Summary
Een methode voor het leveren van neurale stamcellen, aanpasbaar voor het injecteren van oplossingen of schorsingen, via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) na ischemische beroerte wordt gemeld. Geïnjecteerde cellen worden breed verspreid over de hersenen parenchyma en kan worden gedetecteerd tot 30 d na de bevalling.
Abstract
Neurale stamcel (NSC) therapie is een opkomende innovatieve behandeling voor beroerte, traumatisch hersenletsel en neurodegeneratieve aandoeningen. In vergelijking met intracraniale levering, intra-arteriële toediening van NSC's is minder invasief en produceert een meer diffuse distributie van NSC's binnen de hersenen parenchyma. Verder, intra-arteriële levering maakt de eerste-pass effect in de hersenen circulatie, het verminderen van het potentieel voor het vangen van cellen in perifere organen, zoals lever en milt, een complicatie in verband met perifere injecties. Hier beschrijven we de methodologie, bij zowel muizen als ratten, voor de levering van NSC's via de gemeenschappelijke halsslagader (muis) of externe halsslagader (rat) aan het ipsilaterale halfrond na een ischemische beroerte. Met behulp van GFP-gelabelde NSC's illustreren we de wijdverspreide verspreiding die op het knaagdierilaterale halfrond wordt bereikt op 1 d, 1 week en 4 weken na de postischemische levering, met een hogere dichtheid in of nabij de ischemische letsellocatie. Naast de overleving op lange termijn, tonen we bewijs van differentiatie van GFP-gelabelde cellen na 4 weken. De intra-arteriële leveringsbenadering die hier voor NSC's wordt beschreven, kan ook worden gebruikt voor toediening van therapeutische verbindingen, en heeft dus een brede toepasbaarheid op uiteenlopende CNS-letsel- en ziektemodellen voor meerdere soorten.
Introduction
Stamceltherapie (SC) heeft een enorm potentieel als behandeling voor neurologische aandoeningen, waaronder beroerte, hoofdtrauma en dementie1,,2,,3,,4,,5,6. Een efficiënte methode om exogene SCs aan de zieke hersenen te leveren blijft echter problematisch2,6,7,8,9,,10,11,12,13. SC's die via perifere leveringsroutes worden geleverd, waaronder intraveneuze (IV) of intraperitoneale (IP)-injectie, zijn onderhevig aan eerste-pass-filtering in de microcirculatie, met name in de longen, lever, milt en spier8,,9,13,14, waardoor de kans op accumulatie van cellen in niet-doelgebieden toeneemt. De invasieve intracerebrale injectiemethode resulteert in gelokaliseerde schade aan hersenweefsel en een zeer beperkte verspreiding van SC's in de buurt van de injectieplaats2,6,8,14,15,16. We hebben onlangs een katheter-gebaseerde intra-arteriële injectie methode om exogene neurale SCs leveren, die hier wordt beschreven toegepast in een knaagdier model van focal ischemische beroerte. We induceren tijdelijke (1 h) ischemie-reperfusie letsel in een halfrond met behulp van een siliconen rubber gecoate gloeidraad om de linker middelste hersenslagader (MCA) in de muis of rat17,,18,19occlude . In dit model hebben we reproducibly waargenomen ongeveer 75-85% depressie van cerebrale bloedstroom (CBF) in ipsilaterale hemisfeer met Laser Doppler of Laser speckle imaging17,19, waardoor consistente neurologische tekorten17,18,19.
Voor tijdbesparende doeleinden wordt de video ingesteld om twee keer de normale snelheid en routinematige chirurgische ingrepen af te spelen, zoals huidvoorbereiding en wondsluiting met hechting en het gebruik en de installatie van de gemotoriseerde spuitpomp worden niet gepresenteerd. De methode van intra-arteriële levering van NSC's wordt aangetoond in de context van het midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) model van experimentele beroerte bij knaagdieren. Daarom nemen we de voorbijgaande ischemische beroerteprocedure op om later aan te tonen hoe de tweede operatie, de intra-arteriële injectie, wordt uitgevoerd met behulp van de vorige chirurgische plaats op hetzelfde dier. De haalbaarheid van intra-arteriële NSC levering in knaagdier slag modellen wordt aangetoond door het beoordelen van de distributie en overleving van exogene NSC's. De werkzaamheid van NSC-therapie om hersenpathologie en neurologische disfunctie te verzachten, wordt afzonderlijk gerapporteerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures over dierlijke onderwerpen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kentucky, en de juiste zorg werd genomen om stress of pijn in verband met chirurgie te minimaliseren.
1. Bereiding van injectiekatheter en chirurgische haken
- Bouw de injectiekatheter (figuur 1). Verzamel de benodigde materialen, waaronder: MRE010, MRE025 en MRE050 buizen, 20 G, 26 G en 27 G injectienaalden (Figuur 2A),600 grit schuurpapier, superlijm en twee-component 5-minuten epoxy.
- Snijd 20 G en 26 G naalden op 1 cm van de naaldnaaf en polijst het uiteinde op schuurpapier (figuur 2B). Spoel de naalden door met 10 mL dubbel gedestilleerd water om de naaldboring schoon te maken.
OPMERKING: Er worden twee verschillende ontwerpen(figuur 1) gebruikt. Ontwerp 1 heeft een enkele connector en wordt gebruikt voor het injecteren van oplossingen of suspensies. Ontwerp 2 heeft 20 G en 26 G Luer lock connectors voor injectie van cellen (20 G naald) en flush van het dode volume (26 G naald) om de levering van het volledige volume van NSC-bevattende oplossing te garanderen.
- Snijd 20 G en 26 G naalden op 1 cm van de naaldnaaf en polijst het uiteinde op schuurpapier (figuur 2B). Spoel de naalden door met 10 mL dubbel gedestilleerd water om de naaldboring schoon te maken.
- Ontwerp 1: Steek een 3-4 cm lange MRE010 katheter in een 15 cm lange MRE025 katheter en bevestig met superlijm.
- Sluit het andere uiteinde van de MRE025-buis aan op een segment van DE050-katheter en beveilig met superlijm. Steek een afgestomde 20 G naald in het resterende uiteinde van de MRE050 katheter en bevestig met superlijm (figuur 1).
- Verder versterken van de verbinding sites met epoxy lijm. Dit katheterontwerp is optimaal voor injectie van reagentia (zoals chemische of drugoplossingen of andere biologische zoals cytokines).
- Ontwerp 2: Steek een 3-4 cm lange MRE010 katheter in een 15 cm lange MRE025 katheter en bevestig met superlijm.
- Sluit het andere uiteinde van de MRE025-buis aan op een segment van DE050-katheter en beveilig met superlijm. Steek een afgestomde 20 G naald in het resterende uiteinde van de MRE050 katheter en bevestig met superlijm.
- Steek een afgestomde 26 G naald in de MRE050 buis in de buurt van de punt van de eerste naald, na de richting van de injectiestroom, en veilig met superlijm (Figuur 1 en figuur 2C). Versterk beide naalden en het segment van de MRE050-buis met duidelijke epoxy(figuur 2C). Dit ontwerp maakt injectie van voertuigoplossing via naald 2 (26 G) na NSC-injectie door naald 1 (20 G) mogelijk om het dode volume in de katheter in de hersencirculatie te spoelen, waardoor de injectievolumes nauwkeuriger worden.
- Gebruik een 20 G naald voor NSC-injectie om schade aan de NSC's te minimaliseren, wat de levensvatbaarheid negatief kan beïnvloeden.
- Na de bouw spoel je de katheters door met 10 mL dubbel gedestilleerd water, gevolgd door 70% ethanol, en week ze vervolgens 's nachts in 70% ethanol.
- Verwijder vóór de operatie de katheters van 70% ethanol en spoel met 10 mL steriele PBS en plaats ze in een autoclaved chirurgische gereedschapskist voor opslag en transport.
- Voorbereiding van de chirurgische haken
- Snijd een 1,5- 2 cm lange naaldschacht van een naald van 27 G en polijst beide uiteinden op schuurpapier tot het dof is. Gebruik vervolgens een kleine hemostatische klem om de schacht te buigen in een haak aan de ene kant en een ring-vorm aan de andere kant.
- Steek een 10-15 cm lange MRE025 katheter door de ring en bevestig met duidelijke chirurgische tape(figuur 2D). Maak nog 2 haken met dezelfde methode.
- Week alle haken en kathetersystemen in 70% ethanol tot gebruik.
2. Voorbereiding van dieren: Levering, huisvesting, aanpassing van het milieu
- Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6 muizen (10-12 weken, n=10/tijdpunt) en Wistar ratten (10-12 weken, n=10) werden gebruikt in deze studie.
- Huis ze in een milieuvriendelijke dierlijke vivarium met voedsel en water ad libitum.
- Laat ze zich minstens 1 week voor de beroerteoperatie aanpassen aan de omgeving.
OPMERKING: Een muis en een rat stierf op 1 d na een beroerte operatie en een muis werd geëuthanaseerd op 3 d post-beroerte voorafgaand aan NSC injectie om humane redenen als gevolg van ernstige verlamming.
3. Cultuur van muis- en rattenneurale stamcellen (NSC's)
OPMERKING: NSC's werden geïsoleerd en gekweekt volgens een vastgesteld protocol20.
- Muis
- Isolaat wildtype (WT) en GFP-gelabelde NSC's uit de E18 embryonale cortex van getimede zwangerschap vrouwelijke C57BL/6 muizen gekoppeld aan GFP-positieve mannelijke muizen (B6 ACTb-EGFP). Om GFP (+) embryo's te identificeren, observeer je de geoogste embryo's op een fluorescentiemicroscoop met behulp van het FITC-kanaal. GFP (+) embryo's leveren groen fluorescentiesignaal op, terwijl WT-embryo's slechts zwakke autofluorescentie vertonen(figuur 3A).
- Rat
- Isoleer NSC's uit de subventriculaire zone (SVZ) van jongvolwassen WT-ratten. Label ze met DiI vlak voor de injectie volgens de instructies van de fabrikant21.
- Cultuur muis of rat NSCs totdat ze zich ontwikkelen tot neurosferen, en doorsnee ze wanneer de diameter van de bol bereikt ongeveer 100 μm (Figuur 3B). Gebruik de NSC's voor injectie tussen passages 3 en 5.
- Controleer hun stamceleigenschappen met behulp van een embryonaal stamcelmarkeringspaneel(figuur 3C).
- Verzamel op de dag van injectie NSC-bollen en los met de celloslatingsoplossing, hang in calcium- en magnesiumvrije PBS op tot een concentratie van 107 cellen/mL en plaats op nat ijs tot de injectie.
4. Chirurgische voorbereiding
- Markeer vóór de operatie een stip op de commerciële MCAO-hechting met een zilveren stift pen op 9 mm (voor muis) of 15 mm (voor rat) van de tip voor in-chirurgie referentie van invoeglengte. Autoclave de chirurgische instrumenten (schaar, tang) en instrumenten voor elke operatie, en warmte steriliseren ze in een glazen kraal sterilisator tussen operaties.
- Induceer anesthesie bij dieren met 5% isoflurane via inademing en behoud anesthesie met 1-2% isoflurane. Evalueer de diepte van anesthesie door observatie van algemene aandoeningen (ademhalingspatroon, snorbeweging en spontane lichaamscorrectie houding), hoornvliesreflex en reactie op teenknijpen.
- Leg dierlijke supine op een verwarmingskussen, en bereid de chirurgische plaats op het dier door het knippen en schrobben met betadine oplossing gevolgd door 70% ethanol. Bescherm de ogen van het dier tegen drogen door tijdens de operatie oogheelkundig zalf (bijvoorbeeld kunstmatige traanzalf) aan te brengen.
- Laat chirurgen grondig schrobben hun handen met een bacteriocidale scrub en draag een masker, steriele handschoenen, en een schone lab jas.
5. Middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) beroerte chirurgie
OPMERKING: De operaties om ischemische beroerte te veroorzaken in een halfrond van muis of rat zijn vergelijkbaar in dat een hechting wordt geïntroduceerd in de interne halsslagader (ICA) om de bloedstroom af te beelden (Figuur 4)17,18,19,22. De voor hechting geselecteerde slagader verschilt echter op basis van de beschikbare bewerkingsruimte die nodig is voor de daaropvolgende stamcelinjectie. De rat heeft voldoende ruimte in het segment van de externe halsslagader (ERK) om twee afzonderlijke, sequentiële operaties (beroerte en NSC-injectie) mogelijk te maken, maar de muis niet, waardoor een alternatieve aanpak nodig is. Stroke-geïnduceerde cerebrale bloedstroom veranderingen, herseninfarct grootte en neurologische tekorten zijn gemeld zoals in de auteurs 'eerdere rapporten17,18,19.
- Om ischemische beroerte te induceren, beginnen zowel muis en rat operaties met een middellijn incisie op het cervicale gebied, en isolatie van de linker gemeenschappelijke halsslagader (CCA), ECA en ICA (Figuur 4). Wees voorzichtig om niet te rekken, verplaatsen of knijpen de CCA of vagus zenuw. Aangezien de selectie van slagader en chirurgische stappen daarna verschillend zijn, zal mcao chirurgie op de muis en de rat afzonderlijk worden beschreven.
- MCAO chirurgie op de muis(Figuur 4A)
- Plaats drie gevlochten 6-0 nylon hechtingen onder de CCA(Figuur 4A, stap 1), en maak een strakke chirurgische knoop om het vat zo ver mogelijk van de splitsing af te sluiten met behulp van de proximale string(Figuur 4A, stap 2). Knip de hechtingseinden af.
- Maak een slipknot aan de distale kant van CCA (let op: niet te veel aanspannen als het zal worden vrijgegeven in stap 6) en een losse slipknot tussen de twee aangescherpte knopen (Figuur 4A, stap 2).
- Snijd een kleine incisie (~ 1/4 - 1/3 van de omtrek) dicht bij de proximale knoop op de CCA met microscissors (Figuur 4A, stap 3), en zorgvuldig invoegen van de commerciële siliconen rubber gecoate 7-0 nylon vaste hechting(Figuur 4A, stap 4). Zet deze hechting vast met de middelste snaar, scherper(figuur 4A, stap 5) om geen bloedlekkage van de incisie en geen beweging van de siliconen rubber gecoate nylon filament door de terugstroom van ICA, terwijl nog steeds waardoor de vooruitgang van de hechting in de richting van de ERK met een zachte druk door de pincetten.
- Laat de bovenste (distale) slipknot(figuur 4A, stap 6) los en ga de nylon hechting in de ICA tot de punt de splitsing voor 9 mm passeert (met behulp van de zilveren markering op de hechting als referentie). Draai de bovenste twee slipknots aan om de hechting vast te stellen en de terugstroom van het bloed te voorkomen.
- Trek de gloeidraad 1 uur later(Figuur 4A, stap 7) en ligate de CCA met behulp van de middelste knoop om bloedingen te voorkomen (Figuur 4A, stappen 5-7 in omgekeerde volgorde, definitieve resultaten zoals te zien in stap 8). Laat de bovenste knoop los. Sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.
- MCAO chirurgie op rat (Figuur 4B)
- Plaats twee gevlochten 6-0 nylon hechtingen onder de ERK(Figuur 4B, stap 1), en maak een strakke knoop aan het distale uiteinde zoveel mogelijk(Figuur 4B, stap 2).
- Plaats vatclips op de ICA en CCA om de arteriële bloedstroom af te beelden(figuur 4B, stap 3). Een slipknot kan worden gebruikt als alternatief voor een vatclip.
- Maak een kleine incisie op de ERK met microscissors(Figuur 4B, stappen 3-4), steek een commerciële siliconen rubber bekleed 6-0 nylon filament (Figuur 4B, stap 5), en veilig goed met een slipknot op de ERK.
- Laat de vaartuigclip op de ICA los, zet de gloeidraad in de ICA tot de zilveren markering (15 mm) de splitsing bereikt(figuur 4B, stap 6), en zet de hechting vervolgens vast met de2e knoop op de ERK(figuur 4B, stap 6).
- Na 1 uur ischemie trekt u deze gloeidraad terug en ligate de incisie om bloedingen te voorkomen(figuur 4B, stap 7), verwijder de vaatclip van CCA (eindresultaat in stap 8) en sluit u de wond met 4-0 chirurgische hechting.
6. Herstel
- Na een beroerte operatie, plaats dieren op een verwarmingskussen totdat ze volledig weer bij bewustzijn.
- Zorg voor analgesie via onderhuidse injectie. Breng dieren terug naar hun kooien thuis met toegang tot water en voedsel ad libitum.
7. Intra-arteriële injectie
- Was de hele katheter met 70% ethanol en geniet 's nachts tot gebruik. Sluit vlak voor de injectie het Luerslot van de naald aan met een steriele spuit en was de gehele lumenkant van het kathetersysteem met 10 mL steriele PBS.
- Tijdvenster en voorbereiding voor NSC-injectie
OPMERKING: Op basis van ervaring en rapporten van andere onderzoeksteams is de timing voor NSC-injectie cruciaal om zowel proefpersonen als exogene NSC's te overleven. In onze pilot studie leidde injectie van NSC's op vroege tijdstippen (binnen de eerste 6 uur na reperfusie) tot een hogere mortaliteit. Zo hebben we later injectietijdpunten getest en het tijdvenster tussen 2 d (48 uur) tot 3 d (72 uur) na een beroerte veilig en draaglijk voor dieren getest en efficiënt in het bereiken van intraparenchymale distributie van NSC's. De hierin gepresenteerde resultaten zijn van dieren die NSC-injectie op 3 d na letsel hebben ontvangen.- Stel de injectiesnelheid van de spuitpomp in op 20 μL/min voor muizen en 50 μL/min voor ratten. Overmatige snelheid of duur van de injectie kan leiden tot systemische volumeoverbelasting, waarvoor muizen kwetsbaarder zijn dan ratten.
- Kortom, op 3 d na een beroerte operatie, verdoven de dieren met isoflurane en leg ze supine op een verwarmingskussen.
- Heropen de cervicale wond en stel de ERK, ICA en CCA opnieuw bloot(figuur 5, stap 1). Bepaal net als bij de beroerteoperaties de injectieroute op basis van de soort. Gebruik de CCA voor NSC injectie in de muis, en de ERK voor de rat23.
- Intra-arteriële injectie via de CCA in muis
- Plaats twee 6-0 gevlochten nylon hechtingen onder de CCA. Maak een losse slipknot met elk van hen tussen de splitsing en lagere knopen van de vorige beroerte operatie (Figuur 5, stap 2).
- Draai de bovenste slipknot aan en maak vervolgens een kleine incisie boven de onderste knoop(figuur 5, stap 3). Steek een MRE010 katheter door de incisie(figuur 5, stap 4) en zet met de middelste knoop zonder de injectiestroom te blokkeren(figuur 5, stap 5). Terugstroom van bloed moet zichtbaar zijn in de katheter bij het loslaten van de bovenste knoop en het aanpassen van de katheterpositie.
- Plaats een vatclip op de ERK, injecteer 1 x 106 GFP-NSC's via deze katheter op 20 μL/min gedurende 5 minuten met een spuitpomp, gevolgd door een flush met 50-100 μL PBS bij dezelfde snelheid.
- Na injectie bindt u de CCA boven de incisie met de bovenste slipknoop en trekt u de MRE010-katheter(figuur 5, stap 6) in. Draai en trim de middelste knoop en de bovenste knoop. Verwijder de vaartuigclip uit de ERK. Raadpleeg de uiteindelijke afbeelding in figuur 5, stap 7.
- Sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.
- Na voldoende herstel op een verwarmingskussen en onderhuidse pijnstillende injectie, breng je de dieren terug naar hun kooi thuis.
- Intra-arteriële injectie via de ERK bij rat
- Tijdelijk occlude de ERK en CCA met vat clips (Figuur 5, stap 2).
- Maak een kleine incisie aan de proximale zijde vanERK (figuur 5, stap 3), steek de MRE010-katheter in en bevestig met een knoop(figuur 5, stap 4).
- Verwijder beide scheepsclips, injecteer 5 x 106 NSC's in 100 μL PBS bij 50 μL/min gedurende 2 min, gevolgd door een flush met 50-100 μL PBS (figuur 5, stap 5) met dezelfde snelheid, met behulp van een gemotoriseerde spuitpomp.
- Na injectie occlude de CCA en ECA met vat clips opnieuw en ligate de ERK aan de proximale kant van de tweede incisie na terugtrekking van de injectiekatheter (Figuur 5, stap 6).
- Verwijder de twee vatclips(figuur 5, stap 7) en sluit de wond met 4-0 chirurgische hechting.
- Na voldoende herstel op een verwarmingskussen en onderhuidse pijnstillende injectie, breng je de dieren terug naar hun kooi thuis.
- Histologische test
- Verzamel hersenen van muizen en ratten die een ischemische beroerte hebben gekregen, gevolgd door injectie van NSC's of voertuigoplossing na euthanasie en intracardieperfusie met 4% paraformaldehyde bij 1 d (muis en rat), 7 d (muis) en 30 d (muis) na injectie. Elk van deze vier groepen bestond uit 5 NSC en 5 voertuig geïnjecteerd dieren.
- Fix hersenen 's nachts en cryopreserve in 30% sacharose voor 3 d.
- Sluit de hersenen in in OCT, snijd op 40 μm dikte, en onderzoeken de verdeling van NSCs na immunostaining met celspecifieke markers, met inbegrip van gliafibrillaire zure eiwitten (GFAP, astrocyten), Tuj1 (volwassen neuronen), en doublecortine (DCX, onrijpe neuronen).
OPMERKING: Vanwege het ontbreken van een rattenstam die GFP uitdrukt, gebruikten we DiI, een voorbijgaand fluorescerend label, voor ratten NSCs, die alleen relatief korte termijn observatie mogelijk maakt. Vandaar, NSC distributie werd alleen onderzocht op 1 d na beroerte bij ratten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GFP-gelabelde NSC's werden gemakkelijk gedetecteerd in de ischemische hersenen, meestal in het ipsilaterale halfrond, vooral in de penumbra en langs de letselrand(figuur 6). De examinator was blind tijdens beeldvorming en analyse.
Bijvoorbeeld, op 1 d na injectie, NSC's werden gedetecteerd in de muis hippocampus. Een subset van NSC's toonde co-expressie van de onrijpe neuron marker DCX in de dentate gyrus, zelfs op dit vroege tijdstip(figuur 6A).
Bij 10 d na beroerte (7 d na NSC-injectie) werden exogene GFP-NSC's waargenomen bij de hoogste dichtheid aan de rand van letsel (waterscheidingsgebied) in het striatum en de cortex(figuur 6B). Het is opmerkelijk dat door 7 d na injectie veel van de GFP-NSCs ook DCX (weergegeven door blauwe cirkels), met vermelding van hun neuronale lot uitgedrukt. Vergeleken met dieren die voertuigoplossingsinjectie kregen, verhoogde de NSC-injectie ook DCX-vlekken (rood) in het ipsilaterale halfrond.
Op 30 d na injectie, NSC's werden nog steeds gedetecteerd in de gewonde cortex, en een deel van hen toonde expressie van glial marker GFAP (Figuur 6C) of volwassen neuronale marker Tuj1 (Figuur 6D), met vermelding van het potentieel van exogene NSCs te onderscheiden in een glia of neuronale lot, en overleven tot 1 maand in de gewonde hersenen.
Figuur 1: Schematische ontwerpen van injectiekatheters. We introduceren twee ontwerpen, Design 1 voor samengestelde oplossing injectie en Design 2 voor celinjectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Bereiding van katheter voor NSC-injectie en van chirurgische haken. (A) Materialen voor katheterbouw: MRE010, MRE025 en MRE050 katheters met respectievelijk 3 cm, ~10-15 cm en 3 cm lengtes. (B) Afgesneden naald tips en polijsten tot saai. (C) Sluit elk segment en veilig met superlijm, en dan insluiten zowel naald Luer sloten en MRE050 segment in epoxy voor verbetering. (D) Maak chirurgische haak met behulp van 27 G naald schacht en MRE025 katheter. Schaalbalk: 5 mm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Cultuur van GFP (+) neurale stamcellen. (A) Identificeer GFP -embryo's (+) met fluorescentiemicroscoop met behulp van het FITC-kanaal. (B) Isoleren en cultuur corticale NSC's totdat ze vormen neurosferen. Schaalbalk: 100 μm. (C) Neurosfeer-eigenschappen onderzoeken met behulp van een stamcelmarkerpaneel. Schaalbalk: 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Schematische beelden van stapsgewijze midden cerebrale slagader occlusie (MCAO) beroerte chirurgie op muis of rat. Raadpleeg de video voor een gedetailleerde chirurgische ingreep. ICA, inwendige halsslagader; ERK, externe halsslagader; CCA, gemeenschappelijke halsslagader. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Schematische beelden van intra-arteriële neurale stamcel (NSC) injectie in muis of rat. Raadpleeg de video voor een gedetailleerde chirurgische ingreep. ICA, inwendige halsslagader; ERK, externe halsslagader; CCA, gemeenschappelijke halsslagader. De groene pijl geeft de richting van de stroom tijdens de injectie. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 6: Distributie, overleving en differentiatie van neurale stamcellen (NSC's) in de ischemische hersenen. (A) Detectie van GFP (+) NSC's in de hippocampal dentate gyrus op 1 d na injectie. Stamcellen fluoresceren groen; doublecortine (DCX) immunostaining weergegeven in rood. De witte pijl geeft een GFP (+) NSC met DCX-expressie aan. (B) Schematische kaart van GFP -cellen (+) en DCX-gelabelde cellen op 10 d na Ischemie-Reperfusie (I-R) in schijncontroles (geen injectie) en voertuig (I-R) of NSC (I-R + NSC) geïnjecteerde muizen. De topografie van de ischemische belediging is afgebeeld in het laatste schema, waar lichter en donkerder oranje vertegenwoordigen het gebied onderworpen aan ischemische uitdaging en de necrotische kern, respectievelijk. Het blauwe lint geeft het "keerpunt" aan. De grijze rechthoeken geven de locaties weer waar afbeeldingen voor (C) en (D) zijn gemaakt. (C,D) Exogene NSC's kunnen zich onderscheiden in een glialot (GFAP, C) of een neuronale lot (Tuj1, D) door 30 d na de bevalling. Er werden geen significante signalen waargenomen in het FITC-kanaal (GFP) bij de slagdieren die voertuiginjectie kregen (voertuig in C en D),terwijl in NSC-geïnjecteerde muizen, overlevende GFP-NSC's werden gevisualiseerd en colocalized met GFAP(C)of Tuj1(D)kleuring. Pijlen geven overlay van 2 kanalen aan. Schaalbalk: 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Stamceltherapie voor neurologische aandoeningen bevindt zich nog in een vroeg verkennend stadium. Een belangrijk probleem is dat er geen vaste methode is voor voldoende levering van SCs of NSC's in de hersenen.
Hoewel exogene SCs/NSC's in de hersenen kunnen worden gedetecteerd na intraveneuze (IV), intraperitoneale (IP) of intraparenchymale/intracerebrale injectie, heeft elke leveringsbenadering nadelen. De detecteerbare populatie in de hersenen wordt geschat op zeer laag met perifere injectie (IV of IP), die slechts een klein deel van de cellen geïnjecteerd of toegediend. Intracerebrale injectie levert een zeer focale verdeling op en kan direct leiden tot hersenletsel2,6,7,8,9,10,11,12,13. Daarom hebben we de haalbaarheid van intra-arteriële injectie getest als een alternatieve methode voor NSC-levering na ischemische beroerte. Deze methode levert NSC's via de ipsilaterale cerebrale perfusie na een beroerte belediging. Als geïnjecteerd vroeg na een beroerte, exogene NSC's kunnen de verstoorde bloed-hersenbarrière (BBB), het bereiken van een brede verdeling in de hersenen. Een voordeel van intra-arteriële injectie is dat het gebruik maakt van een first-pass effect binnen het CNS, het maximaliseren van het potentieel voor exogene NSC's te vestigen in de hersenen, in tegenstelling tot perifere levering routes waarin de cellen eerst door de rijke microcirculatie van filteren organen zoals de long en lever.
De hier beschreven intra-arteriële benadering is veelzijdig en kan worden aangepast aan verschillende soorten leveringsparadigma's en letsel- of ziektemodellen. Hoewel in het huidige onderzoek slechts één intra-arteriële injectie wordt uitgevoerd, kan de MRE025-katheter worden aangesloten op een microport die onderhuids is ingebed, waardoor dieren repetitieve intra-arteriële injecties kunnen ontvangen12. Bovendien kan deze injectiemethode, met het eenvoudigere, enkelvoudige lumenontwerp, worden gebruikt voor de levering van reagentia in oplossing12,23. Als de levering van meerdere therapieën nodig is, de dubbele lumen ontwerp kan worden gebruikt om een eerste oplossing gelijktijdig of sequentieel met een tweede drug of verbinding te leveren. Voor toepassingen op knaagdiermodellen van neurodegeneratie of traumatisch hersenletsel, wanneer er geen behoefte is aan de eerste beroerteoperatie, kan een operatie voor de installatie van de injectiekatheter in de muis worden uitgevoerd op de ERK (hetzelfde protocol als dat voor rat, waarbij het injectievolume en de snelheid in stap 7.4 voor muizen adequaat worden aangepast, om mogelijke verstoring van de cerebrale bloedstroom door de CCA te voorkomen.
Verschillende nadelen en mogelijke nadelige gevolgen van deze intra-arteriële injectie moeten worden overwogen. Dieren krijgen een tweede operatie, die het potentieel voor complicaties in verband met anesthesie of chirurgie draagt. Cerebrale bloedstroom door de ipsilaterale CCA wordt verstoord, zij het tijdelijk (minder dan een paar minuten), die kan leiden tot een andere voorbijgaande episode van milde depressie van CBF. Bovendien is BBB-storing of opening van cruciaal belang voor intra-arteriële NSC-levering, wat het therapeutische venster beperkt. In de pilot studie, bijna geen GFP (+) NSCs werden gedetecteerd in naïeve hersenen na intra-arteriële injectie. Echter, als het onderwerp medicijnen kan verdragen die BBB van voorbijgaande aard kunnen openen, zoals hoge osmolaliteit mannitol of zoutoplossing, kan dit worden gebruikt om een voorbijgaand venster van BBB opening voor NSC injectie op latere tijd punten te creëren. In voorbereidende studies, vonden we dat intra-arteriële injectie binnen de eerste 6 uur na een beroerte resulteerde in een hogere mortaliteit dan waargenomen met een beroerte alleen. Dit kan gerelateerd zijn aan een tweede invasieve operatie na een relatief korte periode van herstel na de eerste operatie. Als alternatief, na ischemische belediging, de gewonde cerebrovasculature kan een hogere neiging om te vernauwen in reactie op eventuele extra stimuli, zoals de invoering van de katheter, extra vochtbelasting, of gehechtheid van exogene NSCs aan de luminale wand na injectie. Een andere redelijke zorg met betrekking tot NSC levering na beroerte is dat NSC's embolie kunnen vormen die microschepen verder occlude of verstoren. In overeenstemming met eerdere rapporten8,16,24, vonden we geen significant bewijs van GFP (+) embolie in de microvasculatuur, hoewel we GFP (+) NSCs in de perivasculaire ruimte (Virchow-Robin ruimte) in de vroege dagen na injectie vonden. Nadat we het tijdvenster voor injectie hadden geoptimaliseerd, was er geen verschil in complicatie of sterftecijfer tussen beroertegroepen die voertuig- of NSC-injectie kregen in de huidige studie. Daarom is goed ontworpen intra-arteriële NSC-injectie een veilige en efficiënte methode van NSC-behandeling gericht op neurologische ziekten.
Om een succesvolle NSC-injectie te bereiken en de resultaten van dieren te verbeteren, moeten verschillende aspecten voorzichtig worden behandeld tijdens de beroerteoperatie of NSC-injectie. Algemene chirurgische ondersteuning en zorg, zoals de bescherming van het hoornvlies en het onderhoud van de kerntemperatuur, moeten worden beoefend. Hier introduceren we een aantal mogelijke complicaties van deze specifieke operatie en begeleiding om hun optreden te minimaliseren.
Er kan stress zijn op de nervus vagus. Tijdens de operatie mag de nervus vagus niet worden uitgerekt, geplet, geband of gestimuleerd. Incidentele stimulatie van de nervus vagus kan aritmie veroorzaken, zoals bradycardie, hartstilstand of zelfs de dood.
Onjuiste plaatsing of aanscherping van hechting, of verkeerde plaatsing of uitglijden van een vatclip kan leiden tot arteriële bloedingen uit het proximale uiteinde van CCA (van cardiale output) of distaal uiteinde door de cirkel van Willis. Zorg er bij elke stap voor dat de bloedvatclip of knopen goed worden geplaatst om de bloedstroom af te nemen. Als er bloedingen optreden, probeer dan de juiste plaatsing van knoop- of vatclips te herstellen. Als het gezichtsveld wazig is met bloed, zet het puntje van een steriel wattenstaafje op de CCA en houd met druk om de bloedstroom te stoppen. Hemoglobine van bloeden zal het sluiten van de incisie op de slagader vergemakkelijken. Nadat het bloeden stopt, draai de knoop of plaats het vat clip op de juiste locatie, reinig het bloed in het gezichtsveld en zet de operatie voort.
Er kan letsel of complicaties van katheter inbrengen. Trim de MRE010-tip onder een hoek van 45°, zodat hij gemakkelijk in de kleine incisie op de slagader kan komen, zonder dat het vat letsel veroorzaakt. In zeldzame gevallen kan een overgeslepen punt de slagader binnendringen of de ruimte tussen het keldermembraan en tunica externa binnendringen. Om deze verwondingen te voorkomen, maak een juiste grootte incisie op de slagader. Wij raden een grootte van 1/4-1/3 de omtrek van de slagader, die groot genoeg is om de binnenkomst van katheter tip mogelijk te maken, maar behoudt genoeg kracht in het vat muur te wikkelen buiten de katheter. Een te grote incisie kan leiden tot scheuren van de slagader op de incisieplaats. Leid de MRE010 kathetertip voorzichtig om de incisie in te voeren. Forceer de indringening van de katheterpunt of de voortgang van de katheter niet. Indien nodig kunnen scherpe tangen worden gebruikt om de rand van de incisie op te tillen. Ga de katheter met een lage hoek ten opzichte van de slagader vooruit, zodat de katheter en de slagader bijna parallel zijn.
Er zijn ook mogelijke injectie-gerelateerde complicaties. Een veel voorkomende complicatie van intra-arteriële injectie is overmatige volumebelasting, wat kan leiden tot acute cardiale overbelasting en longoedeem. Snelle injectiesnelheden kunnen deze risico's versterken en schade aan de vaatwandveroorzaken 8. Zo moeten zowel de snelheid als het totale volume zorgvuldig worden gecontroleerd. Wij raden 20 μL/min aan als over het algemeen veilig voor muizen wanneer deze over een korte periode van 5 minuten worden gebruikt. Als symptomen van volumeoverbelasting worden opgemerkt, zoals snelle, ondiepe adem, roze bellen van nares of dysforie-achtige afwijkende beweging, moet de injectie worden gestopt of afgebroken en moeten de dieren zich laten herstellen. Een andere mogelijke complicatie is de vorming van NSC embolie in het cerebrovasculaire systeem. De suspensieoplossing mag geen calcium of magnesium bevatten, waarvan bekend is dat ze celaggregatie bevorderen. Om de kans op het induceren van embolie te verminderen, moeten suspensies met één cel van NSC's vlak voor de injectie onder de loep worden genomen om een afwezigheid van celclusters te bevestigen. Als celclusters aanwezig zijn, titreer dan met een steriele 1 mL pipet tot een celsuspensie is bereikt.
Deze studie stelt de haalbaarheid vast van de intra-arteriële leveringsbenadering voor muizen en ratten, en onthult een aantal belangrijke kenmerken van deze intra-arteriële injectie van NSC's in het kader van ischemische beroerte. In vergelijking met de relatief focale verdeling van NSC's overleven in de hersenen parenchyma meestal gemeld met intra-cerebrale injectie1,7,9,11,15,16, we waargenomen een diffuse verdeling over de ipsilaterale hemisfeer, met inbegrip van de cortex, hippocampus en striatum. Zo is intra-arteriële levering zeer geschikt, niet alleen voor een beroerte, maar ook voor meerdere soorten letsel of ziekten die diffuse hersenschade te betrekken. In de setting van MCAO werd de hoogste concentratie NPC's aangetroffen langs de rand van de schadelocatie. De toegenomen dichtheid van exogene NSC's in de penumbrazone kan te wijten zijn aan een verhoogde levering aan deze regio via de bijkomende stroom van opnieuw vastgestelde bloedperfusie en opening van de BBB en de migratie van NSC's naar het beschadigde gebied. Hoewel iv-levering van SC's kan resulteren in een diffuse verdeling, wordt het aantal cellen dat de hersenen bereiken geschat op een klein deel van het totaal dat wordt geleverd, deels als gevolg van filtratie door perifere organen8,13. Op basis van een eerdere studie over hersenmetastase12, intra-arteriële geïnjecteerd luciferase-label D122 tumorcellen maakte gebruik van de eerste pass effect te vestigen in de cerebrale vasculatuur en ontwikkelen uitgezaaide sites in de hersenen in plaats van de perifere organen. Cerebrale gemetastaseerde sites als gevolg van exogene tumorcellen werden ontdekt in de hersenen ipsilaterale aan de injectie al 1 week na de injectie met behulp van een IVIS imaging systeem om het bioluminescente signaal te detecteren door de intacte schedel en hoofdhuid. In tegenstelling, luminescent signalen (met vermelding van tumorlast geassocieerd met de exogene tumorcellen) uit de perifere organen, zoals lever, long en spier, werden niet gedetecteerd tot 3-4 weken na intra-arteriële injectie. Daarom verwachten we, in een vergelijkbaar scenario, intra-arteriële NSC-levering zal ook profiteren van de first-pass effect in de cerebrale circulatie om de lokalisatie naar de hersenen sterk te verhogen in vergelijking met perifere organen.
Hoewel directe intracerebrale injectie kan worden gebruikt om grote aantallen cellen te leveren aan de gewonde hersenen, de aanpak resulteert in cellulaire schade of bloeding als gevolg van naald penetratie van de parenchyma die lokale neuro-inflammatie triggers, potentieel afbreuk te doen aan de overleving en integratie van de nieuw geleverde cellen14,15,16,25,26. De intra-arteriële benadering voor NSC levering is voordelig in die zin dat het deze gelokaliseerde hersenschade en neuro-ontsteking vermijdt, en ondersteunt de overleving op lange termijn van NSC's3,8,9,14,24. We constateerden overleving en differentiatie van geïnjecteerde GPF-NSCs in de gewonde hersenen op tijdstippen tot 30 d na injectie. Hoewel we NSC's vonden die zich hadden onderscheiden in volwassen neuronen en astrocyten, zijn gedetailleerde studies nodig om de relatieve verdeling van verschillende celtypen gegenereerd uit GFP-NSCs en de verhoudingen die overleven in de chronische postinjury periode te bepalen. Wat nog belangrijker is, of overlevende, exogene NSCs kunnen interageren met constitutieve hersencellen om het cerebrale netwerk te herbouwen en neurologische functie te veranderen is nog onduidelijk en moet worden onderzocht.
Samen introduceren we een intra-arteriële leveringsmethode om NSC's in de ischemische hersenen te leveren, waarbij we op lange termijn overleven op het ischemische halfrond en differentiatie in neuronale en gliaceltypen aantonen. De intra-arteriële levering benadering is aanpasbaar voor tal van soorten en meerdere modellen van CNS letsel en ziekte en kan worden gebruikt voor de levering van andere celtypes of enkele of meerdere therapeutische verbindingen of biologische stoffen, het verstrekken van breed nut voor de neurowetenschappen gemeenschap.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd ondersteund door het volgende: AHA Award 14SDG20480186 voor LC, Subject innovation team van Shanxi University of Chinese Medicine 2019-QN07 for BZ, en Kentucky Spinal Cord and Head Injury Research Trust grant 14-12A for KES and LC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 20 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305175 | preparation of injection catheter |
| 26 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305111 | preparation of injection catheter |
| 27 G needle | Becton & Dickinson | BD PrecisionGlide 305136 | preparation of injection catheter |
| 4-0 NFS-2 suture with needle | Henry Schein Animal Health | 56905 | surgery |
| 6-0 nylon suture | Teleflex/Braintree Scientific | 104-s | surgery |
| Accutase | STEMCELL Technologies | 7922 | cell detachment solution |
| blade | Bard-Parker | 10 | surgery |
| Buprenorphine-SR Lab | ZooPharm | Buprenorphine-SR Lab® | analgesia (0.6-1 mg/kg over 3 d) |
| Calcium/magnisum free PBS | VWR | 02-0119-0500 | NSC dissociation |
| DCX antibody | Millipore | AB2253 | immunostaining |
| GFAP antibody | Invitrogen | 180063 | immunostaining |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 50562-1 | surgery |
| MCAO filament for mouse | Doccol | 702223PK5Re | surgery |
| MCAO filament for rat | Doccol | 503334PK5Re | surgery |
| MRE010 catheter | Braintree Scientific | MRE010 | preparation of injection catheter |
| MRE025 catheter | Braintree Scientific | MRE025 | preparation of injection catheter |
| MRE050 catheter | Braintree Scientific | MRE050 | preparation of injection catheter |
| Nu-Tears Ointment | NuLife Pharmaceuticals | Nu-Tears Ointment | eye care during surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Angled | Fine Science Tools | 00649-11 | surgery |
| S&T Forceps - SuperGrip Tips JF-5TC Straight | Fine Science Tools | 00632-11 | surgery |
| Superglue | Pacer Technology | 15187 | preparation of injection catheter |
| syringe pump | Kent Scientific | GenieTouch | surgery |
| Tuj1 antibody | Millipore | MAb1637 | immunostaining |
| two-component 5 minute epoxy | Devcon | 20445 | preparation of injection catheter |
| Vannas spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | surgery |
| vascular clamps | Fine Science Tools | 00400-03 | surgery |
| Zeiss microscope | Zeiss | Axio Imager 2 | microscopy |
References
- Wang, Y. Stroke research in 2017: surgical progress and stem-cell advances. The Lancet. Neurology. 17, 2-3 (2018).
- Bliss, T., Guzman, R., Daadi, M., Steinberg, G. K. Cell transplantation therapy for stroke. Stroke. 38, 817-826 (2007).
- Boese, A. C., Le, Q. E., Pham, D., Hamblin, M. H., Lee, J. P. Neural stem cell therapy for subacute and chronic ischemic stroke. Stem Cell Research & Therapy. 9, 154 (2018).
- Kokaia, Z., Llorente, I. L., Carmichael, S. T. Customized Brain Cells for Stroke Patients Using Pluripotent Stem Cells. Stroke. 49, 1091-1098 (2018).
- Savitz, S. I. Are Stem Cells the Next Generation of Stroke Therapeutics. Stroke. 49, 1056-1057 (2018).
- Wechsler, L. R., Bates, D., Stroemer, P., Andrews-Zwilling, Y. S., Aizman, I. Cell Therapy for Chronic Stroke. Stroke. 49, 1066-1074 (2018).
- Muir, K. W. Clinical trial design for stem cell therapies in stroke: What have we learned. Neurochemistry International. 106, 108-113 (2017).
- Guzman, R., Janowski, M., Walczak, P. Intra-Arterial Delivery of Cell Therapies for Stroke. Stroke. 49, 1075-1082 (2018).
- Misra, V., Lal, A., El Khoury, R., Chen, P. R., Savitz, S. I. Intra-arterial delivery of cell therapies for stroke. Stem Cells and Development. 21, 1007-1015 (2012).
- Argibay, B., et al. Intraarterial route increases the risk of cerebral lesions after mesenchymal cell administration in animal model of ischemia. Scientific Reports. 7, 40758 (2017).
- Kelly, S., et al. Transplanted human fetal neural stem cells survive, migrate, and differentiate in ischemic rat cerebral cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11839-11844 (2004).
- Chen, L., Swartz, K. R., Toborek, M. Vessel microport technique for applications in cerebrovascular research. Journal of Neuroscience Research. 87, 1718-1727 (2009).
- Fischer, U. M., et al. Pulmonary passage is a major obstacle for intravenous stem cell delivery: the pulmonary first-pass effect. Stem Cells and Development. 18, 683-692 (2009).
- Misra, V., Ritchie, M. M., Stone, L. L., Low, W. C., Janardhan, V. Stem cell therapy in ischemic stroke: role of IV and intra-arterial therapy. Neurology. 79, 207-212 (2012).
- Muir, K. W., Sinden, J., Miljan, E., Dunn, L.
- Boltze, J., et al. The Dark Side of the Force - Constraints and Complications of Cell Therapies for Stroke. Frontiers in Neurology. 6, 155 (2015).
- Huang, C., et al. Noninvasive noncontact speckle contrast diffuse correlation tomography of cerebral blood flow in rats. Neuroimage. 198, 160-169 (2019).
- Wong, J. K., et al. Attenuation of Cerebral Ischemic Injury in Smad1 Deficient Mice. PLoS One. 10, 0136967 (2015).
- Zhang, B., et al. Deficiency of telomerase activity aggravates the blood-brain barrier disruption and neuroinflammatory responses in a model of experimental stroke. Journal of Neuroscience Research. 88, 2859-2868 (2010).
- Walker, T. L., Yasuda, T., Adams, D. J., Bartlett, P. F. The doublecortin-expressing population in the developing and adult brain contains multipotential precursors in addition to neuronal-lineage cells. The Journal of Neuroscience. 27, 3734-3742 (2007).
- Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3, 20130001 (2013).
- Bertrand, L., Dygert, L., Toborek, M. Induction of Ischemic Stroke and Ischemia-reperfusion in Mice Using the Middle Artery Occlusion Technique and Visualization of Infarct Area. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Leda, A. R., Dygert, L., Bertrand, L., Toborek, M. Mouse Microsurgery Infusion Technique for Targeted Substance Delivery into the CNS via the Internal Carotid Artery. Journal of Visualized Experiments. , (2017).
- Chua, J. Y., et al. Intra-arterial injection of neural stem cells using a microneedle technique does not cause microembolic strokes. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, 1263-1271 (2011).
- Potts, M. B., Silvestrini, M. T., Lim, D. A. Devices for cell transplantation into the central nervous system: Design considerations and emerging technologies. Surgical Neurology International. 4, 22-30 (2013).
- Duma, C., et al. Human intracerebroventricular (ICV) injection of autologous, non-engineered, adipose-derived stromal vascular fraction (ADSVF) for neurodegenerative disorders: results of a 3-year phase 1 study of 113 injections in 31 patients. Molecular Biology Reports. 46, 5257-5272 (2019).
