JoVE Journal Genetics

Genetics

RT-PCR quantitativo ad alta produttività in campioni C. elegans singoli e sfusi che utilizzano la tecnologia nanofluidica

Published: May 28, 2020 doi: 10.3791/61132

Laetitia Chauve*¹, Jérémie Le Pen*^2,3,5, Francesca Hodge¹, Pia Todtenhaupt¹, Laura Biggins¹, Eric A. Miska^2,3,4, Simon Andrews¹, Olivia Casanueva¹

¹Babraham Institute, ²Gurdon Institute, University of Cambridge, ³Department of Genetics, University of Cambridge, ⁴Wellcome Trust Genome Campus, Wellcome Trust Sanger Institute, ⁵Laboratory of Virology and Infectious Disease, The Rockefeller University

* These authors contributed equally

Summary

In questo articolo viene descritto un protocollo ad alta produttività per una determinazione rapida e affidabile dei livelli di espressione genica in campioni C. elegans singoli o sfusi. Questo protocollo non richiede l'isolamento dell'RNA e produce cDNA direttamente dai campioni. Può essere utilizzato insieme a piattaforme qPCR multiplexate ad alta produttività in tempo reale.

Abstract

Questo documento presenta un saggio quantitativo di trascrizione quantitativa PCR (RT-qPCR) ad alta produttività per gli elegans caenorhabditis che è veloce, robusto e altamente sensibile. Questo protocollo ottiene misurazioni precise dell'espressione genica da singoli worm o da campioni di massa. Il protocollo qui presentato fornisce un nuovo adattamento dei metodi esistenti per la preparazione del DNA complementare (cDNA) accoppiato a una piattaforma rt-qPCR nanofluidico. La prima parte di questo protocollo, chiamata "Worm-to-CT", consente la produzione di cDNA direttamente dai nematodi senza la necessità di un precedente isolamento dell'mRNA. Aumenta la produttività sperimentale consentendo la preparazione del cDNA da 96 vermi in 3,5 ore. La seconda parte del protocollo utilizza la tecnologia nanofluidica esistente per eseguire RT-qPCR ad alta produttività sul cDNA. Questo documento valuta due diversi chip nanofluidici: il primo esegue 96 campioni e 96 obiettivi, con il risultato di 9.216 reazioni in circa 1,5 giorni di panchina. Il secondo tipo di chip è costituito da sei array 12 x 12, con il risultato di 864 reazioni. Qui, il metodo Worm-to-CT è dimostrato quantificando i livelli di mRNA dei geni che codificano proteine di shock termico da singoli worm e da campioni di massa. Fornito è un ampio elenco di primer progettati per amplificare l'RNA elaborato per la maggior parte dei geni codificanti all'interno del genoma C. elegans.

Introduction

L'ottimizzazione del sequenziamento dell'RNA a singola cellula e del qPCR ha rivelato che impulsi o esplosioni trascrittivi possono portare a variazioni massicce nel numero di molecole di RNA per cella¹. Inoltre, queste tecnologie hanno scoperto una sostanziale eterogeneità cellulare precedentemente persa da misurazioni trascrittomiche di massa standard. A seconda del contesto, alcune variabilità trascrizionale a singola cellula sono causate dalla composizione cellulare mista dei tessuti. Tuttavia, anche nelle popolazioni di cellule isogeniche coltivate nello stesso ambiente c'è un'eterogeneità trascrizionale^{diffusa 2}^,³. Questa "variabilità biologica" è sempre più identificata come una proprietà onnipresente delle reti cellulari, dai batteri all'uomo. In alcuni casi, può avere conseguenze fenotipiche nello sviluppo, nella progressione del cancro, nella latenza dell'HIV e nella risposta alla chemioterapia⁴^,⁵.

Il nematode Caenorhabditis elegans è un organismo modello unico con caratteristiche ideali per lo studio delle cause e delle conseguenze della variabilità biologica tra gli individui. Questi nematodi sono un semplice organismo modello composto da 959 cellule e la loro cuticola trasparente li rende disponibili per studi di imaging in vivo⁶. C. elegans è una specie ermafrodita che si riproduce prevalentemente attraverso l'autofertilizzazione; ciò ha portato a ceppi di laboratorio isogenici. Nonostante l'isogenicità e le condizioni di coltura controllata, molti fenotipi e trascrizioni sono variabili tra gli individui, suggerendo che le differenze stocastiche o microambientali contribuiscono all'eterogeneità^{tra gli individui 7}^,⁸. Tale variabilità nell'espressione genica ha molteplici conseguenze di forma fisica, tra cui variabilità nella penetranza di mutazioni, sopravvivenza, tempi di sviluppo e fecondità^7,⁸^,⁹. A causa di queste caratteristiche, gli studi a verme singolo offrono l'opportunità senza precedenti di studiare la variabilità biologica in un intero organismo.

C'è una necessità fondamentale sul campo di sviluppare e ottimizzare le tecnologie per il rilevamento accurato delle trascrizioni a livello di worm singolo. Nuove tecnologie, come il sequenziamento dell'RNA a verme^{singolo 10,}il sequenziamento dell'RNA dai tessuti^{isolati 11}e il sequenziamento a^{singola cellula 12} sono ora disponibili per C. elegans. Tuttavia, rimane una sfida principale: quando si monitora l'interindividualità, i geni debolmente espressi spesso diminuiscono al di sotto dei livelli^{rilevabili 13}. Ciò è particolarmente rilevante per le trascrizioni rare isolate da piccole quantità di materiale di partenza, in quanto esiste una relazione consolidata e inversa tra espressione media e varianza tecnica, che spesso fa scendere trascrizioni rare al di sotto dei tagli statistici¹³. L'ottimizzazione delle tecnologie qPCR multiplexate ad alta produttività si è dimostrata utile per gli studi a cella singola dei mammiferi, in particolare quando si studia l'espressione di trascrizioni rare^14,¹⁵. Questa tecnologia può essere utilizzata anche per scopi di benchmarking e convalida di altre tecnologie single-worm.

Worm-to-CT è un metodo veloce e robusto adattato da un kit utilizzato negli studi di biologia cellulare, per la preparazione di cDNA a verme singolo. cDNA ottenuto con questo metodo accoppiato con la tecnologia qPCR nanofluidico multiplexato è stato scelto perché fornisce una maggiore produttività sperimentale, una gamma dinamica più ampia di rilevamento ed è stato convalidato per scopi a^{singola cella 14}^,¹⁵. La preparazione cDNA descritta è applicabile anche per l'uso con tecnologie PCR standard. La produttività è aumentata in due modi: in primo luogo, la preparazione del cDNA è più veloce e affidabile della tradizionale estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio guanidium, perché i vermi vengono aggiunti direttamente al tampone di lysis, saltando l'isolamento diretto dell'RNA facilmente degradabile. In secondo luogo, l'utilizzo di tecnologie nanofluidiche aumenta significativamente il numero di campioni e obiettivi che possono essere eseguiti contemporaneamente. In questa carta vengono confrontati due chip: un chip a matrice singola e un chip multi-array. Un chip a matrice singola può eseguire 96 singoli worm e 96 set di primer, con il risultato di 9.216 reazioni per esperimento. Per ottenere una velocità effettiva simile utilizzando le tecnologie qPCR standard sarebbero necessari 96 esperimenti qPCR separati, utilizzando 96 piastre di pozzo. Il chip multi-array più piccolo e flessibile è costituito da sei array 12 x 12 con conseguente reazioni 864. L'affidabilità e la sensibilità superiori del metodo sono potenziate dalla tecnologia nanofluidica e dall'introduzione di una fase di preamplificazione. Il metodo presentato in questo documento è pensato per essere utilizzato insieme a un algoritmo statistico all'avanguardia per estrarre la varianza biologica. In questo articolo viene presente il protocollo per la preparazione rapida di cDNA e qPCR ad alta velocità effettiva sia per i campioni di worm singolo che batch; l'algoritmo sarà pubblicato altrove. Per questo protocollo, l'organizzazione di ogni chip deve essere preparata prima dell'esperimento. La tabella 1 e la tabella 2 mostrano esempi di questi piani per un chip multi-array e single-array, rispettivamente. Nella figura 1 sono inoltre disponibili panoramiche del protocollo Worm-to-CT che eseguono i chip multi-array e single array nella figura 2.

Protocol

NOTA: In tutto questo protocollo Caenorhabditis elegans è indicato come "worm" o "worm". Una varietà di ceppi C. elegans può essere ordinata attraverso database online o contattando direttamente laboratori che utilizzano l'organismo modello. La parte I di questo protocollo (sezioni 1−3) descrive la preparazione del cDNA attraverso il protocollo Worm-to-CT. La parte II di questo protocollo (sezioni 4−13) descrive l'esecuzione di RT-qPCR ad alta produttività utilizzando nanofluidici, adattati da un protocollo sviluppato da Fluidigm¹⁶. Questo protocollo si applica all'uso dei due tipi di chip nanofluidici definiti in precedenza, il chip a matrice singola, che può monitorare 96 bersagli in 96 campioni (9.216 reazioni RT-qPCR totali), o il chip multi-array, che funziona come subunità di 12 campioni target x 12. Ogni chip multi-array contiene sei array indipendenti che possono essere eseguiti insieme o separatamente. Ad esempio, l'utilizzo di un intero chip multi-array può monitorare 72 bersagli x 12 campioni (o viceversa) o 36 bersagli x 24 campioni (o viceversa). Per ulteriori informazioni su uno qualsiasi dei materiali utilizzati in questo protocollo, fare riferimento alla Tabella dei Materiali.

1. Convalida del primer RT-qPCR

NOTA: I primer in tempo reale sono stati progettati in base alle proprietà consigliate originariamente emesse dalle linee guida^{MIQUE 17}. Per rendere i primer specifici per l'RNA lavorato, i prodotti sono stati progettati in modo tale che i due primer siano legati su entrambi i lati di almeno una giunzione di giunzione. I requisiti per primer adatti includevano il 20%−80% di guanina e contenuto di citosina, una temperatura di fusione di 58−60 °C, una differenza nella temperatura di fusione tra coppie primer di ≤0,5 °C e una lunghezza del prodotto di 70-120 bp. La sequenza dei primer generati è disponibile nella tabella supplementare 1. Il codice open source per gli script utilizzati per generare i primer può essere trovato in https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Le coppie primer per trascrizioni con siti di giunzione sono state progettate in modo che giacevano in due esoni che fiancheggiano un introne ma non sono state progettate per essere specifiche della variante di giunzione, utilizzando il software NCBI Primer Blast¹⁸. Per questo studio, i set di primer sono stati esplosi contro il genoma di C. elegans per testare qualsiasi complementarità off-target.

Recuperare primer dal database dei primer RT-qPCR (Tabella supplementare 1). In alternativa, progetta coppie di primer qPCR utilizzando strumenti online come NCBI Primer Blast¹⁸.
Eseguire una curva standard qPCR per monitorare la specificità e l'efficienza PCR per ogni coppia di primer utilizzando tecniche qPCR di massa standard¹⁹ e seguendo le linee guida MIQUE¹⁷^,²⁰.
NOTA: Devono essere utilizzate solo coppie di primer con R² > 0,98 ed efficienza PCR compresa tra l'85% e il 115%. La sequenza, l'efficienza della PCR e r² per i primer utilizzati nel presente studio sono dettagliate nella tabella 3.

2.Lisi del verme attraverso Worm-to-CT

Raccogli i vermi dal loro prato batterico su una piastra NGM fresca e non sesata e consenti ai vermi di muoversi intorno al piatto per 5 minuti per rimuovere la maggior parte dei batteri dal verme attraverso il suo movimento.
NOTA: Il prato batterico e le condizioni di crescita differiranno a seconda del design sperimentale. Gli esperimenti qui presentati richiedono piastre NGM da 6 cm sementi con OP50 Escherichia coli con vermi di interesse cresciuti fino allo stadio L4.9 in un incubatore a 20 °C.
In una cappa priva di RNasi, preparare un master mix composto da 12,5 μL di tampone RT 2x, 1,25 μL di tampone enzimatico RT 20x e 0,25 μL di acqua priva di nucleasi per campione. Aggiungere 14 μL di miscela master a 11 μL di ciascun campione dal passaggio 2.8.
Posizionare il coperchio di una striscia PCR capovolta sulla piattaforma dell'ambito di sezionazione e aggiungere 10 μL della miscela di lisi ai tappi del tubo PCR a cupola sotto un microscopio composto.
NOTA: Con solo uno o due campioni, è meglio utilizzare una striscia PCR contenente almeno quattro tubi, in quanto ciò riduce il rischio che i tappi si aprano nelle successive fasi di congelamento-scongelamento. In alternativa, gli elastici possono essere utilizzati per tenere i tappi in posizione. In tal caso assicurarsi che i tappi siano chiusi correttamente ogni volta che i tubi vengono trasferiti.
Raccogliere i vermi dalla piastra in ogni fessura del coperchio contenente la miscela di lisi "raccogliendoli" (cioè catturando i vermi sottostanti con il piccone) per evitare contaminazioni batteriche. Chiudere i tubi e farli girare verso il basso per 5 s utilizzando un microcentrifugo da tavolo(Table of Materials)prima di metterli in un pallone Dewar riempito con azoto liquido.
NOTA: Tra 15 e 30 vermi devono essere utilizzati per esperimenti di massa e 1 worm per misurazioni a verme singolo.
ATTENZIONE: Quando si maneggia azoto liquido indossare Cryo-Gloves e occhiali protettivi e aderire alle norme standard sull'abbigliamento, perché il contatto con la pelle o gli occhi può causare gravi lesioni da congelamento.
Congelare-scongelare i tubi PCR 10x trasferendoli tra azoto liquido e un bagno d'acqua di ~ 40 °C. Lasciare i tubi nell'azoto liquido per un minimo di 5 s per assicurarsi che i campioni siano completamente congelati. Lasciare i tubi nel bagno d'acqua fino a quando i campioni non si scongelano. Non lasciare per un periodo più lungo, in quanto ciò porta alla degradazione dell'RNA.
NOTA: I tubi possono essere lasciati in azoto liquido per un lungo periodo di tempo, poiché i campioni vengono congelati a circa -200 °C, riducendo la degradazione dell'RNA. Tuttavia, questo non dovrebbe essere un punto di arresto del protocollo, perché l'azoto liquido evapora rapidamente.
Mescolare i campioni su un miscelatore termico (Table of Materials) impostato a 4 °C per 20−30 min ruotando a ~1.800 giri/min.
Durante la miscela dei campioni, scongelare la soluzione di arresto sul ghiaccio.
Ruotare i campioni verso il basso utilizzando un microcentrifugo da tavolo(Tabella dei materiali)e aggiungere 1 μL di soluzione di arresto a ciascun tubo.
NOTA: I campioni possono essere lasciati a -80 °C per un massimo di 1 settimana prima di trascrivere inversamente l'RNA (sezione 3).

3. Trascrizione inversa

NOTA: Per la trascrizione inversa di singoli worm, i risultati mostrati qui sono stati generati utilizzando i reagenti forniti con i chip nanofluidici (opzione 2 nella figura 1). I reagenti evidenziati nell'opzione 2 della figura 1 sono stati utilizzati anche per la trascrizione inversa di campioni raggruppati. Entrambi i metodi funzionano in modo intercambiabile per i diversi tipi di esempio.

Trascrizione inversa di singoli worm
1. In una cappa priva di RNasi, aggiungere 1,25 μL di miscela di trascrizione inversa(Tabella dei materiali)a un tubo PCR fresco.
  NOTA: Una piastra PCR da 96 porci e una pipetta automatica possono essere utilizzate se ci sono molti campioni. Il protocollo del produttore afferma che 1 μL può essere utilizzato per campione.
2. Prendere 5 μL della soluzione di lisi e interrompere la miscela di soluzioni dal passaggio 2.8 e aggiungerlo al tubo PCR fresco contenente la miscela di trascrizione inversa.
  NOTA: Il protocollo del produttore stabilisce che 1 μL di RNA (2,5 pg/μL-250 ng/μL) può essere utilizzato per reazione. Un controllo RT negativo per piastra può essere aggiunto sostituendo la miscela di trascrizione inversa con 5 μL di campione lysed e 1,25 μL di acqua priva di RNAse.
3. Eseguire i campioni utilizzando il seguente programma di trascrizione inversa su un termociclo: 25 °C per 5 minuti, 42 °C per 30 minuti, 85 °C per 5 minuti e 4 °C per ∞.
  NOTA: Il cDNA prodotto può essere conservato a -20 °C prima di procedere all'amplificazione e alla raccolta dei dati utilizzando qPCR ad alta produttività.
Trascrizione inversa per campioni di massa (15−30 worm)
1. In una cappa priva di RNasi, preparare un master mix composto da 12,5 μL di tampone RT 2x, 1,25 μL di tampone enzimatico RT 20x e 0,25 μL di acqua priva di nucleasi per campione. Aggiungere 14 μL di master mix a 11 μL di soluzione dilisi e interrompere la miscela di soluzioni dal passaggio 2.8.
  NOTA: Quando si ha a che fare con un gran numero di campioni questo può essere eseguito in 96 piastre di pozzo.
2. Eseguire i campioni attraverso un termociclo utilizzando il seguente programma di trascrizione inversa: 37 °C per 60 min, 95 °C per 5 minuti e 4 °C per ∞.
3. Diluire il cDNA prodotto 1:4 in acqua priva di nucleasi.
  NOTA: Generalmente, i prodotti arrivano ad un volume finale di 25 μL, nel qual caso devono essere aggiunti 75 μL. Tuttavia, a causa della condensazione il volume finale può variare. Pertanto, regolare di conseguenza per creare un rapporto 1:4 nella soluzione finale. Questo passaggio di diluizione non si applica se si esegue qPCR su singoli worm. Il cDNA prodotto può essere conservato a -20 °C prima di procedere all'amplificazione e alla raccolta dei dati utilizzando qPCR ad alta produttività.

4. Preparazione del mix di primer multiplex

Preparare un calcio di primer forward/reverse (F/R) per ogni coppia di primer a 50 μM di concentrazione finale. Mescolare lo stesso volume di primer avanti e indietro a 100 μM ciascuno.
Combinare 1 μL di 50 μM F/R per ogni coppia di primer da testare. Aggiungere il tampone di sospensione del DNA fino a un volume totale di 100 μL.
NOTA: Le concentrazioni di primer di serie qui differiscono da quelle descritte nel protocollo^{16 del produttore,} ma mantengono la stessa concentrazione finale di 500 nM.

5. Preamplificazione specifica dell'obiettivo

Preparare una miscela principale contenente 1 μL di mastermix di preamplificazione (tabella deimateriali),0,5 μL della miscela di primer in pool (fase 4.2) e 2,25 μL di acqua priva di nucleasi per reazione con un volume complessivo di surplus del 10%.
In una piastra di pozzo 96, aliquota 3,75 μL della miscela master in tanti pozzi quanti sono necessari per il numero di campioni da eseguire.
Aggiungere 1,25 μL delle soluzioni di interesse cDNA generate al passaggio 3.1.3 o 3.2.3 ad ogni pozzo.
Coprire la piastra con 96 nastro di tenuta del pozzo, brevemente vortice e centrifuga con uno spinner a piastre da tavolo. Trasferire su un termociclo ed eseguire il seguente programma: 95 °C per 2 min, 15 cicli di denaturazione a 95 °C per 15 s, ricottura / estensione a 60 °C per 4 min e 4 °C per ∞.
NOTA: Il produttore consiglia da 10−20 cicli per la reazione di preamplificazione¹⁶. Questo protocollo raccomanda 10 o 15 cicli a seconda dei livelli di espressione dei geni bersaglio.

6. Trattamento con esonucleasi I

NOTA: Questo per rimuovere i primer non integrati dalla preamplificazione.

Preparare una miscela di esonucleasi I contenente 0,2 μL di tampone di reazione per esonucleasi I(tabelladei materiali), 0,4 μL di esonucleasi I a 20 U/μL (tabella deimateriali)e 1,4 μL di acqua priva di nucleasi per campione. Tenere tutti i reagenti sul ghiaccio, specialmente l'esonero I.
Rimuovere la piastra del pozzo 96 (fase 5.4) dal termociclo, centrifugare con lo spinner della piastra da tavolo e rimuovere con cura la guarnizione. Aggiungere 2 μL dell'esonucleasi che mescolo ad ogni reazione di preamplificazione. Reseal, centrifuga e riposizionare la piastra del pozzo 96 nel termociclo utilizzando il seguente programma: 37 °C per 30 min, 80 °C per 15 minuti e 4 °C per ∞.
Prelevare i campioni dal termociclo e diluirli 1:5 aggiungendo 18 μL di tampone Tris EDTA 1x(Tabella dei materiali).
NOTA: È possibile mantenere i campioni di cDNA a -20 °C per un uso successivo. Il protocollo del produttore suggerisce potenziali diluizioni di 5x, 10x o 20x in questa^{fase 16}, a seconda del livello di espressione degli obiettivi di interesse.

7. Preparazione delle miscele di saggi

NOTA: Le miscele di saggi possono essere preparate in 384 piastre di pozzo, poiché i pozzi hanno la stessa spaziatura dei trucioli nanofluidici, rendendo più facile il caricamento.

Preparazione di mix di test per un chip multi-array
1. Preparare una miscela principale composta da 2 μL di reagente di carico del saggio 2x (tabella deimateriali)e 1,6 μL di tampone di sospensione del DNA(tabella dei materiali)per ciascun pozzo secondo il piano preparato. Aliquota 3,6 μL di questa miscela master per pozzo in una piastra di pozzo 384.
2. Aggiungere 0,4 μL del materiale primer F/R da 50 μM preparato nella fase 4.1 ai pozzi appropriati secondo il piano preparato.
  NOTA: Fornisce un totale di 4 μL di miscela di saggi per pozzo, con un'eccedenza di 1 μL.
Preparazione di mix di test per un chip a matrice singola
1. Preparare una miscela master composta da 3 μL di reagente di carico del saggio 2x e 2,4 μL di tampone di sospensione del DNA per ogni pozzo secondo il piano preparato. Aliquota 5,4 μL di questa miscela master per pozzo in una piastra 384 ben marcata.
2. Aggiungere 0,6 μL del materiale primer F/R da 50 μM ai pozzi appropriati secondo il piano preparato.
  NOTA: Questo fornisce un totale di 6 μL di miscela di saggi per pozzo, con un'eccedenza di 1 μL.

8. Preparazione delle miscele di campioni

NOTA: Le miscele di campioni possono essere preparate fino a 1 giorno prima e conservate a 4 °C.

Preparazione di campioni per un chip multi-array
1. Preparare una miscela master campione composta da 2 μL di supermismix a sonda fluorescente 2x con ROX basso(Tabella dei materiali)e 0,2 μL di reagente campione(Tabella dei materiali)per campione. Distribuire 2,2 μL di questa miscela nella piastra del pozzo marcata 384.
  NOTA: Il produttore consiglia di non vorticere il reagente del^{campione 16}.
2. Pipetta 1,8 μL di ogni esonucleasi preamplificata ho trattato il campione dal passaggio 3.2.3 nei pozzi appropriati secondo il piano preparato.
  NOTA: Questo dà un totale di 4 μL, con un'eccedenza di 1 μL.
Preparazione di campioni per un chip a matrice singola
1. Preparare una miscela master campione composta da 3 μL di supermismix a sonda fluorescente 2x con ROX basso(Tabella dei materiali)e 0,3 μL di reagente di carico del campione di colorante legante il DNA 20x (Tabella deimateriali)per campione. Distribuire 3,3 μL di questa miscela nella piastra del pozzo marcata 384.
2. Pipetta 2,7 μL di ogni preamplificato ed esonucleasi ho trattato il campione dal passaggio 6.3 nei pozzi appropriati secondo il piano preparato.
  NOTA: Questo dà un totale di 6 μL, con un'eccedenza di 1 μL. Se ci sono pozzi da eseguire senza un campione, questi devono essere caricati con miscela master campione e 2,7 μL di acqua al posto del cDNA. Questo è consigliato per entrambi i tipi di chip. La macchina ha bisogno di ROX basso in ogni ingresso per rilevare la griglia del chip.

9. Priming il chip nanofluidico

NOTA: un chip multi-array deve essere privilegiato solo alla prima esecuzione. Se ci sono esecuzioni successive dello stesso chip, questa fase può essere saltata. Questi passaggi sono gli stessi per entrambi i tipi di chip.

Lentamente e con attenzione, iniettare tutti i 150 μL del fluido della linea di controllo dalle siringhe incluse negli accumulatori del chip. Assicurarsi che nessun liquido di controllo tocchi il truciolo tenendo il truciolo con un angolo di 45° e tenendo lontana la punta della siringa per evitare fuoriuscite.
Rimuovere la pellicola protettiva blu dal fondo del chip.
Posizionare il chip nella macchina di adescamento PCR nanofluidica (Table of Materials), con il codice a barre rivolto verso l'esterno. Eseguire lo script 'Prime (153x)', che richiede ~15-20 min.
NOTA: Accendi il termociclo nanofluidica (Tavolo dei Materiali) in questa fase, perché la fotocamera impiega circa 10 minuti per raffreddarsi fino a meno di 0 °C.

10. Caricamento del chip nanofluidico

Rimuovere le spine barriera in sequenza man mano che avviene il caricamento. Ciò riduce la possibilità di scaricare pozzi.
Trasferire 3 μL per un chip multi-array o 5 μL per un chip a matrice singola di ogni mix di test del primer e miscele di campioni alle corrispondenti insenature del chip nanofluidico secondo il piano preparato. Assicurati di non introdurre bolle, che possono causare il volume totale trasferito più piccolo del desiderato.
NOTA: Se ci sono pozzi che verranno eseguiti senza un primer è importante che questi siano caricati con mix master, sostituendo il volume del primer con acqua. Questo vale per entrambi i tipi di chip. In questa fase, può essere più facile posizionare il chip su una superficie scura, il che consentirà di vedere i pozzi più facilmente.

11. Esecuzione del chip nanofluidico

NOTA: la prima volta che si esegue un chip multi-array, impostare il file di rilevamento selezionando Strumenti | Flex Six Usage Tracking, fare clic su Nuovo, immettere un nome di file e selezionare un percorso prima di fare clic su Fatto.

Aprire il software di raccolta dati. Fare clic su Avvia nuova esecuzione. Posizionare il chip caricato nel termociclore nanofluidica con il codice a barre rivolto verso l'esterno.
Se applicabile, scegliere l'impostazione del progetto, quindi fare clic su | Caricare. Se si carica un chip multi-array, selezionare le partizioni (matrici) da eseguire.
Selezionare l'applicazione Reference Probes, quindi modificare il tipo di applicazione in Gene Expressione modificare il riferimento passivo in ROX. Selezionare il saggio sonda singola , modificareil tipo di probe in Eva Green efare clic su Avanti.
Selezionare il protocollo di ciclo termico GE FLEX six Fast PCR+Melt v1 per eseguire un chip multi array oppure il protocollo GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 per eseguire un chip a matrice singola.
Verificare che l'opzione Esposizione automatica sia selezionata e fare clic su Avvia esecuzione.

12. Esecuzione post chip

NOTA: questa sezione è necessaria solo per i chip multi-array quando non si utilizza l'intero chip.

Eserti il chip dal termociclometro nanofluidica e caricalo nella macchina di adescamento PCR nanofluidica ed esegui lo script Post Run (153x), che dura 5 minuti.
Etichettare le spine utilizzate come riferimento personale.
NOTA: Il chip può ora essere conservato a temperatura ambiente e gli array rimanenti sul chip possono essere eseguiti entro 2 mesi.

13. Pulizia e analisi dei dati

Aprire i dati nel software 'Real-Time PCR Analysis' (Table of Materials). Controllare la temperatura di picco di fusione per ogni coppia di primer testata. Elimina i risultati che mostrano più di un picco di temperatura di fusione, per una data coppia di primer.
NOTA: Più picchi appaiono solo occasionalmente, presumibilmente quando le coppie di primer formano dimeri, o dalle interazioni dei primer bersaglio con altri primer nel mix di primer raggruppato.
Esportare i dati come file di foglio di calcolo 'heatmap' ed eliminare campioni o primer non riusciti.
Analizzare i dati utilizzando il metodo Delta-Ct standard²¹. Per la valutazione statistica eseguire ANOVA uni-way sui livelli di espressione relativi.

Representative Results

Convalida di Worm-to-CT come metodo di preparazione cDNA

Per verificare se il protocollo Worm-to-CT è un metodo di estrazione cDNA valido, è stato confrontato con i metodi standard di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio. I risultati sono riportati nella figura 3, dove il cDNA è stato preparato a partire da una media di ~1.000 vermi utilizzando tecniche standard di estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio standard²² e da 30 vermi utilizzando il metodo Worm-to-CT. I campioni sono rimasti scioccati dal calore contemporaneamente (30 minuti a 34 °C). A livello globale, i livelli di espressione di hsp-70 mRNA per 100 ng di RNA totale erano paragonabili usando entrambi i metodi. Tuttavia, nel caso dell'espressione hsp-70 più alta (cioè in N2 a seguito di shock termico) i livelli di espressione erano più alti con il metodo Worm-to-CT, indicando una migliore sensibilità.

Per determinare se è possibile riprodurre una diminuzione prevista dell'espressione hsp in hsf-1(sy441)²³, una mutazione nel principale regolatore trascrizionale degli accompagnatori^{molecolari 23}^,²⁴, è stata confrontata l'induzione di chaperone trascrizionale a seguito di un breve shock termico. Con entrambi i metodi è stata rilevata una diminuzione dell'induzione di hsp-70 negli animali hsf-1(sy441). Questo era previsto, perché gli animali mutanti hsf-1(sy441) mostrano una ridotta capacità di indurre chaperoni a causa di un troncamento nel dominio di trasattivazione di HSF-1. Per l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio il guanidio hsp70 è diminuito dell'82,7% rispetto ai controlli e del 92,3% per il verme-TC rispetto agli animali di tipo selvatico(figura 3). I risultati sono stati comparabili tra i due metodi e comparabili alle precedenti relazioni^23. Questi risultati indicano che il metodo Worm-to-CT è una valida alternativa alle tecniche standard di sintesi cDNA.

Convalida della piattaforma PCR nanofluidica utilizzata per amplificare gli obiettivi dell'mRNA

Per testare la coerenza dei risultati usando qPCR nanofluidico per l'amplificazione della trascrizione, i risultati PCR ottenuti dal metodo bulk Worm-to-CT sono stati confrontati sia su un sistema qPCR standard (Table of Materials) che su un sistema qPCR nanofluidico utilizzando un chip multi-array. Il cambiamento di piegatura nell'espressione di tre diversi geni, sma-3 (Figura 4A), sma-10 (Figura 4B) e dnj-26, è stato monitorato (Figura 4C) negli animali che trasportano un allele nullo in dbl-1 (dbl-1(nk3)^{) 25} rispetto alle controparti di tipo selvatico. Dbl-1 codifica l'unico ligando della via di segnalazione della proteina morfogenetica ossea (BMP). sma-3 e sma-10 sono geni che codificano ortologhi SMAD, componenti chiave della cascata di segnalazione BMP. Dnj-26 codifica un chaperone molecolare, un bersaglio della segnalazione BMP. Questi risultati mostrano poca o nessuna differenza nella variazione di piegatura confrontando i risultati dei due metodi, risultando in valori P non significativi rispettivamente a 0,3113, 0,2635 e 0,3481 per sma-3, sma-10 e dnj-26. Complessivamente, questi risultati mostrano che il metodo Worm-to-CT applicato ai campioni di massa è un modo efficiente e rapido per estrarre l'RNA da pochi worm e fornisce dati affidabili se accoppiati con sistemi PCR standard o piattaforme qPCR basate su nanofluidici ad alta produttività.

Confronto tra i livelli di espressione ottenuti da campioni di massa con medie ottenute da singoli worm

I livelli di espressione relativi sono stati calcolati utilizzando cDNA ottenuto da campioni di massa (25 worm) o da una media di 36 campioni di worm singoli (Figura 5). Entrambi i cDNA sono stati ottenuti utilizzando il metodo Worm-to-CT e amplificati utilizzando la tecnologia PCR nanofluidica. Come osservato nella figura 5A-C, per tutti gli accompagnatori testati (ad esempio, hsp16.1, F44E5.4, hsp-70), i metodi hanno rilevato livelli di espressione comparabili. Questi risultati indicano che i parametri ottenuti da singoli worm sono affidabili.

Applicazione di Worm-to-CT accoppiata alla tecnologia nanofluidica per stimare i parametri di espressione genica a verme singolo

Poiché il chip a matrice singola consente il monitoraggio di un massimo di 96 trascrizioni di destinazione su 96 singoli campioni, è quindi adatto per monitorare la variabilità individuale nell'espressione di trascrizione tra singoli worm. La figura 6A presenta un risultato rappresentativo che mostra l'espressione media di più trascrizioni hsp da singoli worm a seguito di un breve shock termico. Come osservato nella figura, la variabilità nell'espressione delle trascrizioni differiva notevolmente tra i diversi geni (Figura 6A). Per ottenere ulteriori informazioni, il coefficiente di variazione (CV) è stato calcolato dividendo la deviazione standard per la media dei livelli di^{espressione 26} (Figura 6B). Sono stati monitorati tre geni i cui valori CV sono stati precedentemente stimati con metodi alternativi (dati inediti). Due trascrizioni stabili (ife-1 e Y45F10D.4) e una variabile (nlp-29²⁷) hanno mostrato la loro variabilità prevista. Il grafico descrive inoltre chiaramente la ben nota relazione inversa tra i valori di variabilità e i livelli di^{espressione 26} (Figura 6B).

Le repliche tecniche sono di fondamentale importanza per garantire la riproducibilità quando si utilizzano campioni di massa. Tuttavia, questo non è necessariamente il caso degli esperimenti a cella^{singola 14}^,¹⁵^,²⁸. Per determinare se l'uso di repliche tecniche è necessario per la stima dei parametri quando si utilizzano campioni a worm singolo, sono stati raccolti 28 singoli worm, a seguito di un breve shock termico, e lavorati utilizzando triplicati tecnici. Sono stati confrontati i valori CV calcolati dai dati a worm singolo ottenuti in triplice copia (punti blu nella figura 7, CV tecnico) rispetto a quelli di ogni trascrizione ottenuta da singoli worm (punti rossi nella figura 7, variabilità biologica). Per ogni trascrizione testata, i CV tecnici erano inferiori ai CV biologici, il che indica che i triplicati tecnici non erano necessari per la stima dei parametri. Il fatto che non siano necessarie repliche tecniche aumenta la produttività dell'esperimento senza compromettere la qualità.

Figura 1: Panoramica del protocollo Worm-to-CT.
In questa figura viene illustrata una breve panoramica dei diversi passaggi necessari per eseguire worm tramite il protocollo Worm-to-CT. Per il passaggio di trascrizione inversa vengono visualizzati due metodi facoltativi; questi sono metodi intercambiabili per entrambi i tipi di chip. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Panoramica della preparazione e dell'esecuzione del qPCR nanofluidico.
Questa figura descrive i preparativi per l'esecuzione del sistema qPCR nanofluidico usando un chip multi-array e un chip a matrice singola. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Protocollo worm-to-CT su campioni di massa ha fornito risultati affidabili.
Confronto tra il protocollo Worm-to-CT e la normale estrazione tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio²² su campioni sfusi. Coerentemente con i risultati precedenti, nei mutanti hsf-1(sy441)²³, i livelli di trascrizioni hsp in risposta allo shock termico sono diminuiti. Gli istogrammi di cui sopra raffigurano l'induzione di hsp-70 in assenza di (-), o a seguito (+) di un breve shock termico di 30 min a 34 °C. Il cDNA è stato ottenuto utilizzando l'estrazione del tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio applicata a 1.000 vermi (a sinistra) o utilizzando il metodo Worm-to-CT applicato a 30 vermi in pool (a destra). Sono stati confrontati i livelli di espressione di hsp-70 per 100 ng di RNA totale ottenuti con ciascun metodo. Come previsto, nell'hsf-1(sy441) l'induzione trascrizionale di hsp-70 in risposta allo shock termico è diminuita significativamente dell'82,7% utilizzando il tiocianato-fenolo-cloroformio del guanidio e del 92,3% utilizzando il metodo Worm-to-CT. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. Ogni punto rappresenta una replica biologica. I dati sono stati log trasformati per l'analisi statistica, in quanto non soddisfacivano le convenzioni richieste per l'analisi parametrica. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando un ANOVA RM-Un-way utilizzando il test di confronto multiplo di Sidak. Tipo jolly = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Le barre indicano l'errore standard della media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: I modelli di espressione erano coerenti tra i sistemi qPCR standard e qPCR nanofluidici.
(A) Il livello di espressione di sma-3 (A), sma-10 (B) o dnj-26 (C) mRNA è stato determinato attraverso qPCR regolare e qPCR nanofluidico (chip multi-array) da tre repliche biologiche di cDNA generate attraverso Worm-to CT dal ceppo di tipo selvatico (N2) e dal ceppo knockout dbl-1(nk3) ²⁵. I livelli relativi di espressione dell'mRNA sono stati determinati per ogni ceppo utilizzando il metodo Delta-Ct²¹. Il cambiamento di piegatura è stato quindi determinato dividendo i livelli di espressione ottenuti nei vermi dbl-1(nk3) per i corrispondenti livelli di mRNA nel ceppo N2. Come mostrato nel pannello A, i modelli erano coerenti per entrambi i metodi in ogni singola replica biologica. (B) e (C) sono gli stessi di (A) rispettivamente per i livelli di sma-10 e dnj-26 mRNA. I livelli di mRNA target sono stati normalizzati rispetto ai geni delle pulizie cdc-42 e pmp-3. L'analisi statistica è stata calcolata per ogni gene utilizzando un test t accoppiato confrontando i risultati delle tre repliche biologiche prodotte attraverso qPCR standard e quelle generate attraverso qPCR nanofluidico. I valori P di questi confronti erano rispettivamente 0,3113, 0,2635 e 0,3481 per sma-3, sma-10 e dnj-26. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: L'utilizzo del metodo Worm-to-CT su campioni di massa o su singoli worm ha fornito livelli di espressione simili quando normalizzato per worm.
I livelli di espressione di (A) hsp-16.1/11, (B) F44E5.4 e (C) hsp-70 (C12C8.1) sono stati analizzati in giovani animali adulti in assenza di shock termico eseguendo Worm-to-CT su una massa di 25 animali o su 36 singoli individui. Quando i dati sono stati normalizzati per worm, non c'era alcuna differenza significativa tra i livelli ottenuti per worm per ogni trascrizione utilizzando entrambi i metodi. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. Le barre rappresentano l'errore standard della media. Statistics = test t accoppiato. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: RT-qPCR ad alta produttività su singoli worm utilizzando il metodo Worm-to-CT potrebbe monitorare la variabilità inter-individuale nell'espressione genica.
(A) I livelli di espressione media per 53 trascrizioni ottenute in caso di esposizione a un breve shock termico (30 min a 34 °C). I boxplot rappresentano la distribuzione dell'espressione media dell'mRNA dai singoli worm (sono state utilizzate in media tre repliche tecniche per singolo worm). I punti rappresentano i livelli di espressione in 28 singoli worm. I livelli di mRNA dei geni bersaglio sono stati normalizzati rispetto alla media dei tre geni delle pulizie cdc-42, pmp-3e ire-1. (B) Il coefficiente di^{variazione 26} (CV) in funzione dell'espressione media dell'mRNA per 53 trascrizioni a seguito dell'esposizione a uno shock termico breve è stato calcolato da 28 singoli animali (dati grezzi mostrati nel pannello B). L'insieme di trascrizioni include la variabile nlp-29 trascrizione²⁷ e due trascrizioni stabili (ife-1 e Y45F10D.4; dati non pubblicati). Il CV è il rapporto tra la deviazione standard e la media. Questo CV è stato utilizzato per stimare la variabilità inter-individuale nell'espressione di trascrizione tra i singoli worm. Come previsto, la variabilità inter-individuale è stata ridimensionata con livelli di espressione media ridotti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Le repliche tecniche non erano necessarie quando si analizzava la variabilità inter-individuale nell'espressione genica usando un chip nanofluidico.
I dati presentati in questo grafico sono stati ottenuti in 28 singoli vermi a seguito di un breve shock termico (30 min a 34 °C). Ogni punto rosso rappresenta il coefficiente di variazione (CV) dei livelli di espressione di trascrizione media per una trascrizione saggiata tra 28 singoli vermi (bio CV). Ogni punto blu rappresenta il CV dei livelli di espressione tra tre repliche tecniche ottenute da un singolo worm, per trascrizione saggiata (CV tecnico). Questo grafico mostra che la variabilità tecnica (tra repliche tecniche) era molto inferiore alla variabilità biologica (tra singoli vermi), suggerendo che non è necessario eseguire repliche tecniche su un array di espressioni geniche nanofluidiche quando si saggia l'espressione genica in singoli worm, in modo simile agli studi a^{singola cellula 14}^,¹⁵^,²⁸. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Pianificare il layout per un chip multi-array. La tabella precedente mostra un layout semplice che può essere utilizzato durante la pianificazione di un'esecuzione di chip multi-array. A sinistra ci sono gli spazi che dovrebbero essere riempiti con i bersagli di interesse del primer e a destra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con i campioni di interesse. Ogni saggio e matrice di campioni è accoppiato per numero attraverso il chip. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Pianificare il layout per un chip a matrice singola. La tabella precedente mostra un layout semplice che può essere utilizzato durante la pianificazione di un'esecuzione di chip a matrice singola. A sinistra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con bersagli di interesse primer e a destra ci sono spazi che dovrebbero essere riempiti con i campioni di interesse. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Elenco dei primer RT-qPCR utilizzati nel presente studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella supplementare 1: Primer della base di dati dei primer RT-qPCR. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussion

In questo articolo, il protocollo Worm-to-CT si dimostra essere un metodo rapido ed efficiente per estrarre l'RNA da singoli worm o da un piccolo pool di worm. L'elevata produttività offerta dal sistema nanofluidico lo rende ideale per la quantificazione delle misurazioni della variabilità inter-individuale. Inoltre, l'elevata sensibilità di questo metodo consente il rilevamento di geni espressi a bassi livelli che cadono al di sotto del rilevamento quando si utilizzano tecnologie RNA-seq a verme^{singolo 9}.

Quando si considera la scelta del metodo per preparare il cDNA da singoli worm. Ly et al.^{29 ottimizzato} un protocollo che si basa sulla proteinasi K per la digestione delle cuticola. La cuticola è un grosso ostacolo per l'isolamento delle molecole dai vermi e la proteinasi K fornisce un metodo efficace per romperla. Tuttavia, la proteinasi K deve essere inattivata termicamente per poter usare enzimi per la trascrizione inversa. Mentre Ly et al. Invece di usare la proteinasi K, sono stati usati ripetuti cicli di congelamento-disgelo per rompere la cuticola. Il congelamento-disgelo è un metodo efficace per rompere la cuticola perché più RNA può essere isolato per verme. riferiscono che l'RNA totale estratto per verme è di 35 ng utilizzando proteinasi K, mentre questo protocollo ottiene 51,75 ng ± 6,74 SEM di RNA totale per verme. Evitare l'esposizione al calore abbinata a fasi di preamplificazione apparentemente allarga la gamma dinamica di rilevamento di Worm-to-CT rispetto ai protocolli standard. Riportano valori Ct assoluti di 21,1 ± 0,15 per hsp-16,2 e 22,8 ± 0,17 per hsp-70 dopo shock termico. Utilizzando le stesse condizioni di shock termico (1 h a 30 °C), questo protocollo ottiene valori Ct assoluti di 17,93 ± 0,57 per hsp-16.2 e 21.13 ±0.33 per hsp-70. Ciò indica che il metodo di lisi congelamento-disgelo fornisce rese più elevate di RNA ed è più appropriato per trascrizioni a bassa espressa.

I sistemi nanofluidici sono ideali quando si studia un dato insieme di trascrizioni bersaglio e l'uso di un numero di campioni più piccolo (chip multi-array) o più grande (chip a matrice singola) che consente l'adattamento alla scala dell'esperimento. Per ottenere un'immagine imparziale di tutte le trascrizioni espresse in un singolo worm, la scelta ovvia è usare il sequenziamento dell'RNA. Se, tuttavia, il focus dell'esperimento è un insieme più piccolo ma ancora relativamente grande di geni bersaglio, è più conveniente utilizzare questo protocollo, a condizione che il ricercatore abbia accesso a una macchina PCR nanofluidica. Il costo dei reagenti del sistema nanofluidico e di un chip a matrice singola è stimato in circa £ 13 per worm, mentre i costi dei reagenti per il sequenziamento a singolo verme sarebbero di circa £ 60 per worm, senza includere i costi di sequenziamento.

Quando si considera quale piattaforma PCR utilizzare, il metodo Worm-to-CT accoppiato al qPCR nanofluidico offre vantaggi per quanto riguarda il tempo e la velocità effettiva. È possibile ottenere 9.216 risultati RT-qPCR in circa 2 giorni di lavoro, mentre l'amplificazione dello stesso numero di bersagli utilizzando una piattaforma qPCR standard richiederebbe circa 5 settimane lavorative utilizzando 96 test di piastra di pozzo, eseguendo quattro piastre al giorno. Tuttavia, se il numero di destinazioni da testare è più piccolo, è più conveniente utilizzare Worm-to-CT accoppiato con una macchina qPCR standard. I chip a matrice singola non possono essere rieseguiti, quindi l'esecuzione di pozzi vuoti riduce l'efficienza in termini di costi.

Una limitazione del metodo è la formazione potenziale di dimeri primer-primer durante la fase di multiplexing, ma ciò si verifica in meno dell'1% dei casi. Sebbene il protocollo Worm-to-CT sia efficiente e fornisca risultati affidabili se applicato a singoli worm, c'è un tasso di guasto di circa il 5%, che probabilmente corrisponde ai casi in cui il verme rimane intrappolato nel tappo o nella parte superiore del tubo durante la fase di raccolta.

Insieme, questo metodo versatile e affidabile offre una maggiore produttività e sensibilità rispetto alle tecniche più standard. Questo metodo può essere molto utile per la convalida di schermi ad alta velocità effettiva ed è una scelta eccellente per monitorare o convalidare i livelli di espressione genica a worm singolo. Questo metodo può essere applicato ad altre tecniche impegnative, come la quantificazione dell'espressione genica da tessuti isolati. Ad esempio, l'isolamento di tessuti completi, come l'intestino, le gonadi o le cellule isolate dalle FAC, fornisce materiale sufficiente per eseguire esperimenti di sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, quantità limitate di materiale spesso portano a letture duplicate, che impediscono la quantificazione di trascrizioni rare. In questo scenario, l'utilizzo della tecnologia basata sulla nanofluidica dovrebbe fornire una maggiore sensibilità agli esperimenti e aumentare l'efficienza in termini di costi se i ricercatori devono monitorare solo un sottoinsieme di tutte le trascrizioni in quei tessuti o cellule.

Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Ringraziamo Sharlene Murdoch e le strutture del Babraham Institute per il loro sostegno. JLP è stato supportato dal Wellcome Trust (093970/Z/10/Z) e OC è supportato da ERC 638426 e BBSRC [BBS/E/B000C0426].

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent	Fluidigm	100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M-96.96	Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software	Fluidigm	101-6793	Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system	Fluidigm	100-2451 K1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs	Fluidigm	89000021	Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer	TEKnova	T0021
domed PCR caps
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293L
Exonuclease I reaction buffer	New England BioLabs	B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent	Fluidigm	100-7673	referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC	Fluidigm	100-6308	referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide	Fluidigm	68000088	This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX	Fluidigm	68000112 I1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR	Fluidigm	100-2297	Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge	StarLab	C1301B-230V	Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner	Labnet	K4050725	mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit	invitrogen	4402955	This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR^®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix	Fluidigm	100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions	Fluidigm	100-6299	One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX	Bio-Rad Laboratories	172-5211	referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA	TEKnova	T0224	Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000031	Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Raj, A., Peskin, C. S., Tranchina, D., Vargas, D. Y., Tyagi, S. Stochastic mRNA Synthesis in Mammalian Cells. PLoS Biology. 4 (10), 309 (2006).
Semrau, S., van Oudenaarden, A. Study lineage decision-making in vitro: emerging concepts and novel tools. Annual Review of Cell Developmental Biology. 31, 317-345 (2015).
Kelsey, G., Stegle, O., Reik, W. Single-cell epigenomics: Recording the past and predicting the future. Science. 358 (6359), 69-75 (2017).
Eling, N., Morgan, M. D., Marioni, J. C. Challenges in measuring and understanding biological noise. Nature Review Genetics. 20 (9), 536-548 (2019).
Kaufmann, B. B., van Oudenaarden, A. Stochastic gene expression: from single molecules to the proteome. Current Opinion in Genetics & Development. 17 (2), 107-112 (2007).
Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , Edited by The C. elegans Research Community (2015).
Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
Raj, A., Rifkin, A. A., Andersen, E., van Oudenaarden, A. Variability in gene expression underlies incomplete penetrance. Nature. 463 (7283), 913-918 (2010).
Perez, M. F., Francesconi, M., Hidalgo-Carcedo, C., Lehner, B. Maternal age generates phenotypic variation in Caenorhabditis elegans. Nature. 552 (7683), 106-109 (2017).
Serra, L., et al. Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq. Bio-protocol. 8 (4), 2729 (2018).
Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Biology. 14 (8), 1007559 (2018).
Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
Stegle, O., Teichmann, S. A., Marioni, J. C. Computational and analytical challenges in single-cell transcriptomics. Nature Review Genetics. 16 (3), 133-145 (2015).
Ståhlberg, A., Kubista, M. The workflow of single-cell expression profiling using quantitative real-time PCR. Expert Review of Molecular Diagnostics. 14 (3), 323-331 (2014).
Livak, K. J., et al. Methods for qPCR gene expression profiling applied to 1440 lymphoblastoid single cells. Methods. 59 (1), 71-79 (2013).
Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide. , https://www.fluidigm.com/binaries/content/documents/fluidigm/resources/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/real-time-pcr-analysis-ug-68000088/fluidigm%3Afile (2018).
Huggett, J. F., et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 59 (6), 892-902 (2013).
U. S. National Library of Reference. Primer Blast. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/ (2020).
Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. Journal of Molecular Endocrinology. 29 (1), 23-39 (2002).
Nolan, T., Huggett, J., Sanchez, E. Good Practice guide for the application of quantitative PCR (qPCR), LGC. , (2013).
Yuan, J. S., Reed, A., Chen, F., Stewart, C. N. Jr Statistical analysis of real-time PCR data. BMC Bioinformatics. 22 (7), 85 (2006).
He, F. Total RNA Extraction from C. elegans. Bio-protocol. Bio-101. 47, (2011).
Hajdu-Cronin, Y. M., Chen, W. J., Sternberg, P. W. The L-Type Cyclin CYL-1 and the Heat-Shock-Factor HSF-1 Are Required for Heat-Shock-Induced Protein Expression in Caenorhabditis elegans. Genetics. 168 (8), 1937-1949 (2004).
Douglas, P. M., et al. Heterotypic Signals from Neural HSF-1 Separate Thermotolerance from Longevity. Cell Reports. 12 (7), 1196-1204 (2015).
Zhang, X., Zhang, Y. Dbl-1 a TGF-beta is essential for C. elegans aversive olfactory learning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (42), 17081-17086 (2012).
Sørensen, J. B. The Use and Misuse of the Coefficient of Variation in Organizational Demography Research. Sociological Methods & Research. 30 (4), 475-491 (2002).
Pujol, N. Distinct innate immune responses to infection and wounding in the C. elegans epidermis. Current Biology. 18 (7), 481-489 (2008).
Brennecke, P., et al. Accounting for technical noise in single-cell RNA-seq experiments. Nature Methods. 10 (11), 1093-1095 (2013).
Ly, K., Reid, S. J., Snell, R. J. Rapid RNA analysis of individual Caenorhabditis elegans. MethodsX. 7 (2), 59-63 (2015).

RT-PCR quantitativo ad alta produttività in campioni <em>C. elegans singoli e sfusi</em> che utilizzano la tecnologia nanofluidica

Play Video

PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F.,… More

Chauve, L., Le Pen, J., Hodge, F., Todtenhaupt, P., Biggins, L., Miska, E. A., Andrews, S., Casanueva, O. High-Throughput Quantitative RT-PCR in Single and Bulk C. elegans Samples Using Nanofluidic Technology. J. Vis. Exp. (159), e61132, doi:10.3791/61132 (2020).

Less

Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions

View Video