Summary
Jernoksid nanopartikler syntetiseres via en ikke-vandig sol gel prosedyre og belagt med anioniske korte molekyler eller polymer. Bruk av magnetometry for overvåking av inkorporering og biotransformasjoner av magnetiske nanopartikler inne i menneskelige stamceller er demonstrert ved hjelp av et vibrerende prøvemagnetometer (VSM).
Abstract
Magnetiske nanopartikler, laget av jernoksid, presenterer en særegen interesse for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner som de ofte internaliseres i celler og deretter igjen innenfor. En utfordring er å vurdere deres skjebne i det intracellulære miljøet med pålitelige og presise metoder. Her introduserer vi bruken av det vibrerende prøvemagnetometeret (VSM) for å nøyaktig kvantifisere integriteten til magnetiske nanopartikler i celler ved å måle deres magnetiske øyeblikk. Stamceller er først merket med to typer magnetiske nanopartikler; nanopartiklene har samme kjerne produsert via en rask og effektiv mikrobølgebasert ikke-vandig solgelsyntese og varierer i belegget: det vanlige sitronsyremolekylet sammenlignes med polyakrylsyre. Dannelsen av 3D-celle-sfæroider oppnås deretter via sentrifugering, og det magnetiske øyeblikket til disse sfæroidene måles til forskjellige tider med VSM. Det oppnådde øyeblikket er et direkte fingeravtrykk av nanopartiklenes integritet, med avtagende verdier som indikerer en nanopartikkelforringelse. For begge nanopartikler reduseres det magnetiske øyeblikket over kulturtid som avslører deres biologisk nedbrytning. En beskyttende effekt av polyakrylsyrebelegget er også vist, sammenlignet med sitronsyre.
Introduction
Det er økt interesse for de magnetiske egenskapene til jernoksid nanopartikler for et bredt spekter av biomedisinske applikasjoner. Deres respons på magnetisk resonans gjør dem pålitelige kontrastmidler for magnetisk resonansavbildning (MR), en fordel i regenerativ medisin hvor celler merket med magnetiske nanopartikler kan spores in vivo etter implantasjon1. Ved hjelp av magnetiske felt kan celler også styres på avstand; på denne måten kan cellulæresfæroider 2,3,ringer 4ellerark 5 konstrueres magnetisk og også eksternt stimulert6, en ressurs i utviklingen av stillasfritt vev. Utvalget av muligheter for disse nanopartikler inkluderer også legemiddelleveringssystemer7,8 og magnetisk og fotoindusert hypertermisk behandling for å drepe kreftceller9,10,11. For alle disse programmene er nanopartiklene integrert i det biologiske miljøet enten ved intravenøs injeksjon eller via direkte internalisering i celler og blir deretter igjen innenfor, noe som bringer inn spørsmålet deres intracellulære skjebne.
In vivo analyser formidlet en generell forståelse av nanopartikler skjebne i organismen: ved injeksjon i blodet, blir de først fanget hovedsakelig av makrofagene i leveren (Kupffer celler), milt og benmarg, blir gradvis degradert, og bli med jern bassenget av organismen12,13,14,15,16,17,18,19. Kvalitative observasjoner er bare mulig på grunn av sirkulasjonen av nanopartiklene i hele organismen. Vanligvis kan overføring elektronisk mikroskopi (TEM) brukes til å observere nanopartiklene direkte, og tilstedeværelsen av jern i organene kan bestemmes via dosering. Mer nylig har deres skjebne blitt vurdert direkte på en pool av celler, noe som betyr i nær krets uten jernflukt, slik at en kvantitativ måling av deres biotransformasjoner på cellenivå20,21,22. Slike målinger er mulige via analysen av nanopartiklenes magnetiske egenskaper som er tett knyttet til deres strukturelle integritet. Vibrerende prøvemagnetometri (VSM) er en teknikk der prøven vibreres med jevne mellomrom, slik at spolemålingen av fluksindusert gir det magnetiske øyeblikket til prøven på det påførte magnetfeltet. Slik synkron deteksjon gir mulighet for en rask måling, som er en ressurs for å bestemme de magnetiske øyeblikkene til et stort antallprøver 20,21,22,23. Den makroskopiske magnetiske signaturen hentet av VSM gir deretter en kvantitativ oversikt over hele den biologiske prøven som er direkte korrelert med nanopartiklenes størrelse og struktur. Spesielt gir det magnetiske øyeblikket ved metning (uttrykt i emu) av prøvene, som er en direkte kvantifisering av antall magnetiske nanopartikler tilstede i prøven, henholdsvis til deres spesifikke magnetiske egenskaper.
Det har vist seg at den intracellulære behandlingen av magnetiske nanopartikler er tett knyttet til deres strukturelle egenskaper20. Disse funksjonene kan styres via optimale synteseprotokoller. Hver protokoll gir fordeler og begrensninger. Jernoksid nanopartikler er ofte syntetisert i vandige løsninger via coprecipitation av jernioner24. For å overvinne begrensningene av nanopartikler størrelse polydispersity, andre syntese metoder som polyol-mediert sol-gel metoder har blitt utviklet25. Ikke-queous tilnærminger ved termisk nedbrytning fører til produksjon av svært godt kalibrert jernoksid nanopartikler26. Imidlertid kompliserer bruken av massive mengder overflateaktive stoffer som oleylamin eller oljesyre deres funksjonalisering og vannoverføring for biomedisinske applikasjoner. Av denne grunn syntetiserer vi slike magnetiske nanopartikler gjennom en ikke-vandig solgelrute som fører til høy krystallinitet, renhet og reproduserbarhet27. Denne protokollen produserer velstyrte nanopartikler i størrelse som kan justeres gjennom temperaturvariasjon28. Likevel har den mikrobølgeassisterte ikke-vandige sol-gelruten en øvre størrelsesgrense på de oppnådde nanopartikler på rundt 12 nm. Denne prosedyren ville ikke bli tilpasset for applikasjoner ved hjelp av ferromagnetiske partikler ved romtemperatur. I tillegg til kjernen syntese, en annen hovedfunksjon som skal vurderes er belegget. Liggende på overflaten av nanopartikkelen fungerer belegget som et forankringsmolekyl, og hjelper den målrettede internaliseringen av nanopartiklene, eller det kan beskytte nanopartikkelen mot nedbrytning. Siden benzylalkohol fungerer som oksygenkilde og en ligand samtidig, produseres nakne nanopartikler uten behov for ekstra overflateaktive stoffer eller ligander. Nanopartiklene blir deretter lett overflatefunksjonalisert etter syntese uten en overflateaktivt utvekslingsprosess.
Heri vurderes to typer nanopartikler som har samme kjerne og varierer i belegget. Kjernen syntetiseres ved hjelp av en rask og svært effektiv mikrobølgebasert teknikk. De to beleggene sammenlignet består av sitronsyre, en av de mest brukte som belegg i biomedisinske applikasjoner29,30,og polyakrylsyre (PAA), et polymerbelegg med et høyt antall chelating funksjoner. VSM magnetometrimålinger brukes deretter først til å kvantifisere nanopartikkelopptaket av cellene, og deretter som en direkte vurdering av nanopartikkelens strukturelle integritet ved internalisering i stamceller. Resultatene viser at inkubasjonskonsentrasjonen påvirker nanopartikkelopptaket og at belegget påvirker deres nedbrytning, med det store antallet forankringsmolekyler av PAA som beskytter kjernen mot nedbrytning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Syntese av magnetiske nanopartikler
- Kjernesyntese – mikrobølgeassistert
- Oppløs 400 mg jern (III) acetylacetonat (> 99,9%) i 10 ml benzylalkohol (BA, 99,8 %) i et 30 ml hetteglass med monobølgeglass.
- Øk temperaturen på suspensjonen fra 25 til 250 °C i 20 min (med en hastighet på 11,25 °C/min) og vedlikehold den ved 250 °C i 30 min ved hjelp av en mikrobølgeovnreaktor.
- Overfør de resulterende nanopartikler suspendert i benzylalkohol til et hetteglass med glass og skill nanopartikler ved hjelp av en neodymmagnet i 30 min.
- Vask bunnsplittet i det forrige 100 ml hetteglasset med 10 ml diklormetan, 1 M natriumhydroksid, etanol, pH 7 vann (tre ganger) ved hjelp av en neodymmagnet i 5 minutter hvert trinn for å pelletisere nanopartikler og fjerne det overnaturlige.
- Juster nanopartikkelfjæringen i vann til pH 2 ved hjelp av 1 M saltsyre, og sentrifuge i 100 kDa ultracentrifugalfiltre ved 2200 x g i 10 min.
- Fjern filtratet, tilsett 12 ml 10-2 M saltsyre til nanopartikler løsning og sentrifuge i 100 kDa ultracentrifugal filtre på 2200 x g i 10 min (tre ganger). Fortynne deretter nanopartikler oppløsning innen 10 ml av 10-2 M saltsyre før belegg.
- Belegg
- Fortynn 175 mg sitronsyre og polyakrylsyre i vann ved pH 2 i et 100 ml hetteglass og justert pH til 2 med en 1 M saltsyreoppløsning.
- Tilsett 10 ml nanopartikler vandig dispersjon til beleggmolekylløsningen, tilsvarende et masseforhold på 5 mellom beleggemolekylet og nanopartiklene. Agitate i 2 timer under magnetisk omrøring ved romtemperatur.
- Etter reaksjonen, juster pH til 7 med 1 M natriumhydroksid.
- Sentrifuge nanopartikkeloppløsningen 3 ganger med deionisert (DI) vann i 100 kDa ultracentrifugalfiltre ved 2200 x g i 10 min; fjern filtratet og fortynne nanopartikler oppløsning i 12 ml DI vann.
2. Kultur og magnetisk merking av stamceller
- Kultur humanmesenchymale stamceller (MSC) i komplett mesenchymal stamcellevekst medium (MSCGM) ved 37 °C og 5% CO2. Når cellene er på 90% samløpet, tilsett 10 ml trypsin-EDTA forvarmet ved 37 ° C per 150 cm² kolbe og la stå i 2-3 minutter for å løsne cellene.
- For å vite når cellene er løsrevet, observere dem med et lyst felt mikroskop. Resuspend de frittliggende cellene i MSCGM og dele dem i fire 150 cm² flasker. Forsterk cellene på denne måten til passasje 4 til 5.
- Forbered løsningen av magnetiske nanopartikler for cellemerking: spre den valgte konsentrasjonen av jernoksid nanopartikler i serumfri Roswell Park Memorial Institute medium (RMPI-1640) uten glutamin. RPMI brukes til nanopartikkel inkubasjon (og relaterte skylletrinn) da den har en lavere ionisk styrke enn DMEM og bedre forhindrer nanopartikkelaggregasjonshendelser.
- Når cellene er ved passasje 4 eller 5 og 90% samløpet, fjern MSCGM medium, skyll cellene med serumfri RPMI (uten glutamin) og tilsett 10 ml jernoksid nanopartikler løsning per 150 cm2 kultur kolbe, som er minimumsvolumet som kreves for å dekke alle cellene.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 min og kast deretter nanopartikkeloppløsningen. Vask en gang med serumfri RPMI-1640 (ingen glutamin) og inkuber med Dulbeccos modifiserte Eagle Medium (DMEM) supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin (25 ml per 150 cm2 kolbe) over natten ved 37 ° C og 5% CO2 for å tillate en fullstendig internalisering av nanopartiklene.
3. Dannelse av stamcelle-sfæroider
- Nyforbered celle-sfæroid kultur medium bestående av DMEM høy glukose med L-glutamin supplert med 50 μM L-askorbinsyre 2-fosfat, 0,1 μM deksametason, 1 mM natriumpyuvat, 0,35 mM L-prolin og 1 % universalkulturtilskudd som inneholder insulin, human transferrin og selensyre (ITS-Premix).
- Ta av de magnetiske parlamentsmedlemmene ved å tilsette 10 ml med 0,05 % trypsin-EDTA forvarmet ved 37 °C per 150 cm2 kolbe i 2-3 minutter. Når cellene er løsrevet, umiddelbart inaktivere trypsin ved å legge til 1/3 av volumet av DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin pre-oppvarmet ved 37 °C.
- Sentrifuge de dissosierte cellene ved 260 x g i 5 min, aspirerer media og re-suspendere cellene i et lite volum (mindre enn 1 ml per 150 cm² kolbe) celle-sfæroid kultur medium som å ha 200.000 celler i ca 50 μL av medium. Telle cellenummeret ved hjelp av et hemocytometer og juster volumet om nødvendig.
- Tilsett 1 ml nylaget celle-sfæroid kultur medium i en 15 ml steril konisk sentrifuge rør og legge volumet av resuspended løsning tilsvarende 200.000 celler.
- Sentrifuge disse magnetisk merkede cellene ved 180 x g i 3 min, for eksempel danner en cellepellet nederst på røret og holder det overnaturlige, som er cellekulturmediet.
- Åpne rørene litt for å tillate luftutveksling og inkubere ved 37 °C med 5 % CO2 i opptil 21 dager, kulturtid langs hvilke cellene danner en sammenhengende 3D-struktur som resulterer i en fullt dannet sfæroid. Bytt medium to ganger i uken.
- På gitte dager, vask spheroidene to ganger med kaktodylatbuffer laget av 0,2 M kaktodylat fortynnet i demineralisert vann og fest dem ved hjelp av 2% glutaraldehyd i 0,1 M kaktodylatbuffer fortynnet i destillert vann i 30 min ved romtemperatur. Oppbevar de faste sfæroidene i PBS til de brukes til VSM-måling eller TEM-bildebehandling. Dette fikseringstrinnet stopper alle biologiske prosesser og tillater langsiktig bevaring.
4. Kvantifisering av magnetiske nanopartikler i oppløsning og i cellulo ved hjelp av et vibrerende prøvemagnetometer (VSM)
- Plasser enten et gitt volum magnetisk nanopartikkeloppløsning (maksimalt 10 μL) eller en enkeltcelle-sfæroid i prøveholderen spesielt designet for å passe inn i VSM.
- Sett inn eksemplet i VSM og søk etter eksempelforskyvning. Plasser prøven i posisjonen som tilsvarer magnetiserings maximum.
- Utfør den første målingen ved et lavt magnetfelt (mellom -1500 Oe og +1500 Oe) med en 20 Oe/s-hastighet.
- Utfør en ny måling på et høyt magnetfelt (mellom -30 000 Oe og +30 000 Oe) med en 200 Oe/s-hastighet.
5. Overføring elektron mikroskopi (TEM) analyse
- For nanopartikkelløsningene må du deponere 10 μL av den vandige løsningen på et karbonbelagt kobbergitter og la det tørke ved romtemperatur.
- For nanopartikler internalisert i celler, kontrast de faste celle-sfæroider med Oolong Tea Extract (OTE) på 0,5% fortynnet i 0,1 M cacodylate buffer, post fix med 1% osmium tetroxide inneholder 1,5% kalium cyanoferrat og deretter dehydrere i gradert etanol bad, inkludert i Epon. Skjær ultraseksjoner på 70 nm og deponer dem på Cooper-rutenett.
- Ta bilder ved hjelp av et elektronmikroskop ved 80 kV med en forstørrelse fra 1k for observasjon av hele celler til 40k for observasjon av ensosomale rom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av mikrobølgeassistert syntese produseres magnetiske nanopartikler med monodisperse 8,8 ± 2,5 nm kjernestørrelse og belagt med enten citrate eller PAA (figur 1A). Stamceller inkuberes deretter med disse nanopartikler dispergert i kulturmedium ved en gitt konsentrasjon i 30 minutter, noe som resulterer i endocytose og innesperring i cellulære endosomer (figur 1B). De magnetiske stamcellene blir deretter suspendert i middels, sentrifugert, og cellepellet dannet er dyrket i opptil 21 dager (Figur 1C). Sfæroidene som oppnås er faste, for eksempel å stoppe biologiske prosesser, og holdes i PBS til de måles via VSM.
For det første måles det magnetiske øyeblikket til nanopartikkelløsningen ved hjelp av VSM: 10 μL av nanopartikkelens vandige dispersjon som inneholder 7 μg jern måles, og den oppnådde kurven vises i figur 2A. På grunn av tilstedeværelsen av vann i denne løsningen, og til prøveholderen, fanges et diamagnetisk signal i tillegg til nanopartiklenes superparamagnetiske signal. En diamagnetisk konstant (Mdia) som tilsvarer skråningen av den andre delen av kurven kan måles, som vist i figur 2A, og denne konstantenkan trekkes fra, for eksempel å oppnå det magnetiske øyeblikket til nanopartiklene bare(M-prøve = M - M dia ). Metningsmagnetiseringen av nanopartiklene (Ms) kan deretter ekstraheres; det tilsvarer 518 μemu for vandig dispersjon, noe som betyr at oppløsningen er på 74 emu / g jern (Fe) tilsvarende 52 emu / g nanopartikler (Fe3O4).
Det magnetiske øyeblikket av celle spheroider kan på samme måte oppnås. I dette tilfellet settes en celle-sfæroid (laget av 200.000 celler) inn i prøveholderen, plassert i VSM og målt (figur 2B). De magnetiske momentverdiene som oppnås, er her mye lavere enn de av den første nanopartikkelløsningen; De forblir imidlertid innenfor registreringsområdet. Metningsmagnetiseringen av denne spesielle prøven er på 69 μemu. Dessuten inneholder denne sfæroiden 1,3 μg nanopartikler (6,7 pg nanopartikler per celle), i samsvar med metningsverdien ved 52 emu / gFe3O4. Denne verdien kan dermed brukes til å bestemme mengden nanopartikler i cellulære prøver. I figur 2Cmåles sfæroider som tilsvarer celler merket med tre konsentrasjoner av citratbelagte nanopartikler en dag etter merking. Resultatene viser tydelig at opptaket av nanopartiklene avhenger av inkubasjonskonsentrasjonen, med konsentrasjoner på henholdsvis 0,125, 0,25 og 0,5 mM som fører til opptak på henholdsvis 0,3, 0,7 og 1,3 μg jern per sfæroid, noe som betyr henholdsvis 1,3, 3,3 og 6,7 pg jern per celle.
Oppmerksomhet har blitt brakt på betydningen av overflatebelegget, som direkte samhandler med det biologiske miljøet20. To belegg har her blitt produsert: et citratbelegg, ofte brukt til biomedisinske applikasjoner, og et PAA-belegg, med et høyere antall chelating-funksjoner. Stamceller er merket med disse to typer nanopartikler og sentrifugert som danner en cellepellet som deretter blir en sammenhengende celle-sfæroid (Figur 3A). Magnetisme av disse celle-sfæroider måles via VSM på dag 1 og dag 21 (figur 3B og figur 3C). Resultatene viser en reduksjon i magnetisme på 21 kulturdager, noe som indikerer biologisk nedbrytning av nanopartiklene, denne nedbrytningen er viktigere for de citratbelagte nanopartiklene (figur 3B) enn de PAA-belagte (figur 3C). TEM-bilder bekrefter nedbrytningen av nanopartiklene og viser utseendet til mindre (6 nm i størrelse) lysegrå prikker, typisk for ferritin lastet med jern. Noen nanopartikler som er igjen intakte kan også observeres, spesielt med PAA-belegget.
Figur 1: Mikrobølgeassistert syntese av jernoksid (Fe3O4) nanopartikler, deres internalisering i stamceller og den påfølgende kulturen i cellene som sfæroider. (A) Skjematisk av de ulike trinnene i nanopartikkelsyntesen. For det første syntetiseres kjernen via en ikke-vandig solgelprosedyre. Belegget molekylet, enten Citrate (Cit) eller polyakrylsyre (PAA), blir deretter podet på overflaten av jernoksid kjernen. Et representativt TEM-bilde viser syntetiserte nanopartikler med et citratbelegg. (B) Skjematisk av nanopartikkel internalisering i stamcelle, viser nanopartikler begrenset i endosomene ved internalisering. Representative TEM-bilder viser også citraten og PAA-belagte nanopartikler inne i cellene, begrenset i endosomene. (C) Skjematisk av stamcelle-sfæroider dannelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Måling av prøvene magnetisk øyeblikk via VSM. (A) 10 μL nanopartikler dispergert i en vandig løsning måles via VSM. Signalet som er oppnådd representerer det magnetiske øyeblikket til denne nanopartikkelløsningen i funksjon av magnetfeltet (B). Diamagnetismen som kommer fra tilstedeværelsen av vann, og prøveholderen kan deretter måles som det tilsvarer skråningen av den andre delen av kurven og trekkes fra, for eksempel å oppnå det magnetiske øyeblikket av nanopartiklene bare. Det magnetiske øyeblikket ved metning (Ms) kan deretter bestemmes. (B)Det magnetiske øyeblikket av celle spheroider kan på samme måte oppnås; I dette tilfellet måles en enkelt celle-spheroid i en gitt tidsperiode. (C) Kurver av sfæroider tilsvarende celler merket med citratbelagte nanopartikler ved tre uavhengige konsentrasjoner på 0,125 mM (oransje), 0,25 mM (grå) og 0,5 mM (blå). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av magnetisk nanopartikkelforringelse i cellulo via VSM. (A)Ved cellemerking med magnetiske nanopartikler dannes en cellepellet ved sentrifugering (dag 0). Cellene danner deretter en sammenhengende struktur som resulterer i en lett å håndtere celle-sfæroid som kan holdes i kultur uten celletap i lengre tidsperioder (måneder). (B, C) Heri er to typer magnetiske nanopartikler, belagt med citrat (B) eller PAA (C), internalisert i stamceller og cellene er dyrket som sfæroider i opptil 21 dager. Magnetisme av sfæroider dyrket i 1 dag (oransje kurver) og 21 dager (grå kurver) måles med VSM, med en reduksjon i magnetisme som indikerer en nedbrytning av nanopartiklene. Representative TEM bilder tatt på dag 21 viser lysegrå prikker ca 6 nm er størrelse innenfor endosomer og cytoplasma av cellene, typisk størrelse og form av ferritin, jern lagring protein (svarte piler). Noen intakte nanopartikler kan også observeres, for det meste for PAA-belagte nanopartikler (brun pil). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av en rask og effektiv mikrobølgebasert syntese kan magnetiske nanopartikler enkelt syntetiseres, med kontrollert størrelse og ytterligere belagt med gitte molekyler. Et kritisk skritt er å lagre jernsaltet og benzylalkoholen under vakuum for å holde en liten spredning i størrelse. Benzylalkoholen fungerer som både løsemiddel og ligand samtidig slik at den direkte kan få kalibrert bart jernoksid uten behov for ekstra ligander. Etter nanopartikler overføres i vann kan de nakne magnetiske nanopartiklene enkelt belagt med et stort utvalg av ligande. Dette belegget gir inter-nanopartikkel og nanopartikkel-celle interagering egenskaper som kan påvirke deres cellulære internalisering, en parameter som må kontrolleres tett som et minimum internalisering er nødvendig for biomedisinske applikasjoner mens en for høy internalisering kan være skadelig for cellene og potensielt stammer cytotoksiske hendelser31. Magnetometri er et kraftig verktøy for å vurdere denne internaliseringen, samt skjebnen til magnetiske nanopartikler i cellulo. Ved inkorporering av magnetiske nanopartikler i stamceller, kan sfæroider dannes via en enkel sentrifugasjon etterfulgt av kultur i et medium som stopper spredningen av cellene og driver ekstracellulær matriseproduksjon. Cellene blir svært sammenhengende og begynner å skape et vev. Spheroidene er da veldig enkle å håndtere og kan dyrkes i lengre tidsperioder (måneder) som gjør det mulig for langsiktig sporing av magnetiske nanopartiklers skjebne i et biologisk miljø. Ved å stoppe celledeling er det ingen fortynning av nanopartiklene fra mor til dattercelle; Videre har det blitt bekreftet at med denne celle-sfæroid modellen, er det ingen jern flukt over en måned med kultur21,22,23. Som en konsekvens kan en reduksjon i magnetismeverdier bare tilsvare en nedbrytning av nanopartiklene og ikke å stryke som eksporteres ut av cellene.
Magnetisme av celle spheroids er her målt via VSM som gir en rask og presis kvantifisering. Andre metoder har også blitt utforsket for å måle cellulær magnetisme, for eksempel ved hjelp av en Superconducting Interface Device (SQUID), en maskin som vanligvis er mer presis enn VSM med en følsomhet rundt 10-7 emu sammenlignet med 10-6 emu for VSM, men driftskostnadene erhøyere 32. Følsomheten til VSM slik at målinger av magnetisk jerndose dårligere enn 2 pg / celle i det eksperimentelle oppsettet er her tilstrekkelig presis som jerndoser dårligere enn 2 pg / celle ville være for lav for de siktede applikasjoner, for eksempel celle attraksjon mot en magnetisk for celleveiledning og vev engineering formål. Både VSM og SQUID magnetometri, i tillegg til å tillate en kvantifisering av cellemagnetisme, kan gi ytterligere detaljer om nanopartiklenes funksjoner. Ved analyse av signalet oppnådd, kan størrelsen på nanopartiklene trekkes22,23 ogogså generell forestilling om deres magnetiske egenskaper kan oppnås, hysterese og tvang av nanomaterialer kan for eksempel avsløres. Alternative magnetometry tilnærminger finnes også, for eksempel magnetophoresis som består i å måle hastigheten til individuelle celler når tiltrukket mot en magnet og magnetismen til enkeltceller er ekstrapolert33,34. Magnetismen på enkeltcellenivå kan på denne måten oppnås; Det kan imidlertid ikke bestemmes noen ekstra nanopartikkelfunksjoner. I tillegg har en liten magnetisk sensor som gir et signal proporsjonalt med prøvemagnetismen nylig blitt brukt med en lignende cellesfæroidmodell. Denne magnetiske sensoren tillot sporing av magnetiske nanopartiklers biologisk nedbrytning i sanntid, kontinuerlig, over 7 dager35. Signalet til denne magnetiske sensoren kan imidlertid ikke oversettes direkte til et magnetisk øyeblikk, da det avhenger av størrelsen på nanopartiklene. Av denne grunn må en kalibreringskurve utføres for hver nanopartikkeldesign, kurve som kan realiseres ved hjelp av VSM.
Målinger utført her med VSM viser en progressiv nedbrytning av de magnetiske nanopartiklene i cellemiljøet, indikert av en reduksjon i magnetisme. De beviser også at en samme kjerne belagt med forskjellige molekyler er degradert til varierende priser avhengig av belegget. Når du sammenligner en PAA og et citratbelegg, fører PAA til høyere kjernebeskyttelse til nedbrytning, mest sannsynlig på grunn av sterk forankring til den magnetiskekjernen 20. Skjebnen til magnetiske nanopartikler i det intracellulære miljøet vurderes på cellesfæroider; Metoden er imidlertid ikke begrenset til den. Faktisk kan det ekstrapoleres til cellesuspensjoner, som allerede har blitt brukt til å vurdere effekten av stamcelledividering på nanopartiklenesskjebne 22. Det viste at, avhengig av differensieringsveien, behandles de magnetiske nanopartiklene annerledes av cellene, med i noen tilfeller nykrystalliseringen av jern ved oppløsning. VSM magnetometri er dermed et nyttig verktøy for å utforske påvirkningen av både nanopartikkel og cellefunksjoner på intracellulær behandling av jernoksid nanoobjekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Den europeiske union (ERC-2014-CoG-prosjektet MaTissE #648779). Forfatterne ønsker å anerkjenne CNanoMat physico-kjemiske karakteriseringer plattform av Universitetet Paris 13.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Benzyl alcohol for synthesis | Sigma Aldrich | 8.22259 | |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare a 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| Dichloromethane ≥99% stabilised, GPR RECTAPUR | VWR Chemicals | 23367 | |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10270-106 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| Hydrochloric acid, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35640 | |
| Iron(III) acetylacetonate (> 99.9%) | Sigma Aldrich | 517003 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare a fresh concentrated solution (25 mM) diluted in distilled water |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare a 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | |
| Monowave glass vial | Anton Paar | 82723_us | |
| Microwave reactor | Anton Paar | Monowave 300 | |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Poly(acrylic acid, sodium salt) | Sigma Aldrich | 416010 | MW = 1200 g/mol |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| Sodium hydroxide, 1.0N Standardized Solution | Alfa Aesar | 35629 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| Sterile conical centrifuge tube | Falcon | 352097 | 15 mL tubes |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare a 1 M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Tri-Sodium Citrate Dihydrate, Certified AR for Analysis | Sigma Aldrich | 10396430 | |
| Ultra centrifugal filter | Amicon | AC S510024 |
References
- Azevedo-Pereira, R. L., et al. Superparamagnetic iron oxide nanoparticles as a tool to track mouse neural stem cells in vivo. Molecular Biology Reports. 46 (1), 191-198 (2019).
- Fayol, D., Frasca, G., Le Visage, C., Gazeau, F., Luciani, N., Wilhelm, C. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Advanced Materials. 25 (18), Deerfield Beach, Fla. 2611-2616 (2013).
- Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
- Yamamoto, Y., et al. Preparation of artificial skeletal muscle tissues by a magnetic force-based tissue engineering technique. Journal of Bioscience and Bioengineering. 108 (6), 538-543 (2009).
- Gonçalves, A. I., Rodrigues, M. T., Gomes, M. E. Tissue-engineered magnetic cell sheet patches for advanced strategies in tendon regeneration. Acta Biomaterialia. 63, 110-122 (2017).
- Du, V., et al. A 3D magnetic tissue stretcher for remote mechanical control of embryonic stem cell differentiation. Nature Communications. 8 (1), 400 (2017).
- Amiri, M., Salavati-Niasari, M., Pardakhty, A., Ahmadi, M., Akbari, A. Caffeine: A novel green precursor for synthesis of magnetic CoFe2O4 nanoparticles and pH-sensitive magnetic alginate beads for drug delivery. Materials Science and Engineering: C. 76, 1085-1093 (2017).
- Vangijzegem, T., Stanicki, D., Laurent, S. Magnetic iron oxide nanoparticles for drug delivery: applications and characteristics. Expert Opinion on Drug Delivery. 16 (1), 69-78 (2019).
- Cazares-Cortes, E., et al. Recent insights in magnetic hyperthermia: From the "hot-spot" effect for local delivery to combined magneto-photo-thermia using magneto-plasmonic hybrids. Advanced Drug Delivery Reviews. 138, 233-246 (2019).
- Espinosa, A., et al. Magnetic (Hyper)Thermia or Photothermia? Progressive Comparison of Iron Oxide and Gold Nanoparticles Heating in Water, in Cells, and in vivo. Advanced Functional Materials. 28 (37), 1803660 (2018).
- Plan Sangnier, A., et al. Targeted thermal therapy with genetically engineered magnetite magnetosomes@RGD: Photothermia is far more efficient than magnetic hyperthermia. Journal of Controlled Release. 279, 271-281 (2018).
- Pham, B. T. T., et al. Biodistribution and Clearance of Stable Superparamagnetic Maghemite Iron Oxide Nanoparticles in Mice Following Intraperitoneal Administration. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), (2018).
- Kolosnjaj-Tabi, J., et al.
- Bargheer, D., et al. The distribution and degradation of radiolabeled superparamagnetic iron oxide nanoparticles and quantum dots in mice. Beilstein Journal of Nanotechnology. 6, 111-123 (2015).
- Freund, B., et al. A simple and widely applicable method to 59Fe-radiolabel monodisperse superparamagnetic iron oxide nanoparticles for in vivo quantification studies. ACS Nano. 6 (8), 7318-7325 (2012).
- Singh, S. P., Rahman, M. F., Murty, U. S. N., Mahboob, M., Grover, P. Comparative study of genotoxicity and tissue distribution of nano and micron sized iron oxide in rats after acute oral treatment. Toxicology and Applied Pharmacology. 266 (1), 56-66 (2013).
- Levy, M., et al. Long term in vivo biotransformation of iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (16), 3988-3999 (2011).
- Briley-Saebo, K., et al. Hepatic cellular distribution and degradation of iron oxide nanoparticles following single intravenous injection in rats: implications for magnetic resonance imaging. Cell and Tissue Research. 316 (3), 315-323 (2004).
- Gu, L., Fang, R. H., Sailor, M. J., Park, J. H. In vivo Clearance and Toxicity of Monodisperse Iron Oxide Nanocrystals. ACS Nano. 6 (6), 4947-4954 (2012).
- Sangnier, A. P., et al. Impact of magnetic nanoparticle surface coating on their long-term intracellular biodegradation in stem cells. Nanoscale. , (2019).
- Mazuel, F., et al. Magneto-Thermal Metrics Can Mirror the Long-Term Intracellular Fate of Magneto-Plasmonic Nanohybrids and Reveal the Remarkable Shielding Effect of Gold. Advanced Functional Materials. 27 (9), 1605997 (2017).
- Van de Walle, A., et al. Biosynthesis of magnetic nanoparticles from nano-degradation products revealed in human stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4044-4053 (2019).
- Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
- Bee, A., Massart, R., Neveu, S. Synthesis of very fine maghemite particles. Journal of Magnetism and Magnetic Materials. 149 (1), 6-9 (1995).
- Feldmann, C., Jungk, H. O. Polyol-Mediated Preparation of Nanoscale Oxide Particles. Angewandte Chemie International Edition. 40 (2), 359-362 (2001).
- Hyeon, T., Lee, S. S., Park, J., Chung, Y., Na, H. B. Synthesis of Highly Crystalline and Monodisperse Maghemite Nanocrystallites without a Size-Selection Process. Journal of the American Chemical Society. 123 (51), 12798-12801 (2001).
- Pinna, N., Grancharov, S., Beato, P., Bonville, P., Antonietti, M., Niederberger, M. Magnetite Nanocrystals: Nonaqueous Synthesis, Characterization, and Solubility. Chemistry of Materials. 17 (11), 3044-3049 (2005).
- Richard, S., et al. USPIO size control through microwave nonaqueous sol-gel method for neoangiogenesis T2 MRI contrast agent. Nanomedicine. 11 (21), 2769-2797 (2016).
- Ngo, A. T., Pileni, M. P. Assemblies of Ferrite Nanocrystals: Partial Orientation of the Easy Magnetic Axes. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (1), 53-58 (2001).
- Li, L., et al. Effect of synthesis conditions on the properties of citric-acid coated iron oxide nanoparticles. Microelectronic Engineering. 110, 329-334 (2013).
- Sun, X., et al. Tracking stem cells and macrophages with gold and iron oxide nanoparticles - The choice of the best suited particles. Applied Materials Today. 15, 267-279 (2019).
- Buchner, M., Höfler, K., Henne, B., Ney, V., Ney, A. Tutorial: Basic principles, limits of detection, and pitfalls of highly sensitive SQUID magnetometry for nanomagnetism and spintronics. Journal of Applied Physics. 124 (16), 161101 (2018).
- Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. European Biophysics Journal. 31 (2), 118-125 (2002).
- Jing, Y., et al. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis. The FASEB Journal. 22 (12), 4239-4247 (2008).
- Van de Walle, A., et al. Real-time in situ magnetic measurement of the intracellular biodegradation of iron oxide nanoparticles in a stem cell-spheroid tissue model. Nano Research. , (2020).
