Summary
कृमि-संरेखित/Worm_CP एक सरल फिजी/सेलप्रोफिलर वर्कफ्लो है जिसका उपयोग कैनोरहैब्डिटिस एलिगेंस नमूनों को सीधा और संरेखित करने और पूर्व प्रशिक्षण चरणों की आवश्यकता के बिना पूरे कृमि छवि-आधारित परख को स्कोर करने के लिए किया जा सकता है। हमने जीवित जानवरों या लिपिड बूंदों में गर्म-सदमे प्रेरित अभिव्यक्ति के मात्राकरण के लिए कृमि-संरेखित/Worm_CP को निर्धारित नमूनों में लागू किया है ।
Abstract
फिक्स्ड या एनेस्थेटाइज्ड सी एलिगेंस से इमेज डेटा प्राप्त करते समय अक्सर एक मुद्दा सामना करना पड़ता है कि कीड़े अपने पड़ोसियों के साथ क्रॉस और क्लस्टर करते हैं। यह समस्या कीड़े के बढ़ते घनत्व के साथ बढ़ जाती है और इमेजिंग और मात्राकरण के लिए चुनौतियां पैदा करती है। हमने एक फिजी-आधारित कार्यप्रवाह, वर्म-रिलाइन विकसित किया है, जिसका उपयोग सी एलिगेंस के कच्चे छवि डेटा से उपयोगकर्ता-चयनित, सीधे और गठबंधन कीड़े के एकल या बहु-चैनल असेंबल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। वर्म-एलाइन एक सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल कार्यप्रवाह है जिसे उपयोगकर्ता या विश्लेषण एल्गोरिदम के पूर्व प्रशिक्षण की आवश्यकता नहीं होती है। कीड़े-संरेखित के साथ उत्पन्न असेंबल कीड़े के दृश्य निरीक्षण, उनके वर्गीकरण और प्रतिनिधित्व में सहायता कर सकते हैं। इसके अलावा, कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हम Worm_CP में कीड़ा-संरेखित उत्पादन का आयात करके इसे प्रदर्शित करते हैं, एक पाइपलाइन जो ओपन-सोर्स सेलप्रोफिलर सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है। सेलप्रोफिलर का लचीलापन उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अतिरिक्त मॉड्यूल के समावेश को सक्षम बनाता है। एक व्यावहारिक उदाहरण के रूप में, हमने दो डेटासेट पर पाइपलाइन का उपयोग किया है: पहला डेटासेट हीट शॉक रिपोर्टर कीड़े की छवियां हैं जो हीट शॉक अकक्षीय जीन एचएसपी-70के प्रमोटर के नियंत्रण में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करते हैं, और दूसरा डेटासेट निश्चित कीड़े से प्राप्त छवियां हैं, जो फ्लोरोसेंट डाई के साथ वसा-भंडारों के लिए सना हुआ है।
Introduction
एक अपेक्षाकृत सरल जीव, सूत्रकृमि सी एलिगेंस,मानव रोगों का अध्ययन करने के लिए एक अत्यंत उपयोगी मॉडल प्रणाली है। सी एलिगेंस जीनोम में लगभग 38% जीन मनुष्यों में कार्यात्मक समकक्ष हैं1,2. सी एलिगेंस की अनूठी विशेषताओं में से एक यह है कि यह ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी है, जो ऊतकों में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर्स की (उप) सेलुलर अभिव्यक्ति के बारे में वीवो जानकारी में आसान पहुंच को सक्षम करता है। यह सी एलिगेंस को इमेज-आधारित प्लेटफॉर्म3का उपयोग करके उच्च सामग्री वाली स्क्रीन के लिए एक प्रमुख मॉडल जीव बनाता है। हालांकि, एक मुद्दा जो अक्सर इन अध्ययनों को जटिल बनाता है, वह यह है कि जब कीड़े की घनी आबादी इमेजिंग करते हैं, तो वे पार करते हैं और क्लस्टर करते हैं, व्यक्तिगत कीड़े में तुलना को चुनौती देते हैं, डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण और क्वांटिटेशन को धूमिल करते हैं।
इस मुद्दे को दूर करने वाले मौजूदा समाधान आमतौर पर संस्कृति और इमेजिंग प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर भरोसा करते हैं, जैसे माइक्रो-फ्लूइडिक्स सेटअप4के उपयोग के माध्यम से, एकल कीड़े को अलग-अलग छवियों में कैप्चर करने की अनुमति देता है5,6। दूसरों ने मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम लागू किया है जो एकल कीड़े की मान्यता के लिए अनुमति देता है, यहां तक कि एक झुरमुट आबादी में भी। उत्तरार्द्ध का एक उत्कृष्ट उदाहरण वर्मटूलबॉक्स है, जो ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस प्लेटफॉर्म, सेलप्रोफिलर7का मॉड्यूलर विस्तार है। वर्मटूलबॉक्स सी एलिगेंसके विश्लेषण के लिए एक उच्च-थ्रूपुट और उच्च सामग्री समाधान प्रदान करता है, और सेलप्रोफिलर में इसके शामिल होने से स्पष्ट रूप से लाभ उठाता है, क्योंकि अतिरिक्त विश्लेषण मॉड्यूल आसानी से शामिल किए जा सकते हैं। हालांकि वर्मटूलबॉक्स एक पूर्व प्रशिक्षित मॉडल (डिफ़ॉल्ट वर्मवर्ममॉडल.xml) के साथ आपूर्ति की जाती है, मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम का पुनर्प्रशिक्षण आमतौर पर प्रत्येक नए आवेदन के लिए आवश्यक होता है। यह कैसे करना है पर ऑनलाइन ट्यूटोरियल गिथब (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) पर उपलब्ध हैं। इसके बावजूद, वर्मटूलबॉक्स को स्थापित करने और उपयोग करने के लिए नौसिखिए उपयोगकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण समय-निवेश की आवश्यकता होती है।
यहां, हम संस्कृति के लिए एक सरल और लागत और समय प्रभावी प्रोटोकॉल, और सी एलिगेंस की छवि आबादी का वर्णन करते हैं। अधिग्रहीत छवियों में व्यक्तिगत कीड़े के आकलन की अनुमति देने के लिए हमने एक साधारण ओपन-सोर्स फिजी-आधारित कार्यप्रवाह विकसित किया है, जिसका नाम वर्म-एलाइन है। कृमि-संरेखण का उपयोग सीधे और गठबंधन कीड़े के एकल या बहु-चैनल असेंबल उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। सबसे पहले, उपयोगकर्ता को मैन्युअल रूप से सिर से पूंछ तक एक लाइन खींचकर विश्लेषण के लिए व्यक्तिगत कीड़े का चयन करना होगा। कृमि-संरेखण अवलोकन छवि से चयनित कीड़े को फसल करने के लिए इस चयन का उपयोग करेगा, और एक असेंबल उत्पन्न करेगा जिसमें चयनित कीड़े को सीधा किया जाता है और दृश्य तुलना और प्रस्तुति की सुविधा के लिए गठबंधन किया जाता है।
इसके अलावा, कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हम Worm_CP में कीड़ा-संरेखित उत्पादन का आयात करके इसे प्रदर्शित करते हैं, एक पाइपलाइन जो ओपन-सोर्स सेलप्रोफिलर सॉफ्टवेयर का उपयोग करती है। सेलप्रोफिलर का लचीलापन उच्च सामग्री स्क्रीनिंग के लिए अतिरिक्त मॉड्यूल के समावेश को सक्षम बनाता है। हमने हीट शॉक रिस्पांस को निर्धारित करने के लिए Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग किया है, एक अच्छी तरह से संरक्षित सुरक्षात्मक तंत्र जो प्रोटीन को फिर से गुना करता है जो उच्च तापमान 8 जैसे तनावों के कारण गलतहोताहै। विशेष रूप से, हमने एक एकीकृत मल्टी-कॉपी ट्रांसजीन ले जाने वाले कीड़े के लिए पाइपलाइन लागू की, जहां गर्मी के झटके में जीन, एचएसपी-70 (C12C8.1) के प्रमोटर, ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)9चलाता है। हमने निश्चित जानवरों पर Worm_CP पाइपलाइन का भी उपयोग किया है जिसे फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है जो लिपिड बूंदों (एलडी) की कल्पना करता है, सी एलिगेंस10में मुख्य वसा भंडारण ऑर्गेनेल। हालांकि इस वर्कफ्लो में वर्मटूलबॉक्स द्वारा पेश किया गया थ्रूपुट नहीं है, लेकिन यह दृश्य प्रस्तुति और छवि-आधारित सी एलिगेंस प्रयोगों के विश्लेषण के लिए एक उपयोगकर्ता के अनुकूल और सरल विकल्प है।
Protocol
1. लिपिड बूंदों (BODIPY)10 के लिए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग करके वसा-सामग्री इमेजिंग के लिए कीड़े का निर्धारण
- मानक प्रक्रियाओं के अनुसार ब्लीचिंग द्वारा सी एलिगेंस की सिंक्रोनाइज्डआबादीतैयार करें । प्रति 1,000 एल1-स्टेज कीड़े को प्रति शर्त 9 सेमी निमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेट पर प्लेट करें।
नोट: हैंडलिंग करते समय कीड़े के नुकसान के कारण अंत में वास्तव में मात्रा निर्धारित की तुलना में अधिक कीड़े तैयार किए जाते हैं। - युवा वयस्क चरण में जानवरों की छवि के लिए (20 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 50 एच पोस्ट एल1 प्लेटिंग), प्रत्येक 9 सेमी प्लेट को एक शंकुस ट्यूब में एम 9 के 15 एमएल के साथ धोएं, 1 मिनट के लिए 252 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनिटेंट को हटा दें।
- धो दोहराएं और कीड़े के गोली पर M9 के 1 एमएल छोड़ दें।
- कम प्रतिधारण युक्तियों का उपयोग करके 2 एमएल कम प्रोटीन बाइंडिंग माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में कीड़े युक्त एम9 के 1 एमएल को स्थानांतरित करें।
- 1 मिनट के लिए एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में 252 x ग्राम पर नीचे स्पिन करें और सुपरनेट को हटा दें, सावधान रहें कि ट्यूब के नीचे कीड़ा गोली को न छूना।
- 4,4-डिफ्लोरो-1,3,5,7, 8-पेंटामेथिल-4-बोरा-3ए, 4a-डायज़ा-एस-इंडासेन (BODIPY) दाग का उपयोग कर वसा सामग्री की निगरानी के लिए10 (सामग्री की तालिका),3 मिनट 11 के लिए कीड़ा गोली में 60% आइसोप्रोपेनॉल के 0.5 एमएल जोड़कर या10मिनट के लिए बर्फ-ठंडे मेथनॉल के 2 एमएल जोड़कर कीड़े को ठीक करें। दोनों प्रक्रियाओं के लिए, ट्यूब हर 30 एस उलटा।
सावधानी: यदि मेथनॉल चुना फिक्सेशन रिएजेंट है, तो इस कदम को इसकी विषाक्तता के कारण धूम हुड में किया जाना चाहिए। - कृमि गोली को छूने के बिना जितना संभव हो उतना फिक्सटिव निकालें और एम 9 के 1 एमएल जोड़ें। कीड़े को ट्यूब के नीचे 3−5 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें।
- M9 के 1 एमएल के साथ फिर से धोएं, कीड़े को व्यवस्थित करें और सुपरनैंट को हटा दें, ट्यूब में लगभग 50 माइक्रोन छोड़ दें। क्लैंप का उपयोग करके ट्यूब को सुरक्षित करें।
- फ्रीज-तरल नाइट्रोजन में सुरक्षित रूप से बंद ट्यूब जल्दी से आगे बढ़नेवाला और फिर ~40 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म पानी स्नान में जल्दी से आगे बढ़नेवाला द्वारा कीड़े दरार।
- कदम 1.9 एक बार और दोहराएं।
- 1 μg/μL की अंतिम एकाग्रता पर M9 में पतला BODIPY के 0.5 एमएल जोड़ें और 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर एक रोटेटर पर जगह है।
- 1 घंटे के बाद, कीड़े को ट्यूब के नीचे 3−5 मिनट के लिए व्यवस्थित होने दें।
- सुपरनेट निकालें और M9 के 1 एमएल जोड़ें।
- कीड़े को नीचे बसने दें और सुपरनैंट को हटा दें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, 1 मिनट के लिए 252 x ग्राम पर स्पिन करना संभव है, क्योंकि यह आकृति विज्ञान को प्रभावित नहीं करता है। - M9 के 0.5 एमएल जोड़ें।
नोट: यदि फिक्सेटिव 60% आइसोप्रोपैनॉल है, तो कीड़े का उपयोग केवल 48 घंटे के भीतर किया जा सकता है। यदि फिक्सेटिव मेथनॉल है, तो कीड़े का उपयोग 24h के भीतर किया जाना चाहिए।
2. कीड़े माउंट करने के लिए एगर उठे पैड तैयार करना
नोट: एक agarose पैड तैयार करते समय महत्वपूर्ण कदम नियमित मोटाई का एक पैड प्राप्त करने के लिए है । अन्यथा, पैड के पार कीड़े विभिन्न फोकल विमानों में होंगे, जिससे देखने के व्यापक क्षेत्र की एक केंद्रित छवि प्राप्त करना मुश्किल हो जाएगा।
- एक बीकर या शंकुधारी फ्लास्क में 10 एमएल की निष्फल एच 2 ओ में0.2ग्राम एग्रिसडिंग जोड़कर 2% एग्राजेड पैड तैयार करें। 30 एस के लिए माइक्रोवेव में गर्मी जब तक agarose उबलते शुरू होता है ।
नोट: बुलबुले दिखाई देते ही ओवरहीट न करें और बंद न करें; अन्यथा यह अगर उठी की चिपचिपाहट को बढ़ाता है जिससे वांछित पैड मोटाई प्राप्त करना कठिन हो जाता है। - एक बार जब एगर उठे पिघल जाते हैं, तो 1000 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करके माइक्रोस्कोप ग्लास स्लाइड के केंद्र में पिघले हुए एगरेज़ की एक बूंद को अपने अंत में कटौती के साथ वितरित करें। तुरंत, लेकिन नाजुक, एक और ग्लास स्लाइड को बहुत एगर उठे ड्रॉप के करीब पकड़ें और इसे सबसे अच्छा माइक्रोस्कोपी परिणामों के लिए नियमित मोटाई के पैड बनाने के लिए एगर उठे पर छोड़ दें।
नोट: ऊंचाई से शीर्ष स्लाइड जारी करने से न केवल बुलबुले बनेंगे बल्कि एक असमान पैड होगा। वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक स्लाइड पर टेप की एक पतली परत के साथ पैड के साथ स्लाइड को फ्लैंक करने वाले दो ग्लास स्लाइड का उपयोग करना भी संभव है। - न्यूनतम 2−3 मिनट के बाद, शीर्ष स्लाइड को धीरे-धीरे हटा दें। शीर्ष स्लाइड के पक्ष का उपयोग करके, पैड को स्क्वायर आकार देने के लिए ट्रिम करें। उपयोग से पहले पैड को सूखने से रोकने के लिए, 5 मिनट के भीतर कीड़े को माउंट करें।
3. इमेजिंग के लिए फिक्स्ड कीड़े बढ़ते
- एक बुनसेन बर्नर(चित्रा 1A)की लौ में एक पतली ग्लास केशिका का विस्तार करके एक मुंह माइक्रोपिपेट बनाएं। लौ में विस्तार के बाद, केशिका को दो टुकड़ों(चित्रा 1B)में तोड़ दें। सबसे पर्याप्त चुनें, आमतौर पर सबसे लंबे समय तक, और परीक्षण करें कि क्या केशिका का अंत पानी को एस्पिरेट करने की कोशिश करके खुला है।
नोट: यदि तरल केशिका में नहीं आता है, तो यह बहुत पतला या अवरुद्ध है। धीरे कैंची की एक जोड़ी के साथ केशिका के अंत में कटौती, बहुत ज्यादा काटने से परहेज के रूप में कीड़े अगर छेद बहुत बड़ा है aspirated हो जाएगा । - 6 मिमी सिलिकॉन ट्यूब से जुड़े केशिका एडाप्टर(चित्रा 1C)में चरण 3.1 से ग्लास केशिका प्लग करें और 6 मिमी सिलिकॉन ट्यूब के दूसरे छोर को 0.2 माइक्रोन फिल्टर में प्लग करें, जो इसके दूसरे छोर(चित्रा 1C)पर 3 मिमी सिलिकॉन ट्यूब से जुड़ा हुआ है। तरल को एस्पिरेट करने के लिए 3 मिमी सिलिकॉन ट्यूब के मुक्त अंत में 1 एमएल फिल्टर टिप(चित्रा 1 सी)प्लग करें।
नोट: प्रयोगकर्ता की अधिकतम सुरक्षा सुनिश्चित करने के लिए प्रयोगकर्ता और केशिका के मुंह के बीच 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर जोड़ा जाता है। इसी तरह के घोल का इस्तेमाल माउस भ्रूण को संभालने के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले मुंह के माइक्रोपिपेट्स के लिए कियाजाताहै । फिल्टर बदलें (आमतौर पर हर कुछ महीने) अगर मुंह माइक्रोपिपेट अब तरल नहीं है । - विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत मुंह माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, निश्चित कीड़े(चित्रा 2)के कीड़ा गोली के आसपास जितना संभव हो उतना तरल निकालें।
नोट: मैन्युअल माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पिपेटिंग सुपरनेट का उपयोग 3.1 से 3.3 चरणों में मुंह के पिपेट के विकल्प के रूप में किया जा सकता है ताकि जितना संभव हो उतना सुपरनैट्ट निकाला जा सके। बढ़ते माध्यम के 6 माइक्रोन जोड़ें। हालांकि, हम पाते हैं कि यह विधि कुशलता से काम नहीं करती है क्योंकि पैड में अत्यधिक तरल एक विरल कृमि घनत्व बनाता है, जो इमेजिंग को अधिक समय लेने वाला बनाता है। चरण 3.6 फिर से शुरू करें। ट्यूब के नीचे देखें और सुनिश्चित करें कि पिपेट कीड़े को नहीं जाता है। - जल्दी से ट्यूब के नीचे बढ़ते माध्यम(सामग्री की तालिका) के10 माइक्रोन जोड़ें।
- प्लास्टिक पिपेट टिप के किनारों से चिपके रहने से कीड़े को रोकने के लिए डिटर्जेंट (0.01% ट्राइटन) के निशान के साथ पीबीएस में 10 माइक्रोन टिप कुल्लाएं। कैंची की एक जोड़ी के साथ टिप के बहुत अंत काटें।
- कदम 2.3 में तैयार एगर उठे पैड पर कीड़े युक्त बढ़ते माध्यम के 8 माइक्रोन स्थानांतरित करें। माइक्रोस्कोप के नीचे, कीड़े के ओवरलैप से बचने के लिए, धीरे-धीरे स्लाइड को हिलाएं।
- 18 मिमी x 18 मिमी कवरलिप(चित्रा 3)के साथ एग्राजिंग पैड पर बढ़ते माध्यम की बूंद को कवर करें।
नोट: छोटे कवर्लिप्स को पसंद किया जाता है क्योंकि वे कीड़े पर कम दबाव डालते हैं। चिमटी की एक जोड़ी के साथ कवरलिप पकड़ो और चिमटी के साथ धीरे से कवरस्लिप जमा करने से पहले, agarose पैड के खिलाफ कवरस्लिप के एक किनारे लागू होते हैं ।
4. इमेजिंग के लिए बढ़ते लाइव कीड़े
नोट: लाइव कीड़े की छवि के लिए, वे पैड पर स्थिर किया जाना है । इसे प्राप्त करने का एक तरीका निकोटीन रिसेप्टर एगोनिस्ट के साथ उन्हें लकवा मारना है: लेविमिसोल(सामग्री की तालिका)।
- 3 एमएल लेविसोल का पिपेट 3−4 माइक्रोन एम 9 में चरण 2.3 में बनाए गए एगर उठे पैड पर भंग हो गया।
नोट: पर्याप्त तरल मात्रा होनी चाहिए कि कीड़े एक दूसरे के शीर्ष पर नहीं हैं, लेकिन बहुत अधिक तरल नहीं हैं कि कीड़े पैड पर बहुत विरल हैं। अनुभवी कीड़ा बीनने वाले लेवामिसोल के 3 माइक्रोन का उपयोग कर सकते हैं। कम अनुभवी बीनने वालों को लेविमिसोल की एक बड़ी मात्रा जोड़ने की आवश्यकता हो सकती है, ताकि लेविमिसोल पूरी तरह से वाष्पित न हो। - लेविमिसोल की बूंद में प्रति स्थिति 30−50 कीड़े चुनें।
- 18 मिमी x 18 मिमी कवरलिप के साथ एग्राजिंग पैड पर लेविमिसोल की बूंद को कवर करें। 1 घंटे के भीतर छवि कीड़े, लकवा मारने वाले एजेंट के रूप में अंततः कीड़े की मौत हो जाएगी।
5. एक एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के साथ इमेजिंग स्लाइड
- एक समान मोटाई के एक agarose पैड के साथ, एक बार में स्लाइड पर सभी कीड़े छवि एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के 20x उद्देश्य के साथ उदाहरण के लिए एक 6 x 6 या 7 x 7 बड़ी छवि का उपयोग कर । यदि पैड की मोटाई भी नहीं है, तो एक ही स्लाइड के कई छोटे 3 x 3 या 4 x 4 छवियों को प्राप्त करें।
- सभी स्थितियों के लिए फ्लोरेसेंस तीव्रता और एक्सपोजर समय के लिए एक ही सेटिंग्स का उपयोग करें। प्रत्येक सेटिंग को उस स्लाइड से मेल खाने के लिए समायोजित करें जिसमें सबसे उज्ज्वल तीव्रता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि कोई पिक्सेल संतृप्ति नहीं है। छवि अधिग्रहण पर विशिष्ट निर्देशों के लिए, माइक्रोस्कोप निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
6. कीड़ा-संरेखित फिजी पाइपलाइन का उपयोग करके गठबंधन एकल कीड़े की असेंबल छवियां बनाना
- ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर पैकेज फिजी13/इमेजजे14 को https://imagej.net/Fiji से इंस्टॉल करें । यदि फिजी की पूर्व स्थापना उपलब्ध है, तो सुनिश्चित करें कि इसे 1.52 ए संस्करण या बाद में अपडेट किया गया है, क्योंकि मैक्रो (जैसे, टेबल फ़ंक्शन) में उपयोग किए जाने वाले कुछ कार्यों की आवश्यकता है। गिथुब से कृमि-संरेखित मैक्रो डाउनलोड करें: https://github.com/hannekeo/Worm-align।
- फिजी खोलें और वर्म-संरेखित मैक्रो चलाएं। प्लगइन्स | पर क्लिक करके कृमि-संरेखित निष्पादित करें मैक्रोन | फिजी मुख्य मेनू बार(चित्रा S1)में भागो। अब कंप्यूटर पर कीड़ा-align.ijm स्क्रिप्ट का पता लगाएं।
- मैक्रो छवियों के स्थान के लिए पूछ कर शुरू करते हैं। पाइपलाइन सिंगल-चैनल और मल्टी-चैनल फ्लोरेसेंस इमेजेज(चित्रा S2)दोनों पर काम करेगी । एक इनपुट फ़ोल्डर चुनें और मैक्रो स्वचालित रूप से एक आउटपुट फ़ोल्डर उत्पन्न करेगा जहां सभी परिणाम सेव(चित्रा S3)होंगे।
नोट: यह महत्वपूर्ण है कि चयनित फ़ोल्डर में केवल छवि फ़ाइलें होती हैं क्योंकि अन्य फ़ाइल प्रारूपों की उपस्थिति मैक्रो को क्रैश करने का कारण बनेगी। आदर्श रूप से, केवल एक साथ समूह छवियों को एक ही माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के साथ कैप्चर किया गया था। वर्म-रिलाइन एनडी2, सीजेआई, टिफ, आरजीबी, जेपीजी और पीएनजी सहित कई अलग-अलग फाइल प्रारूपों को स्वीकार करेगा। आउटपुट फ़ोल्डर का नाम इनपुट फ़ोल्डर के समान होगा, जिसमें '_output' को पोस्टफिक्स के रूप में जोड़ा जाएगा, यानी यदि इनपुट फ़ोल्डर 'छवियां' है, तो आउटपुट 'images_output' में पाया जाएगा। आउटपुट फोल्डर में चार सबफोल्डर होंगे, जिसमें डेटा सेव हो जाएगा। - मैक्रो को इनपुट फ़ोल्डर में पहली छवि खोलने के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें और असेंबल उत्पन्न करने के लिए एक सेटिंग निकालने के लिए इसे प्रतिनिधि छवि के रूप में उपयोग करें।
नोट: वर्म-संरेखित स्वचालित रूप से इनपुट फ़ोल्डर में पहली छवि का चयन करेगा जो फ़ोल्डर में अन्य सभी छवियों पर लागू की जाएगी सेटिंग्स उत्पन्न करेगी। यदि किसी अन्य छवि को डेटासेट का अधिक प्रतिनिधि माना जाता है, तो यह सुनिश्चित करें कि इस छवि को इनपुट फ़ोल्डर में छवि की एक प्रति सहेजकर चुना जाता है, नाम बदलते हुए ताकि अब सूची के शीर्ष पर सूचीबद्ध हो (उदाहरण के लिए, '0_RepresentativeImage')। - सीधी-रेखा ड्राइंग टूल के साथ, एक कीड़े(चित्रा S4)की चौड़ाई में एक लाइन खींचें और एकल कीड़े के लिए फसली क्षेत्रों की ऊंचाई निर्धारित करने के लिए इस लाइन की लंबाई का उपयोग करें। प्रत्येक चैनल के लिए, नाम, लुकअप टेबल (LUT), तीव्रता सेटिंग्स (बी एंड सी) निर्दिष्ट करें और क्या इसे असेंबल(चित्रा S4)में शामिल किया जाना चाहिए।
नोट: इन मापदंडों को रिकॉर्ड किया जाता है और आउटपुट फ़ोल्डर के सेलप्रोफिलर सबफोल्डर में स्थित सेटिंग फ़ाइल, सेटिंग्स.csvमें सहेजा जाता है। - एक बार सभी सेटिंग्स कैप्चर हो जाने के बाद, उपयोगकर्ता को दिखाया जाता है कि लागू की गई सेटिंग्स(चित्र S5)के आवेदन के बाद छवियां कैसी दिखेंगी। यदि सेटिंग्स पर्याप्त हैं तो शीर्ष बॉक्स पर टिक करें। असेंबल पीढ़ी के लिए विकल्पों का चयन करें (यदि आवश्यक न हो तो टिकों को हटा दें): 1. प्रत्येक एकल छवि के लिए चयनित कीड़े का एक असेंबल उत्पन्न करें, या 2. एक संयुक्त असेंबल उत्पन्न करें जिसमें इनपुट फ़ोल्डर में सभी छवियों पर चुने गए सभी कीड़े को एक ही असेंबल में जोड़ा जाएगा। बाकी मैक्रो को अंजाम देने के लिए ओके पर क्लिक करें।
नोट: यदि 'ओके' पर क्लिक करने से पहले शीर्ष बॉक्स टिक नहीं जाता है तो मैक्रो सेटअप को फिर से चलाना होगा, इसलिए छवि सेटिंग्स को अनुकूलित किया जा सकता है। - कृमि-संरेखित पाइपलाइन अब इनपुट फ़ोल्डर में सभी छवियों को खोलने के लिए आय। प्रत्येक छवि के लिए, 'खंडित लाइन' उपकरण (फिजी मुख्य मेनू बार पर) का उपयोग करके असेंबल और/या मात्रा(चित्रा 4 और चित्रा S6)में शामिल किए जाने वाले सभी कीड़ों की देशांतर धुरी पर लाइनें बनाएं। कीड़ा के उचित संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए, सिर से पूंछ के अंत (या इसके विपरीत) और कीड़े की पूरी लंबाई के साथ लगातार लाइनें बनाएं (चित्रा 4Bमें "अच्छे" और "खराब" लाइन ड्राइंग के उदाहरण देखें)।
- सीटीआरएल+ टी वर्म-एलाइन पर क्लिक करके प्रत्येक पंक्ति को जोड़ें, एकल चयनित कीड़े की फसली छवियों को उत्पन्न करने के लिए कीड़ा चौड़ाई पैरामीटर (चरण 6.4 में सेट) के संयोजन में आरओआई प्रबंधक में जोड़ी गई लाइनों का उपयोग करता है। लाइन आरओआई का संग्रह 'डेटा' सबफोल्डर में सहेजा जाता है। इस फ़ोल्डर में रेखाओं को दिखाने वाली मूल छवि की एक प्रति भी शामिल है, साथ ही कीड़ा की संख्या भी है। लाइनें Glasbey_on_dark लुकअप टेबल के साथ रंग-कोडित होती हैं। आउटपुट फ़ोल्डर के single_worms सबफोल्डर में सीधे कीड़े की छवियां सहेजी जाती हैं। इसके अलावा, यदि इस प्रोटोकॉल के चरण 6.6 में चुना जाता है, तो वर्म-रिलॉर्ड प्रति अवलोकन छवि के अनुसार चयनित सभी कीड़े के असेंबल का उत्पादन करता है और /या इनपुट फ़ोल्डर में सभी अवलोकन छवियों के लिए (चित्रा 4C और चित्रा S7देखें)। ये असेंबल आउटपुट फ़ोल्डर के 'गठबंधन' उपफोल्डर में पाए जा सकते हैं।
7. एक स्वचालित सेलप्रोफाइलर पाइपलाइन में कृमि-संरेखित से उत्पादन का उपयोग करके एकल-कृमि फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण करना
- वर्म-रिलाइन आउटपुट के डाउनस्ट्रीम डेटा प्रोसेसिंग और विश्लेषण के लिए, ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर पैकेज 'सेलप्रोफिलर15, 16https://cellprofiler.org/ से डाउनलोड करें औरइंस्टॉल करें। हर पल अपडेट रहने के लिए डाउनलोड करें Hindi News App Web Title: गिटहब से Worm_CP.सीपीप्रोज पाइप लाइन: https://github.com/hannekeo/Worm-align
नोट: यहां वर्णित उदाहरण पाइपलाइन का निर्माण सेलप्रोफिलर2.2.0 का उपयोग करके किया गया था और यह सेलप्रोफिलर के बाद के संस्करणों में नहीं चल सकता है। - Worms_CP.सीपीप्रोज पाइपलाइन शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी अपेक्षित आउटपुट छवियां कृमि-संरेखित आउटपुट फ़ोल्डर के सेलप्रोफिलर सबफोल्डर में मौजूद हैं: मूल छवि की एक प्रसंस्कृत प्रति (नाम: Original_), कृमि आबादी का एक बाइनरी इमेज मास्क (नाम: Mask_), चयनित कीड़े (नाम: Lines_) पर खींची गई लाइनों का एक लाइन मुखौटा, और मूल छवि में मौजूद चैनलों में से प्रत्येक का प्रतिनिधित्व करने वाली एक छवि (चैनल संख्या द्वारा नामित)।
- एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवियों इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और बस सेलप्रोफिलर आउटपुट फ़ोल्डर को खिड़की में खींचें जो यहां ड्रॉप फाइल और फ़ोल्डरकहता है। यदि पिछले विश्लेषण से छवियों की एक सूची मौजूद है, तो सबसे पहले विंडो में सही क्लिक करके और स्पष्ट फ़ाइल सूचीका चयन करके इन्हें हटा दें। इमेज सूची से 'सेटिंग्स.csv' फ़ाइल को बाहर करने के लिए, फ़िल्टर सेटिंग्स(चित्र एस8)के लिए 'एक्सटेंशन इज टिफ, टिफ, ओम.tif या ओम.tiff' के साथ 'केवल छवियां' या 'कस्टम' चुनें।
- मेटाडेटा इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें। दूसरी निष्कर्षण विधि में, पीले फ़ोल्डर पर क्लिक करें, और वर्मअलिगन आउटपुट फ़ोल्डर(चित्रा S9)में सेलप्रोफिलर सबफोल्डर का पता लगाएं। सेटिंग्स का चयन करें.csv फ़ाइल और छवियों (चैनल मेटाडेटा) में उन लोगों के लिए सीएसवी फ़ाइलों में मेटाडेटा मिलान द्वारा सेलप्रोफिलर आउटपुट के लिए फ़ाइल में सेटिंग्स लिंक ।
- नाम और टाइप इनपुट मॉड्यूल पर क्लिक करें और मूल छवि के प्रत्येक चैनल के लिए एक नई छवि डालें।
नोट: पहले से ही उदाहरण पाइपलाइन में मौजूद कीड़ा मुखौटा, दो रंग छवियों, लाइन मुखौटा और मूल छवि, और तीन ग्रे पैमाने छवियों (हरे और लाल चैनल) हैं । यदि मूल छवियों में उदाहरण छवियों की तुलना में अधिक या कम चैनल हैं तो इस मॉड्यूल में सूची को समायोजित करने की आवश्यकता है। - चेक करें कि हर कॉलम लेबल/मास्क/कीड़े में छवियों का नाम सही है या नहीं ।
नोट: एक पंक्ति पर छवियों के नाम सभी का विश्लेषण करने के लिए एक ही प्रारंभिक छवि के अनुरूप होना चाहिए । यदि छवि विश्लेषण प्रक्रिया के दौरान कोई गलती की जाती है, तो कुछ आउटपुट छवियां गायब हो जाएंगी और तीन कॉलम लेबल/मास्क/कीड़े के तहत नाम प्रत्येक पंक्ति के लिए अब एक ही प्रारंभिक छवि के अनुरूप नहीं होंगे । अगर यही स्थिति है तो पता लगाएं कि गलती कहां है। - सेलप्रोफिलर से आउटपुट को बचाने के लिए फ़ोल्डर का चयन करने के लिए प्रेस व्यू आउटपुट सेटिंग।
- स्टार्ट टेस्ट मोडपर क्लिक करें । एक बार टेस्ट मोड में, रन (जो पाइपलाइन में सभी सक्रिय मॉड्यूल के माध्यम से चलेगा), या चरण (जो एक समय में पाइपलाइन एक मॉड्यूल के माध्यम से चलेगा) पर क्लिक करके, डेटासेट में पहली छवि पर उन्हें लागू करके पाइपलाइन की सेटिंग्स को डबल-चेक करें।
नोट: जबकि परीक्षण मोड में, निकाले गए मापों का निर्यात नहीं किया जाएगा, भले ही एक निर्यातटोस्प्रेडशीट मॉड्यूल पाइपलाइन में मौजूद (और सक्रिय) हो। - एक बार पाइपलाइन जिस तरह से यह चाहिए प्रदर्शन करता है, एग्जिट टेस्ट मोड पर क्लिक करें और फिर प्रेस छवियों का विश्लेषण । जैसा कि वर्तमान में कॉन्फ़िगर किया गया है, Worms_CP (1) चयनित कीड़े को एकल करने के लिए किसी न किसी कृमि मास्क और Lines_ छवि(चित्रा S10A)को खंडित करने के लिए Mask_ छवि का उपयोग करेगा और एकल कृमि मास्क(चित्रा S10C),(2) उन कीड़े की पहचान और मास्क में इनपुट छवियों में मौजूद सभी चैनलों की फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापेगा। पाइपलाइन पृष्ठभूमि की तीव्रता(चित्रा S10B)को भी माप सकती है और तदनुसार सभी छवियों को सही कर सकती है (मापी गई पैरामीटर के नाम पर शब्द सीमा द्वारा इंगित की गई है। उदाहरण के लिए: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) चयनित कीड़े के आकार को मापते हैं, और (4) सभी मापा मापदंडों(चित्रा S10D)का निर्यात करते हैं।
- Worm_CP आउटपुट को खोलें जिसमें दो सीएसवी फाइलें, कीड़े.csv और लाइनें शामिल हैं.csv जो चयनित आउटपुट फ़ोल्डर (चित्रा S11देखें) में सहेजे जाते हैं। इन फाइलों को पोस्ट-प्रोसेसिंग और रिपोर्टिंग के लिए एक्सेल या आर (स्टूडियो) में खोला जा सकता है। यदि अतिरिक्त आउटपुट की आवश्यकता है, उदाहरण के लिए प्रति छवि डेटा, इसे पाइपलाइन में एक्सपोर्टटोस्प्रेडशीट मॉड्यूल में चुना जा सकता है।
Representative Results
इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि के अनुसार Culturing और इमेजिंग सी एलिगेंस कीड़ा आबादी की बड़ी अवलोकन छवियों का उत्पादन करता है। इन छवियों से कीड़े के दृश्य निरीक्षण और वर्गीकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए हमने कीड़ा-संरेखण विकसित किया है। वर्म-रिलाइन एक सरल और उपयोगकर्ता के अनुकूल फिजी स्क्रिप्ट है जिसका उपयोग सीधे और गठबंधन किए गए कीड़े के असेंबल बनाने के लिए किया जा सकता है। कीड़े की देशांतर धुरी के साथ एक लाइन ड्राइंग द्वारा अवलोकन छवियों से का चयन कर रहे हैं। प्रत्येक चयनित कीड़ा एक नंबर सौंपा है, फसली और सीधा, और एक असेंबल करने के लिए जोड़ा । असेंबल प्रति छवि उत्पन्न किया जा सकता है या मूल इनपुट फ़ोल्डर से सभी छवियों के संयोजन।
जैसा कि अपेक्षित था, पाइपलाइन का उत्पादन काफी हद तक छवियों के शीर्ष पर खींची गई रेखाओं की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। इस बिंदु को समझाने के लिए, चित्रा 4 कई लाइन उदाहरण दिखाता है, और कीड़ा-संरेखित से उनका उत्पादन। सिर से पूंछ की नोक तक एक पूरी रेखा एक ठीक से गठबंधन कीड़ा ("अच्छा" लेबल) पैदा करती है। चित्रा 4 यह भी दिखाता है कि कृमि-संरेखण के निष्पादन के दौरान अशुद्धियों का पता लगाने से संरेखण के उत्पादन को कैसे प्रभावित किया जाता है। चित्रा 4Cमें शामिल एनोटेटेड असेंबल से, निम्नलिखित त्रुटियों से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, क्योंकि वे कीड़े के उचित संरेखण में बाधा डालते हैं:
- सिर से पूंछ तक कीड़े का असंगत अनुरेखण ("पूंछ से सिर तक" लेबल)। इसके परिणामस्वरूप संरेखण में कीड़े को विभिन्न दिशाओं (यानी पूंछ से सिर बनाम सिर से पूंछ) में केंद्रित किया जा रहा है।
- अपूर्ण ट्रेसिंग (लेबल "अधूरा")। यह केवल कीड़े का हिस्सा है कि असेंबल के लिए फसली होने का पता लगाया गया था में परिणाम है ।
- एक ही ट्रेस में कई कीड़े सहित (लेबल "दो सिर के साथ कीड़ा") । इसके परिणामस्वरूप कीड़े प्लस (महत्वपूर्ण वर्ग) में उनके पड़ोसियों को असेंबल के एक ही पैनल में डाला जा रहा है।
- छवि में यादृच्छिक लाइनें जोड़ना (लेबल "यादृच्छिक") । इसके परिणामस्वरूप असेंबल में यादृच्छिक पैनलों का सम्मिलन होता है।
असेंबल के निर्माण के लिए यह एक मुद्दा नहीं है यदि दो व्यक्तिगत लाइनें एक तरफा (लेबल "इंटरसेक्टिंग") या कृमि के दोनों छोर पर शामिल हो जाती हैं (लेबल "शामिल हो गए"), जब तक प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत कीड़ा की पूरी लंबाई का निशान लगाती है: कीड़ा-संरेखित स्क्रिप्ट व्यक्तिगत रूप से और क्रमिक रूप से प्रत्येक लाइन आरओआई, फसलों और सीधा का चयन करता है, ताकि अंतिम असेंबल में प्रत्येक पैनल एक ही लाइन का प्रतिनिधित्व करेगा। हालांकि, कीड़े को काटने के मामले में, हालांकि पूर्ण लंबाई सीधे कीड़े असेंबलिंग 1 और कीड़े के लिए दिखाई देते हैं असेंबल (चित्रा 5ए-बीदेखें), यह स्पष्ट रूप से ध्यान देने योग्य है कि ये कीड़े मूल अवलोकन छवि में एक दूसरे को पार करते हैं। इसलिए, यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि 'डेटा' सबफोल्डर(चित्रा 5A)में पाए जाने वाले ओवरले छवि के साथ-साथ असेंबल(चित्रा 5 बी)में व्यक्तिगत कीड़े के पैनलों से एक-दूसरे को काटने वाली रेखाओं की दृश्य पहचान संभव है। इसके अलावा, कीड़े/लाइनों के किसी भी ओवरलैप की पहचान की जा सकती है गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) टेबल से प्रत्येक प्रसंस्कृत छवि के लिए उत्पन्न कीड़ा-संरेखित करके, और डेटा सबफोल्डर में सहेजा जाता है । यह तालिका छवि में खींची गई प्रत्येक लाइन आरओआई के लिए तीन पैरामीटर रिकॉर्ड करती है (चित्रा 5Cदेखें): इनमें से, लंबाई लाइन आरओआई की लंबाई को इंगित करती है, जो कीड़े के आकार का एक अच्छा संकेतक है; और कीड़ा संख्या उस क्रम को इंगित करती है जिसमें अवलोकन छवि पर रेखाएं खींची गई थीं। अंत में, अंतिम कॉलम इंगित करता है कि क्या प्रश्न में कीड़ा/रेखा और छवि में चयनित अन्य कीड़े/लाइनों में से किसी के बीच ओवरलैप है । ओवरलैप के मामले में इस कॉलम में संख्या कृमि संख्या कॉलम में सूचीबद्ध एक से अलग होगी। ओवरले छवि के संयोजन में, क्यूसी तालिका शोधकर्ता को सीखा निर्णय लेने के लिए सहायता करनी चाहिए जिस पर कीड़े असेंबल और/या मात्राकरण से बाहर रखा जाना चाहिए ।
कृमि-संरेखण के उत्पादन का उपयोग एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद के मात्राकरण के लिए किया जा सकता है। फिजी में, लाइन आरओआई का उपयोग मूल छवि डेटा में फ्लोरेसेंस तीव्रता को मापने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए सरल फिजी स्क्रिप्ट 'कृमि-quant.ijm' को निष्पादित करके, जो गिथुब पर कृमि-संरेखित भंडार में भी पाया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, वर्म-संरेखित उत्पादन को तीसरे पक्ष के छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में आयात किया जा सकता है। हम इसे दो डेटासेट के वर्म-संरेखित उत्पादन को Worm_CP में आयात करके प्रदर्शित करते हैं, जो हमने सेलप्रोफिलर में उत्पन्न एक पाइपलाइन है। Worm_CP कीड़ा-संरेखित आउटपुट फ़ोल्डर के 'सेलप्रोफिलर' सबफोल्डर में फ़ाइलों का उपयोग करता है ताकि कृमि-संरेखित मैक्रो के निष्पादन के दौरान चयनित उन व्यक्तिगत कीड़े के ठीक-ट्यून सेगमेंटेशन मास्क हो सके। विशेष रूप से, यह बाइनरी मास्क (नाम: Mask_) में देखे गए कीड़े आबादी से चयनित कीड़े को अलग करने के लिए लाइन मास्क (नाम: Lines_) का उपयोग करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि लाइनें जो अवलोकन छवि(चित्रा 5A)पर छेड़छाड़ करती हैं, हालांकि असेंबल की पीढ़ी के लिए समस्या नहीं है, Worm_CP पाइपलाइन के लिए समस्याग्रस्त हैं। यह मामला क्यों है, चित्रा 5 डी-ईमें सचित्र है । Worm_CP लाइन मास्क(चित्रा 5D)का उपयोग करता है, न कि व्यक्तिगत कीड़े की पहचान में सहायता करने के लिए व्यक्तिगत आरओआई। कृमि-संरेखण के निष्पादन के दौरान दूसरी ओर खींची गई इंटरेक्टिंग लाइन पहली पंक्ति पर आरोपित है और इसलिए इस लाइन के साथ तीव्रता आरओआई2 की होगी जिसमें थोड़ा भी शामिल है जहां लाइन 1 और 2 ओवरलैप शामिल है। नतीजतन, सेलप्रोफिलर लाइन2 को एक ऑब्जेक्ट के रूप में सेगमेंट करेगा, लेकिन लाइन1 दो वस्तुओं के रूप में है जो अलग होते हैं जहां यह line2 के साथ छेड़छाड़ करता है। इसका मतलब यह है कि सेलप्रोफिलर कीड़ा 'intersecting1'(चित्रा 5E)के लिए दो (आधा) कृमि मास्क का उत्पादन करेगा। अंतिम विश्लेषण (यदि आवश्यक हो) से इन घटनाओं को बाहर करने का सबसे आसान तरीका क्यूसी टेबल (डेटा सबफोल्डर) से कीड़े को काटने की की कृमि संख्या की पहचान करना और सेलप्रोफाइलर आउटपुट फ़ाइलों से इन कीड़े के लिए माप को हटाना है। कृपया ध्यान दें कि कीड़े को फिजी और सेलप्रोफिलर में एक ही नंबर आवंटित नहीं किया जाएगा: सेलप्रोफिलर आउटपुट में फिजी कीड़ा संख्या की पहचान करने के लिए 'लाइन.csv' आउटपुट फ़ाइल में Intensity_Max_Intensity मूल्यों को देखें। किसी भी Intensity_Max_Intensity मूल्य है कि ' लाइनों में प्रकट होता है.csv ' मेज प्रति छवि एक से अधिक बार है कि लाइन रॉय का एक संकेत है जिसके परिणामस्वरूप एक खंडित कीड़ा मुखौटा है ।
एक बार व्यक्तिगत कृमि मास्क खंडित हो जाते हैं, Worm_CP सभी रिकॉर्ड किए गए चैनलों के लिए चयनित कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता को माप सकते हैं। सभी माप मूल (कच्चे) छवि डेटा से लिए जाते हैं, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि सेलप्रोफिलर स्वचालित रूप से 0-1 के पैमाने पर पिक्सेल तीव्रता को फिर से बनाता है। यह छवि के लिए अधिकतम संभव पिक्सेल तीव्रता द्वारा कच्चे पिक्सेल तीव्रता मूल्य को विभाजित करके हासिल किया जाता है। 8-बिट छवियों के मामले में यह मूल्य 255 है, और 16-बिट छवियों के मामले में यह 65535 है। इसलिए सेलप्रोफाइलर तीव्रता मूल्यों को कच्चे छवि डेटा के बराबर मूल्यों को हासिल करने के लिए अधिकतम संभव तीव्रता मूल्य से गुणा करने की आवश्यकता होती है। Worm_CP आउटपुट में दो सीएसवी फाइलें, 'कीड़े.csv' और 'लाइन्स.csv' शामिल हैं जो चयनित आउटपुट फ़ोल्डर में सहेजे जाते हैं। इन फाइलों का निरीक्षण करते समय, यह स्पष्ट है कि सेलप्रोफिलर फ्लोरेसेंस तीव्रता से संबंधित बड़ी संख्या में मापदंडों को रिकॉर्ड करता है। इनमें से, Intensity_IntegratedIntensity प्रति कीड़ा कुल फ्लोरेसेंस से मेल खाती है (यानी, सभी पिक्सेल के भीतर फ्लोरेसेंस तीव्रता का योग जो एक व्यक्तिगत कीड़े के मुखौटे को कॉन्स्ट्यू करता है)। पैरामीटर Intensity_MeanIntensity एक व्यक्तिगत कीड़े के भीतर औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता को संदर्भित करता है (यानी, एक व्यक्तिगत कीड़े के भीतर निहित सभी पिक्सेल के लिए प्रति पिक्सेल औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता)। कृमि मास्क को खंडित करने में (छोटी) त्रुटियों की सामयिक घटना के कारण यह सिफारिश की जाती है कि दो स्थितियों के बीच व्यक्तिगत कीड़े के फ्लोरेसेंस माप की तुलना करते समय मीनइंटेंसिटी माप का उपयोग किया जाता है। यदि मात्रात्मक मापन से पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करना चाहते हैं, तो MeanIntensity_Threshold नाम के मापनों का उपयोग करें।
हमने Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग निश्चित जानवरों से फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया है जिन्हें फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल किया गया है जो लिपिड बूंदों (एलडीएस)(चित्रा 6)में शामिल हैं। कीड़ा-संरेखित/Worm_CP पाइपलाइन से फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन को मान्य करने के लिए, हमने फिजी/इमेजजे में या तो कीड़े-संरेखित/Worm_CP पाइपलाइन या मैनुअल मात्राकरण द्वारा बॉडीपी डेटासेट से कीड़े के एक ही सेट में फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित की । फिजी/इमेजजे में प्रत्येक कीड़ा के साथ-साथ हर छवि में एक अंधेरे पृष्ठभूमि क्षेत्र का चक्कर लगाकर मैनुअल मात्राकरण किया गया था। फ्लोरेसेंस तीव्रता को आरओआई प्रबंधक में मापा गया था और छवि पृष्ठभूमि के लिए मापा गया मूल्य प्रत्येक कीड़े के कीड़े फ्लोरेसेंस माप से घटाया गया था, जैसा कि17वर्णित है। हमने जंगली प्रकार (डब्ल्यूटीई) एन 2 कीड़े की तुलना डीबीएल-1 (nk3) म्यूटेंट से की, जो लिपिड बूंद सामग्री18को कम करते हैं। जैसा कि अपेक्षित था, दोनों विधियों(चित्रा 6ए, बी)के साथ डब्ल्यूटीई और डीबीएल-1 (एनके3) कीड़े के बीच हरे रंग की फ्लोरेसेंस तीव्रता में काफी कमी आई है। गठबंधन कीड़े के उदाहरण चित्र 6सी, डीमें देखे जा सकते हैं। लिपिड ड्रॉपलेट सामग्री में 17% (पी-वैल्यू एंड एलटी;0.0001, अप्रूव्ड टी-टेस्ट) की कमी आई है, जो मैनुअल क्वांटिफिकेशन का उपयोग करके डब्ल्यूटीई और डीबीएल-1 (nk3) के बीच है, और Worm_CP पाइपलाइन का उपयोग करके 14% (पी-वैल्यू = 0.0051 अकीदतित टी-टेस्ट) है। दोनों मात्राकरण विधियों के साथ डीबीएल-1 (nk3) में यहां देखी गई लिपिड बूंद सामग्री में कमी साहित्य18के अनुसार है। इससे पता चलता है कि सेलप्रोफिलर पाइपलाइन Worm_CP के साथ अधिग्रहीत फ्लोरेसेंस छवियों का मात्राकरण मैनुअल मात्राकरण के बराबर है।
हमने लाइव शॉक एक्सपेरि़ेंट जीन एचएसपी-70 (C12C8.1)9के नियंत्रण में GFP व्यक्त करने वाले लाइव कीड़े में हीट शॉक रिस्पांस की मात्रा निर्धारित करने के लिए Worm_CP का भी इस्तेमाल किया है। चित्रा 7 लाइव सी elegans गर्मी-उत्तरदायी hsp-70 (C12C8.1)पी ले जाने के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता है:: GFP रिपोर्टर । गर्मी के तनाव के अभाव में, कीड़े GFP अभिव्यक्ति(चित्रा 7ए, बी)को प्रेरित नहीं करते हैं। हालांकि, जब कीड़े 34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट की छोटी गर्मी-सदमे से अवगत होते हैं, तो वे जीएफपी अभिव्यक्ति(चित्र 7सी, डी)को प्रेरित करते हैं। जीएफपी अभिव्यक्ति के स्तर के साथ और गर्मी के बिना सदमे-सदमे चित्रा 7Eमें मात्रा निर्धारित कर रहे हैं ।
जैसा कि यह खड़ा है, Worm_CP एक बहुत ही बुनियादी पाइपलाइन है । हालांकि, यह दृष्टिकोण व्यक्तिगत कृमि मास्क का अधिक सटीक विभाजन सक्षम करता है, जो छवि से चुने गए उन कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के अधिक सटीक मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। इस कारण से, हम फिजी में किसी न किसी मात्रा पर इस दृष्टिकोण को पसंद करते हैं, सिर्फ लाइन मास्क का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, सेलप्रोफिलर लाभ प्रदान करता है कि अतिरिक्त विश्लेषण मॉड्यूल को आसानी से पाइपलाइन में शामिल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, लिपिड बूंद सामग्री को देखने वाले डेटासेट के लिए, Worm_CP पाइपलाइन में अतिरिक्त मॉड्यूल डालने से ओवरव्यू छवियों में चयनित उन कीड़े में लिपिड ड्रॉपलेट संख्या और व्यक्तिगत बूंदों की फ्लोरेसेंस तीव्रता की जांच की जा सकती है।
चित्रा 1: एक मुंह माइक्रोपिपेट पैदाकरना। एक ग्लास केशिका को बुनसेन बर्नर(ए)की लौ में बढ़ाया जाता है, जब तक कि यह पतली लम्बी छोर(बी)प्रदान नहीं करता है। विस्तारित ग्लास केशिका को तब मुंह माइक्रोपिपेट के एडाप्टर टुकड़े में प्लग किया जाता है। (ग)एक मुंह माइक्रोपिपेट की योजनाबद्ध । मुंह माइक्रोपिपेट एक ग्लास केशिका एक एडाप्टर में खामियों को दूर के साथ इकट्ठा किया गया था । एक 6 मिमी सिलिकॉन ट्यूब एडाप्टर को 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर से जोड़ता है, जो सुरक्षा के लिए उपयोग किया जाता है। फ़िल्टर का दूसरा छोर 1mL फिल्टर टिप के साथ समाप्त होने वाली 3 मिमी सिलिकॉन ट्यूब से जुड़ा हुआ है। प्रयोगकर्ता फ़िल्टर टिप के माध्यम से आकांक्षी कर सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मुंह माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, कृमि गोली के आसपास के तरल की आकांक्षा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: agarose पैड पर बिछाने कीड़े पर कवरलिप जोड़ना कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 4: ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर फैट-7pको ले जाने वाले जीवित जानवरों से प्राप्त फ्लोरेसेंस छवियों पर कृमि-संरेखित का उपयोग करके कृमि के सीधे के उदाहरण: आंत में जीएफपी और फरीनेक्स में एक लालसह-इंजेक्शन मार्कर (मायो-2पी::tdtomato)। (क)वयस्कता के तीसरे दिन जीवित कीड़े के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत एक समग्र छवि का स्क्रीनशॉट । छवि को Worm_align के साथ खोला गया था और कीड़े-संरेखित का उपयोग करके कीड़े की देशांतर धुरी के साथ लाइनें खींची गई थीं। (ख)में के रूप में एक ही छवि का स्क्रीनशॉट(ए),उदाहरण के साथ कीड़े की धुरी के साथ लाइनों की अच्छी और बुरी ड्राइंग की टिप्पणी की, कीड़ा संरेखित का उपयोग कर । (ग)कीड़े के शीर्ष पर खींची गई रेखाओं के उदाहरण जो गलत तरीके से गठबंधन किए गए कीड़े तक बढ़ सकते हैं । बी में चयनित कीड़े के कीड़े-संरेखित उत्पादन एक उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप पर एक 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था (सामग्री तालिका देखें) हरे फ्लोरेसेंस तीव्रता = 1, एक्सपोजर = 60 एमएस और लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता = 8, एक्सपोजर = 60 एमएस कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: कीड़े को काटने पर कृमि-संरेखित का उपयोग करके सीधे कीड़े के उदाहरण। (क)वयस्कता जानवरों के दिन 3 में जीवित कीड़े के फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर अधिग्रहीत एक समग्र छवि का स्क्रीनशॉट ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर फैट-7p लेजाता है: आंत में जीएफपी और फैर्नेक्स में एक लालसह-इंजेक्शन मार्कर (मायो-2पी::tdtomato)। एक-दूसरे कीड़े को "इंटरसेक्टिंग 1" और "इंटरसेक्टिंग2" लेबल किया जाता है, जबकि गैर ओवरलैपिंग कीड़े को "गुड3" और "गुड4" लेबल किया जाता है। (ख)कृमि-संरेखण द्वारा बनाया गया असेंबल(ए)में चयनित सीधे कीड़े का प्रतिनिधित्व करता है । असेंबल में यह ध्यान देने योग्य है कि कीड़े 1 और 2 मूल छवि (कीड़े को "इंटरसेक्टिंग 1" और "इंटरसेक्टिंग2" के रूप में लेबल किए गए थे)। (ग)कीड़ा-संरेखण से क्यूसी तालिका का स्क्रीनशॉट जो उन मामलों को हाजिर करने की अनुमति देता है जहां कीड़े एक दूसरे को काटते हैं। लंबाई: आरओआई लाइन की लंबाई; कृमि संख्या: जिस क्रम में लाइनें खींची गई थीं; अंतिम कॉलम इंगित करता है कि क्या कीड़ा/ब्याज की रेखा और किसी अन्य कीड़ा के बीच ओवरलैप है । इस उदाहरण में, पहले कच्चे (कीड़ा नंबर 1) में कीड़ा 2 कीड़ा संख्या के साथ ओवरलैप होता है, जैसा कि अंतिम कॉलम में संख्या "2" द्वारा इंगित किया गया है। (घ)ए में चुने गए चार कीड़े पर कृमि-संरेखित के साथ खींची गई रेखाओं का स्क्रीनशॉट(ई)ए में चुने गए चार कीड़े पर कीड़ा-संरेखित द्वारा उत्पन्न मास्क का स्क्रीनशॉट, यह दिखाता है कि दो परस्पर कृमि के लिए मास्क कैसे प्रदान किए जाते हैं । इस मामले में, एक के बजाय दो मास्क अब कीड़ा "intersecting1" के अनुरूप हैं। छवियों को एक उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप पर एक 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था (सामग्री तालिका देखें) हरे फ्लोरेसेंस तीव्रता = 1, एक्सपोजर = 60ms और लाल फ्लोरेसेंस तीव्रता = 8, एक्सपोजर = 60 एमएस के साथ यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।
चित्रा 6: Worm_CP पाइपलाइन फ्लोरेसेंस को मैनुअल मात्रा के रूप में सटीक रूप से निर्धारित करती है। Worm_CP पाइपलाइन(ए)या मैनुअल क्वांटिफिकेशन(बी)का उपयोग करके, हरे फ्लोरोसेंट डाई बोडीपी के साथ लिपिड बूंद सामग्री के लिए तय और दाग वाले युवा वयस्क कीड़े के फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन की तुलना। डब्ल्यूटीई और डीबीएल-1 (nk3) की लिपिड बूंद सामग्री को BODIPY के साथ जानवरों को ठीक करने और धुंधला करके निगरानी की गई थी, जो लिपिड बूंदों के फैटी एसिड में इंटरकैलेट करता है (प्रोटोकॉल ए देखें)। युवा वयस्क जानवरों को 60% आइसोप्रोपेनॉल के साथ तय किया गया था और 1h के लिए BODIPY के साथ दाग दिया गया था। जानवरों के एक ही सेट को या तो Worm_CP पाइपलाइन (चरण 7 देखें) का उपयोग करके या मानकप्रक्रियाओंके अनुसार मैनुअल मात्राकरण द्वारा निर्धारित किया गया था। {पाइपलाइन का उपयोग करते हुए फ्लोरेसेंस का मात्राकरण Worm_CP। WT: n = 22 जानवरों, औसत फ्लोरेसेंस = 1.016 (एयू) ± 0.206 एसडी; dbl-1 (nk3):n= 25 जानवरों, औसत फ्लोरेसेंस = 0.8714 (एयू) ± ०.१२६ एसडी Unpaired टी परीक्षण । (ख) फ्लोरेसेंस का मैनुअल मात्राकरण । WT: n = 22 जानवर, औसत फ्लोरेसेंस = 1.048 ± 0.153 एसडी; डीबीएल-1 (nk3):n= 25 जानवर, औसत फ्लोरेसेंस = 0.8632 ± 0.109 एसडी. अकर्मित टी-टेस्ट। (C, D) प्रतिनिधि उदाहरण या डब्ल्यूटीई(सी)और डीबीएल-1 (एनके3) (डी)जानवरों के लिए वर्म-संरेखित उत्पादन कीड़ा-संरेखित पाइपलाइन के साथ सीधा होता है। छवियां एक उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप पर एक 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था (सामग्री तालिका देखें) हरे फ्लोरेसेंस तीव्रता = 2, जोखिम = 60ms के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 7: फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन और लाइव कीड़े के संरेखण का उदाहरण ट्रांसक्रिप्शनल रिपोर्टर एचएसपी-70 (C12C8.1)p::GFPहीट-शॉक के बाद ले जाने वाले लाइव कीड़े की छवियों से। (क)एक छोटी गर्मी-सदमे (34 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट) पर, युवा वयस्क कीड़े उनकी खेती के तापमान (25 डिग्री सेल्सियस) पर बरामद किए गए और फिर 3.5h पोस्ट हीट शॉक की छवि पर चढ़कर । कीड़ा-संरेखित पाइपलाइन का उपयोग करके हीट शॉक के बाद लगभग 30 कीड़े की मात्रा निर्धारित की गई थी । (ए-बी) गठबंधन कीड़े के उदाहरण जो गर्मी के झटके के संपर्क में नहीं आए हैं। (सी-डी) एचएसपी-70 (C12C8.1)p::कीड़ा-संरेखित का उपयोग करके जीएफपी ले जाने वाले गर्मी से स्तब्ध कीड़े के उदाहरण। (ई)डब्ल्यूटीई युवा वयस्क कीड़े के जीएफपी औसत तीव्रता (Worm_CP पैरामीटर: MeanIntensity_Threshold) को दिखाता है, बिना गर्मी के झटके के या गर्मी के झटके के संपर्क में (30 मिनट के लिए 34 डिग्री सेल्सियस)। छवियों को एक उल्टे वाइडफील्ड माइक्रोस्कोप पर 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था (सामग्री तालिका देखें) हरे फ्लोरेसेंस तीव्रता = 1, एक्सपोजर = 60ms के साथ; कोई एचएस: एन = 12, एचएस: एन = 32। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
पूरक चित्रा 1: फिजी में स्थान जहां वर्म-संरेखित मैक्रो पाया जा सकता है, एक बार स्थापित किया गया। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्र 2: एक ही सेटिंग्स के साथ ली गई सभी छवियों वाले फ़ोल्डर का चयन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 3: फिजी में आउटपुट फ़ोल्डर में 4 सबफोल्डर का उत्पादन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 4: असेंबल के लिए कीड़ा और चैनल सेटिंग्स की चौड़ाई में एक लाइन का ड्राइंग। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 5: लागू सेटिंग्स के साथ छवि का पूर्वावलोकन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 6: असेंबल और/या मात्राकरण में शामिल करने के लिए ब्याज की कीड़े की देशांतर धुरी के साथ एक लाइन का ड्राइंग । इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 7: "गठबंधन" फ़ोल्डर के तहत, आउटपुट फ़ोल्डर में चयनित कीड़े का असेंबल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 8: सेल प्रोफाइलर में पिछले विश्लेषण से पिछले छवियों को साफ़ करना। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 9: सेटिंग्स.csv सबफोल्डर का चयन करके वर्म-संरेखित आउटपुट फ़ोल्डर से सेलप्रोफिलर में मेटाडेटा का आयात करना। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 10: सेलप्रोफिलर पाइपलाइन Worm_CP.cpproj चयनित कीड़े (ए) को एकल करने के लिए Lines_ छवियों का उपयोग करता है, और ब्याज की कीड़े (सी) के एकल कीड़े मास्क का उत्पादन करता है। पाइपलाइन पृष्ठभूमि तीव्रता (बी) को भी मापता है । पाइपलाइन द्वारा मापे गए सभी मापदंडों का आउटलुक Worm_CP.ccproj जो सीएसवी फाइल (डी) में निर्यात किए जाते हैं। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा 11: "Worm_CP.cpproj पाइपलाइन में ExportToSpreadsheet में उत्पादन फ़ाइलों का चयन। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
वर्म-रिलॉर्ड एक फिजी-आधारित छवि प्रसंस्करण पाइपलाइन है जो उपयोगकर्ता-चयनित कीड़े के असेंबल को आसानी से उत्पन्न करती है, जिसमें कीड़े को सीधा किया जाता है और दृश्य तुलना, वर्गीकरण और प्रतिनिधित्व की सहायता के लिए गठबंधन किया जाता है। यद्यपि यह सुविधा कुछ मौजूदा उपकरणों द्वारा भी पेश की जाती है, विशेष रूप से सेलप्रोफिलर7में वर्मटूलबॉक्स मॉड्यूल, वर्म-रिलॉर्ड को तुलनात्मक रूप से कम पूर्व छवि विश्लेषण अनुभव की आवश्यकता होती है: उपयोगकर्ताओं को केवल उन कीड़े का पता लगाने की आवश्यकता होती है जिन्हें वे असेंबल (और विश्लेषण) के लिए चुनना चाहते हैं। हालांकि कच्चे छवि डेटा पर कीड़े का पता लगाना एक आसान प्रक्रिया है-विशेष रूप से जब एक टच स्क्रीन कंप्यूटर या टैबलेट उपलब्ध है-, यह सर्वोपरि है, कि लाइनों को सही ढंग से कीड़े की देशांतर धुरी के साथ तैयार कर रहे हैं । अधूरी रेखाएं, जो कीड़े के केवल हिस्से का पालन करती हैं, असेंबल (यानी, पूंछ के सिर गायब कीड़े) और सेलप्रोफिलर विश्लेषण के दौरान आंशिक विभाजन मास्क में आंशिक कीड़े का परिणाम होगा। इसके अलावा, यदि दो व्यक्तिगत कीड़े से लाइनें पार करती हैं, तो कीड़े संरेखण असेंबल के साथ-साथ फ्लोरेसेंस क्वांटिफिकेशन के लिए सही ढंग से संसाधित नहीं किए जाएंगे। गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मूल छवि पर लाइन चयन की एक ओवरले छवि डेटा फ़ोल्डर में सहेजी जाती है, साथ ही क्यूसी टेबल के साथ। इन से, समस्याग्रस्त लाइनों है कि गलत तरीके से खंडित कीड़े के लिए नेतृत्व करेंगे आसानी से पहचान की और असेंबल और/या बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जा सकता है ।
यद्यपि कीड़े के चयन में प्रयोगकर्ता से प्रत्यक्ष इनपुट शायद थोड़ा समय लेने वाला लगता है, यह प्रयोगों में दूसरों पर कार्यप्रवाह का स्पष्ट लाभ प्रस्तुत करता है जहां विभिन्न विकासात्मक चरणों से कीड़े एक ही छवि में मौजूद होते हैं: कीड़े को "ट्रेसिंग चरण" के दौरान चुना जा सकता है, केवल उन कीड़े को रेखांकित करके जो सही विकासात्मक चरण में हैं। वैकल्पिक रूप से, कीड़े को ट्रेसिंग लाइन की लंबाई, या विभाजन मुखौटा के क्षेत्र, कीड़े की लंबाई/आकार के दोनों विश्वसनीय संकेतकों के आधार पर Worm_CP से आउटपुट का उपयोग करके फ़िल्टर किया जा सकता है। यकीनन, मशीन-लर्निंग एल्गोरिदम विभिन्न विकासात्मक चरणों से कीड़े को पहचानने के लिए संघर्ष कर सकते हैं, क्योंकि डीआईसी छवियों में उनका आकार और उपस्थिति बहुत अलग है।
कृमि-संरेखित के उत्पादन का उपयोग सीधे फिजी में या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफार्मों में एकल कीड़े में फ्लोरेसेंस तीव्रता के बाद की मात्रा के लिए किया जा सकता है। हमने वर्म-रिलाइन आउटपुट को एक साधारण सेलप्रोफिलर पाइपलाइन (Worm_CP) में आयात करके इसका प्रदर्शन किया, जो उन व्यक्तिगत कीड़े में बहु-चैनल फ्लोरेसेंस तीव्रता के मात्राकरण की अनुमति देता है जिन्हें कृमि-संरेखित पाइपलाइन चलाते समय चुना गया था। हमने सेलप्रोफिलर सॉफ़्टवेयर के लचीलेपन के कारण इस दृष्टिकोण को चुना: व्यक्तिगत कीड़े में अतिरिक्त सुविधाओं का विश्लेषण करने के लिए पाइपलाइन में अतिरिक्त मॉड्यूल को शामिल करना सीधा है (उदाहरण के लिए लिपिड बूंदों के आकार को मापना, या तनाव कणिकाओं, नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया)। इसके अलावा, एक कृमि मास्क संभवतः WormToolbox7के लिए एक नया मॉडल प्रशिक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
इस विधि के मुख्य फायदे यह हैं कि यह तेज है और इसके लिए एक साधारण कीड़ा बढ़ते सेट-अप की आवश्यकता होती है। यह विधि तेज है क्योंकि इसके लिए सॉफ्टवेयर ऑपरेशन सीखने में समय बिताने की आवश्यकता नहीं होती है और न ही मशीन एल्गोरिदम7के माध्यम से प्रशिक्षण सेट चलाने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, यह विधि या तो लाइव या निश्चित कीड़े के साथ काम करती है जो नियमित रूप से एगरेग्मेंट पैड पर घुड़सवार होती है। जटिल माइक्रोफ्लुइडिक कक्षों का उपयोग करने की कोई आवश्यकता नहीं है, जैसा कि अन्य तरीकों में विकसित किया गया है5,6।
Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम बायोसीईवी (प्राग, चेक गणराज्य) में डॉ क्रिश्चियन लैंक्टोट को धन्यवाद देना चाहते हैं ताकि हमें माउथ माइक्रोपिपेट पर सुरक्षा सेटअप साझा करने के लिए फिक्स्ड कीड़े और डॉ फातिमा सैंटोस और डॉ डेबी ड्रेज को माउंट करने के लिए माउथ माइक्रोपिपेट तकनीक सिखाई जा सके । हम पांडुलिपि, शर्लीन मर्डोक और बाबरहाम संस्थान सुविधाओं को उनके समर्थन के लिए संपादित करने के लिए फ्रांसिस्का हॉज को भी धन्यवाद देते हैं । ओसी ईआरसी 638426 और BBSRC [BBS/E/B000C0426] द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Beaker | |||
| BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
| Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
| Conical flask | |||
| Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
| Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Isopropanol | |||
| Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
| Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
| Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
| Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
| Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microwave Oven | Delongi | ||
| M9 | prepared in the lab according to15 | ||
| 9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
| PBS | prepared in the lab | ||
| Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
| Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
| Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Rotator | Stuart Scientific | ||
| Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
| Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
| 10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
| 200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
| 1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
| 15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
| Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |
References
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