Summary
Orm-align / Worm_CP er en enkel FIJI / CellProfiler arbeidsflyt som kan brukes til å rette og justere Caenorhabditis elegans prøver og å score helorm bildebaserte analyser uten behov for tidligere opplæringstrinn. Vi har brukt Worm-align/Worm_CP på kvantifisering av varmesjokkindusert uttrykk hos levende dyr eller lipiddråper i faste prøver.
Abstract
Et problem som ofte oppstår når du anskaffer bildedata fra faste eller bedøvede C. elegans er at ormer krysser og klynger seg med sine naboer. Dette problemet forverres med økende tetthet av ormer og skaper utfordringer for avbildning og kvantifisering. Vi utviklet en FIJI-basert arbeidsflyt, Worm-align, som kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av brukervalgte, rettede og justerte ormer fra rå bildedata av C. elegans. Orm-align er en enkel og brukervennlig arbeidsflyt som ikke krever tidligere opplæring av brukeren eller analysealgoritmen. Montasjer generert med Worm-align kan hjelpe visuell inspeksjon av ormer, deres klassifisering og representasjon. I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Som et praktisk eksempel har vi brukt rørledningen på to datasett: det første datasettet er bilder av varmesjokkreporterormer som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) under kontroll av arrangøren av et varmesjokkinduserbart gen hsp-70, og det andre datasettet er bilder hentet fra faste ormer, farget for fettbutikker med fluorescerende fargestoff.
Introduction
En relativt enkel organisme, nematoden C. elegans, er et ekstremt nyttig modellsystem for å studere menneskelige sykdommer. Omtrent 38% av genene i C. elegans genom har funksjonelle kolleger hos mennesker1,2. En av de unike egenskapene til C. elegans er at den er optisk gjennomsiktig, noe som gir enkel tilgang til in vivo-informasjon om (sub) cellulært uttrykk for fluorescerende journalister på tvers av vev. Dette gjør C. elegans en førsteklasses modell organisme for høyinnholdsskjermer ved hjelp av bildebaserte plattformer3. Men et problem som ofte kompliserer disse studiene er at når de avbilder tette populasjoner av ormer, har de en tendens til å krysse og klynge, noe som gjør sammenligninger på tvers av individuelle ormer utfordrende, overskyet nedstrøms bildeanalyse og kvantisering.
Eksisterende løsninger som overvinner dette problemet, er vanligvis avhengige av optimalisering av kulterings- og bildeprotokollen, for eksempel gjennom bruk av mikroflytoppsett4, slik at enkeltormer kan fanges i separate bilder5,6. Andre har brukt maskinlæringsalgoritmer som åpner for anerkjennelse av enkeltormer, selv i en klumpete befolkning. Et utmerket eksempel på sistnevnte er WormToolbox, som er en modulær forlengelse av åpen kildekode bildeanalyseplattform, CellProfiler7. WormToolbox tilbyr en løsning med høy gjennomstrømning og høyt innhold for analyse av C. elegans,og drar helt klart nytte av inkluderingen i CellProfiler, da ytterligere analysemoduler enkelt kan inkluderes. Selv om WormToolbox leveres med en forhåndstrent modell (DefaultWormModel.xml), er omskolering av maskinlæringsalgoritmen vanligvis nødvendig for hvert nytt program. Online tutorials om hvordan du gjør dette er tilgjengelig på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Til tross for dette krever installasjon og bruk av WormToolbox en betydelig tidsinvestering for nybegynnere.
Her beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv protokoll til kultur, og bildepopulasjoner av C. elegans. For å tillate vurdering av individuelle ormer i de oppkjøpte bildene har vi utviklet en enkel åpen kildekode FIJI-basert arbeidsflyt, kalt Worm-align. Orm-align kan brukes til å generere enkelt- eller flerkanals montasjer av rettede og justerte ormer. For det første må brukeren manuelt velge individuelle ormer for analyse ved å tegne en linje fra hodet til halen. Orm-align vil bruke dette valget til å beskjære utvalgte ormer fra oversiktsbildet, og generere en montasje der valgte ormer er rettet og justert for å lette visuell sammenligning og presentasjon.
I tillegg kan utgangen av Worm-align brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre programvareplattformer for bildeanalyse. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utgangen til Worm_CP, et datasamlebånd som bruker Open-source CellProfiler-programvaren. CellProfilers fleksibilitet gjør det mulig å innlemme flere moduler for screening av høyt innhold. Vi har brukt Worm_CP rørledningen til å kvantifisere varmesjokkresponsen, en godt bevart beskyttelsesmekanisme som binder seg over proteiner som er feilfoldet på grunn av stressfaktorer som høy temperatur8. Spesielt brukte vi rørledningen på ormer som bærer en integrert multi-kopi transgene, hvor arrangøren av et varmesjokk induserbart gen, hsp-70 (C12C8.1), driver grønt fluorescerende protein (GFP)9. Vi har også brukt Worm_CP rørledningen på faste dyr som har blitt merket med et fluorescerende fargestoff som visualiserer lipiddråper (LDer), den viktigste fettlagringsorganelle i C. elegans10. Selv om denne arbeidsflyten ikke har gjennomstrømningen som tilbys av WormToolBox, er det et brukervennlig og enkelt alternativ for visuell presentasjon og analyse av bildebaserte C. elegans eksperimenter.
Protocol
1. Fiksering av ormer for fettinnholdsavbildning ved hjelp av et fluorescerende fargestoff for lipiddråper (BODIPY)10
- Forbered en synkronisert populasjon av C. elegans ved bleking i henhold til standardprosedyrer2. Plate ca 1000 L1-trinns ormer på en 9 cm nematode vekst media (NGM) plate per tilstand.
MERK: Flere ormer er forberedt enn faktisk kvantifisert på slutten, på grunn av tap av ormer ved håndtering. - For å bilde dyr på ung voksen stadium (rundt 50 h post L1 plating ved 20 ° C), vask hver 9 cm plate med 15 ml M9 i et konisk rør, sentrifuge på 252 x g i 1 min, og fjern supernatant.
- Gjenta vasken og la 1 ml M9 over pellet av ormer.
- Overfør 1 ml M9 som inneholder ormene i et 2 ml lavt proteinbindende mikrocentrifugerør, ved hjelp av lave oppbevaringsspisser.
- Spinn ned på 252 x g i en mikrocentrifuge i 1 min og fjern supernatanten, vær forsiktig så du ikke berører ormpelleten nederst på røret.
- For overvåking av fettinnhold ved hjelp av 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) farging1 ( Table of Materials), fikse ormer enten ved å legge til 0,5 ml 60% isopropanol til ormpellet i 3 min11, eller ved å legge til 2 ml iskald metanol i 10 min. For begge prosedyrene, inverter røret hver 30 s.
FORSIKTIG: Hvis metanol er den valgte fikseringsreagensen, må dette trinnet utføres i en røykhette på grunn av toksisiteten. - Fjern så mye fikseringsmiddel som mulig uten å berøre ormpelleten og tilsett 1 ml M9. La ormene bosette seg på bunnen av røret i 3-5 min.
- Vask igjen med 1 ml M9, la ormene slå seg ned og fjern supernatanten, og la ca 50 μL i røret. Fest røret med en klemme.
- Frys-sprekk ormene ved å stupe sikkert lukket rør i flytende nitrogen og deretter inn i et varmt vann bad på ~ 40 ° C.
- Gjenta trinn 1.9 en gang til.
- Tilsett 0,5 ml BODIPY fortynnet i M9 ved en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL og plasser på en rotator ved romtemperatur i 1 time.
- Etter 1 t, la ormene bosette seg nederst på røret i 3-5 min.
- Fjern supernatant og tilsett 1 ml M9.
- La ormene bosette seg nederst og fjerne supernatant.
MERK: Alternativt er det mulig å spinne ned på 252 x g i 1 min, da dette ikke ser ut til å påvirke morfologien. - Legg til 0,5 ml M9.
MERK: Hvis fikseringsmiddelet er 60% isopropanol, kan ormene bare brukes innen 48 timer. Hvis fikseringsmiddelet er metanol, bør ormene brukes innen 24h.
2. Klargjøre agarose pads for å montere ormene
MERK: Det kritiske trinnet under utarbeidelsen av en agarosepute er å få en pute med vanlig tykkelse. Ellers vil ormer over puten være i forskjellige fokale fly, noe som gjør det vanskelig å få et fokusert bilde av et bredere synsfelt.
- Forbered 2% agarose pads ved å legge til 0,2 g agarose til 10 ml sterilisert H2O i et beger eller en konisk kolbe. Varm i mikrobølgeovnen i 30 s til agarose begynner å koke.
MERK: Ikke overopphetes og stopp så snart bobler vises. ellers øker det viskositeten til agarose gjør det vanskeligere å oppnå ønsket pad tykkelse. - Når agarose er smeltet, dispensere en dråpe smeltet agarose i midten av et mikroskop glass lysbilde ved hjelp av en 1000 μL pipette tips med sin helt ende kutt. Umiddelbart, men delikat, hold et annet glasssklie svært nær agarose-fallet og slipp den på agarose for å danne en pute med vanlig tykkelse for best mikroskopiresultater.
MERK: Hvis du slipper det øverste lysbildet fra en høyde, dannes ikke bare bobler, men vil resultere i en ujevn pute. Alternativt er det også mulig å bruke to glasssklier flankerer lysbildet med puten, med et tynt lag med tape på hvert lysbilde. - Etter minst 2-3 min, fjern forsiktig det øverste lysbildet. Bruk siden av det øverste lysbildet til å trimme puten for å gjøre den firkantet formet. Monter ormene innen 5 min, for å hindre at puten tørker før bruk.
3. Montering av faste ormer for bildebehandling
- Lag en munnmikropipette ved å utvide en tynn glasskapillær i flammen til en Bunsen-brenner (figur 1A). Etter forlengelse i flammen, bryte kapillær i to stykker (Figur 1B). Velg den mest tilstrekkelige, vanligvis den lengste, og test om enden av kapillæren er åpen ved å prøve å aspirere vann.
MERK: Hvis væsken ikke kommer inn i kapillæren, er den for tynn eller blokkert. Skjær forsiktig enden av kapillæren med en saks, unngå å kutte for mye som ormer vil bli aspirert hvis hullet er for stort. - Plugg glasskapillæren fra trinn 3.1 til kapillæradapteren (figur 1C), koblet til silikonrøret på 6 mm og koble den andre enden av silikonrøret på 6 mm til et 0,2 μm filter, festet til et 3 mm silikonrør i den andre enden (figur 1C). Plugg en 1 ml filterspiss (figur 1C) inn i den frie enden av 3 mm silikonrør for å aspirere væske.
MERK: Filteret på 0,2 μm tilsettes mellom munnen på eksperimentereren og kapillæren, for å sikre maksimal sikkerhet for eksperimentereren. En lignende løsning brukes til munnmikropipetter som brukes til å håndtere museembryoer12. Bytt filteret (vanligvis noen få måneder) hvis munnmikropipetten ikke aspirerer væske lenger. - Bruk munnmikropipetten under et disseksjonsmikroskop, fjern så mye væske som mulig rundt ormpellet av faste ormer (figur 2).
MERK: Pipettering supernatant ut ved hjelp av en manuell mikropipette kan brukes som et alternativ til munnpipettene i trinn 3.1 til 3.3 for å fjerne så mye supernatant som mulig. Tilsett 6 μL monteringsmedium. Vi finner imidlertid at denne metoden ikke fungerer så effektivt fordi overdreven væske i putene skaper en sparsom ormtetthet, noe som gjør avbildningen mer tidkrevende. Fortsett trinn 3.6. Se på bunnen av røret og sørg for at pipetten ikke aspirerer ormene. - Tilsett raskt 10 μL monteringsmedium (Materials table) til bunnen av røret.
- Skyll en 10 μL tupp i PBS med spor av vaskemiddel (0,01% Triton), for å hindre ormer fra å holde seg til sidene av plastpipettespissen. Klipp selve enden av spissen med en saks.
- Overfør 8 μL monteringsmedium som inneholder ormene på agaroseputen tilberedt i trinn 2.3. Under mikroskopet rister du forsiktig lysbildet, for å unngå overlapping av ormene.
- Dekk dråpe monteringsmediet på agaroseputen med en 18 mm x 18 mm dekslerslip (figur 3).
MERK: Mindre dekkslips foretrekkes da de utøver mindre press på ormene. Hold dekkslipsen med et par pinsett og påfør den ene kanten av dekkslippen mot agaroseputen, før du forsiktig deponerer dekkslipsen med pinsettene.
4. Montering av levende ormer for avbildning
MERK: For å bilde levende ormer, må de immobiliseres på puten. En måte å oppnå dette på er å lamme dem med nikotinreseptoragonisten: levamisol (Materialseksjon).
- Pipette 3−4 μL på 3 mM levamisole oppløst i M9 på agaroseputen som ble opprettet i trinn 2,3.
MERK: Det bør være nok flytende volum at ormene ikke er oppå hverandre, men ikke for mye væske at ormene er for sparsomme på puten. Erfarne ormplukkere kan bruke 3 μL levamisole. Mindre erfarne pickers må kanskje legge til et større volum av levamisole, slik at levamisole ikke helt fordamper. - Plukk 30-50 ormer per tilstand i dråpe levamisole.
- Dekk dråpe levamisole på agarose pad med en 18 mm x 18 mm dekkslipp. Bildeormer innen 1 time, da lammende middel til slutt vil føre til døden av ormene.
5. Bildebilder med et epifluorescencemikroskop
- Med en agarose pad av jevn tykkelse, bilde alle ormer på lysbildet på en gang ved hjelp av en 6 x 6 eller 7 x 7 stort bilde for eksempel med 20x mål om et fluorescerende mikroskop. Hvis tykkelsen på puten ikke engang er jevn, kan du skaffe flere mindre 3 x 3 eller 4 x 4 bilder av samme lysbilde.
- Bruk de samme innstillingene for fluorescensintensitet og eksponeringstid for alle forhold. Juster hver innstilling slik at den samsvarer med lysbildet som har den lyseste intensiteten, slik at det ikke er noen pikselmetning. Hvis du vil ha spesifikke instruksjoner om bildeanskaffelse, følger du mikroskopprodusentens instruksjoner.
6. Opprette montasjebilder av justerte enkeltormer ved hjelp av Worm-align FIJI-rørledningen
- Installer programvarepakken for bildeanalyse med åpen kildekode FIJI13/ImageJ14 fra https://imagej.net/Fiji. Hvis en tidligere installasjon av FIJI er tilgjengelig, må du kontrollere at den er oppdatert til versjon 1.52a eller senere, da noen av funksjonene som brukes i makroen (f.eks. tabellfunksjoner), krever dette. Last ned ormjustert makro fra Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.
- Åpne FIJI, og kjør ormjustert makro. Utfør orm-juster ved å klikke plugins | Makroer | Kjør i fiji hovedmenylinjen (Figur S1). Finn nå Worm-align.ijm-skriptet på datamaskinen.
- Makroen initialiseres ved å be om plasseringen av bildene. Rørledningen vil fungere på både enkanals og flerkanals fluorescensbilder (figur S2). Velg en inndatamappe, og makroen genererer automatisk en utdatamappe der alle resultatene skal lagres (figur S3).
MERK: Det er viktig at den valgte mappen bare inneholder bildefiler, da tilstedeværelsen av andre filformater vil føre til at makroen krasjer. Ideelt sett grupperer bare sammen bilder som ble tatt med de samme mikroskopinnstillingene. Orm-align vil godta mange forskjellige filformater, inkludert nd2, czi, tif, rgb, jpg og png. Navnet på utdatamappen vil være det samme som inndatamappen, med "_output" lagt til som et postfix, det vil si hvis inndatamappen er "bilder", vil utdataene bli funnet i "images_output". Utdatamappen inneholder fire undermapper, der dataene skal lagres. - Tillat at makroen fortsetter å åpne det første bildet i inndatamappen og bruke det som et representativt bilde for å trekke ut en innstilling for å generere montasjen.
MERK: Orm-align vil automatisk velge det første bildet i inndatamappen for å generere innstillingene som skal brukes på alle andre bilder i mappen. Hvis et annet bilde anses å være mer representativt for datasettet, må du kontrollere at dette bildet er valgt ved å lagre en kopi av bildet i inndatamappen, endre navnet slik at det nå er oppført øverst i listen (f.eks. '0_RepresentativeImage'). - Med det rette tegneverktøyet tegner du en linje over bredden på en orm (figur S4) og bruker lengden på denne linjen til å bestemme høyden på de beskårne områdene for enkle ormer. For hver kanal angir du navnet, oppslagstabellen (LUT), intensitetsinnstillingene (B&C) og om det skal inkluderes i montasjen (figur S4).
MERK: Disse parameterne registreres og lagres i en innstillingsfil, Innstillinger.csv, som ligger i CellProfiler-undermappen i utdatamappen. - Når alle innstillingene er tatt, vises brukeren hvordan bildene vil se ut etter påføring av innstillingene som er brukt (Figur S5). Merk av i den øverste boksen hvis innstillingene er tilstrekkelige. Velg alternativer for montasjegenerering (fjern flått, om ikke nødvendig): 1. Generer en montasje av utvalgte ormer for hvert enkelt bilde, eller 2. Generer en kombinert montasje der alle ormer valgt på alle bildene i inndatamappen vil bli kombinert til en enkelt montasje. Klikk OK for å utføre resten av makroen.
MERK: Hvis den øverste boksen ikke er merket av før du klikker på 'OK' makroen vil kjøre oppsettet på nytt, slik at bildeinnstillingene kan optimaliseres. - Worm-align-rørledningen fortsetter nå å åpne alle bilder i inndatamappen. For hvert bilde tegner du linjer på langsgående akse av alle ormer som skal inkluderes i montasjen og/eller kvantifisere (figur 4 og figur S6) ved hjelp av "segmentert linje" -verktøyet (på FIJI-hovedmenylinjen). For å sikre riktig justering av orm, tegn linjer konsekvent fra hode til hale ende (eller vice versa), og langs hele lengden av ormen (se eksempler på "god" og "dårlig" linje tegning i figur 4B).
- Legg til hver linje i roi managerved å klikke Ctrl + T. Worm-align bruker linjene lagt til roi manager, i kombinasjon med orm bredde parameteren (satt i trinn 6.4) for å generere beskårne bilder av enkelt valgte ormer. Samlingen av linje-ROIer lagres i undermappen "data". Denne mappen inneholder også en kopi av det opprinnelige bildet som viser linjene, samt nummeret på ormen. Linjer er fargekodet med Glasbey_on_dark oppslagstabellen. Bildene av rettede ormer lagres i single_worms undermappen i utdatamappen. Hvis det er valgt i trinn 6.6 i denne protokollen, produserer Orm-align montasjer av alle ormer valgt per oversiktsbilde og/eller for alle oversiktsbilder i inndatamappen (se figur 4C og figur S7). Disse montasjer kan bli funnet i "justert" undermappe av utdatamappen.
7. Analysere fluorescensintensitet for enkeltorm ved hjelp av utgangen fra Worm-align i en automatisert CellProfiler-rørledning
- For nedstrøms databehandling og analyse av Worm-align utgang, laste ned og installere åpen kildekode bildeanalyse programvarepakken 'CellProfiler15,16 fra https://cellprofiler.org/. Last ned Worm_CP.cpproj-rørledningen fra GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align
Merk: Eksempelsamlebåndet som er beskrevet her, ble konstruert ved hjelp av CellProfiler2.2.0 og kan ikke kjøres i senere versjoner av CellProfiler. - Før du starter Worms_CP.cpproj-rørledningen, sikre at alle forventede utdatabilder finnes i CellProfiler-undermappen i utdatamappen Worm-align: en bearbeidet kopi av det opprinnelige bildet (kalt: Original_), en binær bildemaske av ormpopulasjonen (kalt: Mask_), en linjemaske av linjene som tegnes på valgte ormer (kalt: Lines_), og ett bilde som representerer hver av kanalene som finnes i det opprinnelige bildet (navngitt av kanalnummer).
- For å kvantifisere fluorescensintensiteten i enkelt ormer, klikk på Bilder inndatamodulen og bare dra CellProfiler utdatamappen inn i vinduet som sier Slipp filer og mapper her. Hvis det finnes en liste over bilder fra tidligere analyser, må du først fjerne disse ved å høyreklikke i vinduet og velge Fjern filliste. Hvis du vil utelate «Innstillinger.csv-filen fra bildelisten, velger du enten «Bare bilder» eller «Egendefinert» med «Utvidelse er tif, tiff, ome.tif eller ome.tiff» for filterinnstillingene (figur S8).
- Klikk på Metadata-inndatamodulen. I den andre utvinningsmetoden klikker du på den gule mappen, og finner cellprofiler-undermappen i utdatamappen WormAlign (Figur S9). Velg innstillinger.csv-filen, og koble innstillingene i filen til CellProfiler-utdataene ved å samsvare metadataene i CSV-filene til de i bildene (kanalmetadata).
- Klikk på NamesAndTypes inndatamodulen og sett inn et nytt bilde for hver kanal av det opprinnelige bildet som skal kvantifiseres.
MERK: Allerede til stede i eksempelpipelinen er ormmasken, to fargebilder, linjemasken og det opprinnelige bildet, og tre gråskalabilder (den grønne og den røde kanalen). Listen i denne modulen må justeres hvis de opprinnelige bildene har flere eller færre kanaler enn eksempelbildene. - Kontroller at navnet på bildene i hver kolonneetikett/maske/ormer er riktig.
MERK: Navnene på bildene på én linje skal alle samsvare med det samme første bildet som skal analyseres. Hvis det gjøres en feil under bildeanalyseprosessen, mangler noen av utdatabildene, og navnene under de tre kolonneetikettene/masken/ormene vil ikke tilsvare det samme første bildet lenger for hver linje. Hvis dette er tilfelle, finn ut hvor feilen er. - Trykk Vis utdatainnstilling for å velge mappen for å lagre utdataene fra Cellprofiler.
- Klikk Start testmodus. Når du er i testmodus, dobbeltsjekker du innstillingene for rørledningen ved å bruke dem på det første bildet i datasettet, ved å klikke Kjør (som vil kjøre gjennom alle aktive moduler i rørledningen), eller Trinn (som vil kjøre gjennom rørledningen én modul om gangen).
MERK: Når du er i testmodus, eksporteres ikke de utpakkede målene, selv om en ExportToSpreadsheet-modul finnes (og aktiv) i rørledningen. - Når rørledningen utfører slik den skal, klikker du Avslutt testmodus og trykker deretter Analyser bilder. Som konfigurert, vil Worms_CP (1) bruke Mask_-bildet til å segmentere en grov ormmaske og Lines_-bildet (Figur S10A) til å utse de valgte ormene og produsere enkeltormmasker (figur S10C), (2) måle fluorescensintensiteten til alle kanaler som finnes i inndatabildene i de ormene identifisert og maskert. Rørledningen kan også måle bakgrunnsintensitet (figur S10B) og korrigere alle bilder tilsvarende (angitt med ordet terskel i navnet på parameteren målt. f.eks. Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) måle størrelsen på de valgte ormene, og (4) eksportere alle målte parametere (Figur S10D).
- Åpne Worm_CP som består av to csv-filer, ormer.csv og linjer.csv som er lagret i den valgte utdatamappen (se Figur S11). Disse filene kan åpnes i Excel eller R (Studio) for etterbehandling og rapportering. Hvis det kreves ekstra utdata, for eksempel per bildedata, kan dette velges i ExportToSpreadsheet-modulen i rørledningen.
Representative Results
Culturing og imaging C. elegans i henhold til metoden beskrevet i denne protokollen produserer store oversiktsbilder av ormpopulasjoner. For å lette visuell inspeksjon og klassifisering av ormer fra disse bildene har vi utviklet Orm-align. Orm-align er et enkelt og brukervennlig FIJI-skript som kan brukes til å lage montasjer av rettede og justerte ormer. Ormer velges fra oversiktsbilder ved å tegne en linje langs ormenes langsgående akse. Hver valgte orm er tildelt et tall, beskåret og rettet, og lagt til i en montasje. Montasjer kan genereres per bilde eller kombinere alle bilder fra den opprinnelige inndatamappen.
Som forventet avhenger produksjonen av rørledningen i stor grad av kvaliteten på linjene som tegnes på toppen av bildene. For å illustrere dette punktet viser figur 4 flere linjeeksempler, og deres utgang fra Worm-align. En komplett linje fra hodet til spissen av halen produserer en riktig justert orm (merket "bra"). Figur 4 viser også hvordan sporing av unøyaktigheter under utførelsen av ormjustering påvirker utgangen av justeringen. Fra den kommenterte montasjen som inngår i figur 4C,bør det tas hensyn til å unngå følgende feil, da de hindrer riktig justering av ormer:
- Inkonsekvent sporing av ormen fra hode til hale (merket "hale til hode"). Dette resulterer i at ormer blir orientert i forskjellige retninger (det vil si hale-til-hode versus hode-til-hale) i justeringen.
- Ufullstendig sporing (merket "ufullstendig"). Dette resulterer i bare den delen av ormen som ble sporet for å bli beskåret for montasjen.
- Inkludert flere ormer i et enkelt spor (merket "orm med to hoder"). Dette resulterer i ormer pluss (betydelige deler av) deres naboer blir satt inn i samme panel av montasjen.
- Legge til tilfeldige linjer i bildet (merket "tilfeldig"). Dette resulterer i innsetting av tilfeldige paneler i montasjen.
For opprettelse av montasjen er det ikke et problem hvis to individuelle linjer krysser (merket "kryssende") eller er føyd i hver ende av ormen (merket "sammenføyd"), så lenge hver linje sporer hele lengden på en individuell orm: Worm-align skriptet individuelt og sekvensielt velger hver linje ROIer, avlinger og retter den, slik at hvert panel i den endelige montasjen vil representere en enkelt linje spor. I tilfelle av de kryssende ormene, men selv om full lengde rettet ormer vises for orm "intersecting1" og orm "krysser2" i montasjen (se figur 5A-B),er det tydelig merkbart at disse ormene krysser hverandre i det opprinnelige oversiktsbildet. Derfor kan det konkluderes med at visuell identifisering av kryssende linjer er mulig fra overleggsbildet som finnes i undermappen "data" (figur 5A), samt fra panelene av individuelle ormer i montasjen (figur 5B). I tillegg kan enhver overlapping av ormer/linjer identifiseres fra kvalitetskontrolltabellen (QC) som genereres for hvert behandlede bilde av Worm-align, og lagres i dataundermappen. Denne tabellen registrerer tre parametere for hver av linje-ROIene som er tegnet i bildet (se figur 5C): Av disse angir Lengde lengden på linjeavkastningen, som er en god indikator på ormens størrelse. og Orm-nummeret angir rekkefølgen linjene ble tegnet i på oversiktsbildet. Til slutt angir den siste kolonnen om det er overlapping mellom den aktuelle ormen/linjen og noen av de andre ormene/linjene som er valgt i bildet. Ved overlapping vil tallet i denne kolonnen være forskjellig fra det som er oppført i Ormnummer-kolonnen. I kombinasjon med overleggsbildet bør QC-tabellen hjelpe forskeren til å ta lærede beslutninger om hvilke ormer som bør utelukkes fra montasjen og/eller kvantifiseringen.
Utgangen av Worm-align kan brukes til etterfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer. I FIJI kan linje-ROIene brukes til å måle fluorescensintensiteten i de opprinnelige bildedataene, for eksempel ved å utføre det enkle FIJI-skriptet ' Worm-quant.ijm', som også finnes i ormjustert repositorium på Github. Alternativt kan Worm-align-utgangen importeres til tredjeparts bildeanalyseprogramvare. Vi demonstrerer dette ved å importere Worm-align-utdataene for to datasett til Worm_CP, et datasamlebånd vi genererte i CellProfiler. Worm_CP bruker filene i undermappen 'CellProfiler' i Worm-align utdatamappen til å finjustere segmenteringsmasker for de individuelle ormene som er valgt under utførelsen av orm-justermakroen. Spesielt bruker den linjemasken (kalt: Lines_) til å isolere valgte ormer fra ormenpopulasjonen sett i den binære masken (kalt: Mask_). Det bør bemerkes at linjer som krysser på oversiktsbildet (Figur 5A), men ikke et problem for generering av montasjer, er problematiske for Worm_CP rørledningen. Hvorfor dette er tilfelle, er illustrert i figur 5 D-E. Worm_CP bruker linjemasken (figur 5D), og ikke individuelle ROIer for å hjelpe til med identifisering av individuelle ormer. Den kryssende linjen trukket andre under utførelsen av Worm-align er lagt på den første linjen, og derfor intensiteten langs denne linjen vil være at av ROI2 inkludert i bit der linje 1 og 2 overlapper. Som et resultat vil CellProfiler segmentere linje2 som ett objekt, men linje1 som to objekter som er atskilt der den krysser med linje2. Dette betyr at CellProfiler vil produsere to (halv) orm masker for orm 'intersecting1' (Figur 5E). Den enkleste måten å utelate disse hendelsene fra den endelige analysen (om nødvendig), er å identifisere orm antall kryssende ormer fra QC-tabellen (dataundermappe), og å fjerne målinger for disse ormene fra CellProfiler-utdatafilene. Vær oppmerksom på at ormer ikke nødvendigvis vil bli tildelt samme nummer i FIJI og CellProfiler: For å identifisere FIJI ormnummeret i CellProfiler utdata se på Intensity_Max_Intensity-verdiene i utdatafilen "Linjer.csv". Alle Intensity_Max_Intensity som vises i tabellen "Linjer.csv" mer enn én gang per bilde, er en indikasjon på at linjeavkastningen resulterer i en brukket ormmaske.
Når individuelle ormmasker er segmentert, Worm_CP kan måle fluorescensintensiteten i de valgte ormene for alle registrerte kanaler. Alle målinger er hentet fra de opprinnelige (rå) bildedataene, selv om det skal bemerkes at CellProfiler automatisk skalerer pikselintensiteten på en skala fra 0-1. Dette oppnås ved å dele råpikselintensitetsverdien med maksimal mulig pikselintensitet for bildet. Ved 8-biters bilder er denne verdien 255, og i tilfelle 16-biters bilder er det 65535. CellProfiler intensitetsverdier må derfor multipliseres med maksimal mulig intensitetsverdi for å gjenvinne verdier som tilsvarer råbildedataene. Den Worm_CP består av to csv-filer, "ormer.csv" og "Linjer.csv" som er lagret i den valgte utdatamappen. Mens inspisere disse filene, er det klart at CellProfiler registrerer et stort antall parametere knyttet til fluorescens intensitet. Av disse tilsvarer Intensity_IntegratedIntensity den totale fluorescens per orm (det vil si summen av fluorescensintensiteten i alle piksler som tolker masken til en individuell orm). Parameteren Intensity_MeanIntensity refererer til den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten i en individuell orm (det vil si gjennomsnittlig fluorescensintensitet per piksel for alle pikslene i en individuell orm). På grunn av sporadisk forekomst av (små) feil i segmentering av ormmaskene anbefales det at MeanIntensity-målinger brukes når man sammenligner fluorescensmålinger av individuelle ormer mellom to forhold. Hvis du ønsker å trekke bakgrunnsfluorescensen fra kvantifiserte mål, bruk målene som heter MeanIntensity_Threshold.
Vi har brukt Worm_CP rørledningen til å kvantifisere fluorescensintensiteten fra faste dyr som er merket med et fluorescerende fargestoff som inkorporerer i lipiddråper (LDer) (figur 6). For å validere fluorescens kvantifisering fra Worm-align/Worm_CP rørledningen, kvantifiserte vi fluorescensintensiteten i samme sett med ormer fra BODIPY-datasettet med enten Worm-align/Worm_CP-rørledningen eller manuell kvantifisering i FIJI/ImageJ. Manuell kvantifisering ble utført i FIJI/ImageJ ved å sirkle hver orm samt en mørk bakgrunnssone i hvert bilde. Fluorescensintensiteten ble målt i ROI-lederen, og verdien målt for bildebakgrunnen ble trukket fra ormfluorescensmålingen av hver orm, som beskrevet17. Vi sammenlignet vill type (WT) N2 ormer med dbl-1 (nk3) mutanter, som viser redusert lipid dråpeinnhold18. Som forventet reduseres den grønne fluorescensintensiteten betydelig mellom WT og dbl-1(nk3) ormer med begge metodene (figur 6A, B). Eksempler på justerte ormer kan observeres i figur 6C, D. Lipiddråpeinnholdet reduseres med 17 % (p-verdi<0,0001, unpaired t-test) mellom WT og dbl-1(nk3) ved hjelp av manuell kvantifisering, og med 14 % (p-value=0,0051 unpaired t-test) ved hjelp av Worm_CP-rørledningen. Nedgangen i lipiddråpeinnhold observert her i dbl-1 (nk3) med begge kvantifiseringsmetodene er i samsvar medlitteraturen 18. Dette viser at kvantifisering av ervervede fluorescensbilder med Worm_CP CellProfiler-rørledningen kan sammenlignes med manuell kvantifisering.
Vi har også brukt Worm_CP til å kvantifisere varmesjokkresponsen i levende ormer som uttrykker GFP under kontroll av varmesjokket som kan induseres gen hsp-70 (C12C8.1)9. Figur 7 viser representative bilder av levende C. elegans som bærer den varmeresponsive hsp-70 (C12C8.1)p::GFP reporter. I fravær av varmestress induserer ormene ikke GFP-uttrykk (figur 7A, B). Men når ormer utsettes for et kort varmesjokk på 30 min ved 34 °C, induserer de GFP-uttrykk (figur 7C,D). GFP-uttrykksnivåer med og uten varmesjokk kvantifiseres i figur 7E.
Som det står, Worm_CP er en veldig grunnleggende rørledning. Denne tilnærmingen muliggjør imidlertid en mer nøyaktig segmentering av individuelle ormmasker, noe som gir en mer nøyaktig kvantifisering av fluorescensintensiteten i de ormene som er valgt fra bildet. Av denne grunn foretrekker vi denne tilnærmingen over en grov kvantifisering i FIJI, ved hjelp av bare linjemaskene. I tillegg tilbyr CellProfiler fordelen at flere analysemoduler enkelt kan inkluderes i rørledningen. For datasettet som ser på lipiddråpeinnhold, kan for eksempel innsetting av flere moduler i Worm_CP-rørledningen undersøke lipiddråpenumre og fluorescensintensiteten til individuelle dråper i de ormene som er valgt i oversiktsbildene.
Figur 1: Generere en munnmikropipette. En glasskapillær er utvidet i flammen til en Bunsen brenner (A), til den gir tynne langstrakte ekstremiteter (B). Den utvidede glasskapillæren kobles deretter til adapterstykket i munnmikropipetten. (C) Skjematisk av en munn mikropipette. Munnmikropipetten ble montert med en glasskapillær koblet til en adapter. Et 6 mm silikonrør kobler adapteren til et sprøytefilter på 0,2 μm, som brukes til sikkerhet. Den andre enden av filteret er festet til et 3 mm silikonrør som slutter med en 1ml filterspiss. Eksperimentereren kan aspirere via filterspissen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Aspirasjon av væsken rundt ormpellet, ved hjelp av munnmikropipetten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Legge til dekkslips på ormene som ligger på agarose pad Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Eksempler på ormrette ved hjelp av Worm-align på fluorescens bilder ervervet fra levende dyr bærer transkripsjonsreporter fett-7p::GFP i tarmen og en rød co-injeksjon markør i svelget (myo-2p::tdtomato). (A) Skjermbilde av et sammensatt bilde ervervet på fluorescerende mikroskop av levende ormer på dag 3 av voksen alder. Bildet ble åpnet med Worm_align linjer ble tegnet langs langsgående akse av ormene ved hjelp av Worm-align. (B) Skjermbilde av det samme bildet som i (A), med eksempler kommentert av god og dårlig tegning av linjene langs ormenes akse, ved hjelp av Worm-align. (C) Eksempler på linjer trukket på toppen av ormer som kan stige til feil justerte ormer. Orm-align utgang av ormene valgt i B. Bilder ble tatt med en 20x mål på en invertert widefield mikroskop (se Materialer tabell) med grønn fluorescens intensitet = 1, eksponering = 60 ms og rød fluorescens intensitet = 8, eksponering = 60 ms. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Eksempler på ormretting ved hjelp av Orm-align på kryssende ormer. (A)Skjermbilde av et sammensatt bilde ervervet på fluorescerende mikroskop av levende ormer på dag 3 av voksenalder dyr bærer transkripsjonsreporter fett-7p::GFP i tarmen og en rød co-injeksjon markør i svelget (myo-2p::tdtomato). Kryssende ormer er merket "intersecting1" og "intersecting2", mens ikke overlappende ormer er merket "good3" og "good4". (B) Montasje opprettet av Worm-align som representerer rettede ormer valgt i (A). Det er merkbart i montasjen at ormene 1 og 2 ble krysset på det opprinnelige bildet (ormer merket som "intersecting1" og "intersecting2"). (C) Skjermbilde av QC-tabellen fra Worm-align som gjør det mulig å oppdage tilfeller der ormer krysser hverandre. Lengde: lengden på roi-linjen; ormnummer: rekkefølge der linjene ble trukket; siste kolonne angir om det er en overlapping mellom ormen/interesselinjen og annen orm. I dette eksemplet overlapper ormen i den første rå (orm nummer1) med orm nummer 2, som angitt med tallet "2" i den siste kolonnen. (D) Skjermbilde av linjene tegnet med Orm-juster på de fire ormene valgt i A. (E) Skjermbilde av maskene generert av Worm-align på de fire ormene som er valgt i A, som viser hvordan maskene for de to kryssende ormene gjengis. I dette tilfellet er to masker i stedet for en nå tilsvarende ormen "intersecting1". Bilder ble tatt med et 20x mål på et omvendt widefield mikroskop (se Materialtabell) med grønn fluorescensintensitet = 1, eksponering = 60ms og rød fluorescensintensitet = 8, eksponering = 60 ms. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Den Worm_CP kvantifiserer fluorescensen like nøyaktig som manuell kvantifisering. Sammenligning av fluorescens kvantifisering av unge voksne ormer fast og farget for lipid dråpeinnhold med den grønne fluorescerende fargestoff BODIPY, ved hjelp av enten Worm_CP rørledning (A) eller manuell kvantifisering (B). Lipiddråpeinnholdet i WT og dbl-1 (nk3) ble overvåket ved å feste og farge dyr med BODIPY, som intercalates i fettsyrer av lipiddråper (se protokoll A). Unge voksne dyr ble fikset med 60% isopropanol og farget med BODIPY i 1t. Det samme settet med dyr ble kvantifisert enten ved hjelp av Worm_CP rørledningen (se trinn 7) eller ved manuell kvantifisering i henhold til standardprosedyrer17. (A)Kvantifisering av fluorescens ved hjelp av Worm_CP rørledningen. WT: n = 22 dyr, gjennomsnittlig fluorescens = 1.016 (A.U) ± 0.206 SD; dbl-1(nk3):n=25 dyr, gjennomsnittlig fluorescens= 0,8714 (A.U) ± 0,126 SD. Unpaired t-test. (B) Manuell kvantifisering av fluorescens. WT: n = 22 dyr, gjennomsnittlig fluorescens = 1,048 ± 0,153 SD; dbl-1(nk3): n=25 dyr, gjennomsnittlig fluorescens = 0,8632 ± 0,109 SD. Ulønnet t-test. (C, D) Representativt eksempel eller Worm-Align utgang for WT (C) og dbl-1 (nk3) (D) dyr rettet med Worm-align rørledningen. Bilder ble tatt med et 20x mål på et invertert widefield mikroskop (se Materialtabell) med grønn fluorescensintensitet = 2, eksponering = 60ms. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Eksempel på fluorescens kvantifisering og justering av levende ormer fra fluorescens bilder av levende ormer bærer transkripsjonsreporter hsp-70 (C12C8.1)p::GFP etter varmesjokk. (A)Ved et kort varmesjokk (30 min ved 34 °C) ble unge voksne ormer gjenfunnet ved dyrkingstemperaturen (25 °C) og montert deretter avbildet 3,5 t stolpevarmesjokk. Om lag 30 ormer ble kvantifisert etter varmesjokk ved hjelp av Worm-align rørledningen. (A-B) Eksempler på justerte ormer som ikke har vært utsatt for varmesjokk. -Det er ikke noe å si på. Eksempler på varmesjokkerte ormer som bærer hsp-70(C12C8.1)p::GFP ved hjelp av Orm-align. (E) viser GFP Gjennomsnittlig intensitet (Worm_CP parameter: MeanIntensity_Threshold) av WT unge voksne ormer dyrket, uten varmesjokk eller ved eksponering for varmesjokk (34 °C i 30 min). Bilder ble tatt med et 20x mål på et invertert widefield mikroskop (se Materialtabell) med grønn fluorescensintensitet = 1, eksponering = 60ms; ingen HS: n = 12, HS: n = 32. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tilleggsfigur 1: Plassering i FIJI der ormjustert makroen kan bli funnet, når den er installert. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 2: Valg av mappen som inneholder alle bilder tatt med de samme innstillingene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 3: Generering av 4 undermapper i utdatamappen i FIJI. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 4: Tegning av en linje over bredden på ormen og kanalinnstillingene for montasjen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 5: Forhåndsvisning av bildet med de brukte innstillingene. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur 6: Tegning av en linje langs langsgående akse av ormene av interesse for inkludering i montasjen og / eller kvantifisering. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 7: Montasje av de valgte ormene i utdatamappen, under "justert" mappe. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstall 8: Fjerne tidligere bilder fra tidligere analyse i Cell Profiler. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstall 9: Importere metadata til CellProfiler fra utdatamappen for orm align ved å velge .csv undermappe. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur 10: CellProfiler-rørledningen Worm_CP.cpproj bruker Lines_-bildene til å enkeltlegge de valgte ormene (A), og produserer enkeltormmasker av interesse ormene (C). Rørledningen måler også bakgrunnsintensitet (B). Outlook for alle parameterne som måles av pipeline Worm_CP.ccproj som eksporteres i en CSV-fil (D). Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggstall 11: Valg av utdatafiler i "ExportToSpreadsheet i Worm_CP.cpproj-rørledningen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
Orm-align er en FIJI-basert bildebehandlingsrørledning som lett genererer montasjer av brukervalgte ormer, der ormer rettes og justeres for å hjelpe visuell sammenligning, klassifisering og representasjon. Selv om denne funksjonen også tilbys av noen eksisterende verktøy, spesielt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, krever Worm-align relativt lite tidligere bildeanalyseopplevelse: Brukere trenger bare å spore de ormene de ønsker å velge for montasjen (og analysen). Selv om sporing av ormene på råbildedataene er en enkel prosess - spesielt når en berøringsskjermdatamaskin eller nettbrett er tilgjengelig- det er viktig, at linjer tegnes riktig langs ormenes langsgående akse. Ufullstendige linjer, som bare følger en del av ormen, vil resultere i delvise ormer i montasjen (det vil si ormer som mangler hoder av haleender) og delvissegmenteringsmasker under CellProfiler-analyse. Også, hvis linjer fra to individuelle ormer krysser, vil ormene ikke bli riktig behandlet i ormen justering montasje samt for fluorescens kvantifisering. For kvalitetskontroll lagres et overleggsbilde av linjevalgene på det opprinnelige bildet i datamappen, sammen med en QC-tabell. Fra disse kan problematiske linjer som fører til feil segmenterte ormer lett identifiseres og utelates fra montasje og/eller påfølgende analyse.
Selv om direkte innspill fra eksperimentereren i valg av ormer kanskje virker litt tidkrevende, presenterer det en klar fordel av arbeidsflyten over andre i eksperimenter der ormer fra forskjellige utviklingsstadier er tilstede i samme bilde: Ormer kan velges under "sporingstrinn", ved å skissere bare de ormene som er i riktig utviklingsstadium. Alternativt kan ormer filtreres ved hjelp av utgangen fra Worm_CP basert på enten lengden på sporingslinjen, eller området av segmenteringsmasken, både pålitelige indikatorer på ormenes lengde/størrelse. Uten tvil kan maskinlæringsalgoritmer slite med å gjenkjenne ormer fra forskjellige utviklingsstadier, da deres størrelse og utseende i DIC-bildene er så forskjellige.
Utgangen av Worm-align kan brukes til påfølgende kvantifisering av fluorescensintensitet i enkeltormer, enten i FIJI direkte eller i andre bildeanalyseprogramvareplattformer. Vi demonstrerte dette ved å importere Worm-align-utgangen til en enkel CellProfiler-rørledning (Worm_CP), som gjør det mulig å kvantifisere flerkanals fluorescensintensitet i de individuelle ormene som ble valgt mens du kjører Worm-align-rørledningen. Vi valgte denne tilnærmingen på grunn av fleksibiliteten til CellProfiler-programvaren: Det er enkelt å innlemme flere moduler i rørledningen for å analysere flere funksjoner i individuelle ormer (f.eks. måle størrelsen på lipiddråper, eller stressgranulat, kjerner, mitokondrier). I tillegg kan enkeltormmaskene potensielt brukes til å trene en ny modell for WormToolbox7.
De viktigste fordelene med denne metoden er at den er rask og krever et enkelt ormmonterings oppsett. Denne metoden er raskere da den ikke krever å bruke tid på å lære programvaredrift eller kjøre opplæringssett gjennom enmaskinalgoritme 7. Videre fungerer denne metoden med enten levende eller faste ormer bare montert på vanlige agarose pads. Det er ikke nødvendig å bruke komplekse mikrofluidiske kamre, som utviklet i andre metoder5,6.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr Christian Lanctôt ved BIOCEV (Praha, Tsjekkia) for å lære oss munnen mikropipette teknikk for å montere faste ormer og Dr Fatima Santos og Dr Debbie Drage for å dele sikkerhetsoppsett på munnen mikropipette. Vi takker også Francesca Hodge for redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch og Babraham Institute Facilities for deres støtte. OC støttes av ERC 638426 og BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
- Shave, D. D., Greenwald, I. OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs. PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).
- Stiernagle, T.
- Letizia, M. C., et al. Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution. Microsystems & Nanoengineering. 4 (6), (2018).
- San-Miguel, A., Lu, H. Microfluidics as a tool for C. elegans research. WormBook. , (2013).
- Atakan, H. B., et al. Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms. Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).
- Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans. Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).
- Wählby, C., et al. An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays. Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).
- Morimoto, R. I. The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease. Biology. 76 (9), 91-99 (2012).
- Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network. PLoS Genetics. 9 (4), (2018).
- Klapper, M., et al. Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches. Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).
- Wählby, C., et al. and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans. Methods. 68 (3), 9 (2014).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome. 7, 100 (2006).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans. Science. 335 (6064), 82-85 (2012).
- Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling. G3. 8 (1), Bethesda. 343-351 (2017).
