Summary
Наночастицы оксида железа синтезируются с помощью неакеозной процедуры геля sol и покрываются анионическими короткими молекулами или полимером. Использование магнитометрии для мониторинга включения и биотрансформации магнитных наночастиц внутри стволовых клеток человека демонстрируется с помощью вибрирующего образца магнитометра (VSM).
Abstract
Магнитные наночастицы, сделанные из оксида железа, представляют особый интерес для широкого спектра биомедицинских применений, для которых они часто интернализированы в клетках, а затем оставлены внутри. Одна из задач заключается в оценке их судьбы во внутриклеточной среде с помощью надежных и точных методологий. В этом случае мы вводим использование вибрирующего образца магнитометра (VSM) для точной количественной оценки целостности магнитных наночастиц в клетках путем измерения их магнитного момента. Стволовые клетки сначала помечены двумя типами магнитных наночастиц; наночастицы имеют то же ядро производится через быстрый и эффективный микроволновой основе неакеозного синтеза сол гель и отличаются по своему покрытию: широко используется молекула лимонной кислоты по сравнению с полиакриновой кислоты. Формирование 3D-сфероидов достигается с помощью центрифугации и магнитный момент этих сфероидов измеряется в разное время с ПОМОЩЬю VSM. Полученный момент является прямым отпечатком пальца целостности наночастиц, с уменьшением значений, указывающих на деградацию наночастиц. Для обоих наночастиц, магнитный момент уменьшается с течением времени культуры выявление их биодеградации. Защитный эффект полиакрилиновой кислоты покрытие также показано, по сравнению с лимонной кислоты.
Introduction
Существует повышенный интерес к магнитным особенностям наночастиц оксида железа для широкого спектра биомедицинских применений. Их реакция на магнитный резонанс делает их надежными контрастными агентами для магнитно-резонансной томографии (МРТ), преимущество в регенеративной медицине, где клетки, помеченные магнитными наночастицами, могут быть отслежены in vivoпосле имплантации 1. Используя магнитные поля, клетки также могут быть направлены на расстоянии; Таким образом, клеточныесфероиды 2,3,кольца 4, илилисты 5 могут быть разработаны магнитно, а также удаленностимулировали 6, актив в развитии эшафот-свободных тканей. Диапазон возможностей для этих наночастиц также включает в себя системыдоставки лекарств 7,8 и магнитного и фотоиндицированных гипертермальноголечения, чтобы убить раковые клетки 9,10,11. Для всех этих применений наночастицы интегрируются в биологическую среду либо путем внутривенных инъекций, либо путем прямой интернализации клеток, а затем остаются внутри, что ставит под сомнение их внутриклеточную судьбу.
Анализы In vivo передают общее понимание судьбы наночастиц в организме: при инъекциях в кровоток они впервые захвачены в основном макрофагами печени (клетки Купфера), селезенкой и костным мозгом, постепенно деградируют, и присоединяютсяк железному бассейну организма 12,13,14,15,16,17,18,19. Качественные наблюдения возможны только благодаря циркуляции наночастиц по всему организму. Как правило, передача электронной микроскопии (TEM) может быть использована для непосредственного наблюдения за наночастицами и наличие железа в органах может быть определено через дозировку. Совсем недавно, их судьба была оценена непосредственно на пул клеток, то есть в тесной цепи без железного побега, что позволяет количественное измерение их биотрансформациина клеточном уровне 20,21,22. Такие измерения возможны с помощью анализа магнитных свойств наночастиц, которые тесно связаны с их структурной целостностью. Вибрирующий образец магнитометрии (VSM) является методом, где образец периодически вибрирует так, что катушка-измерение потока индуцированных обеспечивает магнитный момент образца на прикладном магнитном поле. Такое синхронное обнаружение позволяет быстро измерять, что является активом для определения магнитных моментов большого количестваобразцов 20,21,22,23. Макроскопическая магнитная подпись, полученная VSM, дает количественный обзор всего биологического образца, непосредственно связанного с размером и структурой наночастиц. В частности, он обеспечивает магнитный момент насыщения (выраженный в эму) образцов, что является прямой количественной оценкой количества магнитных наночастиц, присутствующих в образце, соответственно их специфическим магнитным свойствам.
Было показано, что внутриклеточная обработка магнитных наночастиц тесно связана с их структурными особенностями20. Эти функции можно контролировать с помощью оптимальных протоколов синтеза. Каждый протокол предоставляет преимущества и ограничения. Наночастицы оксида железа обычно синтезируются в акальных растворах с помощью совокупления ионовжелеза 24. Для преодоления ограничений полидисперсности размеров наночастиц были разработаны другие методы синтеза, такие как методы полиол-опосредованногосол-геля. Неакеальные подходы при термической разложении приводят к выработке очень хорошо откалиброванных наночастицоксида железа 26. Тем не менее, использование огромного количества сурфактантов, таких как олейламин или олеиновая кислота, усложняет их функционализацию и передачу воды для биомедицинских применений. По этой причине, мы синтезируем такие магнитные наночастицы через неакеозный маршрут сол гель, ведущий к высокой кристалличность, чистота и воспроизводимость27. Этот протокол производит хорошо контролируемые наночастицы размера, которые могут быть настроены через изменение температуры28. Тем не менее, микроволновая печь с помощью не-aqueous сол-гель маршрут имеет верхний предел размера полученных наночастиц около 12 нм. Эта процедура не будет адаптирована для применения с использованием ферромагнитных частиц при комнатной температуре. В дополнение к синтезу ядра, еще одной главной особенностью, которая будет рассмотрена является покрытие. Лежа на поверхности наночастицы, покрытие выступает в качестве якорной молекулы, помогая целенаправленной интернализации наночастиц, или он может защитить наночастицы от деградации. Так как бензиловый спирт действует как источник кислорода и лиганд в то же время, голые наночастицы производятся без необходимости дополнительных сурфактантов или лигандов. Затем наночастицы легко всплываются после синтеза без процесса обмена сурфактантами.
При этом оцениваются два типа наночастиц, которые обладают одним и тем же ядром и отличаются по покрытию. Ядро синтезируется с использованием быстрой и высокоэффективной микроволновой техники. Два покрытия по сравнению состоят из лимонной кислоты, один из наиболее часто используемых в качестве покрытияагента в биомедицинских приложений 29,30, и полиакрилиновой кислоты (PAA), полимерное покрытие с большим количеством хелатирующих функций. Измерения магнитометрии VSM затем используются сначала для количественной оценки поглощения наночастиц клетками, а затем в качестве прямой оценки структурной целостности наночастиц при интернализации стволовых клеток. Результаты показывают, что концентрация инкубации влияет на поглощение наночастиц и что покрытие влияет на их деградацию, при этом большое количество якорных молекул ПАА защищает ядро от деградации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Синтез магнитных наночастиц
- Синтез ядра — микроволновая печь
- Растворите 400 мг ацетилацетоната железа (99,9%) в 10 мл бензилового спирта (BA, 99.8%) в рамках моноволнового стеклянного флакона 30 мл.
- Увеличьте температуру подвески с 25 до 250 градусов по Цельсию за 20 минут (со скоростью 11,25 градуса по Цельсию/мин) и поддерживайте ее при температуре 250 градусов по Цельсию в течение 30 минут с помощью микроволнового реактора.
- Передача полученных наночастиц, подвешенных в бензиловом спирте, в стеклянный флакон и отделяйте наночастицы с помощью неодимийного магнита в течение 30 минут.
- Вымойте осадок в предыдущем стеклянном флаконе 100 мл с 10 мл дихлорметана, 1 М гидроксида натрия, этанола, рН 7 воды (три раза) с помощью неодимового магнита в течение 5 минут на каждый шаг для гранулизации наночастиц и удаления супернатанта.
- Отрегулируйте подвеску наночастиц в воде до рН 2 с использованием 1 М соляной кислоты, а затем центрифугу в 100 kDa ультрацентрифуговых фильтров на 2200 х г в течение 10 мин.
- Удалить фильтрат, добавить 12 мл 10-2 М соляной кислоты в раствор наночастиц и центрифуги в 100 кДа ультрацентрифуговых фильтров при 2200 х г в течение 10 мин (три раза). Затем разбавить раствор наночастиц в пределах 10 мл 10-2 М соляной кислоты перед покрытием.
- Покрытие
- Разбавить 175 мг лимонной кислоты и полиакриновой кислоты в воде при рН 2 в стеклянном флаконе 100 мл и отрегулировать рН до 2 с раствором соляной кислоты 1 м.
- Добавьте 10 мл наночастиц в раствор молекулы покрытия, соответствующий соотношению массы 5 между молекулой покрытия и наночастицами. Агитировать за 2 ч при магнитном перемешивании при комнатной температуре.
- После реакции отрегулируйте рН до 7 с 1 М гидроксидом натрия.
- Центрифуза раствора наночастиц 3 раза с деионизированной (DI) водой в 100 kDa ультрацентрифугических фильтров при 2200 х г в течение 10 мин; удалить фильтрат и разбавить раствор наночастиц в 12 мл воды DI.
2. Культура и магнитная маркировка стволовых клеток
- Культура человеческих мезенхимальных стволовых клеток (MSC) в полной Мезенхимальной стволовой клетки роста среднего (MSCGM) при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2. Когда клетки находятся на 90% слияния, добавить 10 мл трипсина-ЭДТА предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию на 150 см2 колбы и оставить на 2-3 минуты, чтобы отделить клетки.
- Чтобы узнать, когда клетки отсоединяются, наблюдайте за ними с помощью ярко-полевого микроскопа. Переусердуйте отдельные клетки в MSCGM и разделите их на четыре колбы 150 см2. Увеличь клетки таким образом до прохождения 4 до 5.
- Подготовка раствора магнитных наночастиц для маркировки клеток: разогнать выбранную концентрацию наночастиц оксида железа в сыворотке свободного Розуэлл Парк Мемориальный институт среды (RMPI-1640) без глутамина. RPMI используется для инкубации наночастиц (и связанных с ними шагов полоскания), поскольку он имеет более низкую ионическую прочность, чем DMEM, и лучше предотвращает события агрегации наночастиц.
- Когда клетки находятся на проходе 4 или 5 и 90% стечения, удалить MSCGM среды, промыть клетки сыворотки бесплатно RPMI (без глутамина) и добавить 10 мл раствора наночастиц оксида железа на 150см 2 культуры колбу, которая является минимальным объемом, необходимым для покрытия всех клеток.
- Инкубировать при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2 в течение 30 минут, а затем отказаться от раствора наночастиц. Вымойте один раз с сывороткой бесплатно RPMI-1640 (без глутамина) и инкубировать с Dulbecco Модифицированный Eagle Medium (DMEM) дополнен 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин (25 мл на 150см 2 колбы) на ночь при 37 градусов по Цельсию и 5% CO2, чтобы обеспечить полную интернализации наночастиц.
3. Формирование сфероидов стволовых клеток
- Свежеприготовленная среда клеточной сфероидной культуры, состоящая из высокой глюкозы DMEM с L-глутамином, дополненным 50 L-аскорбиновой кислотой 2-фосфат, 0,1 МКМ дексаметазон, 1 мМ пируват натрия, 0,35 мМ Л-пролин и 1% универсальная культурная добавка, содержащая инсулин, люсырин человека и селеновую кислоту (ITS-Premix).
- Отсоедините магнитные MSCs, добавив 10 мл 0,05% трипсина-ЭДТА предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию на 150 см2 колбы в течение 2-3 минут. Когда клетки отсоединяются, немедленно инактивировать трипсин, добавив 1/3 объема DMEM дополняется 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин предварительно нагревается при 37 градусов по Цельсию.
- Центрифуга диссоциированных клеток на 260 х г в течение 5 мин, аспирировать средства массовой информации и повторно приостановить клетки в небольшом объеме (менее 1 мл на 150 см2 колбы) клеточной сфероидной культуры среды, такие как наличие 200000 клеток примерно в 50 йл среды. Подсчитайте номер клетки с помощью гемоцитометра и при необходимости отрегулируйте громкость.
- Добавьте 1 мл свежеприготовленной клеточной среды культуры в стерильную трубку конической центрифуги объемом 15 мл и добавьте объем повторного раствора, соответствующего 200 000 клеток.
- Центрифуга этих магнитно помеченных клеток на 180 х г в течение 3 мин, таких как формирование гранулы клетки в нижней части трубки и сохранить супернатант, который является средой клеточной культуры.
- Слегка откройте трубки, чтобы позволить обмен воздуха и инкубировать при 37 градусов по Цельсию с 5% CO2 на срок до 21 дней, культурное время, вдоль которого клетки образуют сплоченную 3D структуру, что приводит к полностью сформированной сфероида. Изменение среды два раза в неделю.
- В данные дни, мыть сфероиды дважды с буфером какодилата из 0,2 М какодилата разбавленного в деминерализованной воде и исправить их с помощью 2% глутаралдегид в 0,1 M какодилат буфера разбавленной в дистиллированной воде в течение 30 мин при комнатной температуре. Храните фиксированные сфероиды в PBS до тех пор, пока не будут использованы для измерения VSM или изображения TEM. Этот этап фиксации останавливает все биологические процессы и позволяет долгое время консервацию.
4. Количественная оценка магнитных наночастиц в растворе и в целлюлозе с использованием вибрирующего образца магнитометра (VSM)
- Поместите либо данный объем раствора магнитных наночастиц (максимум 10 МКЛ), либо один клеточный сфероид в держатель образца, специально разработанный для вписан в VSM.
- Вставьте образец в VSM и сканируйте для смещения выборки. Поместите образец в положение, соответствующее максимуму намагничения.
- Выполните первое измерение на низком магнитном поле (между -1500 Oe и 1500 Oe) со скоростью 20 Oe/s.
- Выполните второе измерение на высоком магнитном поле (между -30 000 Oe и 30 000 Oe) со скоростью 200 Oe/s.
5. Анализ электронной микроскопии передачи (TEM)
- Для растворов наночастиц, депозит 10 йл аквозного раствора на углеродного покрытия медной сетки и дайте ему высохнуть при комнатной температуре.
- Для наночастиц, интернализированных в клетках, контраст фиксированных клеточных сфероидов с экстрактом чая Улун (OTE) на 0,5% разбавленной в 0,1 М какодилат буфера, пост исправить с 1% осмия тетроксида, содержащего 1,5% калия цианоферрат, а затем обезвоживать в градуированных ванн этанола, включенных в Epon. Нарежьте ультрасекции 70 нм и сдайте их на сетки Cooper.
- Сделайте снимки с помощью электронного микроскопа на 80 кВ с увеличением от 1k для наблюдения целых клеток до 40k для наблюдения эндосомных отсеков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя синтез с помощью микроволновой печи, магнитные наночастицы с монодисперсом 8,8 ± размер ядра 2,5 нм производятся и покрываются либо цитратом, либо ПАА(рисунок 1А). Стволовые клетки затем инкубируется с этими наночастицами, рассеянными в среде культуры при данной концентрации в течение 30 минут, что приводит к их эндоцитозу и заключению в клеточных эндосомах(рисунок 1B). Магнитные стволовые клетки затем подвешив в среде, центрифугированные, и ячейки гранулы формируется культури до 21 дней(рисунок 1C). Полученные сфероиды фиксируются, такие как остановка биологических процессов, и хранятся в PBS до тех пор, пока не будут измерены с помощью VSM.
Во-первых, магнитный момент раствора наночастиц измеряется с помощью VSM: измеряется 10 МКЛ наночастиц, содержащих 7 мкг железа, а полученная кривая отображается на рисунке 2A. Благодаря наличию воды в этом растворе, а также держателю образца, в дополнение к суперпарамагнитный сигнал наночастиц засовывается диамагнитный сигнал. Диамагнитная константа (Mdia), соответствующая наклону второй части кривой, может быть измерена, как показано на рисунке 2A, и эта константа может быть вычтена, например, получение магнитного момента только наночастиц (Mобразец M - Mdia). Намагничивность насыщения наночастиц (Ms)может быть извлечена; он соответствует 518 зему для аквеозной дисперсии, что означает, что раствор находится на уровне 74 эму/г железа (Fe), что соответствует 52 эму/г наночастиц (Fe3O4).
Магнитный момент сфероидов клеток может быть получен аналогичным образом. В этом случае в держатель образца вставляется клеточный сфероид (из 200 000 клеток), помещенный в VSM и измеренный(рисунок 2B). Полученные значения магнитного момента здесь намного ниже, чем значения исходного раствора наночастиц; однако они остаются в пределах диапазона обнаружения. Намагничиесть насыщения этого конкретного образца составляет 69 заму. Кроме того, этот сфероид содержит 1,3 мкг наночастиц (6,7 пг наночастиц на клетку), что соответствует значению насыщения на уровне 52 эму/гFe3O4. Таким образом, это значение может быть использовано для определения количества наночастиц в клеточных образцах. На рисунке 2Cсфероиды, соответствующие клеткам, помеченным тремя концентрациями наночастиц с цитратовым покрытием, измеряются на следующий день после маркировки. Результаты ясно показывают, что поглощение наночастиц зависит от концентрации инкубации, с концентрациями 0,125, 0,25 и 0,5 мм, что приводит к поглощению 0,3, 0,7 и 1,3 г железа на сфероид, что означает 1,3, 3,3 и 6,7 пг железа на клетку, соответственно.
Внимание было привлечено к важности поверхностного покрытия, которое непосредственно взаимодействует с биологической средой20. Здесь были произведены два покрытия: цитратовое покрытие, обычно используемое для биомедицинских применений, и покрытие PAA с большим количеством хелатирующих функций. Стволовые клетки помечены этими двумя типами наночастиц и центрифугированных, таких как формирование клеточной гранулы, которая затем становится сплоченным клеточным сфероидом(рисунок 3A). Магнетизм этих клеточных сфероидов измеряется с помощью VSM в день 1 и день 21(рисунок 3B и рисунок 3C). Результаты демонстрируют снижение магнетизма на 21 дней культуры, что свидетельствует о биодеградации наночастиц, эта деградация является более важным для цитрат покрытием наночастиц (рисунок 3B), чем ПАА покрытием из них (Рисунок 3C). Изображения TEM подтверждают деградацию наночастиц и показывают появление меньших (6 нм по размеру) светло-серых точек, типичных для ферритина, загруженного железом. Некоторые наночастицы, оставшиеся нетронутыми также могут наблюдаться, особенно с покрытием PAA.
Рисунок 1: Микроволновый синтезоксида железа(Fe 3 O4) наночастиц, их интернализации в стволовых клетках и последующей культуры клеток как сфероидов. (A)Схема различных этапов синтеза наночастиц. Во-первых, ядро синтезируется с помощью не-aqueous sol гель процедуры. Молекула покрытия, либо цитрат (Cit) или полиакриливная кислота (PAA), затем прививается на поверхности ядра оксида железа. На репрезентативном изображении TEM показаны синтезированные наночастицы с цитратовым покрытием. (B) Схема интернализации наночастиц в стволовой клетке, показывающая наночастицы, ограниченные в эндосомах при интернализации. Представитель TEM изображения также показывают цитрат и PAA покрытием наночастиц внутри клеток, ограничивается в эндосомах. (C)Схема образования стволовых клеток сфероидов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Измерение магнитного момента образцов с помощью VSM. (A) 10 МЛ наночастиц, рассеянных в aqueous растворе измеряются с помощью VSM. Полученный сигнал представляет собой магнитный момент этого раствора наночастиц в функции магнитного поля (B). Диамагнетизм, поступающий от присутствия воды и держателя образца, может быть измерен, поскольку он соответствует наклону второй части кривой и вычитается, например, получение магнитного момента только наночастиц. Магнитный момент при насыщении (Ms)может быть определен. (B)Магнитный момент сфероидов клеток может быть получен аналогичным образом; В этом случае одноклеточный сфероид измеряется в данный период времени. (C)Кривые сфероидов, соответствующие клеткам, помеченным наночастицами с цитратовым покрытием в трех независимых концентрациях 0,125 мМ (оранжевый), 0,25 мм (серый) и 0,5 мМ (синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Количественная оценка деградации магнитных наночастиц в целлюлозе через VSM. (A)После маркировки клеток магнитными наночастицами, гранулы клетки образуются центрифугой (день 0). Клетки затем образуют сплоченную структуру, в результате чего легко обрабатывать клеточный сфероид, который может храниться в культуре без потери клеток в течение длительных периодов времени (месяцев). (B, C) В этом случае два типа магнитных наночастиц, покрытых цитратом(B) или PAA(C), интернализированы в стволовых клетках и клетки культурированы как сфероиды на срок до 21 дней. Магнетизм сфероидов, культурированных в течение 1 дня (оранжевые кривые) и 21 дней (серые кривые) измеряются с помощью ВСМ, при этом снижение магнетизма указывает на деградацию наночастиц. Представитель TEM изображения, сделанные в день 21 показывают светло-серые точки около 6 нм размер в эндосомах и цитоплазмы клеток, типичный размер и форма ферритина, белка хранения железа (черные стрелки). Некоторые нетронутые наночастицы также можно наблюдать, в основном для наночастиц с покрытием ПАА (коричневая стрелка). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Используя быстрый и эффективный синтез на основе микроволновой печи, магнитные наночастицы могут быть легко синтезированы, с контролируемым размером, и далее покрыты данной молекулы. Важным шагом является запас железной соли и бензилового спирта в вакууме, чтобы сохранить небольшой дисперсии в размерах. Бензиловый спирт действует как растворитель и лиганд в то же время позволяет непосредственно получить откалиброванный голый оксид железа без необходимости дополнительных лигандов. После переноса наночастиц в воду голые магнитные наночастицы могут быть легко покрыты большим разнообразием лигандов. Это покрытие придает межночастицы и наночастицы взаимодействующих свойств, которые могут повлиять на их клеточной интернализации, параметр, который должен быть жестко контролируется как минимальная интернализации требуется для биомедицинских приложений в то время как слишком высокая интернализации может быть вредным для клеток и потенциально возникают цитотоксическиесобытия 31. Магнитометрия является мощным инструментом для оценки этой интернализации, а также судьбы магнитных наночастиц в целлюлозе. После включения магнитных наночастиц в стволовые клетки, сфероиды могут быть сформированы с помощью простой центрифугации следуют культуры в среде, которая останавливает распространение клеток и диски внеклеточной матрицы производства. Клетки становятся очень сплоченными и начинают создавать ткани. Сфероиды, то очень проста в обращении и может быть культурно в течение длительных периодов времени (месяцев), что позволяет для долгосрочного отслеживания судьбы магнитных наночастиц в биологической среде. Остановив деление клеток, нет разбавления наночастиц от клетки матери к дочери; кроме того, было подтверждено, что с этой клеточной сфероидной модели, нет железа избежать в течениемесяца культуры 21,22,23. Как следствие, снижение значения магнетизма может соответствовать только деградации наночастиц, а не к вывозу железа из клеток.
Магнетизм клеточных сфероидов измеряется с помощью VSM, что обеспечивает быструю и точную количественную оценку. Другие методы были также изучены для измерения клеточного магнетизма, такие как использование сверхпроводящих интерфейс устройства (SQUID), машина, как правило, более точным, чем VSM с чувствительностью около 10-7 эму по сравнению с 10-6 эму для VSM, но эксплуатационныерасходы выше 32. Чувствительность VSM позволяет измерения дозы магнитного железа уступает 2 pg/cell в экспериментальной установке здесь достаточно точны, как железо дозы ниже 2 пг / клетка будет слишком низким для направленных приложений, таких как притяжение клеток к магнитным для клеточного наведения и тканей инженерных целей. Магнитометрия VSM и SQUID, в дополнение к количественной оценке клеточного магнетизма, может дать дополнительные сведения об особенностях наночастиц. При анализе полученного сигнала можно вычесть размернаночастиц 22,23, а также получить общее представление об их магнитных особенностях, например, выявиться истереза и принудительность наноматериалов. Альтернативные подходы магнитометрии также существуют, такие как магнитокорез, который состоит в измерении скорости отдельных клеток при привлечении к магниту и магнетизм отдельных клетокэкстраполируется 33,34. Магнетизм на уровне одной клетки может быть получен таким образом; однако никакие дополнительные функции наночастиц не могут быть определены. Кроме того, небольшой магнитный датчик, который обеспечивает сигнал, пропорциональный образцу магнетизма, недавно был использован с аналогичной моделью сфероидов клеток. Этот магнитный датчик позволил отслеживать биодеградацию магнитных наночастиц в режиме реального времени, непрерывно, в течение 7дней 35. Однако сигнал этого магнитного датчика не может быть непосредственно переведен в магнитный момент, так как он зависит от размера наночастиц. По этой причине, кривая калибровки должна быть выполнена для каждого дизайна наночастиц, кривая, которая может быть реализована с помощью VSM.
Измерения, выполненные здесь с помощью ВСМ, демонстрируют прогрессирующую деградацию магнитных наночастиц в клеточной среде, о чем свидетельствует снижение магнетизма. Они также свидетельствуют о том, что одно и то же ядро, покрытое различными молекулами, деградирует с разной скоростью в зависимости от покрытия. При сравнении PAA и цитрат покрытия, PAA приводит к более высокой защиты ядра к деградации, скорее всего, из-за его сильного крепления к магнитномуядру 20. Судьба магнитных наночастиц во внутриклеточной среде оценивается на клеточных сфероидах; однако метод не ограничивается им. Действительно, его можно экстраполировать на клеточные суспензии, которые уже используются для оценки влияния дифференциации стволовых клеток на судьбу наночастиц22. Выяснилось, что, в зависимости от пути дифференциации, магнитные наночастицы обрабатываются клетками по-разному, при этом в некоторых случаях неокристаллизация железа при его растворении. Таким образом, магнитометрия VSM является полезным инструментом для дальнейшего изучения влияния наночастиц и клеточных особенностей на внутриклеточную обработку нано-объектов оксида железа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторов нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Европейским союзом (проект ERC-2014-CoG MaTissE #648779). Авторы хотели бы отметить платформу физико-химических характеристик CNanoMat Парижского университета 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
