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Neuroscience

कॉर्टिकल माउस एस्ट्रोसाइट्स को व्यक्तिगत बनाने के लिए बहु-इंट्रेस्ड जीनोम-इंटीग्रेटिंग कलर (मैजिक) मार्कर के यूटेरो इलेक्ट्रोपंट्रेशन में

Published: May 21, 2020 doi: 10.3791/61110
Automatic Translation
*1, *2, 1, 3, 4, 2, 1, 4, 3, 2, 1
1Université de Montpellier, INSERM, Institut des Neurosciences de Montpellier, 2Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, 3Université Paris-Saclay, CEA, CNRS, MIRCen, Laboratoire des Maladies Neurodégénératives, 4Laboratory for Optics and Biosciences, Ecole polytechnique, CNRS, INSERM, IP Paris
* These authors contributed equally

Summary

एस्ट्रोसाइट्स ने सेरेब्रल कॉर्टेक्स को समान रूप से टाइल किया, जिससे सेलुलर स्तर पर उनकी जटिल आकृति विज्ञान का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण हो जाता है। यहां प्रदान किए गए प्रोटोकॉल में यूटेरो इलेक्ट्रोपॉनेशन के आधार पर मल्टीकलर लेबलिंग का उपयोग किया जाता है ताकि कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को बाहर किया जा सके और उपयोगकर्ता के अनुकूल छवि विश्लेषण पाइपलाइन के साथ उनकी मात्रा और आकृति विज्ञान का विश्लेषण किया जा सके।

Abstract

माउस सेरेब्रल कॉर्टेक्स में स्थित प्रोटोप्लाज्मिक एस्ट्रोसाइट्स (पीआरए) कसकर निकटता वाले होते हैं, जो वयस्क चरणों में जाहिरा तौर पर निरंतर त्रि-आयामी मैट्रिक्स बनाते हैं। इस प्रकार अब तक, कोई इम्यूनोस्टेटिंग रणनीति उन्हें बाहर नहीं कर सकती है और परिपक्व जानवरों में और कॉर्टिकोजेनेसिस के दौरान उनकी आकृति विज्ञान को खंडित कर सकती है। कॉर्टिकल पीआरए पृष्ठीय पैलियम में स्थित जनकों से उत्पन्न होता है और आसानी से एकीकृत वैक्टर के यूटेरो इलेक्ट्रोपाउरेशन में उपयोग करके लक्षित किया जा सकता है। एक प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत किया जाता है बहुदंचालित जीनोम एकीकृत रंग (जादू) मार्कर रणनीति है, जो piggyBac/Tol2 पक्षांतरण औरCre/lox पुनर्संयोजन पर निर्भर करता है के साथ इन कोशिकाओं लेबल के लिए stochastically व्यक्त अलग फ्लोरोसेंट प्रोटीन (नीला, सियान, पीला, और लाल) विशिष्ट उपकोशिकीय डिब्बों को संबोधित किया । यह बहुरंगी भाग्य मानचित्रण रणनीति ग्लोजेनेसिस की शुरुआत से पहले रंग मार्कर के संयोजन के साथ सीटू पास के कॉर्टिकल प्रोजेनिटर में चिह्नित करने और व्यक्तिगत कोशिका स्तर पर भ्रूण से वयस्क चरणों तक एस्ट्रोसाइट्स सहित उनके वंशजों को ट्रैक करने में सक्षम बनाती है। बहुद्रेसेबल जीनोम-एकीकृत रंग मार्कर (मैजिक मार्कर या एमएम) द्वारा प्रदान किए गए इलेक्ट्रोपोटेड वैक्टर और रंग विरोधाभासों की एकाग्रता को समायोजित करके प्राप्त अर्ध-विरल लेबलिंग एस्ट्रोसाइट्स को व्यक्तिगत बनाने और अपने घने शारीरिक व्यवस्था के बावजूद अपने क्षेत्र और जटिल आकृति विज्ञान को अलग करने में सक्षम बनाता है। यहां प्रस्तुत एक व्यापक प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह है जिसमें इलेक्ट्रोपॉशन प्रक्रिया का विवरण, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मल्टीचैनल इमेज स्टैक अधिग्रहण और कंप्यूटर-असिस्टेड त्रि-आयामी विभाजन शामिल है जो प्रयोगकर्ता को व्यक्तिगत पीआरए वॉल्यूम और आकृति विज्ञान का आकलन करने में सक्षम बनाएगा। संक्षेप में, मैजिक मार्कर का इलेक्ट्रोपॉशन व्यक्तिगत रूप से कई एस्ट्रोसाइट्स को लेबल करने और विभिन्न विकासात्मक चरणों में उनकी शारीरिक विशेषताओं तक पहुंच प्राप्त करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है। ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों के साथ जटिल क्रॉस का सहारा लिए बिना विभिन्न माउस मॉडलों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट रूपात्मक गुणों का विश्लेषण करने के लिए यह तकनीक उपयोगी होगी।

Introduction

खगोल विज्ञान मस्तिष्क के विकास और शरीर विज्ञान में कई महत्वपूर्ण कार्य करते हैं1. रक्त-मस्तिष्क बाधा में उनकी भूमिका के अलावा जहां वे पोषक तत्वों के तेज और रक्त प्रवाह को विनियमित करते हैं, वे न्यूरोमोडुलेटर का उत्पादन करते समय इसके गठन और कार्य में सक्रिय रूप से योगदान देते हैं जो न्यूरोनल गतिविधि और व्यवहार2को बदल सकते हैं। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट डिसफंक्शन विभिन्न प्रकार के न्यूरोलॉजिकल विकारों में योगदान देता है3। सेरेब्रल कॉर्टेक्स में स्थित एस्ट्रोसाइट्स न्यूरोनल प्रक्रियाओं के साथ व्यापक संपर्क को सक्षम करने वाली एक विस्तृत आकृति विज्ञान प्रदर्शित करता है। ये संपर्क, सर्किट फ़ंक्शन के लिए आवश्यक, सेल-आसंजन प्रोटीन4के माध्यम से एस्ट्रोसाइट मॉर्फोजेनेसिस और सिंप्टोजेनेसिस को भी नियंत्रित करते हैं। न्यूरोसाइंटिस्टों को अपने ब्याज के न्यूरोलॉजिकल मॉडल में एस्ट्रोसाइट विकास और मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने के लिए सुविधाजनक और मजबूत उपकरणों की आवश्यकता होती है। हालांकि, अपने पड़ोसियों और उनके समान त्रि-आयामी टाइलिंग के लिए एस्ट्रोसाइट्स के करीबी अपोजिशन के कारण, कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स को बाहर करना और इम्यूनोमार्कर का उपयोग करके उनके आकृति विज्ञान का व्यापक आकलन करना चुनौतीपूर्ण है।

वर्तमान में, दो मुख्य जेनेटिक इंजीनियरिंग रणनीतियां सीटू में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लेबलिंग और वैकरण को सक्षम करती हैं: रिपोर्टर प्लाज्मिड के इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करके ट्रांसजेनिक माउस लाइनों या दैहिक ट्रांसजेनेसिस में विरल रिपोर्टर सक्रियण। पहली रणनीति चूहों के साथ एक फड़फड़ा रिपोर्टर माउस लाइन के प्रजनन पर निर्भर करती है जो विशेष रूप से टैमोक्सिफेन डिलीवरी (जैसे, Aldh1l1-CreERT25)पर एस्ट्रोसाइट्स में सक्रिय क्रे रिकॉम्बिनेंट के एक निष्क्रिय रूप को व्यक्त करती है। इस रणनीति से कई नुकसान जुड़े हैं। सबसे पहले, प्रजनन ट्रांसजेनिक चूहों को बड़ी संख्या में जानवरों की आवश्यकता होती है और कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की पर्याप्त रूप से विरल लेबलिंग प्रदान करने के लिए टैमोक्सिफेन की उचित खुराक निर्धारित करने के लिए कई परख की आवश्यकता होती है। ब्याज के आनुवंशिक माउस मॉडल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट फेनोटाइप का विश्लेषण करने के लिए और भी अधिक प्रजनन और माउस की खपत की आवश्यकता होगी। इसके अलावा, गर्भाशय टैमोक्सिफेन इंजेक्शन में पार्टिसिपरिट्यूशन में हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है, जिससे इस रणनीति को एस्ट्रोसाइट विकास के शुरुआती चरणों के अध्ययन पर लागू करना मुश्किल हो जाता है। वीवो डीएनए इलेक्ट्रोपॉन्टेशन में एक वैकल्पिक टैमोक्सिफेन-मुक्त रणनीति है जो कम से कम जानवरों की संख्या पर निर्भर करती है6। भ्रूणीय या प्रसवोत्तर चरणों में या तो किया जाता है, इस दृष्टिकोण में कृंतकों के पार्श्व वेंट्रिकल्स में रिपोर्टर प्लाज्मिड इंजेक्शन होते हैं जिसके बाद विद्युत दालें होती हैं जो कोशिका झिल्ली में छिद्र बनाती हैं, इसलिए डीएनए को वेंट्रिकल अस्तर की प्रोजेनिटर कोशिकाओं में प्रवेश करने की अनुमति देता है। इसके बाद, इलेक्ट्रोपेटेड प्लाज्मिड द्वारा किए गए रिपोर्टर ट्रांसजीन को लक्षित सेल मशीनरी द्वारा संसाधित किया जाता है और 7 व्यक्त कियाजाताहै। दो इलेक्ट्रोपॉरेशन विधियों को पहले माउस कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स लेबल करने के लिए वर्णित किया गया है: 1) इलेक्ट्रोपॉशन (पेले) द्वारा पोस्टनेट एस्ट्रोसाइट लेबलिंग, जो शुरुआती प्रसवोत्तर चरणों में 1-2 एकल रंग एपिसोमल रिपोर्टर प्लाज्मिड्स के इलेक्ट्रोपॉर्मेशन पर निर्भर करता है4; 2) कई एकल रंग एकीकृत रिपोर्टर प्लाज्मिड्स8,9,10के यूटेरो इलेक्ट्रोप्यूरेशन (आईयूई) में आधारित स्टारट्रैक रणनीति । हालांकि इन दो तकनीकों कुशलता से मस्तिष्क प्रांतस्था में पीआरए लेबल, वे भी कुछ सीमाएं मौजूद हैं । अपने प्रारंभिक संस्करण में, दोनों विधियां एस्ट्रोसाइट्स में अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) प्रमोटर पर भरोसा करते हैं, जो रेडियल ग्लिया के साथ-साथ पिल और प्रतिक्रियाशील एस्ट्रोसाइट्स की ओर लेबलिंग को पूर्वाग्रह कर सकता है जो सामान्य आराम पीआरए11, 12की तुलना में GFAP को अधिक दृढ़ता से व्यक्त करता है। पीला के बारे में, अन्य नुकसान इलेक्ट्रोपाउशन के देर से चरण हैं, जो प्रारंभिक जन्म वाले पीआरए (या शुरुआती डेलामिनेटिंग प्रोजेनिटर्स से उत्पन्न होने वाले) और एस्ट्रोग्लिया विकास के शुरुआती चरणों के विश्लेषण और एपिसोमल वैक्टर का उपयोग रोकता है जो पहले प्रसवोत्तर सप्ताह13,14के दौरान लगातार विभाजन के माध्यम से पतला हो जाते हैं। पीला के विपरीत, स्टारट्रैक एकीकृत रिपोर्टर प्लाज्मिड्स के भ्रूणीय इलेक्ट्रोपाउशन पर आधारित है जो पीएनए के लिए भ्रूण और प्रसवोत्तर दोनों जनकों के योगदान को ट्रैक करने की अनुमति देता है। सर्वव्यापक सी प्रमोटर (यूबीसी-स्टारट्रैक)पर निर्भर एक अद्यतनस्टारट्रैकयोजना तंत्रिका जनक15, 16,17के न्यूरोनल और ग्लियल वंश (एस्ट्रोसाइट्स शामिल) दोनों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की व्यापक अभिव्यक्ति प्राप्त करती है। हालांकि, इसके वर्तमान संस्करण में, इस दृष्टिकोण का कार्यान्वयन जटिल है, क्योंकि यह आंशिक उत्तेजन और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप के साथ छह फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) व्यक्त करने वाले 12 अलग प्लाज्मिड्स के समान मिश्रण पर निर्भर करता है।

यहां प्रस्तुत एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित एक मजबूत और मोटे तौर पर सक्रिय प्रमोटर द्वारा संचालित गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन-आधारित मल्टीकलर लेबलिंग विधि में एक सीधा है जो कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स14को बाहर करने के लिए है। इसके अलावा, लाइसेंस प्राप्त (उदाहरण के लिए, इमारिस) और ओपन एक्सेस(Vaa3D18, 19,20)छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एक आसान छवि विश्लेषण पाइपलाइन क्रमशः एस्ट्रोसाइट टेरिटोरियल वॉल्यूम और आर्बोराइजेशन को सेगमेंट करने के लिए प्रदान की जाती है। पहले वर्णित तरीकों की तुलना में, यह रणनीति पूरी तरह से 1-2 मल्टीकलर इंटीग्रेटिव ट्रांसजीन मल्टीड्रेसेबल जीनोम-इंटीग्रेटिंग कलर मार्कर (मैजिक मार्कर या एमएम21)पर निर्भर करती है, जिसका निर्देश साइटोप्लाज्मिक और (वैकल्पिक रूप से) परमाणु सेल डिब्बे को दिया जाता है जिसकी अभिव्यक्ति एक सिंथेटिक सीएजी प्रमोटर द्वारा संचालित होती है जिसमें साइटोमेगालोपायरस एनाउंसर शामिल होता है, चिकन β-ऐक्टिन प्रमोटर, और खरगोश β-ग्लोबिन स्प्लिस स्वीकार्य साइट22। यह भ्रूण से लेकर देर से प्रसवोत्तर चरणों तक कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की लेबलिंग और ट्रैकिंग में सक्षम बनाता है, जो जीएफएपी अभिव्यक्ति14,23से स्वतंत्र है। इन ट्रांसजीन के प्रत्येक निम्नलिखित चार अलग एफपी भालू: eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, और tdTomato/mCherry, जो ंयूनतम स्पेक्ट्रल ओवरलैप है कि आसानी से 1 के साथ दरकिनार किया जा सकता है प्रदर्शित) अनुक्रमिक चैनल अधिग्रहण; 2) अनुकूलित उत्तेजन शक्ति और संग्रह लाभ; और 3) संकीर्ण एफपी उत्सर्जन खिड़कियों को इकट्ठा करने के लिए विशिष्ट डिक्रोइक फिल्टर। एमएम रणनीति एक सेलुलर आबादी में एफपी की स्टोचस्टिक अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक आत्म-उत्तेजनीय क्रे रिकॉम्बिनेस (एसईसीआर) के साथक्रे/लोक्स पुनर्संयोजन का उपयोग करती है। एमएम ट्रांसजीन की एक प्रति एफपी को पारस्परिक रूप से अनन्य तरीके से व्यक्त करती है, जबकि कई ट्रांसजीन एफपी संयोजनों को जन्म देते हैं, जिससे दर्जनों अलग-अलग रंग बनते हैं। ट्रांसजीन का जीनोमिक एकीकरण पिग्गीबाक (पीबी) या टोल2 ट्रांसपोजिशन सिस्टम24,25, 26से प्रेरितहोताहै। इसलिए, गर्भाशय इलेक्ट्रोप्यूशन, एमएम टूलकिट और मल्टीकलर 'मोज़ेक' के माध्यम से जो यह उत्पन्न करता है, लंबी अवधि में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स सहित कई आसन्न कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स के एक साथ अंकन और उनके ग्लियल वंश की ट्रैकिंग को सक्षम करता है। रंग पीआरए के समोच्च के विशिष्ट एफपी परमिट चित्रण की अभिव्यक्ति के परिणामस्वरूप विरोधाभासों और बाद में उनके क्षेत्रीय मात्रा (IMARIS का उपयोग कर) और जटिल आकृति विज्ञान (Vaa3D का उपयोग कर) के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी निकालने । यहां विस्तार से प्रस्तुत बहुरंगी रणनीति एक सुविधाजनक और मजबूत विधि है जो विभिन्न विकासात्मक चरणों में जंगली प्रकार के चूहों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट सतह और आकृति विज्ञान तक त्वरित और आसान पहुंच प्रदान करता है, और ट्रांसजेनिक रिपोर्टर लाइनों का उपयोग किए बिना न्यूरोलॉजिकल रोगों के माउस मॉडल में एस्ट्रोसाइट शारीरिक विशेषताओं की जांच करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय है।

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Protocol

यहां वर्णित सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया । पशु प्रोटोकॉल चार्ल्स डार्विन पशु प्रयोग नैतिक बोर्ड (CEEACD/N ° 5) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. यूटेरो इलेक्ट्रोपॉशन में मैजिक मार्कर के लिए एंडोटॉक्सिन-फ्री प्लाज्मिड की तैयारी

  1. बैक्टीरियल ट्रांसफॉर्मेशन
    1. बर्फ पर, गल DH5 अल्फा सक्षम कोशिकाओं पर संग्रहीत-७० डिग्री सेल्सियस ।
    2. उपयुक्त एंटीबायोटिक (100 माइक्रोग्राम/एमएल एम्पीसिलिन या 50 माइक्रोग्राम/एमएल कानमाइसिन) युक्त आगर प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करें।
    3. गल डीएच 5 अल्फा सक्षम कोशिकाओं के 10 माइक्रोन में मैजिक मार्कर प्लाज्मिड डीएनए के 5-50 एनजी के 1 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण के बिना 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    4. हीट शॉक ट्रांसफॉर्मेशन के लिए, 45 एस के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में एलिकोट रखें, फिर तुरंत बर्फ पर रखें और 3-5 मिनट इंतजार करें।
    5. बाँझ परिस्थितियों में, एसओसी माध्यम के 230 माइक्रोन जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. आगार प्लेट के ऊपर एलिकोट की सामग्री फैलाएं और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. प्लाज्मिड संस्कृति
    1. अगले सुबह, बाँझ परिस्थितियों में, आगर प्लेट से एक कॉलोनी उठाओ और इसे उचित एंटीबायोटिक के साथ एलबी माध्यम के 2 एमएल युक्त 14 एमएल ट्यूब में डाल दें। इसे दिन के लिए 300 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. दिन के अंत में, बीज 300 एमएलबी एंटीबायोटिक के साथ 2 एमएल स्टार्टर संस्कृति का उपयोग कर कदम 1.2.1 से और 300 आरपीएम पर एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
  3. प्लाज्मिड डीएनए तैयारी
    1. अगली सुबह निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद एंडोटॉक्सिन मुक्त मैक्सिप किट का उपयोग करके मैजिक मार्कर प्लाज्मिड डीएनए (यानी, पीबी-सीएजी-साइटबो और टोल2-सीएजी-नुबो के साथ-साथ सीएजी संचालित प्लाज्मिड्स पीबी और टॉल2 ट्रांसपोसेस और क्रे रिकॉम्बेमिनेस को व्यक्त करने वाले) के शुद्धिकरण के साथ आगे बढ़ें।
    2. बाँझ पानी के 200 माइक्रोन में डीएनए को एल्यूट करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके इसकी एकाग्रता का अनुमान लगाएं।

2. गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन (एमएम आईयूई) में मैजिक मार्कर की तैयारी

  1. समाधान की तैयारी
    1. पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 0.9% खारा समाधान के गर्म 30 मिलील और सर्जरी की पूरी अवधि के दौरान इसे गर्म रखें।
    2. पीबी-सीएजी-साइटबो और टोल2-सीएजी-नुबो (अंतिम एकाग्रता, 0.8 μg/μL प्रत्येक), पीबी और Tol2 ट्रांसपोसेस (अंतिम एकाग्रता, 0.4 μg/μL प्रत्येक), CAG-seCre (अंतिम एकाग्रता, 0.16 μg/μL), और 0.01% तेजी से ग्रीन डाई सीए2 + और एमजी2 +के बिना PBS में।
      नोट: एस्ट्रोसाइट शारीरिक पुनर्निर्माण उद्देश्यों के लिए, Tol2-CAG-Nucbow निर्माण लोप किया जा सकता है । हालांकि, यह प्लाज्मिड बारीकी से निकटता वाले एस्ट्रोसाइट्स के दोहरे हिस्सों को अलग करने के लिए उपयोगी है और एस्ट्रोसाइट्स14के बीच क्लोनल संबंधों की जांच करने के लिए मैजिक मार्कर का उपयोग करते समय।
    3. नमकीन समाधान के 2 एमसीएल में पतला केटामाइन (100 मिलीग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोन और जाइलाज़ीन (20 मिलीग्राम/एमएल) के 100 माइक्रोन युक्त एनेस्थेटिक समाधान तैयार करें।
    4. खारा समाधान में 0.3 मिलीग्राम/एमएल बुप्रेनोरफिन स्टॉक समाधान 1:10 को कमजोर करके एनाल्जेसिक समाधान तैयार करें।
  2. सर्जरी सामग्री की तैयारी
    1. एक ग्लास मनका स्टरलाइजर या समकक्ष में उच्च तापमान पर सर्जिकल उपकरण (सामग्री की तालिकादेखें) को स्टरलाइज करें।
    2. इलेक्ट्रोड जेल की एक बूंद को 35 एमएम डिश में रखें।
    3. माइक्रोइंजेक्टर धारक में माइक्रोपिपेट डालें, माइक्रोपिपेट की नोक को तोड़ें, और डीएनए समाधान की आकांक्षा करें।
    4. फास्ट ग्रीन समाधान (0.01%) एक 3 सेमी डिश के ढक्कन में और, इसे संदर्भ के रूप में उपयोग करते हुए, माइक्रोपिपेट की नोक के व्यास को ठीक संदंश के साथ अपनी नोक को तोड़कर समायोजित करें। दबाव पैरामीटर को समायोजित करें ताकि माइक्रोइंजेक्टर द्वारा समकक्ष आकार की बूंदें उत्पादित की जा सकें, जिससे प्रति इंजेक्शन डीएनए समाधान के लगभग 1 माइक्रोन की डिलीवरी को सक्षम किया जा सके।
  3. गर्भवती महिला माउस की तैयारी
    1. RjOrl वजन: स्विस गर्भवती माउस।
    2. एनेस्थेटिक समाधान के शरीर के वजन (बीडब्ल्यू) के प्रति ग्राम 12.5 माइक्रोन के साथ एक इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन करें। 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें और सत्यापित करें कि माउस अपने पंजे को चुटकी देकर सो रहा है।
    3. एक बार जब जानवर चुटकी लेने के लिए अनुत्तरदायी है, यह एनाल्जेसिक समाधान के १.६ μL/g BW के साथ चमड़े की तरह इंजेक्ट ।
    4. सर्जरी के दौरान सुखाने को रोकने के लिए प्रत्येक आंख पर नेत्र जेल की एक बूंद जोड़ें और जानवरों के पेट को वार्मिंग पैड पर रखें।
    5. धीरे-धीरे अपने पेट को शेव करें, इसे आयोडीन से भिगोए गए पैड से साफ करें, और मुंडा क्षेत्र को अल्कोहल पैड के साथ साफ करें।
    6. मुंडा, साफ, और साफ क्षेत्र के आसपास बाँझ संपीड़न रखकर एक ऑपरेटिंग फील्ड की व्यवस्था करें।

3. गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉरेशन (आईयूई) में

  1. इंट्रावेंट्रिकुलर इंजेक्शन
    1. पेट के निचले हिस्से में, त्वचा के माध्यम से, और फिर अंतर्निहित मांसपेशियों के माध्यम से मिडलाइन के साथ 2 सेमी-ऊर्ध्वाधर चीरा काटें। भ्रूणीय बैग में धीरे-धीरे हेरफेर करके गर्भाशय के सींगों का पर्दाफाश करें और गर्भाशय ग्रीवा के स्थान और गर्भाशय ग्रीवा के प्रत्येक पक्ष पर भ्रूणीय बैग की संख्या का आकलन करें।
    2. E15.5 भ्रूण के मस्तिष्क को इलेक्ट्रोपेटेड होने के लिए ब्रेग्मा देखने के लिए उन्मुख करें, आसानी से इसके स्थान के रूप में पहचाना जाता है जो सेरेब्रल फिशर्स के साथ चलने वाली तीन मुख्य रक्त वाहिकाओं के जंक्शन से मेल खाता है।
    3. ब्रेग्मा (खोपड़ी के माध्यम से दिखाई) और आंख के बीच एक आभासी रेखा की कल्पना करो; आभासी रेखा और देशांतर दरार के बीच माइक्रोपिपेट का परिचय दें, फिर लक्षित गोलार्द्ध के पार्श्व वेंट्रिकल में डीएनए समाधान के 1 माइक्रोन देने के लिए इंजेक्टर के पैर पेडल को दबाएं।
      नोट: जब उचित स्थान पर इंजेक्शन, भरा पार्श्व वेंट्रिकल नीला प्रतीत होता है, यह दर्शाता है कि यह डीएनए समाधान से भर दिया गया है ।
  2. इलेक्ट्रोपाउनेशन
    1. इंजेक्शन गोलार्द्ध को कवर करने वाले एनोड के साथ इंजेक्शन भ्रूण के दोनों किनारों पर इलेक्ट्रोड (सामग्रीकी तालिका देखें), पहले इलेक्ट्रोड जेल में डूबा हुआ) लागू करें। इलेक्ट्रोपोरेटर के पैर पेडल प्रेस 35 वी के चार 50 एमएस दालों की एक श्रृंखला देने के लिए, प्रत्येक एक 950 एमएस अंतराल से अलग.
    2. गर्म नमकीन समाधान के साथ भ्रूण गीला।
      नोट: भ्रूण पूरे शल्य चिकित्सा आपरेशन के दौरान गरम खारा समाधान का उपयोग कर आर्द्र रखा जाना चाहिए और गर्भाशय बाहर सूख नहीं होना चाहिए ।
    3. प्रत्येक भ्रूण के लिए 3.1.2-3.2.2 कदम दोहराएं।
    4. एक बार सभी लक्षित भ्रूण को इलेक्ट्रोपेटेड किया गया है, तो पेट में गर्भाशय के सींगों को धीरे से अपनी मूल स्थिति में वापस संदंश के साथ धक्का देकर बदलें। गर्भाशय को सूखने से रोकने के लिए गर्म नमकीन समाधान के साथ पेट की गुहा को भरें जबकि टांके बनाए जाते हैं।
    5. पहले एक सतत अवशोषण सीवन के साथ पेट की मांसपेशियों को बंद करें, और फिर 4-0 सीवन का उपयोग करके कई व्यक्तिगत टांके (~ 10) के साथ त्वचा।
    6. एक साफ पिंजरे में जानवर रखो, एक साफ कागज तौलिया पर अपनी तरफ झूठ बोल रही है और हर 5-10 मिनट दूसरी तरफ जानवर बारी जब तक यह जाग और अपने दम पर चलती शुरू होता है ।
    7. अगले दिन जानवर की स्थिति का आकलन करें, खासकर अगर घोंसला बनाया गया है।
      नोट: कोई पोस्टसर्जरी उपचार की आवश्यकता है। घोंसला के अभाव में, दर्द का कोई भी संकेत (जैसे, साध्वनि, झबरा फर), और/या भारी रक्तस्राव, जानवर को बिना किसी देरी के इच्छामृत्यु दी जानी चाहिए ।

4. ऊतक संचयन और खंड

  1. ऊतक संग्रह
    1. वांछित कटाई के समय टर्मिनल संज्ञाहरण के लिए फेनोबार्बिटल (100 मिलीग्राम/किलो बीडब्ल्यू) इंट्रापेरिटील इंजेक्ट करें। इस मामले में, कटाई के समय प्रसवोत्तर (पी) दिन P4, P7, और P21 पर थे ।
    2. कोल्ड प्रीमेड पैराफॉर्मल्डिहाइड-आधारित समाधान का उपयोग करके इंट्राकार्डिएक परफ्यूजन करें।
    3. मस्तिष्क को विच्छेदन करें और इसे पोस्टफिक्सेशन के लिए पैराफॉर्मलडिहाइड-आधारित समाधान में 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखें।
  2. प्रोटोकॉल
    1. अगले सुबह 1x PBS के साथ 10 मिनट के लिए मस्तिष्क 3x कुल्ला ।
    2. 3% एगर में मस्तिष्क एम्बेड 1x पीबीएस में भंग हो गया।
    3. एक कंपन ब्लेड माइक्रोटॉम का उपयोग कर 80 माइक्रोन वर्गों में कटौती करें।
    4. 1x पीबीएस के साथ पहले से भरे 24 अच्छी तरह से प्लेट में अनुभागों को इकट्ठा करें।
    5. स्लाइड और कवरलिप के बीच बढ़ते माध्यम (सामग्री की तालिकादेखें) में माउंट सेक्शन। इष्टतम फ्लोरोसेंट प्रोटीन संरक्षण और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर घुड़सवार स्लाइड रखें।

5. मल्टीचैनल कॉन्फोकल इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप सेटिंग्स
    1. क्रमशः 440, 515, और 559 एनएम लेजर लाइनों का उपयोग करके क्रमशः 240, 515, और 559 एनएम लेजर लाइनों का उपयोग करके अलग से mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry उत्तेजित करने के लिए कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के विन्यास की स्थापना की।
    2. 20x 0.8 एनए (या उच्च एनए) उद्देश्य का उपयोग करें और Nyquist मानदंडों के अनुसार XY नमूना और जेड-स्टेप आकार को समायोजित करें।
      नोट: उच्च संकल्प (जैसे, 60x 1.4 एनए तेल उद्देश्य) और डिकोवोल्यूशन एल्गोरिदम के साथ प्राप्त छवियां एस्ट्रोसाइट आर्बर के महीन विवरणों के पुनर्निर्माण में सक्षम होंगी। हालांकि, प्रयोगकर्ता को ध्यान रखना चाहिए कि बेहतरीन एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं को पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा हल नहीं किया जा सकता है।
  2. छवि अधिग्रहण
    1. इलेक्ट्रोपोटेड क्षेत्र में सबसे प्रतिभाशाली एस्ट्रोसाइट्स का पता लगाएं।
    2. क्योंकि सतह के करीब स्थित लेबल कोशिकाओं टुकड़ा में गहरे उन लोगों की तुलना में उज्जवल दिखाई दे सकता है, सतह कोशिकाओं पर अधिग्रहण सेटिंग्स समायोजित करने के लिए छवियों संतृप्त से बचने के लिए ।
    3. HiLo LUT का उपयोग करके पिक्सेल संतृप्ति से बचने के लिए सुनिश्चित करते हुए तीन चैनलों में से प्रत्येक के लिए अधिग्रहण सेटिंग्स को अलग से समायोजित करें, जो शून्य मानों को नीले और अधिकतम पिक्सेल मानों के रूप में लाल रंग के रूप में प्रदर्शित करता है।
      नोट: एक पर्याप्त रूप से संतुलित छवि केवल कुछ नीले और लगभग कोई लाल पिक्सेल प्रदर्शित करना चाहिए ।
    4. माइक्रोस्कोप के मोटरीकृत चरण का उपयोग करके टाइल वाले 1,024 x 1,024 पिक्सेल जेड-स्टैक प्राप्त करें, जिसमें आसन्न ढेरों के बीच 10% ओवरलैप के साथ बाद में इलेक्ट्रोपोटेड क्षेत्र या ब्याज के क्षेत्र के मोज़ेक पुनर्निर्माण को सक्षम किया जा सके।

6. एस्ट्रोसाइट टेरिटोरियल वॉल्यूम सेगमेंटेशन

नोट: यह एक वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर प्रोग्राम (जैसे, IMARIS) का उपयोग करके किया जाता है।

  1. डेटासेट की तैयारी
    1. इमेज्ड टिश्यू सेक्शन में पूरी तरह से संलग्न कोशिकाओं का चयन करके 3 डी पुनर्निर्माण (250 x 250 पिक्सल) के भीतर लेबल वाले एस्ट्रोसाइट्स को क्रॉप करें।
      नोट: यदि उपयोग किए गए कंप्यूटर उन्हें संभाल सकते हैं तो बड़ी मात्रा पर सीधे काम करना भी संभव है।
    2. प्रत्येक एस्ट्रोसाइट के लिए एक नई सतह बनाने के लिए पार देखने के ऑब्जेक्ट टूलबार में ब्लू सरफेस बटन पर क्लिक करें।
    3. बेहतर विज़ुअलाइज़ेशन कंट्रास्ट प्राप्त करने के लिए, सबसे पहले एडिट | पर क्लिक करके न्यूनतम और अधिकतम रंग विपरीत मूल्यों को समायोजित करें डिस्प्ले एडजस्टमेंट ऑप्शन दिखाएं और दोनों हैंडल खींचें। यदि आवश्यक हो, तो एक नया रंग चुनने के लिए डिस्प्ले एडजस्टमेंट विंडो में चैनल नाम पर सीधे क्लिक करके चैनल का रंग बदलें।
      नोट: अधिमानतः हमेशा दृश्य पूर्वाग्रह को रोकने के लिए एक ही रंग प्रदर्शन के साथ काम करते हैं।
    4. एडिट | पर क्लिक करें इमेज गुण माइक्रोमीटर में वोक्सल आकार को मैन्युअल रूप से इंगित करते हैं। यदि स्वर आकार सही नहीं है, तो वॉल्यूम गणना गलत होगी।
    5. नई सेटिंग्स को सेव करें।
  2. सतह विभाजन
    1. सतह पेश करने के लिए ब्लू आइकन का उपयोग करें। एक सतह आइकन और बॉक्स दृश्य सूची में दिखाई देगा। वॉल्यूम बॉक्स डेटासेट को देखने/छिपाने की अनुमति देता है।
    2. सरफेस लाइन का चयन करें और स्किप ऑटोमैटिक क्रिएशन | पर क्लिक करें मैन्युअल रूप से संपादित करें।
    3. कंटूर | पर क्लिक करें दृश्यता और कोई क्लिक करें। इसके बाद सिलेक्ट व्यू पर मूव करें और ड्रॉ बटन पर क्लिक करें।
    4. ड्राइंग मोड का चयन करने के लिए मोड पर क्लिक करें।
    5. तेज और कुशल आइसोलिन सेमीऑटोमेटेड ड्राइंग टूल का उपयोग करें। उस पर माउस पॉइंटर ले जाकर सेल आउटलाइन को परिभाषित करें। यदि आइसोलिन पूर्वावलोकन एस्ट्रोसाइट रूपरेखा से मेल नहीं खाते हैं, तो माउस पॉइंटर स्थिति को समायोजित करें। पूर्वावलोकन को मान्य करने के लिए, चयन पर क्लिक करें। संभावित गलतियों को ठीक करने के लिए, वर्तमान जेड-प्लेन कंटूर को हटाने या सीटीआरएल + जेडको दबाने के लिए बोर्ड विंडो का उपयोग करें।
    6. स्लाइस | का उपयोग करना जेड-विमानों के माध्यम से नेविगेट करने की स्थिति, जेड-प्लेन नंबर बदलकर अगले विमान में जाएं और एक नया समोच्च शुरू करें। अधिमानतः कोशिका के बीच से शुरू करें और फिर हाथ-पैरों में चले जाएं।
    7. जब एस्ट्रोसाइट युक्त सभी जेड-विमानों में रूपरेखा तैयार की गई हो, तो क्रिएट सरफेसपर क्लिक करें। एक सतह बनाने से पहले, जांच लें कि सभी घटक जुड़े हुए हैं। यदि नहीं, तो वॉल्यूम डेटा निर्यात करने से पहले सबसे बड़ा चयन करें या प्रासंगिक लोगों को कनेक्ट करें।
    8. डेटा पैनल में प्रदर्शित मात्रात्मक डेटा की जांच करें और स्प्रेडशीट प्रारूप में निर्यात के आंकड़ों, वॉल्यूम वैल्यू और यूनिट की बचत करें ।
    9. बाद में इसे एक्सेस करने के लिए एक नए नाम के नीचे सतह को सहेजें।

7. ट्रेसिंग एस्ट्रोसाइट आर्बोराइजेशन

नोट: यह ओपन एक्सेस सॉफ्टवेयर प्रोग्राम Vaa3D का उपयोग करके किया जाता है।

  1. डेटासेट की तैयारी
    1. छवि स्टैक लोड करें और अलग-अलग रंग प्रदर्शित करने वाले अलग-अलग एस्ट्रोसाइट्स या आस-पास के एस्ट्रोसाइट्स की खोज करें।
      नोट: उद्देश्य एनए और नमूना बढ़ाकर पुनर्निर्माण के संकल्प में सुधार किया जा सकता है। अंततः, हालांकि, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की संकल्प सीमा के कारण, बेहतरीन एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं का सही पता नहीं लगाया जा सकता है। अधिग्रहीत छवियों के संकल्प से परे अतिगमेंटिंग से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए।
    2. फिजी का उपयोग करके, प्रत्येक एस्ट्रोसाइट के चारों ओर फसल 250 x 250 पिक्सेल छवि ढेर।
    3. चूंकि Vaa3D ट्रेसिंग केवल एक रंग पर की जाती है, इसलिए एक चैनल का चयन करें और अन्य चैनलों को निष्क्रिय करें।
    4. छवि को आरजीबी में परिवर्तित करें और इसे .tiff प्रारूप में सहेजें।
  2. आर्बर ट्रेसिंग
    1. Vaa3D में आरजीबी छवि खोलें। इमेज | पर जाएं डेटा | ज्यामिति तो छवि resampling,और एक्स/वाई और जेड स्वर आकार मूल्यों को समायोजित करें ।
      नोट: एस्ट्रोसाइट आर्बर्स का पुनर्निर्माण करते समय, छवियों द्वारा प्रदान किए गए संकल्प की तुलना में विवरण बेहतर का पता लगाने के लिए देखभाल नहीं की जानी चाहिए।
    2. पूरी छवि के लिए 3D दर्शक | कल्पना पर क्लिक करके एक 3Dविंडो खोलें । 3D इमेज पर राइट-क्लिक करें और मार्कर को परिभाषित करने के लिए 1-राइट-क्लिकचुनें । कर्सर एस्ट्रोसाइट के केंद्र के साथ बिंदु और फिर सही क्लिक एक मार्कर सेट करने के लिए ।
      नोट: 3D दृश्य तक पहुंच के लिए एस्केप पर फिर से क्लिक करें।
    3. एडवांस्ड | 3डी ट्रेसिंग | पर जाएं Vaa3D-न्यूरॉन2-ऑटो ट्रेसिंग।
    4. नई खोली गई विंडो पर, उस चैनल का चयन करें जिस पर प्लग-इन लागू करना है।
    5. पृष्ठभूमि सीमा चुनें (अक्सर 30 से 90 के बीच)। यदि आवश्यक हो तो प्रत्येक एस्ट्रोसाइट के लिए इस मूल्य को अनुकूलित करें।
    6. 2D से अनचेक त्रिज्या और ऑटो-डाउन नमूना और ऑटो-रिसंपल की जांच रखें।
    7. 3 पर cnn_type सेट, 1 पर length_thresh, और ०.१ पर SR_ratio ।
    8. ठीकक्लिक करने के बाद, सुनिश्चित करें कि प्लग-इन मूल नाम के आधार पर स्वचालित रूप से दो फाइलें उत्पन्न करता है। प्रत्यय -ini.swc और -coordinateX-coordinateY-coordinateZ-app2.swc जोड़ा जाएगा। प्लग-इन को चलाना जारी रखते हुए उन्हें ओवरराइट न करने के लिए मैन्युअल रूप से इन नाम फ़ाइलों में एक विशिष्ट लेबल जोड़ें।
    9. ओपन ऑब्जेक्ट मैनेजर,न्यूरॉन | पर जाएं लाइन संरचना,ट्रेस किए गए एस्ट्रोसाइट का चयन करें, डिस्प्ले मोडपर क्लिक करें, और हमेशा लाइन मोडका चयन करें।
    10. 3डी विंडो पर वापस जाएं, जहां एस्ट्रोसाइट का कंकाल दिखाई देता है।
      नोट: यदि विभाजन और संकेत मेल नहीं खाते हैं, तो चरण 7.2.3-7.2.10 दोहराएं और सीमा को तब तक समायोजित करें जब तक वे ऐसा न करें। प्लग-इन पुनः आरंभ होने पर उन्हें रीसेट किए जाने के साथ-साथ अन्य मापदंडों को फिर से दर्ज करना सुनिश्चित करें।
    11. कंकाल पर सही क्लिक करें और लाइन | पहली पसंद न्यूरॉन का चयन करें #1... मात्रात्मक माप तक पहुंचने के लिए APP2_Tracing जो एक नई खिड़की की सतह पर दिखाई देगा| ऑब्जेक्ट एनोटेशन।
      नोट: प्रकाश माइक्रोस्कोपी के सीमित संकल्प के कारण, शाखाओं की सूचीबद्ध वस्तुओं की संख्या और विभाजन की संख्या के तहत प्रदर्शित माप केवल एस्ट्रोसाइट आर्बर जटिलता का एक मोटा अनुमान प्रदान करते हैं ।

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Representative Results

भ्रूण कॉर्टिकल प्रोजेनिटर में मैजिक मार्कर का इलेक्ट्रोपॉशन सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकास(चित्रा 1)के शुरुआती से देर चरणों तक एस्ट्रोसाइट्स की लेबलिंग के लिए अनुमति देता है। ये एस्ट्रोसाइट्स विभिन्न प्रसवोत्तर चरणों (पी 4, पी 7, पी 21) में सभी कॉर्टिकल परतों में पाए गए क्योंकि वे पूरे सेरेब्रल कॉर्टेक्स में व्यापक रूप से फैले हुए थे। उन्हें 20x 0.8 एनए (या उच्च एनए) उद्देश्य के साथ अधिग्रहीत टाइल वाली कॉन्फोकल छवियों के साथ मूल्यांकन किया गया था और जेड-स्टैक पुनर्निर्माण(चित्रा 2)के रूप में इकट्ठा किया गया था। मैजिक मार्कर संयोजन लेबलिंग कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के व्यक्तिगतकरण और उनकी मात्रा और आकृति विज्ञान के बारे में जानकारी निकालने में सक्षम है। वाणिज्यिक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, प्रत्येक एस्ट्रोसाइट(चित्र 3)द्वारा कब्जे वाले क्षेत्रीय डोमेन को सेगमेंट और पुनर्निर्माण करने के लिए कॉन्फोकल इमेज स्टैक के प्रत्येक व्यक्तिगत ऑप्टिकल सेक्शन पर व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स का समोच्च चित्रित किया गया था। एक ही जेड-इमेज स्टैक से, सिंगल-आउट कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की शाखाबद्ध आकृति को खुले एक्सेस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके खंडित किया गया था जो मुख्य एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं(चित्र 4)के कंकाल को निकालने की अनुमति देता है। इन विभाजन और अनुरेखण उपकरणों ने क्षेत्रीय मात्रा(चित्र 3) और रूपात्मक जटिलता(चित्रा 4)की वृद्धि का अर्धकांश आकलन प्रदान किया जो व्यक्तिगत कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स के लिए शुरुआती से देर से पोस्टटलचरणों 14तक हुआ था । इन दृष्टिकोणों से विकास के समान चरण में अलग - अलग कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स द्वारा प्रदर्शित मात्रा और आकृति विज्ञान की विषमता का भी पता चला, जैसा कि चित्र 2, चित्र 3और चित्र 4में दर्शाया गया है।

Figure 1
चित्रा 1: मस्तिष्क के विकास के दौरान कॉर्टिकल जनकों और उनके वंश को लेबल करने के लिए गर्भाशय इलेक्ट्रोपॉनेशन (आईयूई) में मैजिक मार्कर (एमएम) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)एमएम टूलकिट में कई प्लाज्मिड्स एन्कोडिंग पीबी-साइटबो, टोल2-नुबो,पीबी और टोल2 ट्रांसपोसेस, और सेल्फ-एक्सर्सेबल क्रे रिकॉम्बेनेस (एसईआरई) शामिल हैं । एमएम निर्माण में, असंगत लोक्स साइटों के तीन जोड़े(loxN, lox2272,और loxP)चार अलग एफपी कोडिंग दृश्यों (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) पार्श्व और क्रे पुनर्संयोजन पर उत्तेजना की पारस्परिक रूप से विशेष संभावनाएं बनाते हैं । क्रे कार्रवाई से पहले, केवल पहला जीन (EBFP2) व्यक्त किया जाता है। सीक्रे द्वारा प्रेरित क्रे-मध्यस्थता उत्तेजना के बाद, या तो टीडीटोमाटो/एमचेरी (रेड एफपी), ईवाईएफपी (ग्रीन एफपी), या mTurquoise2/mCerulean (सियान एफपी) व्यक्त किया जाता है। कई मैजिक मार्कर प्रतियों से एफपी की सह-अभिव्यक्ति लेबल कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म(पीबी-सीएजी-साइटबो)या नाभिक(Tol2-CAG-Nucbow)में रंग संयोजन पैदा करती है। पीबी और टॉल2 ट्रांसपोजिशन एंडफीट तैयार एमएम कैसेट कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स के जीनोम में उनके एकीकरण की अनुमति देते हैं जब एमएम का निर्माण पीबी और टोल2 ट्रांसपोसेस कोडिंग प्लाज्मिड्स के साथ सह विद्युतीकृत होता है। (बी-जी) आईयूई के लगातार चरणों का ग्राफिक चित्रण जिसमें एनेस्थेटाइज्ड गर्भवती चूहों(बी),भ्रूण के पार्श्व वेंट्रिकल्स(डी)में एमएम प्लाज्मिड मिक्स(सी)का इंजेक्शन, दो मस्तिष्क गोलार्द्धों(एफ)में से एक में कॉर्टिकल प्रोजेनिटर को लक्षित करने के लिए सावधानीपूर्वक तैनात ट्वीज़रट्रोड्स(ई)के माध्यम से बिजली की दालों की डिलीवरी, और गर्भवती माउस पेट(जी)की मुकदमा) । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2: मैजिक मार्कर टूलकिट के गर्भाशय इलेक्ट्रोपाउशन में निम्नलिखित, मल्टीकलर एस्ट्रोसाइट्स पोस्टनेटल चरणों में पूरे सेरेब्रल कॉर्टेक्स में बिखरे हुए पाए गए। E15.5 माउस कॉर्टिकल प्रोजेनिटर में एमएम, सेक्री, पीबी और टोल2 ट्रांसपोसेस अभिव्यक्ति चलाने वाले प्लाज्मिड्स के आईयूई के परिणामस्वरूप पी 4, पी 7 और पी 21 में परत 2-3 न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की लेबलिंग हुई। अभिव्यक्ति स्तर और रंग पैलेट कॉर्टिकल जनकों के जीनोम में एकीकृत एमएम ट्रांसजीन की संख्या पर निर्भर करता है। टाइल वाले कॉन्फोकल इमेज स्टैक से अधिकतम तीव्रता अनुमानों का असेंबल 80 माइक्रोन सैगिटल मस्तिष्क वर्गों पर अधिग्रहीत किया जाता है। स्केल बार: 200 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: अलग-अलग विकासात्मक चरणों में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट क्षेत्रीय डोमेन का विभाजन। तीन अलग-अलग विकासात्मक चरणों में वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर(ए-एफ'के साथ खंडित फसली कॉन्फोकल जेड-स्टैक फ्रेमिंग व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स(ए-एफ)और उनके संबद्ध क्षेत्रीय डोमेन के अधिकतम तीव्रता अनुमान क्रमशः पी 4(ए-बी, ए'-बी),पी7(सी-डी),और पी21 (ई-एफ, ई'-एफ')। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट आर्बोराइजेशन का ट्रेसिंग। दो अलग-अलग एस्ट्रोसाइट्स के उदाहरण कॉन्फोकल जेड-स्टैक(ए-डी)से प्राप्त किए गए और दो अलग-अलग विकास चरणों में एकत्र किए गए Vaa3D(A'-D'के साथ उनके आर्बोराइजेशन के पुनर्निर्माण: पी 7(ए-बी, ए'-बी')और पी 21(सी-डी, सी-डी')क्रमशः। स्केल बार: 20 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स(चित्रा 1)में मैजिक मार्कर के यूटेरो इलेक्ट्रोपॉशन (आईयूई) में विभिन्न प्रसवोत्तर चरणों (पी 4-पी 7-पी 21, चित्रा 2)पर पोस्टनेटल सेरेब्रल कॉर्टेक्स में एस्ट्रोसाइट्स की सक्षम लेबलिंग में। दिलचस्प बात यह है कि आईयूई का चरण महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि इलेक्ट्रोपॉशन E13.5 से E15.5 तक किया जाता है, जो कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स14से संबंधित समान लेबलिंग पैटर्न पैदा करता है। हालांकि, कॉर्टिकल पैरेंचिमा में लेबल पिरामिड न्यूरॉन्स का स्थान इलेक्ट्रोपॉरेशन चरण के साथ भिन्न होता है। दरअसल, आईयूई ने E15 मार्क्स लेयर 2-3 न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया जबकि आईयूई ने E13 लेबल पिरामिड न्यूरॉन्स पर सभी कॉर्टिकल परतों में, परत 5 से परत 2-36,27तक प्रदर्शन किया। एमएम आईयूई के बाद कॉर्टिकल पिरामिड न्यूरॉन्स का यह संयुक्त लेबलिंग इस विधि की मुख्य सीमा है, क्योंकि यह परतों में एस्ट्रोसाइट आकृति विज्ञान के अर्ध-उपकरण विभाजन को रोकता है जहां घने न्यूरोनल लेबलिंग एस्ट्रोसाइट प्रक्रियाओं की मान्यता में हस्तक्षेप करते हैं। यह एक समस्या होनी चाहिए, एमएम को पेले में पोस्टनेल चरणों में विद्युतीकृत किया जा सकता है। पी 4 में, उस स्तर पर अभी भी मौजूद रेडियल ग्लिया फाइबर की लेबलिंग भी Vaa3D arbor विभाजन के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। जबकि बोझिल, एक समाधान अगर कोई इस स्तर पर एस्ट्रोसाइट आर्बर पुनर्निर्माण के साथ आगे बढ़ना चाहता है तो एडोब फोटोशॉप का उपयोग करके ब्याज के एस्ट्रोसाइट के आसपास काले पिक्सेल के साथ रेडियल फाइबर सिग्नल को उत्तरोत्तर रूप से बदलकर रेडियल ग्लियल फाइबर को मैन्युअल रूप से हटाना है।

इस सीमा के बावजूद, एमएम आईयूई एक शक्तिशाली तकनीक है जब पर्याप्त रूप से प्रदर्शन किया जाता है। कुछ महत्वपूर्ण कदम देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए: 1) भ्रूण पूरी सर्जरी प्रक्रिया के दौरान आर्द्र रखा जाना चाहिए और ध्यान से उनके अस्तित्व को बढ़ाने के लिए हेरफेर; 2) एक बड़े व्यास या भ्रूण बैग फैलाएंगे के साथ कांच केशिकाओं का उपयोग भी कसकर बैग टूटना और इसलिए भ्रूण की मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं; 3) डीएनए इंजेक्शन के दौरान, रक्तस्राव को रोकने के लिए रक्त वाहिकाओं से बचा जाना चाहिए; 4) भ्रूण के अस्तित्व को अधिकतम करने के लिए पूरी प्रक्रिया संज्ञाहरण से सीवन तक 40 मिनट से अधिक समय तक नहीं होनी चाहिए; 5) तनाव आईयूई की सफलता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और इसलिए तनाव के अतिरिक्त स्रोत जैसे पिंजरे, परिवहन, शोर और कंपन को बदलने से 5 दिन पहले सर्जरी से जन्म के बाद 7 दिनों तक बचा जाना चाहिए ताकि गर्भपात और नरभक्षी को रोका जा सके।

ध्यान दें, किसी दिए गए चरण में पैदा हुई कोशिकाओं को विशेष रूप से लक्षित करने के इच्छुक प्रयोगकर्ता पिग्गीबाक और टोल2 ट्रांसपोसेस को जोड़ने के बिना एमएम टूलकिट का उपयोग कर सकते हैं, जैसे कि केवल इलेक्ट्रोप्यूरेशन के समय पैदा होने वाली कोशिकाएं संयोजन लेबल व्यक्त करती हैं। विधि का एक और लाभ लचीलापन है कि यह लेबल कोशिकाओं के घनत्व और विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों में उनके स्थान के संदर्भ में प्रदान करता है । दरअसल, प्लाज्मिड्स अनुपात को स्थिर रखते हुए एमएम ट्रांसजीन की कुल एकाग्रता को बढ़ाकर कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की डेंजर लेबलिंग हासिल की जा सकती है (क्रे रिकॉम्बिनेंटस/एमएम निर्माण के लिए 1:10 अनुपात और ट्रांसपोसेस/एमएम निर्माण के लिए 1:2 अनुपात)। मोनोक्रोम दृष्टिकोणों के विपरीत, जैसे एआई 9 चूहों में एकल रंग ट्रांसपोसंस या क्रे इलेक्ट्रोपॉशन का इलेक्ट्रोपॉजेशन, जहां व्यक्तिगत एस्ट्रोसाइट्स को एकल करने की क्षमता को विरल लेबलिंग की आवश्यकता होती है, मैजिक मार्कर रणनीति द्वारा पेश किए गए रंग विरोधाभास लेबलिंग घनत्व की एक विस्तृत श्रृंखला पर एस्ट्रोसाइट्स के व्यक्तिगतकरण को सक्षम करते हैं। इसके अलावा, अलग-अलग झुकाव में इलेक्ट्रोड प्रोब्स की स्थिति संभावित स्ट्राटम (वेंट्रल स्थिति में एनोड, सेरेब्रल कॉर्टेक्स में इलेक्ट्रोपॉरेशन प्राप्त करने के लिए आवश्यक पृष्ठीय स्थिति के विपरीत), या हिप्पोकैम्पस (मध्यीय स्थिति में एनोड)28जैसे अलग मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने की अनुमति देती है। अंत में, आईयूई को विभिन्न चूहों के उपभेदों जैसे आउटब्रीड (OF1, स्विस) और इनस्ल (C57BL/6J या N) चूहों में किया जा सकता है, जो ट्रांसजेनिक पशु रोग मॉडल में एमएम टूलकिट के उपयोग के लिए रास्ता खोलता है। हालांकि, सफलतापूर्वक inbred चूहों में आईयूई प्राप्त करने के लिए, एक दालों की संख्या (C57BL/6 चूहों बनाम स्विस में पांच दालों के लिए तीन दालों), वोल्टेज (35 वी के बजाय 30 V), और एनाल्जेसिक खुराक (०.१५ मिलीग्राम/एमएल buprenorphine स्टॉक समाधान और ०.८ μL/g BW) की एक इंजेक्शन मात्रा के अनुकूल होना चाहिए ।

ट्रांसजेनिक पशु प्रजनन या पेले और स्टारट्रैक दृष्टिकोणों की तुलना में, यह विधि कई फायदे प्रदान करती है। के साथ शुरू करने के लिए, प्रजनन रणनीति के विपरीत, यह कुछ जानवरों का उपयोग करता है । यह भी उनके विकास के शुरुआती चरणों के बाद से कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स की लेबलिंग की अनुमति देता है, भ्रूणीय चरणों सहित, पीला4के विपरीत, जो प्रसवोत्तर विद्युतीकरण पर निर्भर करता है । इसके अलावा, स्टारट्रैक दृष्टिकोण8में उपयोग किए जाने वाले बारह रिपोर्टर निर्माणों की तुलना में, यह रणनीति केवल दो बहुरंगी ट्रांसजीन पर निर्भर करती है, इस प्रकार डीएनए मिश्रण तैयारी और इमेजिंग को सरल बनाती है। इसके अलावा, एमएम द्वारा व्यक्त किए गए विभिन्न रंगों के बीच संतुलन आंतरिक रूप से ट्रांसजीन की संरचना द्वारा निर्धारित किया जाता है और प्रयोगकर्ता द्वारा विभिन्न घटकों के मिश्रण पर निर्भर नहीं करता है। इसके अलावा, यह रणनीति सरल शारीरिक विचार से परे हो सकती है और एस्ट्रोसाइट विकास के बहुक्लोनल विश्लेषण के लिए सफलतापूर्वक लागू की जा सकती है, जैसा कि पहले प्रकाशित काम14में प्रदर्शित किया गया था। कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट क्लोन को परिभाषित करने के लिए साइटोप्लाज्मिक और परमाणु मार्कर के दुर्लभ रंग संयोजनों का उपयोग करके यह काम, यह प्रदर्शित करता है कि वे स्थानिक वितरण, संरचनात्मक संगठन, संख्या और उत्पन्न कोशिकाओं के उपप्रकार के मामले में व्यापक परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं।

एमएम-लेबल वाले कॉर्टिकल प्रोजेनिटर्स से जन्मे कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट्स ने महत्वपूर्ण रंग विपरीत प्रदर्शित किए और पूरे सेरेब्रल कॉर्टेक्स(चित्रा 2)में व्यापक रूप से फैलाया। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके सरल मल्टीचैनल जेड-स्टैक अधिग्रहण का उपयोग कई प्रसवोत्तर चरणों में उनके प्रादेशिक मात्रा(चित्रा 3)और उनकी रूपात्मक जटिलता(चित्रा 4)जैसे प्रमुख एस्ट्रोसाइट सुविधाओं तक पहुंचने के लिए किया गया था। एस्ट्रोसाइट्स से परे, इस पद्धति को ओलिगोडेन्ड्रोसाइट्स जैसे अन्य ग्लियल कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा पेश किए गए सीमित संकल्प केवल एस्ट्रोसाइट रूपात्मक जटिलता का आंशिक प्रतिपादन प्रदान कर सकते हैं। जबकि उच्च संकल्प (जैसे, 63x 1.4 एनए तेल उद्देश्य) और डिकोवोल्यूशन एल्गोरिदम के साथ प्राप्त छवियों का उपयोग एस्ट्रोसाइट आर्बर14के महीन विवरणों के पुनर्निर्माण के लिए किया जा सकता है, बेहतरीन प्रक्रियाओं को पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग के साथ हल नहीं किया जा सकता है। फिर भी, यहां प्रस्तुत रणनीति न्यूरोलॉजिकल रोगों के माउस मॉडल में कॉर्टिकल एस्ट्रोसाइट वॉल्यूम या आकृति विज्ञान को प्रभावित करने वाले संभावित फेनोटाइप के लिए कुशलतापूर्वक स्क्रीन करने के लिए रुचि होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए एस फौकेट और इंस्टीटयूट डी ला विजन और इंस्टीटयूट डेस न्यूरोसाइंस डी मोंटपेलियर (एमआरआई और रैम) की इमेजिंग और एनिमल कोर सुविधाओं का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को रेगियन इले-डी-फ्रांस और प्रियतम एआरसी से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था ला रेचेचे सुर ले कैंसर से एस.C, और यूनीवर्सिट पेरिस-सैक्ले (पहल डॉक्टरेल्स इंटरडिसिपिलियर्स) से ला तक, यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-एसजी 336331) से धन द्वारा, पीआई जे वैलेट) ईएच के लिए, एग्नेस नेशनल डे ला रेचेचे द्वारा अनुबंधों के तहत ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (फ्रांस बायोइमेजिंग) , प्रियतम द्वारा ला रेचेचे मेडिडेल (Ref. DBI20141231328), यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी-सीओजी 649117, पीआई जे लाइव) और एटीआईपी-एवेनियर प्रोग्राम (पीआई के Loulier) द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.1 Bacteria transformation
Ampicillin Euromedex EU0400-C
DH5 alpha competent cells Fisher Scientitic 11563117
Ice box Dutscher 139959
Kanamycin Sigma 60615
LB Agar Sigma L2897
SOC medium Fisher Scientitic 11563117
Sterile petri dish- 10 cm Thermo Fisher 150350
Water bath VWR 462-0556H
1.2 Plasmid culture
14 ml culture tube Dutscher 187262
Glass erlenmeyer- 2L Fisher Scientitic 11383454
LB medium Sigma L3522
1.3 Plasmid DNA preparation
NucleoBond Xtra Maxi Plus EF Macherey-Nagel 740426.10
2.1 Preparation of the solutions
26 G x 1/2 needle Terumo 8AN2613R1
30 G x 1/2 needle Terumo 8AN3013R1
Fast Green Sigma Aldrich F7272
NaCl VWR 27810.295
Single-use polypropylene syringe, 1 mL Dutscher 50002
2.2 Preparation of the surgery material
Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm FST 11617-12
Arched tip Forceps- 10 cm FST 11071-10
Glass bead sterilizer Steri 250 Sigma Z378569
Glass micropipette 1 mm diameter FHC 10-10-L
Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm FST 11651-10
Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm FST 11650-10
Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm FST 14060-09
Laboratory tape Fisher Scientitic 11730454
Microinjector INJECT+MATIC No catalog number
Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm FST 12002-12
Optical fiber VWR 631-1806
Plastic-coated white paper Distrimed 700103
Signagel electrode gel Free-Med 15-60
Sterile Petri dish- 35 mm Dutscher 056714
Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 Sigma Z378569
2.3 Preparation of the pregnant female mouse
Alcohol pad Alcomed 1731000
Buprecare Axience 0.3 mg/ml
Compress tRAFFIN 70189
Ketamine Merial Imalgene 1000
Ocular gel tvm lab Ocry-gel
RjOrl:SWISS mice Janvier Labs
Vetadine, 10% solution Vetoquinol 4337400113B
Warming pad Harvard Apparatus 72-0493
Xylazine Bayer Rompun 2%
3.2 Electroporation
Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse Novosyn C0068220
Electroporateur Sonidel Sonidel NEPA 21
Sterile transfer pipets (individually wrapped) Dutscher 043202S
Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes Sonidel CUY650P3
4.1 Tissue harvesting and sectioning
24-well plate Falcon 353047
Agarose Lonza 50004
Antigenfix Microm Microtech U/P0014
Coverslip Dutscher 100266
Dolethal Vetoquinol DOL202
DPBS (10X), no calcium, no magnesium Fisher Scientific 11540486
Nail polish EMS 72180
Slide Dutscher 100001
Vectashield Vectorlabs H-1000
Vibratome Leica VT1000S
5. Multichannel confocal imaging
20X oil NA 0.85 Olympus
Confocal Laser Scanning Microscope Carl Zeiss LSM880
Confocal Laser Scanning Microscope Olympus FV1000
Plan Apochromat 20x/0.8 M27 Carl Zeiss
6. Astrocyte territorial volume segmentation
IMARIS 8.3 and later versions Bitplane
7. Astrocyte arborization tracing
3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science

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References

  1. Clarke, L. E., Barres, B. A. Emerging roles of astrocytes in neural circuit development. Nature Reviews Neuroscience. 14 (5), 311-321 (2013).
  2. Ma, Z., Stork, T., Bergles, D. E., Freeman, M. R. Neuromodulators signal through astrocytes to alter neural circuit activity and behaviour. Nature. 539 (7629), 428-432 (2016).
  3. Blanco-Suárez, E., Caldwell, A. L. M., Allen, N. J. Role of astrocyte-synapse interactions in CNS disorders: Astrocyte-synapse disease. The Journal of Physiology. 595 (6), 1903-1916 (2017).
  4. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  5. Srinivasan, R., et al. New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes in Situ and In Vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
  6. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  7. Shimogori, T., Ogawa, M. Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 499-506 (2008).
  8. García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. Clonal Identity Determines Astrocyte Cortical Heterogeneity. Cerebral Cortex. 23 (6), 1463-1472 (2013).
  9. Martín-López, E., García-Marques, J., Núñez-Llaves, R., López-Mascaraque, L. Clonal Astrocytic Response to Cortical Injury. PLoS ONE. 8 (9), 74039 (2013).
  10. Gutiérrez, Y., et al. Sibling astrocytes share preferential coupling via gap junctions. Glia. 67 (10), 1852-1858 (2019).
  11. Lee, Y., Messing, A., Su, M., Brenner, M. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
  12. Yoon, H., Walters, G., Paulsen, A. R., Scarisbrick, I. A. Astrocyte heterogeneity across the brain and spinal cord occurs developmentally, in adulthood and in response to demyelination. PloS One. 12 (7), 0180697 (2017).
  13. Ge, W. P., Miyawaki, A., Gage, F. H., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Local generation of glia is a major astrocyte source in postnatal cortex. Nature. 484 (7394), 376-380 (2012).
  14. Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
  15. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., López-Mascaraque, L. UbC-StarTrack, a clonal method to target the entire progeny of individual progenitors. Scientific Reports. 6 (1), 33896 (2016).
  16. Figueres-Oñate, M., García-Marqués, J., Pedraza, M., De Carlos, J. A., López-Mascaraque, L. Spatiotemporal analyses of neural lineages after embryonic and postnatal progenitor targeting combining different reporters. Frontiers in Neuroscience. 9, 87 (2015).
  17. Figueres-Oñate, M., Sánchez-Villalón, M., Sánchez-González, R., López-Mascaraque, L. Lineage Tracing and Cell Potential of Postnatal Single Progenitor Cells In Vivo. Stem Cell Reports. 13 (4), 700-712 (2019).
  18. Peng, H., Ruan, Z., Long, F., Simpson, J. H., Myers, E. W. V3D enables real-time 3D visualization and quantitative analysis of large-scale biological image data sets. Nature Biotechnology. 28 (4), 348-353 (2010).
  19. Peng, H., Bria, A., Zhou, Z., Iannello, G., Long, F. Extensible visualization and analysis for multidimensional images using Vaa3D. Nature Protocols. 9 (1), 193-208 (2014).
  20. Peng, H., et al. Virtual finger boosts three-dimensional imaging and microsurgery as well as terabyte volume image visualization and analysis. Nature Communications. 5 (1), 4342 (2014).
  21. Loulier, K., et al. Multiplex Cell and Lineage Tracking with Combinatorial Labels. Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).
  22. Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
  23. Abdeladim, L., et al. Multicolor multiscale brain imaging with chromatic multiphoton serial microscopy. Nature Communications. 10 (1), 1662 (2019).
  24. Chen, F., LoTurco, J. A method for stable transgenesis of radial glia lineage in rat neocortex by piggyBac mediated transposition. Journal of Neuroscience Methods. 207 (2), 172-180 (2012).
  25. Siddiqi, F., et al. Fate Mapping by PiggyBac Transposase Reveals That Neocortical GLAST+ Progenitors Generate More Astrocytes Than Nestin+ Progenitors in Rat Neocortex. Cerebral Cortex. 24 (2), 508-520 (2014).
  26. Yoshida, A., et al. Simultaneous expression of different transgenes in neurons and glia by combining in utero electroporation with the Tol2 transposon-mediated gene transfer system. Genes to Cells. 15 (5), 501-502 (2010).
  27. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and Improved Tools for In Utero Electroporation Studies of Developing Cerebral Cortex. Cerebral Cortex. 19, suppl 1 120-125 (2009).
  28. Pacary, E., et al. Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using in utero Electroporation. Journal of Visualized Experiments. (65), e4163 (2012).

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Dumas, L., Clavreul, S., Durand, J., Hernandez-Garzon, E., Abdeladim, L., Barry-Martinet, R., Caballero-Megido, A., Beaurepaire, E., Bonvento, G., Livet, J., Loulier, K. In Utero Electroporation of Multiaddressable Genome-Integrating Color (MAGIC) Markers to Individualize Cortical Mouse Astrocytes. J. Vis. Exp. (159), e61110, doi:10.3791/61110 (2020).

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