Summary
Les astrocytes tuent uniformément le cortex cérébral, rendant l’analyse de leur morphologie complexe difficile au niveau cellulaire. Le protocole fourni ici utilise l’étiquetage multicolore basé sur l’électroporation in utero pour étiqueter les astrocytes corticaux et analyser leur volume et leur morphologie avec un pipeline d’analyse d’image convivial.
Abstract
Les astrocytes protoplasmiques (PrA) situés dans le cortex cérébral de la souris sont étroitement juxtaposés, formant une matrice tridimensionnelle apparemment continue aux stades adultes. Jusqu’à présent, aucune stratégie d’immunostaining ne peut les entacher et segmenter leur morphologie chez les animaux matures et au cours de la corticogenèse. La PrA corticale provient d’progéniteurs situés dans le pallium dorsale et peut facilement être ciblée à l’aide de l’électroporation in utero des vecteurs intégrateurs. Un protocole est présenté ici pour étiqueter ces cellules avec la stratégie multiaddressable de marqueurs de couleur intégrant le génome (MAGIC), qui s’appuie sur la transposition piggyBac/Tol2 et la recombinaisonCre/lox pour exprimer stochastically des protéines fluorescentes distinctes (bleu, cyan, jaune et rouge) adressées à des compartiments subcellulaires spécifiques. Cette stratégie de cartographie du destin multicolore permet de marquer in situ les progéniteurs corticals à proximité avec des combinaisons de marqueurs de couleur avant le début de la gliogenèse et de suivre leurs descendants, y compris les astrocytes, des stades embryonnaires aux stades adultes au niveau cellulaire individuel. L’étiquetage semi-clairsemé obtenu en ajustant la concentration des vecteurs électroporés et des contrastes de couleurs fournis par les marqueurs de couleur multiaddressables intégrant le génome (marqueurs MAGIQUEs ou MM) permet d’individualiser les astrocytes et de étiqueter leur territoire et leur morphologie complexe malgré leur arrangement anatomique dense. Présenté ici est un workflow expérimental complet comprenant les détails de la procédure d’électroporation, l’acquisition de piles d’images multicanaux par microscopie confocale, et la segmentation tridimensionnelle assistée par ordinateur qui permettra à l’expérimentateur d’évaluer le volume et la morphologie individuels de PrA. En résumé, l’électroporation des marqueurs MAGIQUEs fournit une méthode pratique pour étiqueter individuellement de nombreux astrocytes et accéder à leurs caractéristiques anatomiques à différents stades de développement. Cette technique sera utile pour analyser les propriétés morphologiques corticales des astrocytes dans divers modèles muraux sans recourir à des croisements complexes avec des lignes de reporter transgéniques.
Introduction
Les astrocytes jouent de nombreuses fonctions vitales dans le développement du cerveau et laphysiologie 1. Outre leur rôle à la barrière hémono-encéphalique où ils régulent l’absorption des nutriments et le flux sanguin, ils contribuent activement à la formation et à la fonction de la synapse tout en produisant des neuromodulateurs qui peuvent modifier l’activité neuronale et lecomportement 2. En outre, le dysfonctionnement d’astrocyte contribue à une série de désordres neurologiques3. Les astrocytes situés dans le cortex cérébral présentent une morphologie élaborée permettant un contact étendu avec les processus neuronaux. Ces contacts, essentiels à la fonction du circuit, contrôlent également la morphogenèse et la synaptogenèse des astrocytes par le biais de protéines d’adhérencecellulaire 4. Les neuroscientifiques ont besoin d’outils pratiques et robustes pour étudier le développement des astrocytes et la morphogenèse dans leurs modèles neurologiques d’intérêt. Cependant, en raison de l’apposition étroite des astrocytes à leurs voisins et de leur carrelage tridimensionnel uniforme, il est difficile d’étiquetant les astrocytes corticaux et d’évaluer globalement leur morphologie à l’aide d’immunomarqueurs.
Actuellement, deux stratégies principales de génie génétique permettent l’étiquetage et l’individualisation des astrocytes corticals in situ : l’activation clairsemée de journaliste dans les lignes transgéniques de souris ou la transgenèse somatique utilisant l’électroporation des plasmides de journaliste. La première stratégie repose sur l’élevage d’une ligne de souris reporter floxed avec des souris exprimant une forme inductible de Cre recombinase activé spécifiquement dans les astrocytes lors de la livraison de tamoxifène (par exemple, Aldh1l1-CreERT25). Plusieurs inconvénients sont associés à cette stratégie. Tout d’abord, la reproduction de souris transgéniques nécessite un grand nombre d’animaux et de multiples analyses sont généralement nécessaires pour déterminer la bonne dose de tamoxifène pour fournir une étiquetage suffisamment clairsemée des astrocytes corticals. L’analyse des phénotypes corticals d’astrocyte dans un modèle génétique de souris d’intérêt exigera encore plus d’élevage et de consommation de souris. En outre, l’injection in utero tamoxifène est connue pour interférer avec la parturition, ce qui rend cette stratégie difficile à appliquer à l’étude des premiers stades du développement des astrocytes. L’électroporation in vivo de l’ADN est une stratégie alternative sans tamoxifène qui repose sur un nombre minimum d’animaux6. Réalisée à des stades embryonnaires ou postnatals, cette approche consiste à injecter des plasmides reporter dans les ventricules latéraux des rongeurs suivis d’impulsions électriques qui créent des pores dans la membrane cellulaire, permettant ainsi à l’ADN d’entrer dans les cellules progénitrices tapissant le ventricule. Par la suite, les transgènes reporter transportés par les plasmides électroporés sont traités par les machines cellulaires ciblées etexprimés 7. Deux méthodes d’électroporation ont été précédemment décrites pour étiqueter les astrocytes corticals de souris : 1) étiquetage postnatal d’astrocyte par électroporation (PALE), qui s’appuie sur l’électroporation des plasmides épisomal monocolores de reporter de 1-2 aux étapes postnatalestôt 4; 2) La stratégie StarTrack basée sur l’électroporation in utero (IUE) de plusieurs plasmides reporter intégrateur monocolore8,9,10. Bien que ces deux techniques étiquettent efficacement la PrA dans le cortex cérébral, elles présentent également certaines limitations. Dans leur version initiale, les deux méthodes s’appuient sur un promoteur glial de protéine acide fibrillaire (GFAP) pour conduire l’expression dans les astrocytes, qui peuvent biaiser l’étiquetage vers les gliales radiales aussi bien que les astrocytes piaux et réactifs qui expriment GFAP plus fortement que pra de repos normal11,12. En ce qui concerne pale, d’autres inconvénients sont le stade tardif de l’électroporation, qui empêche l’étiquetage de prA tôt-né (ou ceux provenant des progéniteurs délaminating tôt) et l’analyse des premiers stades du développement d’astroglia, et l’utilisation des vecteurs épisomal qui deviennent dilués par des divisions successives pendant la prolifération massive que PrA subissent pendant la première semaine postnatale13,14. Contrairement à PALE, StarTrack est basé sur l’électroporation embryonnaire des plasmides de reporter intégratifs qui permettent de suivre la contribution des progéniteurs embryonnaires et postnatals à la PrA. Un système StarTrack mis à jour en s’appuyant sur le promoteur ubiquitine C (UbC-StarTrack) réalise une expression plus large des reporters fluorescents dans la descente neuronale et gliaë (astrocytes inclus) des progéniteurs neuronaux15,16,17. Toutefois, dans sa version actuelle, la mise en œuvre de cette approche est complexe, car elle repose sur un mélange équimolaire de 12 plasmides distincts exprimant six protéines fluorescentes (FP) avec excitation partielle et chevauchement des spectres d’émission.
Présenté ici est une simple méthode d’étiquetage multicolore à base d’électroporation utero en utilisant des constructions de journaliste intégrateur conduit par un promoteur fort et largement actif pour étiqueter les astrocytes corticals14. En outre, un pipeline facile d’analyse d’image utilisant des logiciels d’analyse d’image sous licence (p. ex., Imaris) et en libre accès (Vaa3D18,19,20)est fourni pour segmenter le volume territorial et l’arborisation des astrocytes, respectivement. Par rapport aux méthodes décrites précédemment, cette stratégie repose uniquement sur 1-2 transgènes intégratifs multicolores Multiaddressable Genome-Integrating Color Markers (MAGIC Markers ou MM21) dirigés vers le compartiment cytoplasmique et (en option) des cellules nucléaires dont l’expression est pilotée par un promoteur synthétique du CAG composé d’un exhausteur de cytomégalovirus, d’un promoteur de β-actine de poulet et d’un site d’accepteur d’épissage de β-globinede lapin 22. Cela permet l’étiquetage et le suivi des astrocytes corticals, des stades postnatals embryonnaires aux stades postnatals tardifs, indépendamment de l’expressionGFAP 14,23. Chacun de ces transgènes porte les quatre FP distincts suivants : eBFP, mTurquoise2/mCerulean, EYFP et tdTomato/mCherry, qui présentent un chevauchement spectral minimal qui peut être facilement contourné avec 1) l’acquisition séquentielle de canaux; 2) Puissance d’excitation optimisée et gain de collection ; et 3) Filtres dichroïques spécifiques pour recueillir les fenêtres d’émission fp étroites. La stratégie MM utilise la recombinaisonCre/lox avec une recombinase cre auto-excisable (seCre) pour stimuler l’expression stochastique de fp dans une population cellulaire. Une seule copie de MM transgene exprime FP d’une manière mutuellement exclusive, tandis que plusieurs transgènes donnent lieu à des combinaisons FP, créant des dizaines de teintes distinctes. L’intégration génomique des transgènes est entraînée par le système de transposition piggyBac (PB) ou Tol224,25,26. Par conséquent, grâce à l’électroporation in utero, la boîte à outils MM et la « mosaïque » multicolore qu’elle génère permettent le marquage simultané de plusieurs progéniteurs corticals adjacents et le suivi de leur descente gliale, y compris les astrocytes corticals, sur de longues périodes. Les contrastes de couleurs résultant de l’expression d’un FP distinct permettent de délimiter le contour de la PrA et d’extraire par la suite des informations clés sur leur volume territorial (à l’aide de l’IMARIS) et leur morphologie complexe (à l’aide de Vaa3D). La stratégie multicolore présentée en détail ici est une méthode pratique et robuste qui donne un accès rapide et facile à la surface corticale des astrocytes et à la morphologie chez les souris de type sauvage à différents stades de développement, et est facilement adaptable pour étudier les caractéristiques anatomiques des astrocytes dans les modèles muraux de maladies neurologiques sans utiliser de lignes de reporter transgéniques.
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Protocol
Toutes les procédures animales décrites ici ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles. Les protocoles animaux ont été approuvés par le Conseil d’éthique de l’expérimentation animale de Charles Darwin (CEEACD/N°5).
1. Préparation de plasmides sans endotoxine pour marqueurs MAGIQUEs dans l’électroporation utero
- Transformation bactérienne
- Sur la glace, décongeler les cellules dh5 alpha compétentes stockées à -70 °C.
- Réchauffer les plaques d’agar contenant l’antibiotique approprié (100 μg/mL d’ampicilline ou 50 μg/mL de kanamycine) à 37 °C.
- Ajouter 1 μL de 5 à 50 ng d’ADN plasmide magic markers dans 10 μL de cellules alpha décongelées DH5 et incuber sur la glace pendant 10 min sans mélanger.
- Pour la transformation du choc thermique, placer l’aliquot dans un bain d’eau de 42 °C pendant 45 s, puis placer immédiatement sur la glace et attendre 3-5 min.
- Dans des conditions stériles, ajouter 230 μL de SOC moyen et incuber pendant 1 h à 37 °C.
- Étendre le contenu de l’aliquot sur la plaque d’agar et incuber toute la nuit à 37 °C.
- Culture plasmide
- Le lendemain matin, dans des conditions stériles, ramasser une colonie de la plaque d’agar et la mettre dans un tube de 14 mL contenant 2 mL de LB moyen avec antibiotique approprié. Laissez-le incuber pour la journée à 37 °C dans un incubateur secouant à 300 rpm.
- À la fin de la journée, les graines 300 mL de LB avec antibiotique en utilisant la culture de démarrage de 2 mL de l’étape 1.2.1 et incuber pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur secouant à 300 rpm.
- Préparation de l’ADN plasmide
- Le lendemain matin, procéder à la purification de l’ADN plasmide magic markers (c.-à-d. PB-CAG-Cytbow et Tol2-CAG-Nucbow ainsi que des plasmides entraînés par le CAG exprimant des transposases PB et Tol2 et cre recombinase) à l’aide d’un kit maxiprep sans endotoxine suivant le protocole du fabricant.
- Elute l’ADN dans 200 μL d’eau stérile et estimer sa concentration à l’aide d’un spectrophotomètre avant le stockage à -20 °C.
2. Préparation des marqueurs MAGIQUEs dans l’électroporation utero (MM IUE)
- Préparation des solutions
- Réchauffer 30 mL de solution saline de 0,9% à 37 °C dans un bain d’eau et le garder au chaud pendant toute la durée de la chirurgie.
- Préparer un mélange plasmide contenant PB-CAG-Cytbow et Tol2-CAG-Nucbow (concentration finale, transposases 0,8 μg/μL chacune), PB et Tol2 (concentration finale, 0,4 μg/μL chacune), CAG-seCre (concentration finale, 0,16 μg/μL) et 0,01 % colorant vert rapide en PBS sans Ca2+ et Mg2+.
REMARQUE : Aux fins de la reconstruction anatomique des astrocytes, la construction Tol2-CAG-Nucbow peut être omise. Cependant, ce plasmide est utile pour distinguer les doublets des astrocytes étroitement juxtaposés et lors de l’utilisation des marqueurs MAGIQUEs pour sonder les relations clonales entre les astrocytes14. - Préparer une solution anesthésique contenant 100 μL de kétamine (100 mg/mL) et 100 μL de xylazine (20 mg/mL) dilués dans 2 mL de solution saline.
- Préparez la solution analgésique en diluant la solution de stock de buprénorphine de 0,3 mg/mL 1:10 dans la solution saline.
- Préparation du matériel de chirurgie
- Stériliser les outils chirurgicaux (voir tableau des matériaux)à haute température dans un stérilisateur de perles de verre ou équivalent.
- Déposer une goutte de gel électrode dans un plat de 35 mm.
- Insérez la micropipette dans le support du microinjecteur, cassez la pointe de la micropipette et aspirez à la solution ADN.
- Placez une goutte de 1 μL de solution Vert rapide (0,01%) dans le couvercle d’un plat de 3 cm et, en l’utilisant comme référence, ajuster le diamètre de la pointe de la micropipette en cassant sa pointe avec des forceps fins. Ajustez le paramètre de pression de sorte que des gouttes de taille équivalentes soient produites par le microinjecteur, permettant ainsi la livraison d’environ 1 μL de solution d’ADN par injection.
- Préparation de la souris femelle enceinte
- Peser la souris enceinte RjOrl:SWISS.
- Effectuez une injection intraperitoneal avec 12,5 μL par gramme de poids corporel (BW) de solution anesthésique. Attendez 5 min et vérifiez que la souris dort en pinçant son avant.
- Une fois que l’animal ne réagit pas à pincer, injectez-le sous-cutané avec 1,6 μL/g BW de solution analgésique.
- Ajouter une goutte de gel oculaire sur chaque œil pour éviter le séchage pendant la chirurgie et placer le ventre de l’animal sur le coussin chauffant.
- Rasez doucement son abdomen, nettoyez-le avec un tampon imbibé d’iode et désinfectez la zone rasée avec un tampon d’alcool.
- Disposer un champ d’opération en plaçant des compresses stériles autour de la zone rasée, nettoyée et aseté.
3. Électroporation in utero (IUE)
- Injection intraventriculaire
- Couper une incision verticale de 2 cm le long de la ligne médiane à partir de la partie inférieure de l’abdomen, à travers la peau, puis à travers le muscle sous-jacent. Exposez les cornes utérine en manipulant doucement les sacs embryonnaires et évaluez l’emplacement du col de l’utérus et le nombre de sacs embryonnaires de chaque côté du col de l’utérus.
- Orienter le cerveau de l’embryon E15.5 vers l’électroporation afin de voir le bregma, facilement reconnaissable car son emplacement correspond à la jonction des trois vaisseaux sanguins principaux qui courent le long des fissures cérébrales.
- Imaginez une ligne virtuelle entre le bregma (visible à travers le crâne) et l’œil; introduire la micropipette entre la ligne virtuelle et la fissure longitudinale, puis appuyez sur la pédale de l’injecteur pour fournir 1 μL de solution d’ADN dans le ventricule latéral de l’hémisphère ciblé.
REMARQUE : Lorsqu’il est injecté à l’endroit approprié, le ventricule latéral rempli apparaît bleu, indiquant qu’il a été rempli de la solution d’ADN.
- Électroporation
- Appliquer les électrodes (voir tableau des matériaux),préalablement trempées dans du gel électrode, des deux côtés de l’embryon injecté avec l’anode couvrant l’hémisphère injecté. Appuyez sur la pédale de l’électroporateur pour livrer une série de quatre impulsions de 50 ms de 35 V, chacune séparée par un intervalle de 950 ms.
- Humidifier l’embryon avec une solution saline réchauffée.
REMARQUE : Les embryons doivent être conservés humides à l’aide d’une solution saline réchauffée pendant toute l’opération chirurgicale et l’utérus ne doit pas se dessécher. - Répétez les étapes 3.1.2-3.2.2 pour chaque embryon.
- Une fois que tous les embryons ciblés ont été électroporés, remplacez les cornes utérine dans l’abdomen en les poussant doucement avec des forceps à leur position d’origine. Remplissez la cavité abdominale d’une solution saline réchauffée pour empêcher l’utérus de sécher pendant que les sutures sont faites.
- D’abord fermer le muscle abdominal avec une suture absorbable continue, puis la peau avec plusieurs points individuels (~10) en utilisant la suture 4-0.
- Mettez l’animal dans une cage propre, couché sur le côté sur une serviette en papier propre et tournez l’animal de l’autre côté toutes les 5-10 minutes jusqu’à ce qu’il se réveille et commence à se déplacer de lui-même.
- Évaluer l’état de l’animal le lendemain, surtout si un nid a été fait.
REMARQUE : Aucun traitement de postsurgery n’est exigé. En l’absence d’un nid, de tout signe de douleur (p. ex., prostration, fourrure hirsute) et/ou de saignements abondants, l’animal doit être euthanasié sans délai.
4. Récolte et section des tissus
- Collecte de tissus
- Injecter du phénobarbital (100 mg/kg de BW) par voie intrapénitale pour une anesthésie terminale au moment de la récolte désiré. Dans ce cas, les temps de récolte étaient aux jours postnatals (P) P4, P7, et P21.
- Effectuez la perfusion intracardiaque à l’aide d’une solution froide à base de paraformaldéhyde préfabriquée.
- Disséquer le cerveau et le placer toute la nuit à 4 °C dans la solution à base de paraformaldéhyde pour la postfixation.
- Histologie
- Le lendemain matin rincer le cerveau 3x pendant 10 min avec 1x PBS.
- Intégrer le cerveau dans 3% d’agarose dissous en 1x PBS.
- Couper 80 sections de μm à l’aide d’un microtome à lame vibrante.
- Recueillir les sections dans une plaque de 24 puits précalcé avec 1x PBS.
- Monter des sections dans le milieu de montage (voir Tableau des matériaux)entre la glissade et le coverslip. Gardez les glissières montées à -20 °C pour une conservation optimale des protéines fluorescentes et un stockage à long terme.
5. Imagerie confocale multicanal
- Paramètres du microscope
- Configurer la configuration du microscope confocal pour exciter séparément les lignes laser mCerulean/mTurquoise2, EYFP, tdTomato/mCherry en utilisant respectivement 440, 515 et 559 nm.
- Utilisez un objectif 20x 0.8 NA (ou NA plus élevé) et ajustez l’échantillonnage XY et la taille z-step selon les critères nyquist.
REMARQUE : Les images acquises avec une résolution plus élevée (p. ex., objectif pétrolier 60x 1.4 NA) et les algorithmes de déconvolution permettront la reconstruction des détails les plus fins des tonnelles d’astrocytes. Cependant, l’expérimentateur doit garder à l’esprit que les meilleurs processus d’astrocyte peuvent ne pas être résolus par l’imagerie optique conventionnelle.
- Acquisition d’images
- Trouvez les astrocytes les plus brillants dans la zone électroporée.
- Étant donné que les cellules étiquetées situées près de la surface peuvent sembler plus brillantes que celles plus profondes de la tranche, ajustez les paramètres d’acquisition sur les cellules de surface pour éviter de saturer les images.
- Ajustez les paramètres d’acquisition séparément pour chacun des trois canaux tout en vous assurant d’éviter la saturation des pixels à l’aide de HiLo LUT, qui affiche zéro valeur en tant que valeurs bleues et maximales de pixels en rouge.
REMARQUE : Une image suffisamment équilibrée ne doit afficher que quelques pixels bleus et presque aucun pixels rouges. - Acquérir des piles Z carrelées de 1 024 x 1 024 pixels à l’aide de l’étape motorisée du microscope, avec un chevauchement de 10 % entre les piles adjacentes pour permettre par la suite la reconstruction en mosaïque de la zone électroporée ou de la zone d’intérêt.
6. Segmentation du volume territorial des Astrocytes
REMARQUE : Ceci est effectué à l’aide d’un logiciel commercial (p. ex., IMARIS).
-
Préparation de l’ensemble de données
- Recadrer les astrocytes étiquetés dans la reconstruction 3D (250 x 250 pixels) en sélectionnant des cellules entièrement enfermées dans la section tissulaire image.
REMARQUE : Il est également possible de travailler directement sur des volumes plus importants si l’ordinateur utilisé peut les manipuler. - Cliquez sur le bouton Surface Bleue dans la barre d’outils Objet de la vue Surpass pour créer une nouvelle Surface pour chaque astrocyte.
- Pour obtenir un meilleur contraste de visualisation, ajustez d’abord les valeurs minimales et maximales de contraste de couleur en cliquant sur Modifier | Afficher l’option d’ajustement d’affichage et faire glisser les deux poignées. Si nécessaire, modifiez la couleur du canal en cliquant directement sur le nom du canal dans la fenêtre d’ajustement d’affichage afin de sélectionner une nouvelle couleur.
REMARQUE : Travaillez de préférence toujours avec le même affichage couleur pour éviter les biais visuels. - Cliquez sur Modifier | Propriétés d’image pour indiquer manuellement la taille du voxel dans les micromètres. Si la taille voxel n’est pas exacte, les calculs de volume seront incorrects.
- Enregistrez les nouveaux paramètres.
- Recadrer les astrocytes étiquetés dans la reconstruction 3D (250 x 250 pixels) en sélectionnant des cellules entièrement enfermées dans la section tissulaire image.
-
Segmentation de surface
- Utilisez l’icône bleue pour introduire une surface. Une icône et une boîte Surface apparaîtront sur la liste Scène. Une boîte volume permet de voir/masquer l’ensemble de données.
- Sélectionnez la ligne de surface et cliquez sur Sauter la création automatique | Modifier manuellement.
- Cliquez sur Contour | Visibilité et cliquez sur Aucun. Ensuite, passez à la vue Sélectionnez et cliquez sur le bouton Dessiner.
- Cliquez sur Mode pour sélectionner le mode dessin.
- Utilisez l’outil de dessin semi-automatique Isoline rapide et efficace. Définissez le contour de la cellule en déplaçant le pointeur de la souris sur elle. Si l’aperçu isoline ne correspond pas au contour des astrocytes, ajustez la position du pointeur de la souris. Pour valider l’aperçu, cliquez à gauche sur la sélection. Pour corriger les erreurs potentielles, utilisez la fenêtre Board pour supprimer le contour actuel du plan Z ou appuyez sur Ctrl + Z.
- Utilisation de slice | Position pour naviguer à travers les plans Z, passer à l’avion suivant en changeant le numéro de plan Z et de commencer un nouveau contour. Commencez préférentiellement à partir du milieu de la cellule, puis déplacez-vous vers les extrémités.
- Lorsque les contours ont été dessinés dans tous les plans Z contenant l’astrocyte, cliquez sur Créer surface. Avant de créer une surface, vérifiez que tous les composants sont connectés. Si ce n’est pas le cas, sélectionnez les plus grands ou connectez-les pertinents avant d’exporter des données en volume.
- Vérifiez les données quantitatives affichées dans le panel de données et les statistiques d’exportation au format de feuille de calcul, ce qui permet d’économiser de la valeur en volume et de l’unité.
- Enregistrez la surface sous un nouveau nom pour y accéder plus tard.
7. Traçage de l’arborisation des astrocytes
REMARQUE : Cela se fait à l’aide du logiciel en libre accès Vaa3D.
- Préparation de l’ensemble de données
- Chargez la pile d’images et recherchez des astrocytes isolés ou des astrocytes voisins affichant des couleurs distinctes.
REMARQUE : La résolution de la reconstruction peut être améliorée en augmentant l’objectif NA et l’échantillonnage. En fin de compte, cependant, en raison de la limite de résolution de la microscopie confoccale, les meilleurs processus d’astrocyte ne peuvent pas être tracés avec précision. Il faut prendre soin d’éviter les sursegments au-delà de la résolution des images acquises. - À l’aide des Fidji, recadrer 250 x 250 pixels d’image s’empile autour de chaque astrocyte.
- Comme le traçage Vaa3D est effectué sur une seule couleur, sélectionnez un canal et désactivez les autres canaux.
- Convertissez l’image en RGB et enregistrez-la .tiff format.
- Chargez la pile d’images et recherchez des astrocytes isolés ou des astrocytes voisins affichant des couleurs distinctes.
- Traçage d’arbor
- Ouvrez l’image RVB en Vaa3D. Aller à l’image | Données | Géométrie puis rééchantillonnement de l’imageet ajuste les valeurs de taille x/y et z voxel.
REMARQUE : Lors de la reconstruction des arboriculteurs des astrocytes, il faut prendre soin de ne pas tracer les détails plus finement que la résolution fournie par les images. - Ouvrez une fenêtre 3D en cliquant sur Visualize | visionneuse 3D pour l’ensemble de l’image. Cliquez à droite sur une image 3D et choisissez 1-clic droit pour définir le marqueur. Pointez avec le curseur le centre de l’astrocyte, puis cliquez à droite pour définir un marqueur.
REMARQUE : Cliquez sur Escape pour avoir accès à nouveau à la vue 3D. - Aller à Advanced | 3D tracing | Vaa3D-Neuron2-auto-traçage.
- Sur la fenêtre nouvellement ouverte, sélectionnez le canal sur lequel appliquer le plug-in.
- Choisissez un seuil d’arrière-plan (souvent entre 30 et 90). Adaptez cette valeur pour chaque astrocyte si nécessaire.
- Décochez Radius à partir de la 2D et gardez l’échantillon auto-vers le bas et l’auto-rééchantillon vérifié.
- Réglez cnn_type à 3, length_thresh à 1, et SR_ratio à 0,1.
- Après avoir cliqué sur ok, assurez-vous que le plug-in génère automatiquement deux fichiers basés sur le nom d’origine. Le suffixe -ini.swc et -coordinateX-coordinateY-coordinateZ-app2.swc sera ajouté. Ajoutez manuellement une étiquette distinctive à ces fichiers de noms afin de ne pas les écraser tout en continuant à exécuter le plug-in.
- Open Object Manager, aller à Neuron | Structure de ligne,sélectionnez l’astrocyte tracé, cliquez sur le mode Affichage,et sélectionnez toujours le mode de ligne.
- Retournez à la fenêtre 3D, où apparaît un squelette de l’astrocyte.
REMARQUE : Si la segmentation et le signal ne correspondent pas, répétez les étapes 7.2.3-7.2.10 et ajustez le seuil jusqu’à ce qu’ils le soient. Assurez-vous de saisir à nouveau les autres paramètres lorsqu’ils sont réinitialisés lorsque le plug-in est redémarré. - Cliquez à droite sur le squelette et sélectionnez le neurone de premier | ligne #1... APP2_Tracing d’accéder aux mesures quantitatives qui apparaîtront sur une nouvelle surface de fenêtre| Annotation de l’objet.
REMARQUE : En raison de la résolution limitée de la microscopie légère, les mesures affichées sous les éléments énumérés Nombre de branches et nombre de bifurcations ne fournissent qu’une estimation approximative de la complexité des arboriculteurs astrocytes.
- Ouvrez l’image RVB en Vaa3D. Aller à l’image | Données | Géométrie puis rééchantillonnement de l’imageet ajuste les valeurs de taille x/y et z voxel.
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Representative Results
L’électroporation des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals embryonnaires permet l’étiquetage des astrocytes des stades précoces à avancés du développement du cortex cérébral (figure 1). Ces astrocytes ont été trouvés dans toutes les couches corticales à divers stades postnatals (P4, P7, P21) car ils se sont dispersés largement dans le cortex cérébral entier. Ils ont été évalués à l’aide d’images confoccales carrelées acquises avec un objectif de 20 x 0,8 NA (ou NA plus élevé) et assemblées sous forme de reconstructions de piles Z (figure 2). L’étiquetage combinatorial magic markers a permis l’individualisation des astrocytes corticals et l’extraction d’informations concernant leur volume et leur morphologie. À l’aide du logiciel d’analyse d’image commerciale, le contour des astrocytes individuels a été délimité sur chaque section optique individuelle des piles d’images confoccales pour segmenter et reconstruire le domaine territorial occupé par chaque astrocyte (figure 3). À partir des mêmes piles d’images Z, la morphologie ram ram ramée des astrocytes corticals dédaptisés a été segmentée à l’aide du logiciel en libre accès qui permet l’extraction du squelette des principaux processus d’astrocytes (figure 4). Ces outils de segmentation et de traçabilité ont fourni une évaluation semi-quantitative de l’augmentation du volume territorial (figure 3) et de la complexité morphologique (figure 4) qui s’est produite pour les astrocytes corticals individuels des stades postnatals précoces àtardifs 14. Ces approches ont également révélé l’hétérogénéité du volume et de la morphologie affichée par des astrocytes corticals distincts au même stade de développement, comme l’illustrent la figure 2, la figure 3et la figure 4.
Figure 1 : Représentation schématique des marqueurs MAGIQUEs (MM) dans l’électroporation utero (IUE) pour étiqueter les progéniteurs corticals et leur descente pendant le développement du cerveau. (A) La boîte à outils MM comprend plusieurs plasmides codant PB-Cytbow, Tol2-Nucbow, transposases PB et Tol2, et auto-excisable Cre recombinase (seCre). Dans les constructions MM, trois paires de sites de lox incompatibles (loxN, lox2272, et loxP) flanquent quatre séquences distinctes de codage FP (EBFP2, mTurquoise2/mCerulean, EYFP, tdTomato/mCherry) et créent des possibilités mutuellement exclusives d’excision lors de la recombinaison des Cris. Avant l’action cre, seul le premier gène (EBFP2) est exprimé. Après l’excision crémédiée induite par seCre, soit tdTomato/mCherry (FP rouge), EYFP (FP vert), ou mTurquoise2/mCerulean (cyan FP) est exprimé. La co-expression du FP à partir de plusieurs copies magic markers donne des combinaisons de couleurs dans le cytoplasme (PB-CAG-Cytbow) ou le noyau (Tol2-CAG-Nucbow) de cellules étiquetées. L’endfeet de transposition PB et Tol2 encadrant les cassettes MM permet leur intégration dans le génome des progéniteurs corticals lorsque les constructions MM sont coelectroporées avec des transposases PB et Tol2 codant des plasmides. (B-G) Illustration graphique des étapes successives de l’IUE, y compris la laparotomie des souris enceintes anesthésiées (B), injection du mélange plasmide MM (C) dans les ventricules latéraux des embryons (D), la livraison d’impulsions électriques par des pinces soigneusement positionnées (E) pour cibler les progéniteurs corticals dans l’un des deux hémisphères cérébraux (F), et la suture de l’abdomen de la souris enceinte (G). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : À la suite de l’électroporation in utero de la boîte à outils MAGIC Markers, des astrocytes multicolores ont été trouvés dispersés dans l’ensemble du cortex cérébral aux stades postnatals. L’IUE des plasmides conduisant MM, seCre, PB, et Tol2 transposases expression dans E15.5 progéniteurs corticals de souris a eu comme conséquence l’étiquetage des neurones et des astrocytes de couche 2-3 à P4, P7, et P21. Le niveau d’expression et la palette de couleurs dépendaient du nombre de transgènes MM intégrés dans le génome des progéniteurs corticals. Montage de projections d’intensité maximale à partir de piles d’images confocales carrelées acquises sur des sections cérébrales sagittales de 80 μm. Barre d’échelle : 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Segmentation du domaine territorial cortical des astrocytes à des stades de développement distincts. Projections d’intensité maximale des astrocytes individuels confocaux recadrés en z-stack (A-F) et de leur domaine territorial associé segmentés avec le logiciel commercial (A'-F') à trois stades de développement distincts : P4 (A-B, A'-B'), P7 (C-D, C'-D') et P21 (E-F, E'-F'),respectivement. Barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Traçage de l’arborisation corticale des astrocytes. Exemples de deux astrocytes distincts recadrés à partir de piles Z confocales (A-D) et la reconstruction de leur arborisation grossièrement segmentée avec Vaa3D (A'-D ') recueillies à deux stades de développement distincts: P7 (A-B, A'-B ') et P21 (C-D, C'-D '), respectivement. Barre d’échelle : 20 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
L’électroporation in utero (IUE) des marqueurs MAGIQUEs chez les progéniteurs corticals (figure 1) a permis l’étiquetage des astrocytes dans tout le cortex cérébral postnatal à différents stades postnatals (P4-P7-P21, figure 2). Fait intéressant, le stade de l’IUE n’est pas critique, car l’électroporation effectuée de E13.5 à E15.5 donne des modèles d’étiquetage similaires concernant les astrocytes corticals14. Cependant, l’emplacement des neurones pyramidaux étiquetés dans le parenchyme cortical varie avec le stade d’électroporation. En effet, l’IUE a effectué à E15 marques couche 2-3 neurones tandis que iUE effectué à E13 étiquettes neurones pyramidaux dans toutes les couches corticales, de la couche 5 à la couche 2-36,27. Cette étiquetage articulaire des neurones pyramidaux corticals suite à MM IUE est la principale limitation de cette méthode, car elle empêche la segmentation semi-automatique de la morphologie des astrocytes dans les couches où l’étiquetage neuronal dense interfère avec la reconnaissance des processus des astrocytes. Si c’est un problème, MM pourrait être électroporé aux stades postnatals comme dans PALE. Chez P4, l’étiquetage des fibres radiales de glia encore présentes à ce stade peut également interférer avec la segmentation des arbres Vaa3D. Bien que lourde, une solution si l’on veut procéder à la reconstruction arbor astrocyte à ce stade est d’enlever manuellement les fibres glials radiales en remplaçant progressivement le signal de fibre radiale par des pixels noirs autour de l’astrocyte d’intérêt en utilisant Adobe Photoshop.
Malgré cette limitation, le MM IUE est une technique puissante lorsqu’il est correctement exécuté. Quelques étapes critiques doivent être manipulées avec soin : 1) les embryons doivent être conservés humides pendant toute la procédure chirurgicale et soigneusement manipulés pour augmenter leur survie; 2) l’utilisation de capillaires en verre avec un grand diamètre ou serrant trop étroitement les sacs embryonnaires peut conduire à la rupture du sac et donc à la mort des embryons; 3) pendant l’injection d’ADN, les vaisseaux sanguins doivent être évités pour empêcher le saignement ; 4) l’ensemble de la procédure ne doit pas durer plus de 40 minutes de l’anesthésie à la suture afin de maximiser la survie de l’embryon; 5) le stress joue un rôle critique dans le succès de l’IUE et donc des sources supplémentaires de stress telles que le changement de cage, le transport, les bruits et les vibrations doivent être évitées de 5 jours avant la chirurgie à 7 jours après la naissance afin de prévenir l’avortement et le cannibalisme.
Il convient de noter que les expérimentateurs qui souhaitent cibler spécifiquement les cellules nées à un stade donné peuvent utiliser la boîte à outils MM sans ajouter les transposases piggyBac et Tol2 de telle sorte que seules les cellules nées au moment de l’électroporation expriment les étiquettes combinatoires. Un autre avantage de la méthode est la flexibilité qu’elle confère en termes de densité de cellules étiquetées et leur emplacement dans diverses régions du cerveau. En effet, l’étiquetage plus dense des astrocytes corticals peut être réalisé en augmentant la concentration totale de transgènes MM tout en maintenant le ratio plasmides constant (rapport 1:10 pour les constructions Cre recombinase/MM et 1:2 rapport pour les constructions transposases/MM). Contrairement aux approches monochromes, telles que l’électroporation des transposons monocolores ou l’électroporation cre chez les souris Ai9, où la capacité d’étiqueter les astrocytes individuels nécessite un étiquetage clairsemé, les contrastes de couleurs offerts par la stratégie MAGIC Markers permettent l’individualisation des astrocytes sur un large éventail de densités d’étiquetage. En outre, le positionnement des sondes d’électrode dans des orientations distinctes permet de cibler des régions cérébrales distinctes telles que le striatum prospectif (anode en position ventrale, opposée à la position dorsale requise pour atteindre l’électroporation dans le cortex cérébral), ou l’hippocampe (anode en position médiale)28. Enfin, l’IUE peut être réalisée sur différentes souches de souris telles que les souris de race (OF1, Suisse) et consanguin (C57BL/6J ou N), ce qui ouvre la voie à l’utilisation de la boîte à outils MM dans les modèles transgéniques de maladies animales. Toutefois, pour réussir l’IUE chez les souris consanguine, il faut adapter le nombre d’impulsions (trois impulsions pour les souris C57BL/6 contre cinq impulsions en suisse), la tension (30 V au lieu de 35 V) et la dose analgésique (0,15 mg/mL de solution de stock de buprénorphine et un volume injecté de 0,8 μL/g BW).
Par rapport à l’élevage transgénique ou aux approches PALE et StarTrack, cette méthode offre plusieurs avantages. Pour commencer, contrairement à la stratégie d’élevage, il utilise peu d’animaux. Il permet également l’étiquetage des astrocytes corticals depuis les premiers stades de leur développement, y compris les stades embryonnaires, contrairement à PALE4, qui repose sur l’électroporation postnatale. En outre, par rapport aux douze constructions reporter utilisées dans l’approche StarTrack8, cette stratégie ne repose que sur deux transgènes multicolores, ce qui rend la préparation des mélanges d’ADN et l’imagerie plus simple. En outre, l’équilibre entre les différentes couleurs stochastically exprimées par MM est intrinsèquement déterminé par la structure des transgènes et ne dépend pas du mélange des différents composants par l’expérimentateur. En outre, cette stratégie peut s’étendre au-delà de la simple considération anatomique et peut être appliquée avec succès pour l’analyse multiclonale du développement d’astrocytes, comme démontré dans lestravaux précédemment édités 14. Ces travaux, utilisant de rares combinaisons de couleurs de marqueurs cytoplasmiques et nucléaires pour définir les clones corticals des astrocytes, ont démontré qu’ils présentent une grande variabilité en termes de distribution spatiale, d’organisation structurelle, de nombre et de sous-type de cellules générées.
Les astrocytes corticals nés d’progéniteurs corticals étiquetés MM présentaient un contraste de couleur significatif et se dispersaient largement dans l’ensemble du cortex cérébral (figure 2). De simples acquisitions multicanaux à pile Z à l’aide de microscopie confocale ont été utilisées pour accéder aux principales caractéristiques des astrocytes, comme leur volume territorial (figure 3) et leur complexité morphologique (figure 4) à plusieurs stades postnatals. Au-delà des astrocytes, cette méthodologie peut être adaptée pour étudier la morphologie d’autres cellules gliales telles que les oligodendrocytes. Cependant, il convient de garder à l’esprit que la résolution limitée offerte par la microscopie confoccale ne peut fournir qu’un rendu partiel de la complexité morphologique des astrocytes. Bien que les images obtenues avec une résolution plus élevée (p. ex., objectif d’huile 63x 1.4 NA) et les algorithmes de déconvolution puissent être utilisées pour reconstruire des détails plus fins des tonnelles d’astrocytes14, les meilleurs processus ne peuvent pas être résolus avec l’imagerie optique conventionnelle. Néanmoins, la stratégie présentée ici sera d’intérêt à dépister efficacement un phénotype potentiel affectant le volume cortical des astrocytes ou la morphologie dans les modèles muraux de maladies neurologiques.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions S. Fouquet et les installations d’imagerie et de cœur animal de l’Institut de la Vision et de l’Institut des Neurosciences de Montpellier (IRM et RAM) pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des bourses de la Région Ile-de-France et de la Fondation ARC pour la Recherche sur le Cancer à S.C, et de l’Université Paris-Saclay (Initiatives Doctorales Interdisciplinaires) à L.A., par le financement du Conseil européen de la recherche (ERC-SG 336331, PI J. Valette) à E.H., par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre de contrats ANR-10-LABX-65 (LabEx LifeSenses), ANR-11-EQPX-0029 (Equipex Morphoscope2), ANR-10-INBS-04 (France BioImaging) , par la Fondation pour la Recherche Médicale (Réf. DBI20141231328), par le Conseil européen de la recherche (ERC-CoG 649117, PI J. Livet) et par le programme ATIP-Avenir (PI K. Loulier).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.1 Bacteria transformation | |||
| Ampicillin | Euromedex | EU0400-C | |
| DH5 alpha competent cells | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Ice box | Dutscher | 139959 | |
| Kanamycin | Sigma | 60615 | |
| LB Agar | Sigma | L2897 | |
| SOC medium | Fisher Scientitic | 11563117 | |
| Sterile petri dish- 10 cm | Thermo Fisher | 150350 | |
| Water bath | VWR | 462-0556H | |
| 1.2 Plasmid culture | |||
| 14 ml culture tube | Dutscher | 187262 | |
| Glass erlenmeyer- 2L | Fisher Scientitic | 11383454 | |
| LB medium | Sigma | L3522 | |
| 1.3 Plasmid DNA preparation | |||
| NucleoBond Xtra Maxi Plus EF | Macherey-Nagel | 740426.10 | |
| 2.1 Preparation of the solutions | |||
| 26 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN2613R1 | |
| 30 G x 1/2 needle | Terumo | 8AN3013R1 | |
| Fast Green | Sigma Aldrich | F7272 | |
| NaCl | VWR | 27810.295 | |
| Single-use polypropylene syringe, 1 mL | Dutscher | 50002 | |
| 2.2 Preparation of the surgery material | |||
| Adson Forceps - DeBakey Pattern- 12.5 cm | FST | 11617-12 | |
| Arched tip Forceps- 10 cm | FST | 11071-10 | |
| Glass bead sterilizer Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| Glass micropipette 1 mm diameter | FHC | 10-10-L | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Slight Curve- 10 cm | FST | 11651-10 | |
| Graefe Forceps - Titanium 1 mm Tips Straight- 10 cm | FST | 11650-10 | |
| Iris Scissors - Delicate Straight- 9 cm | FST | 14060-09 | |
| Laboratory tape | Fisher Scientitic | 11730454 | |
| Microinjector | INJECT+MATIC | No catalog number | |
| Olsen-Hegar Needle Holder - 12 cm | FST | 12002-12 | |
| Optical fiber | VWR | 631-1806 | |
| Plastic-coated white paper | Distrimed | 700103 | |
| Signagel electrode gel | Free-Med | 15-60 | |
| Sterile Petri dish- 35 mm | Dutscher | 056714 | |
| Sterilizer, glass dry bead, Steri 250 | Sigma | Z378569 | |
| 2.3 Preparation of the pregnant female mouse | |||
| Alcohol pad | Alcomed | 1731000 | |
| Buprecare | Axience | 0.3 mg/ml | |
| Compress | tRAFFIN | 70189 | |
| Ketamine | Merial | Imalgene 1000 | |
| Ocular gel | tvm lab | Ocry-gel | |
| RjOrl:SWISS mice | Janvier Labs | ||
| Vetadine, 10% solution | Vetoquinol | 4337400113B | |
| Warming pad | Harvard Apparatus | 72-0493 | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2% | |
| 3.2 Electroporation | |||
| Absorbable suture Size 4-0 45 cm Suture 1-Needle 19 mm Length 3/8 Circle Reverse | Novosyn | C0068220 | |
| Electroporateur Sonidel | Sonidel | NEPA 21 | |
| Sterile transfer pipets (individually wrapped) | Dutscher | 043202S | |
| Tweezers with 3 mm platinium disk electrodes | Sonidel | CUY650P3 | |
| 4.1 Tissue harvesting and sectioning | |||
| 24-well plate | Falcon | 353047 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antigenfix | Microm Microtech | U/P0014 | |
| Coverslip | Dutscher | 100266 | |
| Dolethal | Vetoquinol | DOL202 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | Fisher Scientific | 11540486 | |
| Nail polish | EMS | 72180 | |
| Slide | Dutscher | 100001 | |
| Vectashield | Vectorlabs | H-1000 | |
| Vibratome | Leica | VT1000S | |
| 5. Multichannel confocal imaging | |||
| 20X oil NA 0.85 | Olympus | ||
| Confocal Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss | LSM880 | |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000 | |
| Plan Apochromat 20x/0.8 M27 | Carl Zeiss | ||
| 6. Astrocyte territorial volume segmentation | |||
| IMARIS 8.3 and later versions | Bitplane | ||
| 7. Astrocyte arborization tracing | |||
| 3D Visualization-Assisted Analysis software suite (Vaa3D) | HHMI - Janelia Research Campus /Allen Institute for Brain Science |
References
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