקים בתוך תא הגזע, המציגה את הננו-חלקיקים המוגבלים באנדוזומים בעת הפנמה. תמונות TEM מייצג גם להראות את חלקיקי ציטראט ו PAA מצופה בתוך התאים, מוגבל אנדוזומים. (C)סכמטי של היווצרות תאי גזע-ספרואידים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מדידת הרגע המגנטי של הדגימות באמצעות VSM. (A)10 μL של חלקיקים מפוזרים בתמיסה מימית נמדדים באמצעות VSM. האות המתקבל מייצג את הרגע המגנטי של פתרון ננו-חלקיקים זה בתפקוד השדה המגנטי (B). ניתן למדוד את הדיאמנטיזם המגיע מנוכחות מים ואת מחזיק המדגם כפי שהוא מתאים את השיפוע של החלק השני של העקומה מופחת כגון קבלת הרגע המגנטי של חלקיקים בלבד. לאחר מכן ניתן לקבוע את הרגע המגנטי ברוויה (Ms). (B)הרגע המגנטי של ספירואידים של תאים ניתן להשיג באופן דומה; במקרה זה תא יחיד-ספרואיד נמדד בפרק זמן נתון. (C)עקומות של ספרואידים המתאימים לתאים המסומנים בננו-חלקיקים מצופים ציטראט בשלושה ריכוזים עצמאיים של 0.125 מ"מ (כתום), 0.25 מ"מ (אפור) ו-0.5 מ"מ (כחול). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כימות של השפלה של ננו-חלקיקים מגנטיים בצלולו באמצעות VSM. (A) על תיוג תאים עם חלקיקים מגנטיים, גלולת תא נוצרת על ידי צנטריפוגה (יום 0). לאחר מכן התאים יוצרים מבנה מגולען וכתוצאה מכך קל לטפל בתא-ספרואיד שניתן לשמור בתרבות ללא אובדן תאים לפרקי זמן ממושכים (חודשים). (B, C) להלן, שני סוגים של חלקיקים מגנטיים, מצופים ציטראט (B) או PAA (C), מופנמים בתאי גזע והתאים מתורבתים כספרואידים עד 21 ימים. מגנטיות של ספרואידים בתרבית במשך יום אחד (עקומות כתומות) ו 21 ימים (עקומות אפורות) נמדדים עם VSM, עם ירידה מגנטיות המציין השפלה של חלקיקים. תמונות TEM מייצג שצולמו ביום 21 להראות נקודות אפורות בהירות על 6 ננומטר הוא גודל בתוך אנדוזומים ואת הציטופלסמה של התאים, גודל אופייני וצורה של פריטין, חלבון אחסון ברזל (חצים שחורים). כמה חלקיקים שלמים ניתן לראות גם, בעיקר עבור חלקיקים מצופים PAA (חץ חום). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
באמצעות סינתזה מהירה ויעילה המבוססת על מיקרוגל, ניתן לסנתז בקלות חלקיקים מגנטיים, עם גודל מבוקר, ומצופים עוד יותר במולקולות נתונות. צעד קריטי הוא למלא את מלח הברזל ואת אלכוהול בנזיל תחת ואקום כדי לשמור על פיזור קטן בגודל. אלכוהול בנזיל פועל הן כמו ממס ו ligand באותו זמן המאפשר ישירות להשיג תחמוצת ברזל חשופה מכויל ללא צורך ligands נוספים. לאחר העברת חלקיקים במים ניתן לציפוי קל של חלקיקים מגנטיים חשופים במגוון גדול של ליגנדים. ציפוי זה מעניק תכונות אינטראקציה בין-חלקיקים וננו-חלקיקים שיכולים להשפיע על הפנמת התאים שלהם, פרמטר שיש לשלוט בו בחוזקה שכן נדרשת הפנמה מינימלית עבור יישומים ביו-רפואיים בעוד הפנמה גבוהה מדי עלולה להזיק לתאים ופוטנציאלית לגרום לאירועים ציטוטוקסיים31. מגנטומטריה היא כלי רב עוצמה להערכת הפנמה זו, כמו גם את גורלם של חלקיקים מגנטיים בצלולו. עם שילוב של חלקיקים מגנטיים לתוך תאי גזע, spheroids יכול להיווצר באמצעות צנטריפוגה פשוטה ואחריו תרבות במדיום שעוצר את התפשטות התאים ומניע ייצור מטריצה חוץ תאית. התאים הופכים מאוד מגובשים ומתחילים ליצור רקמה. לאחר מכן קל מאוד לטפל בספרואידים וניתן לתרבת אותם לפרקי זמן ממושכים (חודשים) המאפשרים מעקב ארוך טווח אחר גורלם של חלקיקים מגנטיים בסביבה ביולוגית. על ידי עצירת חלוקת התא, אין דילול של חלקיקים מאם לתא בת; יתר על כן, אומת כי, עם מודל זה תא ספרואיד, אין בריחה ברזל על חודש של תרבות21,22,23. כתוצאה מכך, ירידה בערכי המגנטיות יכולה להתאים רק להשפלה של הננו-חלקיקים ולא לגהץ המיוצא מהתאים.
מגנטיות של ספירואידים התא נמדד כאן באמצעות VSM המספק כימות מהיר ומדויק. שיטות אחרות נחקרו גם כדי למדוד מגנטיות הסלולר, כגון באמצעות התקן ממשק מוליך על (SQUID), מכונה בדרך כלל מדויק יותר מאשר VSM עם רגישות סביב10-7 אמו לעומת 10-6 אמו עבור VSM, אבל העלות התפעולית גבוהה יותר32. הרגישות של VSM המאפשר מדידות של מינון ברזל מגנטי נחות ל 2 pg / cell במערך הניסוי הוא כאן מדויק מספיק כמו מינונים ברזל נחותים 2 pg / תא יהיה נמוך מדי עבור היישומים המיועדים, כגון משיכה לתא לכיוון מגנטי להנחיית תאים למטרות הנדסת רקמות. הן VSM והן מגנטומטריה SQUID, בנוסף לאפשר כימות של מגנטיות התא, יכול לתת פרטים נוספים על התכונות של חלקיקים. על ידי ניתוח של האות המתקבל, ניתן לנכות את גודל הננו-חלקיקים22,23 וגם מושג כללי של התכונות המגנטיות שלהם ניתן להשיג, היסטרזיס וכפייה של ננו יכולים למשל להתגלות. גישות מגנטומטריה חלופיות קיימות גם כן, כגון מגנטופורזיס המורכבת במדידת המהירות של תאים בודדים כאשר נמשכים לכיוון מגנט והמגנטיות של תאים בודדים משערת33,34. את המגנטיות ברמת התא הבודד ניתן להשיג בדרך זו; עם זאת, לא ניתן לקבוע תכונות ננו-חלקיקים נוספות. בנוסף, חיישן מגנטי קטן המספק אות פרופורציונלי למגנטיות המדגם שימש לאחרונה עם מודל ספירואיד תא דומה. חיישן מגנטי זה איפשר מעקב אחר התכלית חלקיקים מגנטיים בזמן אמת, ברציפות, מעל 7 ימים35. עם זאת, האות של חיישן מגנטי זה לא יכול להיות מתורגם ישירות לרגע מגנטי כפי שהוא תלוי בגודל של חלקיקים. מסיבה זו, עקומת כיול צריך להתבצע עבור כל עיצוב חלקיקים, עקומה שניתן לממש באמצעות VSM.
מדידות המבוצעות בזאת עם VSM מדגימות השפלה הדרגתית של הננו-חלקיקים המגנטיים בסביבה התאית, המצוינת על ידי ירידה במגנטיות. הם גם מעידים כי אותה ליבה מצופה מולקולות שונות מתפרקת בקצב משתנה בהתאם לציפוי. כאשר משווים PAA וציפוי ציטראט, PAA מובילה להגנה גבוהה יותר על הליבה מפני השפלה, ככל הנראה בשל העיגון החזק שלה לליבה המגנטית20. גורלם של חלקיקים מגנטיים בסביבה תאית מוערך על ספרואידים של תאים; עם זאת, השיטה אינה מוגבלת אליו. אכן, זה יכול להיות extrapolated כדי השעיות תאים, אשר כבר שימש כדי להעריך את ההשפעה של בידול תאי גזע על גורלם של חלקיקים22. הוא גילה כי, בהתאם למסלול הבידול, הננו-חלקיקים המגנטיים מעובדים באופן שונה על ידי התאים, כאשר במקרים מסוימים, הניאו-התגבשות הברזל עם התפרקותו. VSM מגנטומטריה ולכן הוא כלי שימושי כדי להמשיך לחקור את ההשפעה של ננו חלקיקים ותכונות תא על עיבוד תאיים של תחמוצת ברזל ננו אובייקטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי האיחוד האירופי (ERC-2014-CoG פרויקט MaTissE #648779). המחברים רוצים להכיר פלטפורמת אפיונים פיזיו-כימיים CNanoMat של אוניברסיטת פריז 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al. Biotransformations of magnetic nanoparticles in the body. Nano Today. 11 (3), 280-284 (2016).
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
