Summary
Eisenoxid-Nanopartikel werden über ein nicht wässriges Sol-Gel-Verfahren synthetisiert und mit anionischen Kurzmolekülen oder Polymeren beschichtet. Die Verwendung der Magnetometrie zur Überwachung der Integration und Biotransformation magnetischer Nanopartikel in menschlichen Stammzellen wird mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM) demonstriert.
Abstract
Magnetische Nanopartikel aus Eisenoxid stellen ein besonderes Interesse für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen dar, für die sie oft in Zellen verinnerlicht und dann im Inneren belassen werden. Eine Herausforderung besteht darin, ihr Schicksal in der intrazellulären Umgebung mit zuverlässigen und präzisen Methoden zu beurteilen. Hierbei stellen wir die Verwendung des vibrierenden Probenmagnetometers (VSM) vor, um die Integrität magnetischer Nanopartikel in Zellen präzise zu quantifizieren, indem sie ihr magnetisches Moment messen. Stammzellen werden zuerst mit zwei Arten von magnetischen Nanopartikeln beschriftet; Die Nanopartikel haben den gleichen Kern, der über eine schnelle und effiziente Mikrowellen-basierte nichtwässrige Solgelsynthese entsteht und unterscheiden sich in ihrer Beschichtung: Das häufig verwendete Zitronensäuremolekül wird mit Polyacrylsäure verglichen. Die Bildung von 3D-Zellsphäroiden wird dann durch Zentrifugation erreicht und das magnetische Moment dieser Sphäroide wird zu unterschiedlichen Zeiten mit dem VSM gemessen. Das erhaltene Moment ist ein direkter Fingerabdruck der Integrität der Nanopartikel, wobei abnehmende Werte auf einen Nanopartikelabbau hindeuten. Bei beiden Nanopartikeln nimmt das magnetische Moment im Laufe der Kulturzeit ab und offenbart ihren biologischen Abbau. Eine schützende Wirkung der Polyacrylsäurebeschichtung wird auch im Vergleich zu Zitronensäure gezeigt.
Introduction
Das Interesse an den magnetischen Merkmalen von Eisenoxid-Nanopartikeln für eine Vielzahl biomedizinischer Anwendungen ist gestiegen. Ihre Reaktion auf Magnetresonanz macht sie zu zuverlässigen Kontraststoffen für die Magnetresonanztomographie (MRT), ein Vorteil in der regenerativen Medizin, wo Zellen, die mit magnetischen Nanopartikeln gekennzeichnet sind, nach der Implantation1in vivo nachverfolgt werden können. Mithilfe von Magnetfeldern können Zellen auch in der Ferne geführt werden; auf diese Weise können zelluläre Sphäroide2,3, Ringe4, oder Blatt5 magnetisch und auch aus der Ferne stimuliert6, ein Vorteil in der Entwicklung von Gerüst-freien Geweben. Die Möglichkeiten für diese Nanopartikel umfassen auch Arzneimittelabgabesysteme7,8 und magnetische und photoinduzierte hyperthermische Behandlung, um Krebszellen9,10,11abzutöten. Bei all diesen Anwendungen werden die Nanopartikel entweder durch intravenöse Injektion oder durch direkte Internalisierung in Zellen in die biologische Umgebung integriert und dann im Inneren gelassen, was ihr intrazelluläres Schicksal in Frage stellt.
In-vivo-Analysen vermittelten ein allgemeines Verständnis des Schicksals der Nanopartikel im Organismus: Bei injektionn in den Blutkreislauf werden sie zunächst hauptsächlich von den Makrophagen der Leber (Kupffer-Zellen), Milz und Knochenmark erfasst, nach und nach abgebaut und verbinden sich mit dem Eisenpool des Organismus12,13,14,15,16,17,18,19. Qualitative Beobachtungen sind nur durch die Zirkulation der Nanopartikel im gesamten Organismus möglich. Typischerweise kann die Getriebeelektronische Mikroskopie (TEM) verwendet werden, um die Nanopartikel direkt zu beobachten und das Vorhandensein von Eisen in den Organen kann über die Dosierung bestimmt werden. In jüngerer Zeit wurde ihr Schicksal direkt an einem Zellpool bewertet, d.h. in einem engen Kreislauf ohne Eisenflucht, was eine quantitative Messung ihrer Biotransformationen auf Zellebene20,21,22ermöglicht. Solche Messungen sind durch die Analyse der magnetischen Eigenschaften der Nanopartikel möglich, die eng mit ihrer strukturellen Integrität verbunden sind. Vibrierende Probenmagnetometrie (VSM) ist eine Technik, bei der die Probe periodisch vibriert, so dass die Spulenmessung des induzierten Flusses das magnetische Moment der Probe am angelegten Magnetfeld liefert. Eine solche synchrone Detektion ermöglicht eine schnelle Messung, die ein Mittel zur Bestimmung der magnetischen Momente einer großen Anzahl von Proben20,21,22,23ist. Die makroskopische magnetische Signatur, die von VSM abgerufen wird, gibt dann einen quantitativen Überblick über die gesamte biologische Probe, die direkt mit der Größe und Struktur der Nanopartikel korreliert. Insbesondere liefert es das magnetische Moment bei der Sättigung (ausgedrückt in emu) der Proben, was eine direkte Quantifizierung der Anzahl der in der Probe vorhandenen magnetischen Nanopartikel bzw. ihrer spezifischen magnetischen Eigenschaften darstellt.
Es hat sich gezeigt, dass die intrazelluläre Verarbeitung magnetischer Nanopartikel eng mit ihren strukturellen Merkmalen verbunden ist20. Diese Funktionen können über optimale Syntheseprotokolle gesteuert werden. Jedes Protokoll bietet Vorteile und Einschränkungen. Eisenoxid-Nanopartikel werden häufig in wässrigen Lösungen durch Kopräzipation von Eisenionen synthetisiert24. Um die Grenzen der Polydispersität der Nanopartikelgröße zu überwinden, wurden andere Synthesemethoden wie polyolvermittelte Sol-Gel-Methoden entwickelt25. Nicht wässrige Ansätze durch thermische Zersetzung führen zur Produktion sehr gut kalibrierter Eisenoxid-Nanopartikel26. Die Verwendung von massiven Mengen an Tensiden wie Oleylamin oder Ölsäure erschwert jedoch deren Funktionalisierung und Wassertransfer für biomedizinische Anwendungen. Aus diesem Grund synthetisieren wir solche magnetischen Nanopartikel über einen nicht wässrigen Sol-Gel-Weg, der zu hoher Kristallinität, Reinheit und Reproduzierbarkeit führt27. Dieses Protokoll erzeugt gut kontrollierte Nanopartikel in Größe, die durch Temperaturschwankungen28abgestimmt werden können. Dennoch hat die mikrowellenunterstützte nicht wässrige Sol-Gel-Route eine obere Größengrenze der erhaltenen Nanopartikel von etwa 12 nm. Dieses Verfahren wäre nicht für Anwendungen mit ferromagnetischen Partikeln bei Raumtemperatur geeignet. Neben der Kernsynthese ist ein weiteres Hauptmerkmal die Beschichtung. An der Oberfläche des Nanopartikels liegend, fungiert die Beschichtung als Verankerungsmolekül, das die gezielte Internalisierung der Nanopartikel unterstützt, oder sie kann das Nanopartikel vor dem Abbau schützen. Da Benzylalkohol gleichzeitig als Sauerstoffquelle und Liganden dient, werden nackte Nanopartikel ohne zusätzliche Tenside oder Liganden hergestellt. Die Nanopartikel werden dann nach der Synthese ohne Tensidaustausch leicht oberflächenfunktionalisiert.
Dabei werden zwei Arten von Nanopartikeln bewertet, die den gleichen Kern besitzen und sich in der Beschichtung unterscheiden. Der Kern wird mit einer schnellen und hocheffizienten Mikrowellentechnik synthetisiert. Die beiden verglichenen Beschichtungen bestehen aus Zitronensäure, einer der am häufigsten als Beschichtungsmittel in biomedizinischen Anwendungen29,30und Polyacrylsäure (PAA), einer polymeren Beschichtung mit einer hohen Anzahl von Chelatfunktionen. VSM-Magnetometriemessungen werden dann zuerst verwendet, um die Nanopartikelaufnahme durch die Zellen zu quantifizieren, und dann als direkte Bewertung der strukturellen Integrität von Nanopartikeln bei der Internalisierung in Stammzellen. Die Ergebnisse zeigen, dass die Inkubationskonzentration die Aufnahme von Nanopartikeln beeinflusst und dass die Beschichtung ihren Abbau beeinflusst, wobei die große Anzahl von Verankerungsmolekülen von PAA den Kern vor Dementstehen schützt.
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Protocol
1. Synthese magnetischer Nanopartikel
- Kernsynthese – Mikrowellen-unterstützt
- 400 mg Eisen(III) Acetylacetonat auflösen (>99,9%) in 10 ml Benzylalkohol (BA, 99,8%) innerhalb einer 30 ml Monowellenglasdurchstechflasche.
- Erhöhen Sie die Temperatur der Suspension von 25 auf 250 °C in 20 min (bei einer Geschwindigkeit von 11,25 °C/min) und halten Sie sie 30 min mit einem Mikrowellenreaktor bei 250 °C.
- Übertragen Sie die in Benzylalkohol suspendierten Nanopartikel in eine Glasdurchstechflasche und trennen Sie die Nanopartikel mit einem Neodymmagneten 30 min.
- Waschen Sie den Niederschlag in der vorherigen 100 ml Glasdurchstechflasche mit 10 ml Dichlormethan, 1 M Natriumhydroxid, Ethanol, pH 7 Wasser (dreimal) mit einem Neodym-Magnetfürst für 5 min pro Schritt, um Nanopartikel zu pelletisieren und den Überstand zu entfernen.
- Stellen Sie die Nanopartikelsuspension in Wasser mit 1 M Salzsäure auf pH2 und dann in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min zentrifugieren.
- Entfernen Sie das Filtrat, fügen Sie 12 ml 10-2 M Salzsäure in die Nanopartikellösung und Zentrifuge in 100 kDa Ultrazentrifugalfilter bei 2.200 x g für 10 min (dreimal). Anschließend die Nanopartikellösung innerhalb von 10 ml von 10-2 M Salzsäure vor der Beschichtung verdünnen.
- Beschichtung
- 175 mg Zitronensäure und Polyacrylsäure in Wasser bei pH 2 in einer 100 ml Glasdurchstechflasche verdünnen und den pH-Wert mit einer 1 M Salzsäurelösung auf 2 einstellen.
- Fügen Sie die 10 ml-Nanopartikel wässrige Dispersion in die Beschichtungsmoleküllösung ein, was einem Massenverhältnis von 5 zwischen dem Beschichtungsmolekül und den Nanopartikeln entspricht. Rühren Sie für 2 h unter magnetischem Rühren bei Raumtemperatur.
- Nach der Reaktion den pH-Wert auf 7 mit 1 M Natriumhydroxid einstellen.
- Zentrifuge die Nanopartikellösung 3 mal mit deionisiertem (DI) Wasser in 100 kDa Ultrazentrifugalfiltern bei 2.200 x g für 10 min; Filtrat entfernen und die Nanopartikellösung in 12 ml DI-Wasser verdünnen.
2. Kultur und magnetische Kennzeichnung von Stammzellen
- Kultur humane mesenchymale Stammzellen (MSC) im vollständigen mesenchymalen Stammzellwachstumsmedium (MSCGM) bei 37 °C und 5%CO2. Wenn die Zellen bei 90% Zusammenfluss sind, fügen Sie 10 ml Trypsin-EDTA vorgewärmt bei 37°C pro 150 cm2 Kolben hinzu und lassen Sie für 2-3 Minuten die Zellen zu lösen.
- Um zu wissen, wann die Zellen abgetrennt sind, beobachten Sie sie mit einem Hellfeldmikroskop. Setzen Sie die abgetrennten Zellen in MSCGM wieder auf und teilen Sie sie in vier 150 cm2-Flaschen. Verstärken Sie die Zellen auf diese Weise bis Durchgang 4 bis 5.
- Bereiten Sie die Lösung magnetischer Nanopartikel für die Zellbeschriftung vor: Dispergieren Sie die gewählte Konzentration von Eisenoxid-Nanopartikeln im serumfreien Roswell Park Memorial Institute Medium (RMPI-1640) ohne Glutamin. RPMI wird für die Inkubation von Nanopartikeln (und die damit verbundenen Spülschritte) verwendet, da es eine geringere Ionenstärke als DMEM hat und Nanopartikelaggregationsereignisse besser verhindert.
- Wenn sich die Zellen in Durchgang 4 oder 5 und 90 % konfluent befinden, entfernen Sie das MSCGM-Medium, spülen Sie die Zellen mit serumfreiem RPMI (ohne Glutamin) aus und fügen Sie 10 ml Eisenoxid-Nanopartikellösung pro 150 cm2 Kulturkolben hinzu, was das minimale Volumen ist, das erforderlich ist, um alle Zellen abzudecken.
- Bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min inkubieren und dann die Nanopartikellösung entsorgen. Einmal mit serumfreiem RPMI-1640 (kein Glutamin) waschen und mit Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) über Nacht mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (25 ml pro 150 cm2 Kolben) bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren, um eine vollständige Internalisierung der Nanopartikel zu ermöglichen.
3. Bildung von Stammzellsphäroiden
- Frisch vorbereitendes Zellsphäroid-Kulturmedium bestehend aus DMEM-Hoher Glukose mit L-Glutamin, ergänzt mit 50 M L-Ascorbinsäure 2-Phosphat, 0,1 M Dexamethason, 1 mM Natriumpyruvat, 0,35 mM L-Prolin und 1% universaler Kulturergänzung, die Insulin, HumanTransferrin und Selensäure (ITS-Premix) enthält.
- Lösen Sie die magnetischen MSCs, indem Sie 10 ml 0,05% Trypsin-EDTA vorwärmte bei 37 °C pro 150 cm2 Kolben für 2-3 Minuten hinzufügen. Wenn die Zellen abgetrennt werden, inaktivieren Sie sofort das Trypsin, indem Sie 1/3 des Volumens von DMEM hinzufügen, das mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin vorgewärmt bei 37 °C ergänzt wird.
- Zentrifugieren Sie die dissoziierten Zellen bei 260 x g für 5 min, aspirieren Sie die Medien und setzen Sie die Zellen in einem kleinen Volumen (weniger als 1 ml pro 150 cm2 Kolben) des Zellsphäroid-Kulturmediums wieder auf, z. B. mit 200.000 Zellen in etwa 50 l Medium. Zählen Sie die Zellennummer mit einem Hämozytometer, und passen Sie die Lautstärke bei Bedarf an.
- Fügen Sie 1 ml frisch zubereitetes Zellsphäroid-Kulturmedium in ein 15 ml steriles konisches Zentrifugenrohr und fügen Sie das Volumen der resuspendierten Lösung hinzu, die 200.000 Zellen entspricht.
- Zentrifugieren Sie diese magnetisch beschrifteten Zellen bei 180 x g für 3 min, wie z. B. die Bildung eines Zellpellets an der Unterseite des Rohres und halten Sie den Überstand, das das Zellkulturmedium ist.
- Öffnen Sie die Rohre leicht, um Luftaustausch zu ermöglichen und bei 37 °C mit 5%CO2 für bis zu 21 Tage zu brüten, Kulturzeit, entlang der die Zellen eine kohäsive 3D-Struktur bilden, die zu einem voll ausgebildeten Sphäroid führt. Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.
- An bestimmten Tagen die Sphäroide zweimal mit Einem Cakodylatepuffer aus 0,2 M in demineralisiertem Wasser verdünntem Cakodylat waschen und mit 2% Glutaraldehyd in 0,1 M Kakokylatpuffer in destilliertem Wasser 30 min bei Raumtemperatur verdünnt fixieren. Bewahren Sie die festen Sphäroide in PBS auf, bis sie für die VSM-Messung oder TEM-Bildgebung verwendet werden. Dieser Fixierungsschritt stoppt alle biologischen Prozesse und ermöglicht eine langfristige Konservierung.
4. Quantifizierung magnetischer Nanopartikel in Lösung und in Cellulo mit einem vibrierenden Probenmagnetometer (VSM)
- Legen Sie entweder ein bestimmtes Volumen magnetischer Nanopartikellösung (maximal 10 l) oder ein einzelnes Zellsphäroid in den Probenhalter, der speziell für den VSM entwickelt wurde.
- Fügen Sie die Probe in den VSM ein, und scannen Sie nach Stichprobenversatz. Platzieren Sie die Probe an der Position, die dem Magnetisierungsmaximum entspricht.
- Führen Sie die erste Messung bei einem niedrigen Magnetfeld (zwischen -1500 Oe und +1500 Oe) mit einer Rate von 20 Oe/s durch.
- Führen Sie eine zweite Messung bei einem hohen Magnetfeld (zwischen -30 000 Oe und +30 000 Oe) mit einer Rate von 200 Oe/s durch.
5. Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) Analyse
- Für die Nanopartikellösungen 10 l der wässrigen Lösung auf ein kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter ablagern und bei Raumtemperatur trocknen lassen.
- Bei den in Zellen internalisierten Nanopartikeln die fixen Zellsphäroide mit Oolong Tea Extract (OTE) mit 0,5% in 0,1 M Cacodylatpuffer verdünnt, postfix mit 1% Osmiumtetroxid mit 1,5% Kaliumcyanoferrat und anschließenddehydratisiert in abgestuften Ethanolbädern, die in Epon enthalten sind. Schneiden Sie Ultrasections von 70 nm und legen Sie sie auf Cooper Grids.
- Nehmen Sie Bilder mit einem Elektronenmikroskop bei 80 kV mit einer Vergrößerung von 1k für die Beobachtung ganzer Zellen bis 40k für die Beobachtung von endosomalen Kompartimenten auf.
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Representative Results
Mit Hilfe der Mikrowellen-gestützten Synthese werden magnetische Nanopartikel mit einem monodispersen Kern von 8,8 ± 2,5 nm Kerngröße hergestellt und entweder mit Citrat oder PAA beschichtet (Abbildung 1A). Stammzellen werden dann mit diesen Nanopartikeln in Kulturmedium in einer gegebenen Konzentration für 30 Minuten dispergiert, was zu ihrer Endozytose und Einschließung innerhalb der zellulären Endosomen führt (Abbildung 1B). Die magnetischen Stammzellen werden dann mittel, zentrifugiert suspendiert, und das gebildete Zellpellet wird für bis zu 21 Tage kultiviert (Abbildung 1C). Die erhaltenen Sphäroide werden fixiert, wie z. B. das Stoppen biologischer Prozesse, und bis zur Messung über VSM in PBS aufbewahrt.
Zunächst wird das magnetische Moment der Nanopartikellösung mit dem VSM gemessen: Es werden 10 l der wässrigen Nanopartikeldispersion mit 7 g Eisen gemessen, und die erhaltene Kurve wird in Abbildung 2Adargestellt. Durch das Vorhandensein von Wasser in dieser Lösung und dem Probenhalter wird zusätzlich zum superparamagnetischen Signal der Nanopartikel ein diamagnetisches Signal erfasst. Eine diamagnetische Konstante (Mdia), die der Steigung des zweiten Teils der Kurve entspricht, kann gemessen werden, wie in Abbildung 2Adargestellt, und diese Konstante kann subtrahiert werden, wie z. B. nur das magnetische Moment der Nanopartikel zu erhalten (M-Probe = M - Mdia). Die Sättigungsmagnetisierung der Nanopartikel (Ms) kann dann extrahiert werden; es entspricht 518 emu für die wässrige Dispersion, was bedeutet, dass die Lösung bei 74 emu/g Eisen (Fe) entspricht, was 52 emu/g Nanopartikeln entspricht (Fe3O4).
Das magnetische Moment von Zellsphäriden kann ähnlich erreicht werden. In diesem Fall wird ein Zellsphäroid (aus 200.000 Zellen) in den Probenhalter eingefügt, in den VSM eingefügt und gemessen (Abbildung 2B). Die erhaltenen magnetischen Momentwerte sind hier viel niedriger als die der ursprünglichen Nanopartikellösung; sie bleiben jedoch innerhalb des Erfassungsbereichs. Die Sättigungsmagnetisierung dieser speziellen Probe beträgt 69 Emu. Außerdem enthält dieses Sphäroid 1,3 g Nanopartikel (6,7 pg Nanopartikel pro Zelle), die mit dem Sättigungswert bei 52 emu/gFe3O4übereinstimmen. Dieser Wert kann somit verwendet werden, um die Menge der Nanopartikel in Zellproben zu bestimmen. In Abbildung 2Cwerden Sphäroide, die Zellen entsprechen, die mit drei Konzentrationen von citratbeschichteten Nanopartikeln gekennzeichnet sind, einen Tag nach der Etikettierung gemessen. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Aufnahme der Nanopartikel von der Inkubationskonzentration abhängt, mit Konzentrationen von 0,125, 0,25 und 0,5 mM, was zu einer Aufnahme von 0,3, 0,7 und 1,3 g Eisen pro Sphäroid führt, was 1,3, 3,3 bzw. 6,7 pg Eisen pro Zelle bedeutet.
Es wurde auf die Bedeutung der Oberflächenbeschichtung hingewiesen, die direkt mit der biologischen Umgebung interagiert20. Hier wurden zwei Beschichtungen hergestellt: eine Citratbeschichtung, die häufig für biomedizinische Anwendungen verwendet wird, und eine PAA-Beschichtung mit einer höheren Anzahl von Chelatfunktionen. Stammzellen werden mit diesen beiden Arten von Nanopartikeln beschriftet und zentrifugiert, wie z. B. die Bildung eines Zellpellets, das dann zu einem kohäsiven Zellsphäroid wird (Abbildung 3A). Der Magnetismus dieser Zellsphäride wird über VSM an Tag 1 und Tag 21 gemessen (Abbildung 3B und Abbildung 3C). Die Ergebnisse zeigen eine Abnahme des Magnetismus an den 21 Tagen der Kultur, was auf den biologischen Abbau der Nanopartikel hindeutet, wobei dieser Abbau für die citratbeschichteten Nanopartikel (Abbildung 3B) wichtiger ist als für die PAA-beschichteten (Abbildung 3C). TEM-Bilder bestätigen den Abbau der Nanopartikel und zeigen das Auftreten kleinerer (6 nm größe) hellgrauer Punkte, die typisch für mit Eisen beladenes Ferritin sind. Einige intakte Nanopartikel können auch beobachtet werden, insbesondere mit der PAA-Beschichtung.
Abbildung 1: Mikrowellenunterstützte Synthese von Eisenoxid (Fe3O4) Nanopartikel, deren Internalisierung in Stammzellen und die anschließende Kultur der Zellen als Sphäroide. (A) Schemat der verschiedenen Schritte der Nanopartikelsynthese. Zunächst wird der Kern über ein nicht wässriges Sol-Gel-Verfahren synthetisiert. Das Beschichtungsmolekül, entweder Citrat (Cit) oder Polyacrylsäure (PAA), wird dann an der Oberfläche des Eisenoxidkerns transplantiert. Ein repräsentatives TEM-Bild zeigt die synthetisierten Nanopartikel mit einer Citratbeschichtung. (B) Schemat der Nanopartikelinternalisierung innerhalb der Stammzelle, die die Nanopartikel zeigt, die bei der Internalisierung in den Endosomen eingeschlossen sind. Repräsentative TEM-Bilder zeigen auch die Citrat- und PAA-beschichteten Nanopartikel in den Zellen, die in den Endosomen eingeschlossen sind. (C) Schematische Stammzellsphäroide Bildung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Messung des magnetischen Moments der Proben über VSM. (A) 10 L Nanopartikel, die in einer wässrigen Lösung dispergiert sind, werden über den VSM gemessen. Das erhaltene Signal stellt das magnetische Moment dieser Nanopartikellösung in Funktion des Magnetfeldes (B) dar. Der Diamagnetismus, der aus dem Vorhandensein von Wasser und dem Probenhalter entsteht, kann dann gemessen werden, da er der Steigung des zweiten Teils der Kurve entspricht und subtrahiert, wie z. B. das erhaltende magnetische Moment der Nanopartikel. Das magnetische Moment bei sättigung (Ms) kann dann bestimmt werden. (B) Das magnetische Moment von Zellsphäriden kann in ähnlicher Weise erhalten werden; In diesem Fall wird ein einzelnes Zellsphäroid zu einem bestimmten Zeitraum gemessen. (C) Kurven von Sphäroiden, die Zellen entsprechen, die mit citratbeschichteten Nanopartikeln in drei unabhängigen Konzentrationen von 0,125 mM (orange), 0,25 mM (grau) und 0,5 mM (blau) gekennzeichnet sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Quantifizierung des magnetischen Nanopartikelabbaus in Cellulo über VSM. (A) Bei der Zellbeschriftung mit magnetischen Nanopartikeln wird ein Zellpellet durch Zentrifugation gebildet (Tag 0). Die Zellen bilden dann eine kohäsive Struktur, was zu einem einfach zu handhabenden Zellsphäroid führt, das über längere Zeiträume (Monate) ohne Zellverlust in Kultur gehalten werden kann. (B, C) Hierbei werden zwei Arten von magnetischen Nanopartikeln, die mit Citrat (B) oder PAA (C) beschichtet sind, in Stammzellen internalisiert und die Zellen werden bis zu 21 Tage lang als Sphäroide kultiviert. Magnetismus von Sphäroiden, die für 1 Tag (orange Kurven) und 21 Tage (graue Kurven) kultiviert werden, werden mit dem VSM gemessen, wobei eine Abnahme des Magnetismus auf einen Abbau der Nanopartikel hindeutet. Repräsentative TEM-Bilder, die an Tag 21 aufgenommen wurden, zeigen hellgraue Punkte von ca. 6 nm Größe innerhalb der Endosomen und das Zytoplasma der Zellen, typische Größe und Form von Ferritin, dem Eisenspeicherprotein (schwarze Pfeile). Einige intakte Nanopartikel können auch beobachtet werden, vor allem für die PAA-beschichteten Nanopartikel (brauner Pfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Mit einer schnellen und effizienten Mikrowellen-basierten Synthese können magnetische Nanopartikel leicht synthetisiert, mit kontrollierter Größe und weiter mit bestimmten Molekülen beschichtet werden. Ein kritischer Schritt ist es, das Eisensalz und den Benzylalkohol unter Vakuum zu lagern, um eine kleine Dispersion in der Größe zu halten. Der Benzylalkohol wirkt sowohl als Lösungsmittel als auch als Liganden und ermöglicht es, kalibriertes blankes Eisenoxid direkt zu erhalten, ohne dass zusätzliche Liganden benötigt werden. Nach dem Transfer von Nanopartikeln in Wasser können die nackten magnetischen Nanopartikel leicht mit einer Vielzahl von Liganden beschichtet werden. Diese Beschichtung verleiht internanopartikel- und nanopartikel-zellinteragierende Eigenschaften, die ihre zelluläre Internalisierung beeinflussen können, ein Parameter, der streng kontrolliert werden muss, da eine minimale Internalisierung für biomedizinische Anwendungen erforderlich ist, während eine zu hohe Internalisierung die Zellen schädigen und möglicherweise zytotoxische Ereignisse hervortreten könnte31. Die Magnetometrie ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um diese Internalisierung sowie das Schicksal magnetischer Nanopartikel in Cellulo zu beurteilen. Bei der Aufnahme magnetischer Nanopartikel in Stammzellen können Sphäroide durch eine einfache Zentrifugation gebildet werden, gefolgt von Kultur in einem Medium, das die Zellproliferation stoppt und die extrazelluläre Matrixproduktion antreibt. Die Zellen werden stark kohäsiv und beginnen, ein Gewebe zu bilden. Die Sphäroide sind dann sehr einfach zu handhaben und können über einen längeren Zeitraum (Monate) kultiviert werden, was eine langfristige Verfolgung des Schicksals magnetischer Nanopartikel in einer biologischen Umgebung ermöglicht. Durch das Stoppen der Zellteilung gibt es keine Verdünnung der Nanopartikel von Mutter zu Tochterzelle; darüber hinaus wurde überprüft, dass es mit diesem Zellsphäroid-Modell keinen Eisenaustritt über einen Monat Kultur21,22,23gibt. Infolgedessen kann eine Abnahme der Magnetismuswerte nur einer Verschlechterung der Nanopartikel entsprechen und nicht dem Austragungseisen aus den Zellen.
Der Magnetismus der Zellsphäride wird hier über VSM gemessen, das eine schnelle und präzise Quantifizierung ermöglicht. Andere Methoden wurden auch untersucht, um zellulären Magnetismus zu messen, wie die Verwendung eines supraleitenden Schnittstellengeräts (SQUID), einer Maschine, die typischerweise präziser ist als die VSM mit einer Empfindlichkeit um 10-7 emu im Vergleich zu 10-6 emu für den VSM, aber die Betriebskosten sind höher32. Die Empfindlichkeit des VSM, die Messungen der magnetischen Eisendosis unter 2 pg/Zelle im Versuchsaufbau ermöglicht, ist hierin ausreichend präzise, da Eisendosen unter 2 pg/Zelle für die angestrebten Anwendungen, wie die Zellanziehung zu einem Magneten für die Zellführung und Gewebetechnik, zu niedrig wären. Sowohl die VSM- als auch die SQUID-Magnetometrie können neben der Quantifizierung des Zellmagnetismus zusätzliche Details zu den Merkmalen der Nanopartikel enthalten. Durch die Analyse des erhaltenen Signals kann die Größe der Nanopartikel22,23 abgezogen und auch eine allgemeine Vorstellung von ihren magnetischen Merkmalen erhalten werden, Hysterese und Koerkivität von Nanomaterialien können beispielsweise aufgedeckt werden. Es gibt auch alternative Magnetometrieansätze, wie die Magnetophorese, die darin besteht, die Geschwindigkeit einzelner Zellen zu messen, wenn sie zu einem Magneten angezogen werden, und der Magnetismus einzelner Zellen wirdextrapoliert 33,34. Der Magnetismus auf der Einzelzellebene kann auf diese Weise erreicht werden; Es können jedoch keine zusätzlichen Nanopartikelmerkmale bestimmt werden. Darüber hinaus wurde kürzlich ein kleiner Magnetsensor verwendet, der ein Proportionalzum dem Probenmagnetismus liefert, und wurde kürzlich mit einem ähnlichen Zellsphäroidmodell verwendet. Dieser magnetische Sensor ermöglichte die Verfolgung des biologischen Abbaus magnetischer Nanopartikel in Echtzeit, kontinuierlich, über 7 Tage35. Das Signal dieses Magnetsensors kann jedoch nicht direkt in ein magnetisches Moment übersetzt werden, da es von der Größe der Nanopartikel abhängt. Aus diesem Grund muss für jedes Nanopartikeldesign eine Kalibrierkurve durchgeführt werden, eine Kurve, die mit dem VSM realisiert werden kann.
Die hierin mit dem VSM durchgeführten Messungen zeigen einen fortschreitenden Abbau der magnetischen Nanopartikel in der zellulären Umgebung, der durch eine Abnahme des Magnetismus angezeigt wird. Sie belegen auch, dass ein mit verschiedenen Molekülen beschichteter Kern je nach Beschichtung mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten abgebaut wird. Beim Vergleich einer PAA- und einer Citratbeschichtung führt PAA zu einem höheren Kernschutz zum Abbau, wahrscheinlich aufgrund seiner starken Verankerung am Magnetkern20. Das Schicksal magnetischer Nanopartikel in der intrazellulären Umgebung wird anhand von Zellsphäriden beurteilt; Die Methode ist jedoch nicht darauf beschränkt. In der Tat kann es auf Zellsuspensionen extrapoliert werden, die bereits verwendet wurden, um die Auswirkungen der Stammzelldifferenzierung auf das Schicksal der Nanopartikel zu bewerten22. Es zeigte sich, dass die magnetischen Nanopartikel je nach Differenzierungsweg von den Zellen unterschiedlich verarbeitet werden, wobei in einigen Fällen die Neokristallisation von Eisen nach seiner Auflösung erfolgt. Die VSM-Magnetometrie ist daher ein nützliches Werkzeug, um den Einfluss von Nanopartikeln und Zellmerkmalen auf die intrazelluläre Verarbeitung von Eisenoxid-Nanoobjekten weiter zu untersuchen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union (ERC-2014-CoG-Projekt MaTissE #648779) unterstützt. Die Autoren möchten die CNanoMat physikalisch-chemische Charakterisierungsplattform der Universität Paris 13 würdigen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
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