Worm-align/Worm_CP es un flujo de trabajo simple de FIJI/CellProfiler que se puede utilizar para enderezar y alinear muestras de Caenorhabditis elegans y para puntuar ensayos basados en imágenes de gusano entero sin necesidad de pasos de entrenamiento previos. Hemos aplicado Worm-align/Worm_CP a la cuantificación de la expresión inducida por choque térmico en animales vivos o gotas de lípidos en muestras fijas.
Un problema que a menudo se encuentra al adquirir datos de imagen de C. elegans fijos o anestesiados es que los gusanos se cruzan y se agrupan con sus vecinos. Este problema se agrava con la creciente densidad de gusanos y crea desafíos para la toma de imágenes y la cuantificación. Desarrollamos un flujo de trabajo basado en FIJI, Worm-align, que se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos seleccionados por el usuario, enderezados y alineados a partir de datos de imagen sin procesar de C. elegans. Worm-align es un flujo de trabajo simple y fácil de usar que no requiere entrenamiento previo ni del usuario ni del algoritmo de análisis. Los montajes generados con Worm-align pueden ayudar a la inspección visual de los gusanos, su clasificación y representación. Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Como ejemplo práctico, hemos utilizado la canalización en dos conjuntos de datos: el primer conjunto de datos son imágenes de gusanos reporteros de choque térmico que expresan proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de un gen inducible por choque térmico hsp-70,y el segundo conjunto de datos son imágenes obtenidas de gusanos fijos, manchadas para reservas de grasa con un tinte fluorescente.
Un organismo relativamente simple, el nematodo C. elegans,es un sistema modelo extremadamente útil para el estudio de enfermedades humanas. Alrededor del 38% de los genes en el genoma de C. elegans tienen contrapartes funcionales en humanos1,2. Una de las características únicas de C. elegans es que es ópticamente transparente, lo que permite un fácil acceso a la información in vivo con respecto a (sub) expresión celular de reporteros fluorescentes a través de los tejidos. Esto convierte a C. elegans en un organismo modelo principal para pantallas de alto contenido utilizando plataformas basadas en imágenes3. Sin embargo, un problema que a menudo complica estos estudios es que cuando se toman imágenes de poblaciones densas de gusanos, tienden a cruzarse y agruparse, haciendo comparaciones entre gusanos individuales desafiantes, nublando el análisis y la cuantificación de imágenes aguas abajo.
Las soluciones existentes que superan este problema suelen basarse en la optimización del protocolo de cultivo e imagen, como mediante el uso de configuraciones micro fluidísticas4,lo que permite capturar gusanos individuales en imágenes separadas5,6. Otros han aplicado algoritmos de aprendizaje automático que permiten el reconocimiento de gusanos individuales, incluso en una población agujena. Un excelente ejemplo de esto último es WormToolbox, que es una extensión modular de la plataforma de análisis de imágenes de código abierto, CellProfiler7. WormToolbox ofrece una solución de alto rendimiento y alto contenido para el análisis de C. elegans,y se beneficia claramente de su inclusión en CellProfiler, ya que se pueden incluir fácilmente módulos de análisis adicionales. Aunque WormToolbox viene incluido con un modelo previamente entrenado (DefaultWormModel.xml), el reentrenamiento del algoritmo de aprendizaje automático suele ser necesario para cada nueva aplicación. Los tutoriales en línea sobre cómo hacerlo están disponibles en Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). A pesar de esto, la instalación y el uso de WormToolbox requiere una importante inversión de tiempo para los usuarios principiantes.
Aquí, describimos un protocolo simple, rentable y eficaz en el tiempo para la cultura, y las poblaciones de imagen de C. elegans. Para permitir la evaluación de gusanos individuales en las imágenes adquiridas, hemos desarrollado un flujo de trabajo simple basado en FIJI de código abierto, llamado Worm-align. La alineación de gusanos se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos enderezar y alineados. En primer lugar, el usuario debe seleccionar manualmente gusanos individuales para su análisis dibujando una línea desde la cabeza hasta la cola. Worm-align utilizará esta selección para recortar los gusanos seleccionados de la imagen de visión general y generar un montaje en el que los gusanos seleccionados se enderezan y alinean para facilitar la comparación visual y la presentación.
Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Hemos utilizado la tubería de Worm_CP para cuantificar la respuesta de choque térmico, un mecanismo de protección bien conservado que reobri las proteínas que están mal pleidas debido a factores de estrés como la alta temperatura8. Específicamente, aplicamos la tubería a los gusanos que llevan un transgén integrado de múltiples copias, donde el promotor de un gen inducible por choque térmico, hsp-70(C12C8.1), impulsa la proteína fluorescente verde (GFP)9. También hemos utilizado la Worm_CP en animales fijos que han sido etiquetados con un tinte fluorescente que visualiza las gotas de lípidos (LDs), el principal orgánulo de almacenamiento de grasa en C. elegans10. Aunque este flujo de trabajo no tiene el rendimiento ofrecido por WormToolBox, es una alternativa sencilla y fácil de usar para la presentación visual y el análisis de experimentos de C. elegans basados en imágenes.
Worm-align es una canalización de procesamiento de imágenes basada en FIJI que genera fácilmente montajes de gusanos seleccionados por el usuario, en los que los gusanos se enderezan y alinean para ayudar a la comparación visual, clasificación y representación. Aunque esta característica también es ofrecida por algunas herramientas existentes, en particular el módulo WormToolbox en CellProfiler7, Worm-align requiere comparativamente poca experiencia previa en el análisis de imágenes: los usuarios solo necesitan rastrear los gusanos que les gustaría seleccionar para el montaje (y el análisis). Aunque el seguimiento de los gusanos en los datos de imagen sin procesar es un proceso fácil -especialmente cuando un ordenador o tableta de pantalla táctil está disponible-, es primordial, que las líneas se dibujan correctamente a lo largo del eje longitudinal de los gusanos. Las líneas incompletas, que siguen sólo una parte del gusano, darán lugar a gusanos parciales en el montaje (es decir, gusanos que faltan cabezas de extremos de cola) y máscaras de segmentación parcial durante el análisis CellProfiler. Además, si las líneas de dos gusanos individuales se cruzan, los gusanos no se procesarán correctamente en el montaje de alineación del gusano, así como para la cuantificación de la fluorescencia. Para el control de calidad, se guarda una imagen superpuesta de las selecciones de línea de la imagen original en la carpeta de datos, junto con una tabla de control de calidad. A partir de estos, las líneas problemáticas que conducirán a gusanos segmentados incorrectamente pueden ser fácilmente identificadas y excluidas del montaje y / o análisis posterior.
Aunque la entrada directa del experimentador en la selección de gusanos quizás parece un poco lenta, presenta una clara ventaja del flujo de trabajo sobre otros en experimentos donde gusanos de diferentes etapas de desarrollo están presentes en la misma imagen: los gusanos se pueden seleccionar durante el “paso de seguimiento”, esbozando sólo los gusanos que están en la etapa de desarrollo correcta. Alternativamente, los gusanos se pueden filtrar utilizando la salida de Worm_CP en función de la longitud de la línea de seguimiento o del área de la máscara de segmentación, ambos indicadores confiables de la longitud/tamaño de los gusanos. Podría decirse que los algoritmos de aprendizaje automático pueden tener problemas para reconocer gusanos de diferentes etapas del desarrollo, ya que su tamaño y apariencia en las imágenes DIC son tan diferentes.
La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Demostramos esto importando la salida Worm-align en una canalización CellProfiler simple (Worm_CP), que permite la cuantificación de la intensidad de fluorescencia multicanal en los gusanos individuales que se seleccionaron mientras se ejecutaba la canalización Worm-align. Elegimos este enfoque debido a la flexibilidad del software CellProfiler: Es sencillo incorporar módulos adicionales en la canalización para analizar características adicionales en gusanos individuales (por ejemplo, medir el tamaño de las gotas de lípidos, o gránulos de tensión, núcleos, mitocondrias). Además, las máscaras de gusano único podrían utilizarse potencialmente para entrenar un nuevo modelo para WormToolbox7.
Las principales ventajas de este método son que es rápido y requiere una configuración de montaje de gusano simple. Este método es más rápido, ya que no requiere pasar tiempo aprendiendo la operación del software ni ejecutar conjuntos de entrenamiento a través de un algoritmo de máquina7. Además, este método funciona con gusanos vivos o fijos simplemente montados en almohadillas de agarosa regulares. No es necesario utilizar cámaras microfluídicas complejas, como se ha desarrollado en otros métodos5,6.
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Christian Lanct-t en BIOCEV (Praga, República Checa) por enseñarnos la técnica de micropipeta de boca para montar gusanos fijos y a la Dra. Fatima Santos y a la Dra. Debbie Drage por compartir la configuración de seguridad en la micropipeta de la boca. También agradecemos a Francesca Hodge por editar el manuscrito, Sharlene Murdoch y Babraham Institute Facilities por su apoyo. OC es compatible con ERC 638426 y BBSRC [BBS/E/B000C0426].
Agarose | MeLford Biolaboratories Ltd | MB1200 | |
Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Beaker | |||
BODIPY 493/593 | Invitrogen | D3922 | stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL |
Centrifuge | MSE MISTRAL 1000 | ||
Conical flask | |||
Cover Slip | VWR | 631-0120 | |
Filter 0.2 µm for Syringe | Sartrius | 16534-K | Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Isopropanol | |||
Levamisole hydrochloride | Sigma-Aldrich | BP212 | 3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9 |
Liquid Nitrogen | Liquid Nitrogen facility | ||
Low Retention Tip 1000µL | Starlab | S1182-1830 | |
Methanol | VWR chemicals | 20847.307 | |
Microscope Slides, MENZEL GLASSER | Thermo Scientific | BS7011/2 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microwave Oven | Delongi | ||
M9 | prepared in the lab according to15 | ||
9cm NGM Plates | prepared in the lab according to15 | ||
PBS | prepared in the lab | ||
Protein LoBind Tube 2ml | Eppendorf | 22431102 | |
Triton | SIGMA | T9284-500ML | |
Ring Caps | SIGMA-ALDRICH | Z611247-250EA | glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Rotator | Stuart Scientific | ||
Silicone tubine translucent | Scientific Laboratory Suppliers | TSR0600200P | 6.0 mm x 2.0 mm wall – to create mouth micro-pipette (see protocol step) |
Sterilized H2O | MilliQ water autoclaved in the lab | ||
10µL Tips | Starlab | S1120-3810 | |
200µL Tips | Starlab | S1120-8810 | |
1000µL Tips | Starlab | S1122-1830 | |
15mL Centrifuge Tube | CORNING | 430791 | |
Vecta Shield | VECTOR | 94010 | antifade mounting medium (H-1000) without DAPI |