Summary
פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס בזחלים זברה. נבגי אספרגילוס הם microinjected לתוך hindbrain של זחלים, טיפול כימי משמש כדי לגרום לדיכוי המערכת החיסונית. התקדמות הזיהום מנוטרת באמצעות מערך הדמיה יומי כדי לפקח על צמיחה פטרייתית ותגובות חיסוניות, כמו גם ספירה של נבגים חיים על ידי ציפוי יחידה יוצר מושבה.
Abstract
אספרגילוזיס פולשני (IA) הוא אחד הזיהומים הפטרייתיים הנפוצים ביותר בקרב אנשים immunocompromised. למרות הזמינות של תרופות נגד פטריות, IA יכול לגרום >50% תמותה בחולים immunocompromised נגועים. זה חיוני כדי לקבוע הן גורמים מארחים ופתוגן התורמים רגישות לזיהום ושיעורי הישרדות נמוכים בחולים נגועים על מנת לפתח טיפולים חדשניים. תגובות חיסוניות מולדות ממלאות תפקיד מרכזי בהכרה וסיווג של נבגי אספרגילוס, אם כי מעט מאוד ידוע על המנגנונים התאיים והמולקולריים המדויקים. מודלים אמינים נדרשים כדי לחקור אינטראקציות מכניות מפורטות בין המארח לפתוגן. הבהירות האופטית והמתיחה הגנטית של זחלי הזברה הופכים אותם למודל מסקרן לחקר אינטראקציות מארח-פתוגן של זיהומים חיידקיים ופטריות אנושיים מרובים במארח חי ושלם. פרוטוקול זה מתאר מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה. ראשית, נבגי אספרגילוס מבודדים ומוזרקים לתוך החדר האחורי של דג הזברה דרך מיקרו-אינג'ינג. לאחר מכן, מעכבים כימיים כגון תרופות לדיכוי המערכת החיסונית מתווספים ישירות למים הזחל. שתי שיטות כדי לפקח על הזיהום בזחלים מוזרקים מתוארים, כולל 1) הומוגניזציה של זחלים עבור המושבה להרכיב יחידה (CFU) ספירה ו 2) חוזר ונשנה, מערך הדמיה חיה יומית. בסך הכל, טכניקות אלה ניתן להשתמש כדי לנתח באופן מכני את ההתקדמות של זיהום אספרגילוס vivo והוא יכול להיות מיושם על רקע מארח שונים זנים אספרגילוס לחקור אינטראקציות מארח-פתוגן.
Introduction
Aspergillus fumigatus היא פטרייה סאפרופיטית בכל מקום, ואת הנבגים המוטסים שלה ניתן למצוא הן בפנים והן בחוץ1. נבגים אלה הם בשאיפה על ידי כולם אבל להיות פינה ביעילות מן הריאות של אנשים immunocompetent1,2. עם זאת, אנשים עם תנאי ריאות השתנו כגון סיסטיק פיברוזיס יכול לפתח אספרגילוזיס bronchopulmonary עקב נביטה פטרייתית בריאות3. הצורה החמורה ביותר של זיהום זה, אספרגילוזיס פולשני (IA), משפיע על אנשים immunocompromised וכרוך בצמיחה של הפטרייה לאיברים אחרים2,3. IA מוביל >50% מוות של חולים נגועים למרות הזמינות של טיפולים אנטי פטרייתיים4. אצל אנשים immunocompetent, תגובות חיסוניות מולדות לשחק תפקיד מרכזי בפינוי נבגים בשאיפה1. עם זאת, המנגנונים הספציפיים התורמים לסיווג חיסוני מולד זה אינם מובנים היטב. חשוב להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים של תאי חיסון מולדים מרכזיים (כלומר, מקרופאגים ונויטרופילים) באישור אספרגילוס על מנת למצוא אסטרטגיות טיפוליות חדשניות עבור IA.
בעוד מודלים יונקים סייעו בזיהוי גורמי ארסיות פטרייתיים ומארחים תגובותחיסוניות 5,6, נגישות חזותית מוגבלת לאינטראקציות מארח-פתוגן ברמה התאית. ניסויים בתרבית רקמות אינם יכולים לשחזר באופן מלא את הסביבה הרב-תאית המורכבת ואת האינטראקציות הקיימות בבעלי חיים שלמים7. לכן, זברהפיש צברה פופולריות כאורגניזם מודל חלופי כדי למלא את הפער הזה ולאפשר את המחקר של אינטראקציות מארח-פתוגן במארח חי, שלם על פני זיהום רב-יומי8,9. מערכת החיסון המולדת זברה מתפתחת כבר 24 שעות לאחר ההפריה (hpf)10, ואת המערכת האדפטיבית לוקח 4-6 שבועות לפתח11, מתן חלון זמן שבו תגובות חיסוניות מולדות ניתן להעריך בבידוד. תגובות חיסוניות מולדות שמורות היטב בין בני אדם לבין זברה דג11. זברהפיש יש תכונות רבות המאפשרות את החקירה של תגובות אלה, כולל בהירות אופטית (המאפשר הדמיה חיה ברזולוציה גבוהה של מארחים שלמים) ואת המתיחה הגנטית (אשר מקל על מחקרים מכניים מולקולריים).
מודל זיהום אספרגילוס זחל זברה המתואר כאן פותח במקור על ידי נוקס ואח'12. זה הורחב לאחרונה על ידי הקבוצה שלנו ואחרים לחקור מנגנונים חיסוניים מארחים12,13, המארח-פתוגן אינטראקציות13,14,15, מנגנונים של דיכוי המערכת החיסונית13,16,17, ארסיות פטרייתית18, ויעילות תרופה אנטי פטרייתית19,20. מודל זה מסכם היבטים מרובים של אספרגילוזיס אנושי. בעוד זחלים immunocompetent עמידים, זחלים immunocompromised יכול להיכנע לזיהום12,13,16,17.
במודל זה, זיהום מקומי נקבע על ידי הזרקת נבגים לתוך החדר hindbrain של זחל, אזור מאוכלס פחות עם phagocytes, גיוס phagocyte והתנהגות ניתן להעריך12,13. הוא האמין כי מקרופאגים לשמש קו ההגנה הראשון נגד נבגי אספרגילוס בבני אדם1 ומודלים יונקים6,21. באופן דומה, במודל הזברה, מקרופאגים מגויסים לנבגי אספרגילוס מוזרקים, בעוד נויטרופילים מגויסים באופן שני בתגובה לצמיחה מהפכלית12,13,22. ממודל זה, נודע גם כי אספרגילוס יכול להתמיד זחלים immunocompetent wildtype לאחר יותר מ 7 ימים של זיהום. יתר על כן, את כל מהלך הזיהום ניתן לעקוב באותם בעלי חיים חיים על ידי הדמיה קונפוקלית יומית.
פרוטוקול זה מתאר את הטכניקה של microinjection להזריק נבגים לתוך החדר hindbrain של 2 ימים לאחר ההפריה (2 dpf) זחלים. הזיהום מנוטר לאחר מכן עד 7 ימים, כמו זחלים זברה יכול לחיות עד 10 dpf ללא האכלה. דיכוי המערכת החיסונית יכול להיגרם על ידי טיפול תרופתי, ואת היישום של תרופות לזחלים מתואר גם. לבסוף, מתוארות שתי שיטות למעקב אחר התקדמות הזיהום, כולל כימות של CFUs מזחלים בודדים והתקנת הדמיה חיה יומית.
Protocol
החוקרים צריכים לקבל אישור לכל הניסויים בבעלי חיים מוועדות הטיפול והשימוש המתאימות בבעלי חיים. נתונים מייצגים המוצגים במאמר זה הם מניסויים שבוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קלמסון (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. הכנת נבגי אספרגילוס להזרקה
- מהשעיית נבג אספרגילוס, לחשב את הנפח הדרוש כדי להשיג 1 x 106 נבגים. הנפח צריך להיות 20-100 μL; אם לא, לייצר דילול 10x ב 0.01% (v / v) סטרילי Tween-20 (Tween-מים; שולחן החומרים). לדוגמה, אם אמצעי האחסון המחושב הוא 5 μL, לייצר דילול 10x ולהשתמש 50 μL של הפתרון מדולל.
הערה: שתי צלחות / זן יכול להיות מוכן לאסוף נבגים נוספים או כרזרבי במקרה של זיהום. - מורחים 1 x10 6 נבגיאספרגילוס על צלחת אחת של מדיה מינימלית של גלוקוז (GMM)(שולחן החומרים)עם מפזר חד פעמי סטרילי בצורת L בארון ביו-ספייטי. הימנע התפשטות לשולי הצלחת. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים, עם הצלחת פונה במהופך.
- ביום האיסוף, הביאו מיראקלית סטרילית וצינורות חרוטיים 50 מ"ל (שניים לכל זן), בקבוקים טריים של מי טווין סטריליים (אחד לכל זן), ומפזרים חד פעמיים סטריליים בצורת L לארון הביוספיטי.
הערה: Miracloth ניתן לחתוך ~ 8 ב x 6 חתיכות, עטוף בנייר כסף, ו autoclaved לעקר. - מניחים חתיכה אחת של miracloth בכל שכותרתו צינור חרוט 50 מ"ל וכובע מחדש. תוציא את חבילת המיראקלות הנותרת מהמכסה המנוע.
- הכניסו צלחות לארון הביו-סטי. פתח צלחת אחת, ולאחר מכן לשפוך Tween-מים על החלק העליון כדי לכסות כשלושה רבעים של הצלחת.
- באמצעות מפזר חד פעמי בצורת L, מגרד בעדינות את פני השטח של התרבות הפטרייתית בתנועה הלוך ושוב, תוך שימוש ביד השנייה כדי לסובב את הצלחת. מגרדים עד שכמעט כל הנבגים הופכים הומוגניים למים של טווין.
הערה: בשל הידרופוביות גבוהה, נבגים יכולים ליצור "פחזניות" כאשר מים טווין מתווספים או במהלך גירוד. יש לנקוט בזהירות רבה כדי למנוע זיהום של צינורות או צלחות סמוכים. מומלץ להחליף כפפות ולנגב את פני השטח עם 70% אתנול בין מיצוי זנים שונים. - קח צינור חרוט אחד 50 מ"ל ולהסיר את חתיכת miracloth. מקפלים אותו לשניים ולהפוך אותו לתוך מסנן מוכנס בחלק העליון של צינור חרוט 50 מ"ל.
- יוצקים את הומוגנית פטרייתי מהצלחת מעל miracloth לתוך הצינור.
הערה: אם שתי צלחות של זן אחד מוכנים, לגרד את שתי הצלחות ויוצקים אותם לתוך אותו צינור חרוט. - יוצקים מים Tween להביא את הנפח הכולל בצינור חרוט ל 50 מ"ל.
- ספין ב 900 x g במשך 10 דקות. הקפד להשתמש בכובעים למניעת אירוסוליזציה בצנטריפוגה.
- יוצקים את supernatant לתוך ~ 10% פתרון אקונומיקה כדי decontaminate. יוצקים 50 מ"ל של PBS סטרילי 1x לתוך הצינור חרוט, ואז מערבולת או לנער כדי resuspend את גלולה.
- ספין שוב ב 900 x g במשך 10 דקות. יוצקים את supernatant ו resuspend גלולה ב 5 מ"ל של PBS סטרילי 1x. מסננים דרך חתיכה טרייה של miracloth לתוך צינור חרוט טרי 50 מ"ל.
- הפוך 10-פי דילול סדרתי (10x, 100x, 1000x) של הומוגנט פטרייתי ב 1.7 צינורות צנטריפוגה מ"ל (למשל, עבור הפתרון 10x, לערבב 100 μL של הומוגנט פטרייתי עם 900 μL של מים Tween).
- בחר את הדילול הראשון שבו הנבגים אינם גלויים כאשר הוא מוזרם לתוך Tween-מים ולהשתמש בדילול זה כדי לספור את מספר הנבגים באמצעות hemocytometer.
- לחשב את ריכוז הנבג ב homogenate פטרייתי מוכן (השעיית מים) באמצעות הנוסחה הבאה:
ריכוז (נבגים/מ"ל) = מספר נבגים באמצע 25 תיבות x גורם דילול x 104 - הכן מלאי 1 מ"ל של 1.5 x 108 נבגים / מ"ל ב- PBS סטרילי 1x בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.7 מ"ל. הכנת נבג זה ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך ~ 4 שבועות.
- לפני השימוש בזריקות, לערבב 20 μL של הכנת הנבג עם 10 μL של 1% אדום פנול סטרילי בצינור צנטריפוגה 1.7 מ"ל כדי להשיג ריכוז נבג סופי של 1 x 108 נבגים / מ"ל. וורטקס ביסודיות לפני ההזרקה.
הערה: 1% פתרון אדום פנול צריך להיות מעוקר מסנן ומאוחסן aliquots. - להזרקה מדומה, מערבבים 20 μL של 1x PBS עם 10 μL של 1% אדום פנול סטרילי.
2. הכנת צלחות אגר להזרקה
- מכינים 2% agarose ב E3 בינוני להמיס במיקרוגל.
- יוצקים לתוך צלחת פטרי 100 מ"מ x 15 מ"מ (~ 25 מ"ל לכל צלחת), מערבולת כדי לכסות את הצלחת באופן שווה, ולתת מגניב.
- לעטוף את הצלחת עם סרט פרפין ולאחסן הפוך ב 4 מעלות צלזיוס.
- לפני ההזרקה, להביא את הצלחת לטמפרטורת החדר (RT).
- יוצקים ~ 1 מ"ל של מסנן מעוקר 2% סרום שור אלבומין (BSA) על הצלחת, להטות את הצלחת כדי להפיץ ולכסות את החלק התחתון כולו, ולשטוף עם E3.
הערה: 2% פתרון BSA יכול להיות מעוקר מסנן ומאוחסן כמו 1 aliquots מ"ל ב -20 °C. 2% BSA טרום טיפול מונע זחלים להידבק על פני השטח של agarose. - יוצקים E3 עם tricaine אגירה על הצלחת ולתת לו לשבת עד הזרקה.
3. זחל זברה בדיעבדברין מיקרו-אינג'רטיקציה לחדר
- באופן ידני dechorionate זחלים עם מלקחיים ב 2 dpf בצלחת פטרי.
הערה: Dechorionation יכול להתבצע בכל עת מ 1.5 dpf עד זמן ההזרקה. - הסר כמה שיותר E3 מצלחת פטרי ולהוסיף אגירה 300 מיקרוגרם / מ"ל tricaine ב E3 כדי להרדים זחלים.
הערה: פתרון מלאי של טריקאין 4 מ"ג / מ"ל ב- E3 יכול להיות מוכן ומאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס. פתרון העבודה יכול להתבצע על ידי דילול 4 מ"ל של פתרון המניה עד 50 מ"ל עם E3. - השתמש במערך microinjection המסופק עם מזרק הלחץ, יחידת לחץ אחורי, footswitch, מחזיק micropipette, micromanipulator, מעמד מגנטי צלחת, כל מחובר למקור של אוויר דחוס(שולחן החומרים).
- פתח את שסתום האוויר הדחוס והפעל את המיקרו-יין. הגדר את הלחץ ~ 25 PSI, משך הדופק ל 60 ms, ויחידת backpressure ל 1 PSI.
- לטעון מחט microinjection באמצעות קצה פיפטה microloader(שולחן החומרים)עם כ 3-5 μL של PBS מוכן או השעיית נבג עם פנול אדום. תרכיב את המחט על המיקרו-מניפולטור.
הערה: מחטי Microinjection ניתן להכין כמתואר בעבר23. מיקרוסקופ סטריאו המשמש microinjections צריך להיות רטיקל חתיכת העין כדי לכייל את מחט microinjection. יש לכייל את הקוטלת באמצעות מיקרומטר שלב, ויש לקבוע את אורך סולם הקוטלת (μm). קוטר טיפת ההשעיה של הנבג הנפלט מהמחט נמדד בהתאם למספר הגיבובים (של הקוטלת) החופפים לירידה. - מקם את micromanipulator כך קצה המחט הוא בתצוגה בהגדלה הנמוכה ביותר תחת מיקרוסקופ סטריאו. זום כדי הגדלה 4x, שמירה על המחט בתצוגה.
- באמצעות מלקחיים חדים, חתוך את קצה המחט. לחץ על דוושת ההזרקה כדי לדמיין את גודל הטיפה שיוצאת. שמור גזירת בחזרה עד ~ 3 nL של השעיית נבג מוזרק (כאן, זה חמישה hashes).
- להזיז micromanipulator ומחט מהדרך כדי למנוע בטעות להכות את המחט בעוד הזחלים מסודרים על צלחת ההזרקה.
- יוצקים E3-Tricaine את צלחת ההזרקה, ולאחר מכן להעביר ~ 24 זחלים מורדמת לצלחת ההזרקה עם כמה שפחות E3 אפשרי באמצעות צינור העברה.
- באמצעות כלי קטן למניפולציה זחלי זברה (כלומר, כלי לולאת שיער או כלי ריסים), לסדר את הזחלים על פי הכיוון שבו הם פונים. באופן ספציפי, למקם את כל הפונה ימינה בשורה אחת, וכל פונה שמאלה בשורה למטה.
הערה: סידור זה קשה אם יש יותר מדי נוזלים על הצלחת, כמו הזחלים יהיה "לצוף" מחוץ למקום. עם זאת, מעט מדי נוזל הוא גם בעייתי אם הזריקות לקחת זמן רב, כמו הזחלים יכולים להתייבש או הרדמה להתפוגג. לכן, תשומת לב זהירה יש להקדיש את כמות הנוזל על הצלחת לאורך כל תהליך microinjection. - כוונן את זום המיקרוסקופ להגדלה הנמוכה ביותר. מחזירים את המיקרומניפולטור ומסדרים כך שהמחט קרובה לזחלים, בזווית של ~ 30°-60°, באמצע שדה הראייה.
- הגדלה להגדלה הגבוהה ביותר ושימוש ידיות כוונון עדינות כדי להתאים עוד יותר את מיקום המחט. ודא כי ~ 30-70 נבגים יוצאים מהמחט על ידי הזרקת ההשעיה נבג לתוך הנוזל על הצלחת ליד הזחלים. התאם את הזמן והלחץ על הגדרת ההזרקה, במידת הצורך.
הערה: יש לחזור על בדיקה זו לאחר כל חמישה עד שישה זחלים, שכן מספר הנבגים שיוצאים מהמחט יכול לגדול או לרדת עם הזמן. - החל מהשורה שבה הזחלים פונים לכיוון המחט, להזיז את הצלחת, כך המחט היא ישירות מעל וממוקם ליד הזחלים הראשונים.
- הזזת המחט עם micromanipulator, להכניס את המחט דרך הרקמה סביב vesicle אוטי לנקב דרך לתוך החדר hindbrain. להזיז את הצלחת עם היד השנייה לפי הצורך כדי לקבל את האוריינטציה הנכונה של הזחל עם הזווית של המחט.
- ויזואלית לוודא כי קצה המחט הוא במרכז החדר hindbrain, לחץ על דוושת הרגל כדי להזריק נבגים בעדינות לחזור המחט.
הערה: הצבע האדום פנול צריך בעיקר להישאר בתוך החדר hindbrain. כמות קטנה עשויה להיכנס midbrain, אבל זה לא צריך להגיע המוח קדימה או מחוץ למוח. אם כן, נפח מוזרק גדול מדי, ואת הלחץ והזמן צריך להיות מופחת בהתאם, או מחט חדשה צריך להיות מכויל. - נע במורד הצלחת, להזריק את כל הזחלים בשורה זו. לאחר מכן, לסובב את הצלחת ולהזריק את כל הזחלים בשורה השנייה.
הערה: זחלים מוזרקים או פגומים בטעות ניתן לסמן על ידי 1) הזרקה לתוך החלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או 2) גרירת הזחל מחוץ לשורה עם המחט. - להזיז מחט למעלה והחוצה מהדרך שוב. הקטן את התצוגה להגדלה נמוכה יותר של המיקרוסקופ. הצבע האדום פנול עדיין צריך להיות גלוי ב hindbrain של כל זחל.
- ראשית, להתרחק עם כלי לולאת שיער פיפטה עד להיפטר כל זחלים עם זריקות לא מוצלח. מעבירים את הזחלים הנותרים לצלחת פטרי חדשה על ידי שטיפתם מהצלחת עם E3 סטרילי טרי וצינור העברה.
- חזור על הפעולה לפי הצורך עבור מספר המדגם הניסיוני הסופי הרצוי.
- יש לשטוף את הזחלים לפחות 2x עם E3 ולהבטיח התאוששות מהרדמה.
- כדי לכמת את ההישרדות ללא כל טיפול נוסף, באמצעות פיפטה העברה, להעביר זחלים לתוך צלחת 96 גם (1 זחל לכל באר) ב E3.
4. הקמת מספרי נבגים מוזרקים ובת קיימא
- מיד לאחר ההזרקה, באמצעות פיפטה העברה, לבחור באופן אקראי על שמונה זחלים מוזרקים ולהעביר אותם 1.7 צינורות צנטריפוגה מ"ל (זחל אחד לכל צינור).
- המתת חסד זחלים עם tricaine או על ידי הצבת אותם ב 4 מעלות צלזיוס עבור 0.5-2.0 שעות.
- הכן 1 מ"ל של 1 אמפיצילין מ"ג / מ"ל ו 0.5 מ"ג / מ"ל kanamycin פתרונות אנטיביוטיים סטריליים 1x PBS. ניתן לאחסן את שאריות הפתרון ב- 4 °C (60 °F) ולהשתמש בו מאוחר יותר.
הערה: פתרונות מלאי של ampicillin ב 100 מ"ג / מ"ל ו kanamycin 50 מ"ג / מ"ל ניתן מראש, מסנן מעוקר, ומאוחסן aliquots ב -20 °C (60 °F). לדלל אלה 100x ב 1x PBS כדי להשיג את פתרון העבודה. - באמצעות פיפטה, להסיר נוזלים רבים ככל האפשר מצינור צנטריפוגה, משאיר את הזחל מאחור ולהוסיף 90 μL של 1x PBS עם אנטיביוטיקה.
הערה: אנטיביוטיקה משמשים כדי למנוע צמיחה חיידקית בצלחות GMM שעלולים להפריע לספירת מושבות אספרגילוס. - הומוגניזציה זחלים ב lyser רקמה ב 1,800 תנודות / דקה (30 הרץ) במשך 6 דקות. ספין למטה ב 17,000 x g עבור 30 s.
- תווית צלחות GMM (צלחת אחת לכל זחלים הומוגניים). באמצעות מבער Bunsen כדי ליצור סביבה סטרילית, פיפטה ההשעיה הומוגנית מצינור אחד לאמצע צלחת GMM, ולאחר מכן להתפשט באמצעות מפזר חד פעמי בצורת L. הימנע הפצת הומוגנית על השפה.
- דגירה הצלחות במהופך ב 37 °C (69 °F) במשך 2-3 ימים ולספור את מספר המושבות שנוצרו (CFU).
- כדי למדוד את מספר הנבגים בחיים במהלך תקופת ההדבקה, בחר זחלים מצלחת הבאר 96 ב 1-7 ימים לאחר הזרקה (dpi) ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגה. המתת חסד והומוגניזציה זחלים להתפשט על לוחות GMM כמתואר בשלבים 4.1-4.5.
5. טיפול תרופתי בזחלים מוזרקים
- לאחר סעיף 4, לפצל את הזחלים הזריק הנותרים לשתי מנות 3.5 מ"מ: אחד לטיפול תרופתי ואחד לבקרה. יש להשתמש בכ-24 זחלים נגועים בכל מצב.
הערה: ניתן לטפל במנות 3.5 מ"מ עם 2% חלב יבש דל שומן במים, שטוף, מיובש באוויר ומאוחסן ב- RT מראש. ציפוי בחלב ימנע זחלים נדבקים לפלסטיק. - הכן את פתרון התרופה הרצוי ואת הרכב ב E3 ללא כחול מתילן בצינורות חרוטים על פי הריכוז הסופי הנדרש, ולאחר מכן לערבב היטב. לדוגמה, כדי לפקח על הישרדותם של זחלים שנחשפו לדקסמתזון, השתמש ב- 24 זחלים (שכפולים) עבור dexamethasone ו- 24 עבור פקד הרכב, כגון DMSO. הכן 5 מ"ל של פתרון התרופה בריכוז הנדרש. כאן, 5 מ"ל של 0.1% DMSO ו 10 μM dexamethasone שימשו, ו 24 זחלים / מצב הועברו ~ 200 μL של הרכב / פתרון סמים / זחלים.
- מוציאים נוזלים רבים ככל האפשר מתבשיל אחד עם פיפטה להעברה ומוסיפים E3 עם קדם-mixed המכיל בקרת רכב. חוזרים על הפעולה עם E3 premixed המכיל את הטיפול של עניין עבור המנה האחרת.
- באמצעות פיפטה, להעביר זחלים לתוך 96 צלחת היטב (זחל אחד לכל באר). לפקח על ההישרדות של זחלים מוזרקים חשופים לרכב או לתרופה במשך 7 ימים.
הערה: התרופה יכולה להיות מיושמת אך ורק ביום ההדבקה ושמורה על הזחלים במשך כל הניסוי או שניתן לרענן אותה מדי יום.
6. הדמיה יומית של זחלים נגועים באמצעות זברה דג פציעה ומלכוד המכשיר לצמיחה והדמיה (zWEDGI)
- ודא כי הזחלים מטופלים עם 100 מיקרומטר N-phenylthiourea (PTU) ב 24 hpf כדי למנוע פיגמנטציה וכי PTU נשמר על הזחלים עבור הניסוי כולו.
הערה: PTU ב 75-100 מיקרומטר מונע פיגמנטציה של זחלים ללא כל פגמים התפתחותיים ברוטו24. עם זאת, PTU יכול להפריע כמה תהליכים ביולוגיים25, וחוקרים צריכים לקבוע מראש אם התרופה עשויה להשפיע על כל התהליכים תחת חקירה. - להדביק זחלים מהונדסים עם אוכלוסיות תאים מסומנות של עניין ב 2 dpf עם נבגי אספרגילוס מהונדסים לבטא חלבון פלואורסצנטי, כמתואר בסעיף 3. לאחר מכן, להעביר זחלים נגועים לתוך בארות של צלחת 48 גם בערך 500 μL / באר של E3 ללא כחול מתאילן.
הערה: צלחת באר 48 משמש כאן, כי קל יותר להעביר זחלים לתוך ומחוץ במהלך הדמיה יומית חוזרת ונשנית. - ביום ההדמיה, הכינו שתי מנות פטרי 3.5 מ"מ: אחת עם 100 מיקרומטר PTU ואחת עם E3-tricaine.
- הוסף E3-tricaine לתוך התאים של מכשיר zWEDGI26,27. תחת מיקרוסקופ סטריאו, להסיר בועות אוויר מן התאים ואת הערוץ מרסן באמצעות מיקרופיפט P100. הסר את כל עודף E3-tricaine, כך שזה רק בתאים.
- פיפטה במעלה זחל אחד מהצלחת באמצעות פיפטה העברה. אם הרבה נוזל משמש להסרתו, פיפטה לתוך צלחת 3.5 מ"מ המכיל E3-PTU. לאחר מכן, פיפטה שוב, באמצעות נוזל קטן ככל האפשר, ולהעביר לתוך E3-tricaine.
- המתן ~ 30 s עבור ההמתה, ולאחר מכן העברה לתא הטעינה של התקן הפציעה והמלכוד (למשל, zWEDGI).
- מתחת למיקרוסקופ הסטריאו, מקם את הזחל. השתמש במיקרופיפט P100 כדי להסיר E3-tricaine מתא הפציעה ולשחרר לתוך תא הטעינה כדי להזיז את הזנב של הזחל לתוך ערוץ ההגבלה. ודא שהזחל ממוקם בצד הצדדי, הגבי או הגבי-לרוחב שלו, כך שניתן יהיה לדמות את הזחל האחורי עם עדשה אובייקטיבית הפוכה.
- זחל תמונה עם מיקרוסקופ קונפוקל.
- לאחר ההדמיה, עם פיפטה P100, לשחרר E3-tricaine לתוך תא הפציעה כדי לדחוף את הזחל מן הערוץ מרסן לתוך תא הטעינה.
- באמצעות פיפטה העברה, להרים את הזחל ולהעביר אותו בחזרה לצלחת פטרי עם E3-Tricaine. באמצעות נוזל קטן ככל האפשר, להעביר אותו לצלחת פטרי עם E3-PTU. יש לשטוף ב-PTU ולהחזיר לצלחת ה-48 באר.
Representative Results
לאחר microinjection של נבגי אספרגילוס לתוך hindbrain של זחלים זברה, תוצאת זיהום יכול להיות ואחריו מבחנים מרובים, כולל הישרדות, CFUs, הדמיה חיה. במהלך מבחני ההישרדות, היה מעקב אחר מספר הזחלים הנגועים ששרדו 1-7 dpi. כאשר זחלים פראיים נותרו ללא טיפול, נצפה מעט מאוד מוות, כאשר כ-80%–100% מהזחלים שרדו את מות הניסוי כולו (איור 1). אם הזחלים היו מדוכאי חיסון, למשל על ידי חשיפה לתרופה קורטיקוסטרואידים dexamethasone (10 מיקרומטר), נצפתה ירידה משמעותית בהישרדות (איור 1).
כאשר יחידות CFUs כמתו לאורך כל הניסוי בן 7 הימים מזחלים מסוג בר נגועים בנבגי A. fumigatus, נצפתה התמדה של נבגים, עם סיווג איטי לאורך זמן (איור 2A). מספר הנבגים ששרדו ב- 1, 2, 3, 5 ו- 7 dpi מנורמל למספר הנבגים שהוזרקו ב- 0 dpi כדי להשוות התמדה וסיווג בין משכפלים (איור 2B).
קווי דגים מהונדסים המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים בלוקוציטים יחד עם נבגי אספרגילוס מבטאי חלבונים פלואורסצנטיים יכולים לשמש כדי לדמיין הן גיוס והתנהגות לויקוציטים והן נביטה פטרייתית וצמיחה13. כאשר מקרופאגים סומנו (למשל,Tg(mpeg1:H2B-GFP),,קיבוץ מאקרו ב- ~ 50% מהזחלים נצפה בדרך כלל, החל מ- 2-3 dpi (איור 3A). גיוס נויטרופילים(lyz:BFP)התעכב בדרך כלל, והתרחש בעיקר לאחר שנביטה פטרייתית התרחשה (איור 3A). בעוד נטל הפטריות נמשך במשך כל הניסוי ברוב הזחלים (איור 3A), נצפתה סיווג (איור 3B). בזחלים מסוימים, נטל פטרייתי מחוץ hindbrain נצפתה גם מאוחר יותר בזיהום, עקב הפצה פטרייתית, ככל הנראה מקרופאגים.
האזור סביב שקע האוטי הוא מקום אפשרי אחד שבו ניתן למצוא הפצה זו (איור 3C). תצפיות אלה כומתו במספר זחלים בודדים במהלך הניסוי כולו (איור 4). בדרך כלל, נביטה נראתה בכ-60% מהזחלים ב-5 dpi(איור 4A). אזור אשכול Phagocyte, גיוס מקרופאג', וגיוס נויטרופילים משתנים הן לאורך זמן והן על פני זחלים, עם כמה מגמות לאורך כל הניסוי וכמה פתרון לאורך זמן(איור 4B, C,D).
איור 1: ניתוח הישרדות מייצג של זחלים נגועים. זחלים נגועים באספרגילוסנחשפו לבקרת רכב (DMSO) או דקסמתזון (דקס), וההישרדות הייתה במעקב. הנתונים מייצגים שלושה עותקים משוכפלים במאגר. CFUs הזרקה ממוצעת: DMSO = 30, Dex = 29 (ערך p ויחס סיכון חושבו על ידי ניתוח רגרסיה סיכון פרופורציונלי קוקס, ****p < 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ספירת CFU מייצג מזחלים נגועים בודדים מיד לאחר ההזרקה (0 dpi) ובמהלך קורס ההדבקה (2, 3, 5 ו- 7 dpi). שמונה זחלים נגועים היו הומוגניים מצופים לספור CFU עבור כל נקודת זמן ולשכפל. (A) נתונים לדוגמה משכפל אחד. כל נקודה מייצגת זחל אחד, מייצגי פעילויות מייצגים אמצעים עבור כל נקודת זמן. (B) ספירות CFU נורמלו לספירת ה- CFU ב- 0 dpi עבור כל שכפול, ושלושה שכפולים אוגדו. הנתונים הושוו בין תנאים ניסיוניים באמצעות ניתוח שונות וסיכום במונחים של אמצעים שוליים משוערים ושגיאות סטנדרטיות. אסטריקס מייצגים מובהקות סטטיסטית בהשוואה ל- CFU ב- 0 dpi (*p < 0.05, **p < 0.01, ****p < 0.0001). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות מניסויי זיהום. זחלים שטופלו ב- PTU עם מקרופאגים פלואורסצנטיים (mpeg1:H2B-GFP) ונויטרופילים (lyz:BFP) הוזרקו עם RFP-מבטא A. fumigatus. זחלים חיים ונגועים צולמו שוב ושוב במיקרוסקופ קונפוקאלי 2, 3 ו-5 dpi. תמונות הקרנה בעוצמה מרבית Z מוצגות. שרטוטים של זחלים מציינים את מיקום ההדמיה עבור כל פאנל. כל סרגלי קנה המידה מייצגים 100 מיקרומטר, למעט סרגלי קנה המידה של הכניסה, שהם 25 מיקרומטר. (A) תמונות המוצגות הן מזחל יחיד שנלקח ב- 2, 3 ו- 5 dpi, המייצג התקדמות זיהום טיפוסית. Insets להראות נביטה פטרייתית בימים 3 ו 5. (B) תמונה מייצגת של תת קבוצה של זחלים שיכולים לנקות את הזיהום, עם נטל פטרייתי נמוך ולא הרבה דלקת ב 5 dpi. (C) תמונה מייצגת של קבוצת משנה של זחלים שבה הזיהום מתפשט מתוך hindbrain בנקודות זמן מאוחרות יותר. בתמונה זו, פטרייה, מקרופאגים ונויטרופילים ניתן למצוא סביב ומתחת לווציקל אוטי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כימות מייצג של ניסויי הדמיה. תמונות ממערך ניסיוני באיור 3 נותחו לצורך נביטה פטרייתית וגיוס לויקוציטים. זחליםהובקעו על נוכחותם של נבגים מונבטים בכל יום, ואחוז הזחלים עם הנביטה חושב. (B, C,D) כל זחל בודד מיוצג כקו צבע שונה. המראה והגודל של אשכול Phagocyte (B), גיוס מקרופגים (C) וגיוס נויטרופילים (D) לוו במהלך הניסוי בן 5 הימים עבור כל זחל. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
מודל הזיהום המתואר כאן מועיל לניתוח התגובות החיסוניות המארחות, אינטראקציות מארח-פתוגן ופתוגנזהפטרייתית 12,13,14,15. מידע זה יכול להיגזר מהדמיה ברזולוציה גבוהה של פתוגנים בעלי תווית פלואורסצנטית ותאים מארחים13, הישרדות זחל והתמדה של CFU לאורך זמן.
טכניקת microinjection היא קריטית להצלחת פרוטוקול זה, ייתכן שיהיה צורך להתאים בעת שימוש בציוד microinjection שונים והגדרות. בפרט, הלחץ וזמן ההזרקה הם שני משתנים עיקריים וניתן להתאים אותם כדי להבטיח כי נפח נפלט על ידי המחט הוא ~ 3 nL. גודל המחט כפי שנקבע על ידי גזירתו עם מלקחיים גם מסדיר את מספר הנבגים מוזרקים; אמנם, פתח גדול יותר יכול לגרום נזק לרקמות הזחל. מצד שני, קטן מדי של פתח לא יאפשר את הנבגים גדולים יחסית (>2 מיקרומטר) החוצה יכול להוביל סתימת מחט. אם זה קורה, המחט ניתן reclipped יש פתח קצת יותר גדול.
פרוטוקולים אחרים עבור microinjection של חיידקים לנצל PVP-40 כדי לסייע בשמירה על תערובת הזרקה הומוגנית, אבל לא מצאנו שום יתרון בשימוש במנשא זה עם נבגי אספרגילוס. סתימת המחט יכולה להיות מופחתת על ידי מערבולת ההכנה הפטרייתית ביסודיות כדי לשבור את כל גושים לפני טעינת המחט. לפעמים, סתימת המחט יכול גם להיות נעקר על ידי הגדלה זמנית של זמן הלחץ או ההזרקה והפעלת microinjector בעוד המחט היא בנוזל המקיף את הזחלים. הלחץ וזמן ההזרקה לאחר מכן צריך להיות ירד שוב לרמות קודמות. במקרים אחרים, לא ניתן להסיר סתימה, ומחט חדשה צריכה להיות טעונה וכיול מחדש.
פרוטוקול זה נועד להזריק ~ 30-70 נבגים לכל זחל. זה ידוע כי בהתבסס על הריכוז של הכנת הנבג ואת נפח מוזרק, מספר זה הוא נמוך למדי. עם זאת, נמצא באופן אמפירי כי זהו מספר הנבגים מוזרקים בתנאים אלה. מדוע הבדל זה מתרחש אינו ידוע, אבל זה יכול להיות בגלל נבג גושים במחט. הניסיונות שלנו להזריק מספר גדול יותר של נבגים לא צלחו ברובם.
כדי להבטיח כ 30-70 נבגים מוזרקים ולשמור על עקביות של זריקות בכל הזחלים, לבדוק את מספר הנבגים על ידי הזרקת על E3 המקיף את הזחלים. חזור על זה כל חמישה עד שישה זחלים לאורך כל הזריקות. אם ספירת הנבגים משתנה, ניתן להתאים את הלחץ ו/או זמן ההזרקה כדי להזריק מספר עקבי של נבגים על פני זחלים מרובים. עם זאת, יש להקפיד כי מינון ההזרקה נשאר בעיקר ב hindbrain ואינו ממלא את midbrain ו forebrain.
כדי להבטיח זיהום מקומי, ההשעיה נבג צריך להיות כלול בתוך החדר hindbrain. זה יכול להיות דמיינו על ידי כתמים אדומים פנול רק לאחר ההזרקה, אם כי הצבע האדום מתפזר עם הזמן. עבור זריקות, האזור סביב vesicle אוטי משמש לנקב דרך ולהגיע לחדר בזווית של 45°-65°. באזור זה אין כלי דם עיקריים, גורם פחות נזק לרקמות, ומרפא באופן מיידי. אם העור מעל החדר הוא פירסינג, ההשעיה נבג ניתן לדלוף החוצה, כי המחט שיש להשתמש בהם עבור זריקות נבג אספרגילוס הוא גדול יותר מזה משמש השעיות חיידקים. זחלים מוזרקים או פגומים בטעות יכולים להיות מסומנים על ידי הזרקת חלמון כמה פעמים כדי ליצור סימן אדום או על ידי גרירת הזחל מחוץ לשורה עם המחט. לאחר קבוצה של זריקות הושלמה, זחלים אלה יש להסיר ולהיפטר לפני השאר נשטפים מהצלחת. E3 ללא כחול מתילן משמש כדי להרדים זחלים לפני ההזרקה וגם לשמור זחלים לאחר הזריקות, כי כחול מתילן הוא אנטי פטרייתי.
בזמן ההזרקה, ספירות CFU מייצגות את מספר הנבגים הקיימים בתוך המארח הנגוע. עם זאת, אם הנבגים לנבוט לתוך hyphae, אלה יכולים להיות מחולקים נפרד קיימא "יחידות פטרייתיות" במהלך הומוגניזציה יכול להוליד מושבות מרובות. לחלופין, היפה רב-תאית רצופה יכולה להוליד מושבה אחת, וכתוצאה מכך ייצוג ממוצע, אך לא סביר, של הנטל הפטריוני. זה יכול להיות מקל על ידי שילוב ספירת CFU עם מיקרוסקופיה אורך של זחלים בודדים, אשר מספק נתונים חזותיים של גורלם של נבגים מוזרקים.
בהשוואה למערכת היונקים, מודל זיהום זחל הזברה משמעותי במיוחד בשל הנגישות האופטית שלו. הגיוס והתגובה של תאי חיסון מולדים ניתן לדמיין בתוך מארח שלם חי. זה יכול להיות משולב עם עיכוב גנטי או כימי של מטרות מולקולריות כדי לנתח כיצד כל מטרה משפיעה על תגובת מקרופאג ' או נויטרופילים נגד נבגי אספרגילוס בבעל חיים.
בעוד זחל זברה אספרגילוס מודל ההדבקה ממשיך להיות אינסטרומנטלי בתיאור היבטים שונים של IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, ישנם תחומים אחרים של התרחבות. מהצד המארח, הוא משמש לתיאור תגובות חיסוניות ברמה התאית, אך ניתן להרחיב זאת כדי לנתח מנגנונים חיסוניים ברמה המולקולרית על ידי שילובו עם מורפולינו ממוקד, CRISPR, קווי מוטנטים יציבים או חשיפה כימית. אזהרה אחת היא כי homologues עבור כל רכיבי מסלול חיסוני מולד יונקים ידועים לא זוהו זברה.
מצד הפתוגן תוארה ארסיות של מינים וזנים שונים. שדרה מבטיחה של מחקר עתידי היא השימוש בזני אספרגילוס מוטנטים כדי לבדוק כיצד גנים או חלבונים ספציפיים תורמים כגורמי ארסיות. ובכך, תרופות אנטי פטרייתיות חדשניות ניתן לפתח כדי למקד חלבונים אלה. תרופות אנטי פטרייתיות הנוכחי יש יעילות נמוכה בחולים אנושיים ויש עמידות גוברת לתרופות אלה פטריות28. מודל זה vivo יכול לשמש כדי לחקור מדוע תרופות אלה להיכשל כמודל ביניים כדי לבדוק את היעילות של תרופות אנטי פטרייתיות הרומן. בסך הכל, הממצאים שהתגלו באמצעות מודל זה יכולים להקל על פיתוח עתידי של טיפולים יעילים לחולים נגועים באספרגילוס.
Disclosures
אין קונפליקטים או אינטרסים פיננסיים לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר K22AI134677. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את השקפותיהם הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Denning, D. W. Invasive aspergillosis. Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
