Summary
Dit protocol beschrijft een Aspergillus infectiemodel in zebravislarven. Aspergillus sporen worden micro-geïnjecteerd in de hindbrain van larven, en chemische behandeling wordt gebruikt om immunosuppressie induceren. Infectieprogressie wordt gecontroleerd via een dagelijkse beeldvormingsopstelling om schimmelgroei en immuunresponsen te monitoren, evenals inventarisatie van levende sporen per kolonievormende eenheidsplating.
Abstract
Invasieve aspergillose (IA) is een van de meest voorkomende schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde personen. Ondanks de beschikbaarheid van antischimmelmiddelen kan IA > 50% mortaliteit veroorzaken bij geïnfecteerde immuungecompromitteerde patiënten. Het is cruciaal om zowel gastheer- als ziekteverwekkerfactoren te bepalen die bijdragen aan de gevoeligheid voor infecties en lage overlevingspercentages bij geïnfecteerde patiënten om nieuwe therapieën te ontwikkelen. Aangeboren immuunreacties spelen een cruciale rol bij de herkenning en klaring van Aspergillus-sporen, hoewel er weinig bekend is over de exacte cellulaire en moleculaire mechanismen. Betrouwbare modellen zijn nodig om gedetailleerde mechanistische interacties tussen de gastheer en de ziekteverwekker te onderzoeken. De optische helderheid en genetische tractabiliteit van zebravislarven maken ze een intrigerend model om gastheer-pathogene interacties van meerdere menselijke bacteriële en schimmelinfecties in een levende en intacte gastheer te bestuderen. Dit protocol beschrijft een larvale zebravis Aspergillus infectie model. Ten eerste worden Aspergillus-sporen geïsoleerd en via micro-injectie in de achterhersenen ventrikel van de zebravis geïnjecteerd. Vervolgens worden chemische remmers zoals immunosuppressieve geneesmiddelen rechtstreeks aan het larvale water toegevoegd. Twee methoden om de infectie in geïnjecteerde larven te controleren worden beschreven, waaronder de 1) homogenisatie van larven voor kolonievormende eenheid (CFU) opsomming en 2) een herhaalde, dagelijkse live beeldvorming. Over het algemeen kunnen deze technieken worden gebruikt om mechanistisch de progressie van Aspergillus-infectie in vivo te analyseren en kunnen ze worden toegepast op verschillende gastheerachtergronden en Aspergillus-stammen om gastheer-pathogene interacties te ondervragen.
Introduction
Aspergillus fumigatus is een alomtegenwoordige saprofytische schimmel, en de sporen in de lucht zijn zowel binnen als buiten te vinden1. Deze sporen worden door iedereen ingeademd, maar worden effectief verwijderd uit de longen van immunocompetente individuen1,2. Mensen met veranderde longaandoeningen zoals cystische fibrose kunnen echter bronchopulmonale aspergillose ontwikkelen als gevolg van schimmelkieming in de longen3. De ernstigste vorm van deze infectie, invasieve aspergillose (IA), treft immuungecompromitteerde individuen en omvat de groei van de schimmel in andere organen2,3. IA leidt tot >50% dood van geïnfecteerde patiënten ondanks de beschikbaarheid van antischimmeltherapieën4. Bij immunocompetente individuen spelen aangeboren immuunresponsen een belangrijke rol bij het opruimen van de geïnhaleerde sporen1. De specifieke mechanismen die bijdragen aan deze aangeboren immuunklaring zijn echter niet goed begrepen. Het is belangrijk om de cellulaire en moleculaire mechanismen van belangrijke aangeboren immuuncellen (d.w.z. macrofagen en neutrofielen) te begrijpen bij de klaring van Aspergillus om nieuwe therapeutische strategieën voor IA te vinden.
Hoewel zoogdiermodellen een belangrijke rol hebben gespeeld bij het identificeren van schimmelvirulentiefactoren en immuunresponsen van gastheer5,6, is de visuele toegankelijkheid beperkt voor interacties tussen gastheer en ziekteverwekker op cellulair niveau. Weefselkweekexperimenten kunnen de complexe multicellulaire omgeving en interacties die bij hele dieren bestaan niet volledig samenvatten7. Daarom is zebravis populair geworden als alternatief modelorganisme om deze kloof op te vullen en de studie van gastheer-pathogene interacties in een levende, intacte gastheer over een meerdaagse infectie8,9tevergemakkelijken . Het aangeboren immuunsysteem van zebravissen ontwikkelt zich al 24 uur na de bevruchting (hpf)10, en het adaptieve systeem duurt 4-6 weken omer 11te ontwikkelen , wat een tijdsvenster biedt waarin aangeboren immuunresponsen afzonderlijk kunnen worden beoordeeld. Aangeboren immuunresponsen zijn goed bewaard gebleven tussen mensen en zebravissen11. Zebravissen hebben veel kwaliteiten die het onderzoek van deze reacties vergemakkelijken, waaronder optische helderheid (die de hoge resolutie live beeldvorming van intacte gastheren mogelijk maakt) en genetische tracteerbaarheid (wat moleculaire mechanistische studies vergemakkelijkt).
De larvale zebravis Aspergillus infectie model hier beschreven werd oorspronkelijk ontwikkeld door Knox et al.12. Het is onlangs uitgebreid door onze groep en anderen om gastheer immuunmechanismen12,13,gastheer-pathogeneinteracties13, 14,15, mechanismen van immunosuppressie13,16,17,schimmel virulentie18,en anti-schimmel drug werkzaamheid19,20te onderzoeken . Dit model vat meerdere aspecten van menselijke aspergillose samen. Hoewel immunocompetente larven resistent zijn, kunnen immuungecompromitteerde larven bezwijken aan infectie12,13,16,17.
In dit model wordt een gelokaliseerde infectie vastgesteld door sporen in de achterhersenen ventrikel van larve te injecteren, een gebied dat minder bevolkt is met fagocyten, en fagocyt rekrutering en gedrag kunnen worden geëvalueerd12,13. Er wordt aangenomen dat macrofagen fungeren als de eerste verdedigingslinie tegen Aspergillus-sporen bij mensen1 en zoogdiermodellen6,21. Evenzo worden in het zebravismodel macrofagen gerekruteerd voor de geïnjecteerde Aspergillus-sporen, terwijl neutrofielen op de tweede plaats worden gerekruteerd als reactie op hyphalgroei12,13,22. Van dit model, het is ook geleerd dat Aspergillus kan blijven in wildtype immunocompetente larven na meer dan 7 dagen van infectie. Bovendien kan het hele verloop van de infectie bij dezelfde levende dieren worden gevolgd door dagelijkse confocale beeldvorming.
Dit protocol beschrijft de techniek van micro-injectie om sporen in de achterhersenen van 2 dagen na bevruchting (2 dpf) larven te injecteren. De infectie wordt vervolgens tot 7 dagen gecontroleerd, omdat zebravislarven tot 10 dpf kunnen leven zonder zich te voeden. Immunosuppressie kan worden geïnduceerd door medicamenteuze behandeling en de toepassing van geneesmiddelen op de larven wordt ook beschreven. Ten slotte worden twee methoden beschreven om infectieprogressie te volgen, waaronder kwantificering van CFUs van individuele larven en een dagelijkse live imaging-opstelling.
Protocol
Onderzoekers moeten goedkeuring krijgen voor alle dierproeven van de juiste comités voor dierverzorging en -gebruik. Representatieve gegevens in dit artikel zijn afkomstig van experimenten die zijn uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Clemson University Institutional Animal Care and Use Committee (AUP2018-070, AUP2019-012).
1. Bereiding van Aspergillus sporen voor injectie
- Bereken uit een Aspergillus-sporensuspensie het volume dat nodig is om 1 x 106 sporen te verkrijgen. Het volume moet 20–100 μL zijn; zo niet, produceer dan een verdunning van 10x in 0,01% (v/v) steriele Tween-20 (Tween-water; Tabel met materialen). Als het berekende volume bijvoorbeeld 5 μL is, produceer dan een verdunning van 10x en gebruik 50 μL van de verdunde oplossing.
OPMERKING: Twee platen/stam kunnen worden voorbereid om meer sporen te verzamelen of als reserve in geval van verontreiniging. - Verdeel 1 x 106Aspergillus sporen op één glucose minimal media (ALV) plaat(Table of Materials)met een steriele wegwerp L-vormige spreider in een bioveiligheidskast. Vermijd verspreiding naar de rand van de plaat. Incubeer gedurende 3-4 dagen bij 37 °C, met de plaat ondersteboven.
- Breng op de dag van inzameling steriel miradoek en 50 ml conische buizen (twee per stam), verse flessen steriel Tween-water (één per stam) en steriele wegwerp L-vormige spreiders naar de bioveiligheidskast.
OPMERKING: Miracloth kan in ~8 in x 6 in stukken worden gesneden, in folie worden gewikkeld en worden geautoclaveerd om te steriliseren. - Plaats een stuk miradoek in elke gelabelde 50 ml conische buis en re-cap. Haal het resterende miradoekpakket uit de motorkap.
- Breng platen in de bioveiligheidskast. Open een bord en giet vervolgens Tween-water op de bovenkant om ongeveer driekwart van de plaat te bedekken.
- Schraap met behulp van een wegwerp L-vormige spreider het oppervlak van de schimmelcultuur voorzichtig in een heen-en-weer beweging, terwijl u de andere hand gebruikt om de plaat te draaien. Schraap tot bijna alle sporen gehomogeniseerd zijn in het Tween-water.
OPMERKING: Vanwege de hoge hydrofobiciteit kunnen sporen "pufjes" veroorzaken wanneer Tween-water wordt toegevoegd of tijdens het schrapen. Er moet goed op worden gelet dat er geen verontreiniging van nabijgelegen buizen of platen is. Het wordt aanbevolen om handschoenen te verwisselen en het oppervlak af te vegen met 70% ethanol tussen extractie van verschillende stammen. - Neem een conische buis van 50 ml en verwijder het stuk miradoek. Vouw het doormidden en maak er een filter van dat in de bovenkant van de 50 ml conische buis is geplaatst.
- Giet het schimmelhomogenaat van de plaat over het miradoek in de buis.
OPMERKING: Als twee platen van één soort zijn voorbereid, schraapt u beide platen en giet u ze in dezelfde conische buis. - Giet Tween-water om het totale volume in de conische buis op 50 ml te brengen.
- Draai op 900 x g gedurende 10 min. Zorg ervoor dat u aërosol-voorkomende doppen in de centrifuge gebruikt.
- Giet het supernatant af in ~10% bleekoplossing om te ontsmetten. Giet 50 ml steriele 1x PBS in de conische buis en draai of schud vervolgens om de pellet opnieuw te gebruiken.
- Draai opnieuw op 900 x g gedurende 10 min. Giet het supernatant eraf en resuspendeer de pellet in 5 ml steriel 1x PBS. Filtreer door een vers stuk miradoek in een verse conische buis van 50 ml.
- Maak 10-voudige seriële verdunningen (10x, 100x, 1000x) van het schimmelhomogenaat in 1,7 ml centrifugebuizen (meng bijvoorbeeld voor de 10x-oplossing 100 μL van het schimmelhomogenaat met 900 μL Tween-water).
- Kies de eerste verdunning waarbij de sporen niet zichtbaar zijn wanneer deze in Tween-water worden geloosd en gebruik deze verdunning om het aantal sporen te tellen met behulp van een hemocytometer.
- Bereken de sporenconcentratie in het bereide schimmelhomogenaat (watersuspensie) met behulp van de volgende formule:
Concentratie (sporen/ml) = Aantal sporen in het midden 25 dozen x verdunningsfactor x 104 - Bereid een voorraad van 1 ml van 1,5 x 108 sporen/ml in steriele 1x PBS in een microcentrifugebuis van 1,7 ml. Dit sporenpreparaat kan ~4 weken bij 4 °C bewaard worden.
- Meng vóór gebruik in injecties 20 μL van het sporenpreparaat met 10 μL steriel fenolrood in een centrifugebuis van 1,7 ml om een uiteindelijke sporenconcentratie van 1 x 108 sporen/ml te bereiken. Vortex grondig voorafgaand aan injectie.
OPMERKING: 1% fenolrode oplossing moet worden gesteriliseerd en opgeslagen in aliquots. - Meng voor een proefinjectie 20 μL 1x PBS met 10 μL steriel fenolrood.
2. Bereiding van agarplaten voor injectie
- Bereid 2% agarose in E3 medium en smelt in een magnetron.
- Giet in een petrischaal van 100 mm x 15 mm (~ 25 ml per plaat), wervel om de plaat gelijkmatig te bedekken en laat afkoelen.
- Wikkel de plaat in met paraffinefolie en bewaar omgekeerd bij 4 °C.
- Breng de plaat vóór de injectie op kamertemperatuur (RT).
- Giet ~1 ml gesteriliseerd filter 2% runderserumalbumine (BSA) op de plaat, kantel de plaat om de hele bodem te spreiden en te bedekken en spoel af met E3.
OPMERKING: 2% BSA-oplossing kan worden gefilterd en opgeslagen als 1 ml aliquots bij -20 °C. 2% BSA-voorbehandeling voorkomt dat larven zich aan het oppervlak van de agarose hechten. - Giet E3 met gebufferde tricaïne op de plaat en laat het zitten tot de injectie.
3. Zebravis larve hindbrain ventrikel micro-injection
- Handmatig dechorionaatlarven met tang bij 2 dpf in een Petrischaal.
OPMERKING: Dechorionatie kan op elk moment worden uitgevoerd vanaf 1,5 dpf tot het moment van injectie. - Haal zoveel mogelijk E3 uit de Petrischaal en voeg gebufferde 300 μg/ml tricaïne in E3 toe om larven te verdoven.
OPMERKING: Een voorraadoplossing van gebufferde 4 mg/ml tricaïne in E3 kan worden bereid en bewaard bij 4 °C. De werkoplossing kan worden gemaakt door 4 ml van de voorraadoplossing tot 50 ml met E3 te verdunnen. - Gebruik een micro-injector die wordt geleverd met de drukinjector, tegendrukeenheid, voetschakelaar, micropipethouder, micromanipulator en een magnetische standaard en plaat, allemaal verbonden met een bron van perslucht (Tabel van materialen).
- Open de persluchtklep en schakel de micro-injector in. Stel de druk in op ~25 PSI, de pulsduur op 60 ms en de backpressuur-eenheid op 1 PSI.
- Laad een micro-injectienaald met behulp van een pipetpunt van de microloader (Tafel van materialen) met ongeveer 3-5 μL bereide PBS- of sporensuspensie met fenolrood. Monteer de naald op de micromanipulator.
OPMERKING: Micro-injectienaalden kunnen worden bereid zoals eerder beschreven23. De stereomicroscoop die wordt gebruikt voor micro-injections moet een oogstuk reticle hebben om de micro-injectienaald te kalibreren. Het reticle moet worden gekalibreerd met een stadiummicrometer en de lengte van de reticleschaal (μm) moet worden bepaald. De diameter van de sporensuspensiedruppel die uit de naald wordt geworpen, wordt gemeten afhankelijk van het aantal hashes (van het reticle) dat overlapt met de druppel. - Plaats de micromanipulator zo dat het uiteinde van de naald bij de laagste vergroting onder de stereomicroscoop in het zicht is. Zoom in op 4x vergroting, zodat de naald in het zicht blijft.
- Knip met een scherpe tang het uiteinde van de naald. Druk op het injectiepedaal om de grootte van de druppel die eruit komt te visualiseren. Blijf terugknippen totdat ~3 nL sporensuspensie is geïnjecteerd (hier is dit vijf hashes).
- Beweeg micromanipulator en naald uit de weg om te voorkomen dat de naald per ongeluk wordt geraakt terwijl de larven op de injectieplaat zijn gerangschikt.
- Giet E3-Tricaine van de injectieplaat en breng vervolgens ~ 24 verdoofde larven over naar de injectieplaat met zo min mogelijk E3 met behulp van een transferpipet.
- Gebruik een klein hulpmiddel voor het manipuleren van zebravislarven (d.w.z. haarlusgereedschap of wimpergereedschap), schik de larven volgens de richting waarin ze zich bevinden. Plaats met name alle naar rechts gerichte in één rij en alle naar links in een rij hieronder.
OPMERKING: Deze opstelling is moeilijk als er te veel vloeistof op de plaat zit, omdat de larven niet op hun plaats zullen "zweven". Te weinig vloeistof is echter ook problematisch als de injecties lang duren, omdat de larven kunnen uitdrogen of anesthesie kan slijten. Daarom moet zorgvuldig worden gelet op de hoeveelheid vloeistof op de plaat gedurende het hele micro-injectieproces. - Pas de microscoopzoom aan op de laagste vergroting. Breng de micromanipulator terug en schik zodat de naald zich dicht bij de larven bevindt, onder een hoek van ~ 30 ° - 60 ° in het midden van het gezichtsveld.
- Zoom in op de hoogste vergroting en gebruik fijne instelknoppen om de positie van de naald verder aan te passen. Controleer of ~30-70 sporen uit de naald komen door de sporensuspensie in de vloeistof op de plaat naast de larven te injecteren. Pas indien nodig de tijd en druk op de injectie-instelling aan.
OPMERKING: Deze test moet na elke vijf tot zes larven worden herhaald, omdat het aantal sporen dat uit de naald komt in de loop van de tijd kan toenemen of afnemen. - Begin met de rij waarin de larven naar de naald zijn gericht, beweeg de plaat zodat de naald direct boven is en in de buurt van de eerste larven is geplaatst.
- Beweeg de naald met de micromanipulator, steek de naald door het weefsel rond het blaasje om door te prikken in de ventrikel van de achterhersenen. Beweeg de plaat indien nodig met de andere hand om de juiste oriëntatie van de larve te krijgen met de hoek van de naald.
- Controleer visueel of het uiteinde van de naald zich in het midden van de ventrikel van de achterwervel bevindt, druk op het voetpedaal om sporen te injecteren en trek de naald voorzichtig terug.
OPMERKING: De fenolrode kleurstof moet voornamelijk in de ventrikel van de achterhersenen blijven. Een kleine hoeveelheid kan in de middenhersenen gaan, maar het mag de voorhersenen of buiten de hersenen niet bereiken. Als dit het doet, is het ingespoten volume te groot en moeten de druk en tijd dienovereenkomstig worden verlaagd of moet een nieuwe naald worden gekalibreerd. - Als je over de plaat beweegt, injecteer je alle larven in die rij. Draai vervolgens de plaat om en injecteer alle larven in de andere rij.
OPMERKING: Tevergeefs geïnjecteerde of per ongeluk beschadigde larven kunnen worden gemarkeerd door 1) een paar keer in de dooier te injecteren om een rode markering te creëren of 2) de larve met de naald uit de rij te slepen. - Beweeg de naald weer omhoog en uit de weg. Zoom uit naar een lagere vergroting op de microscoop. De fenolrode kleurstof moet nog steeds zichtbaar zijn in de achterhersenen van elke larve.
- Trek eerst weg met haarlusgereedschap en pipet omhoog om larven met mislukte injecties te verwijderen. Breng de resterende larven over in een nieuwe petrischaal door ze van het bord te wassen met verse steriele E3 en een transferpipet.
- Herhaal dit indien nodig voor het gewenste definitieve experimentele monsternummer.
- Spoel larven minstens 2x met E3 en zorg voor herstel van anesthesie.
- Om de overleving te kwantificeren zonder verdere behandeling, met behulp van een transferpipet, breng je larven over in een 96 putplaat (1 larve per put) in E3.
4. Vaststelling van geïnjecteerde en levensvatbare sporenaantallen
- Onmiddellijk na injectie, met behulp van een transferpipet, willekeurig ongeveer acht van de geïnjecteerde larven plukken en overbrengen naar 1,7 ml centrifugebuizen (één larve per buis).
- Euthanaseer larven met tricaïne of door ze gedurende 0,5-2,0 uur op 4 °C te plaatsen.
- Bereid 1 ml 1 mg/ml ampicilline en 0,5 mg/ml kanamycine-antibioticaoplossingen in steriel 1x PBS. De overgebleven oplossing kan bij 4 °C worden bewaard en later worden gebruikt.
OPMERKING: Voorraadoplossingen van ampicilline bij 100 mg/ml en kanamycine 50 mg/ml kunnen vooraf worden opgemaakt, gefilterd en opgeslagen in aliquots bij -20 °C. Verdun deze 100x in 1x PBS om de werkoplossing te verkrijgen. - Verwijder met behulp van een pipet zoveel mogelijk vloeistof uit de centrifugebuis, laat de larve achter en voeg 90 μL van de 1x PBS toe met antibiotica.
OPMERKING: Antibiotica worden gebruikt om bacteriële groei in ALV-platen te voorkomen die het tellen van Aspergillus-kolonies kunnen verstoren. - Homogeniseer larven in een weefsellyser bij 1.800 oscillaties/min (30 Hz) gedurende 6 min. Draai naar beneden op 17.000 x g gedurende 30 s.
- Label ALV platen (één plaat per gehomogeniseerde larven). Gebruik een Bunsen-brander om een steriele omgeving te creëren, pipetteer de gehomogeniseerde suspensie van de ene buis naar het midden van de ALV-plaat en verspreid vervolgens met een wegwerp L-vormige spreider. Vermijd het verspreiden van het homogenaat tegen de rand.
- Incubeer de platen ondersteboven bij 37 °C gedurende 2-3 dagen en tel het aantal gevormde kolonies (CFU).
- Om het aantal sporen levend te meten tijdens de infectieperiode, plukt u larven van de 96 putplaat na 1-7 dagen na injectie (dpi) en zet u ze over in centrifugebuizen. Euthanaseer en homogeniseer larven om zich te verspreiden op ALV-platen zoals beschreven in stap 4.1–4.5.
5. Medicamenteuze behandeling van geïnjecteerde larven
- Splits na sectie 4 de resterende geïnjecteerde larven in twee gerechten van 3,5 mm: één voor de medicamenteuze behandeling en één voor de controle. Gebruik ongeveer 24 geïnfecteerde larven per aandoening.
OPMERKING: De 3,5 mm-schotels kunnen worden behandeld met 2% vetvrije droge melk in water, gespoeld, aan de lucht gedroogd en van tevoren bij RT worden bewaard. Coating met melk voorkomt dat larven aan het plastic blijven plakken. - Bereid de gewenste medicijnoplossing en het voertuig in E3 zonder methyleenblauw in conische buizen volgens de vereiste uiteindelijke concentratie en meng vervolgens goed. Gebruik bijvoorbeeld 24 larven (duplo's) voor dexamethason en 24 voor de voertuigcontrole, zoals DMSO, om de overleving van larven die zijn blootgesteld aan dexamethason te controleren. Bereid 5 ml van de medicijnoplossing in de vereiste concentratie. Hier werden 5 ml 0,1% DMSO en 10 μM dexamethason gebruikt en werden 24 larven/conditie overgebracht naar ~200 μL van het voertuig/geneesmiddeloplossing/larven.
- Haal zoveel mogelijk vloeistof uit één schaal met een transferpipet en voeg voorgemengde E3 toe met voertuigbesturing. Herhaal dit met voorgemengde E3 met de behandeling van belang voor het andere gerecht.
- Breng met behulp van een pipet larven over in 96 putplaat (één larve per put). Controleer de overleving van geïnjecteerde larven die gedurende 7 dagen aan het voertuig of het medicijn zijn blootgesteld.
OPMERKING: Medicijn kan alleen op de dag van infectie worden aangebracht en gedurende het hele experiment op de larven worden bewaard of kan dagelijks worden vernieuwd.
6. Dagelijkse beeldvorming van geïnfecteerde larven met behulp van het zebravis wond- en beknellingsapparaat voor groei en beeldvorming (zWEDGI)
- Zorg ervoor dat larven worden behandeld met 100 μM N-fenylthiourea (PTU) bij 24 hpf om pigmentatie te voorkomen en dat PTU gedurende het hele experiment op de larven wordt gehouden.
OPMERKING: PTU bij 75–100 μM voorkomt pigmentatie van larven zonder grove ontwikkelingsstoornissen24. PTU kan echter interfereren met sommige biologische processen25, en onderzoekers moeten van tevoren bepalen of het medicijn van invloed kan zijn op alle onderzochte processen. - Infecteer transgene larven met gelabelde celpopulaties van belang bij 2 dpf met Aspergillus-sporen die zijn ontworpen om een fluorescerend eiwit uit te drukken, zoals beschreven in sectie 3. Breng vervolgens geïnfecteerde larven over in putten van een plaat van 48 put in ongeveer 500 μL/put E3 zonder methyleenblauw.
OPMERKING: Hier wordt een putplaat van 48 well gebruikt, omdat het gemakkelijker is om larven in en uit te brengen tijdens herhaalde dagelijkse beeldvorming. - Bereid op de dag van beeldvorming twee Petrischalen van 3,5 mm: één met 100 μM PTU en één met E3-tricaïne.
- Voeg E3-tricaïne toe aan de kamers van een zWEDGI-apparaat26,27. Verwijder onder de stereomicroscoop luchtbellen uit de kamers en het inperkingskanaal met behulp van een P100-micropipet. Verwijder alle overtollige E3-tricaïne, zodat het alleen in de kamers is.
- Pipetteer een larve van de plaat met behulp van een transferpipet. Als er veel vloeistof wordt gebruikt om het te verwijderen, pipet in een schaal van 3,5 mm met E3-PTU. Pipetteer vervolgens opnieuw, gebruik zo min mogelijk vloeistof en breng over in E3-tricaine.
- Wacht ~30 s op anesthesie en breng vervolgens over in de laadkamer van het wond- en beknellingsapparaat (bijv. zWEDGI).
- Plaats de larve onder de stereomicroscoop. Gebruik de P100 micropipet om E3-tricaïne uit de wondkamer te verwijderen en los te laten in de laadkamer om de staart van de larve in het beperkingskanaal te verplaatsen. Zorg ervoor dat de larve zich aan de laterale, dorsale of dorso-laterale kant bevindt, zodat de achterhersenen kunnen worden afgebeeld met een omgekeerde objectieve lens.
- De larve van het beeld met een confocale microscoop.
- Laat na beeldvorming, met de P100 pipet, E3-tricaine los in de wondkamer om de larve van het bevestigingskanaal in de laadkamer te duwen.
- Pak met behulp van een transferpipet de larve op en breng deze terug naar de Petrischaal met E3-Tricaine. Breng het met zo min mogelijk vloeistof over in de Petrischaal met E3-PTU. Spoel af in PTU en breng terug in de 48 putplaat.
Representative Results
Na micro-invoeging van Aspergillus-sporen in de achterhersenen van zebravislarven, kan het infectieresultaat worden gevolgd door meerdere assays, waaronder overleving, CFUs en levende beeldvorming. Bij een overlevingstest werd het aantal geïnfecteerde larven dat 1-7 dpi overleefde, gecontroleerd. Wanneer wildtypelarven onbehandeld bleven, werd zeer weinig dood waargenomen, waarbij ~80%-100% van de larven het hele experiment overleefde (Figuur 1). Als larven immunosuppressivum waren, bijvoorbeeld door blootstelling aan het corticosteroïdgeneesmiddel dexamethason (10 μM), werd een significant verminderde overleving waargenomen (figuur 1).
Toen CFUs gedurende het 7-daagse experiment werden gekwantificeerd van wildtypelarven die besmet waren met A. fumigatus-sporen, werd persistentie van sporen waargenomen, met langzame klaring in de loop van de tijd (Figuur 2A). Het aantal sporen dat overleefde bij 1, 2, 3, 5 en 7 dpi werd genormaliseerd tot het aantal sporen geïnjecteerd bij 0 dpi om persistentie en klaring tussen replicates te vergelijken (Figuur 2B).
Transgene vislijnen die fluorescerende eiwitten in leukocyten uitdrukken samen met fluorescerende eiwituitdrukkende Aspergillus-sporen kunnen worden gebruikt om zowel leukocytenwerving als gedrag te visualiseren, evenals schimmelkieming en groei13. Wanneer macrofagen werden gelabeld (bijv. Tg(mpeg1:H2B-GFP)), werd macrofaagclustering in ~ 50% van de larven meestal waargenomen, beginnend bij 2-3 dpi (figuur 3A). De rekrutering van neutrofielen (Tg(lyz:BFP)) werd meestal vertraagd, voornamelijk na schimmelkieming (figuur 3A). Terwijl de schimmelbelasting voor het hele experiment bij de meeste larven aanhield (figuur 3A), werd klaring waargenomen (figuur 3B). Bij sommige larven werd schimmellast buiten de hindbrain ook later in infectie waargenomen, als gevolg van schimmelverspreiding, waarschijnlijk in macrofagen.
Het gebied rond het blaasje is een mogelijke locatie waar deze verspreiding te vinden is (Figuur 3C). Deze waarnemingen werden in de loop van het hele experiment gekwantificeerd in meerdere individuele larven (figuur 4). Typisch, ontkieming werd gezien in ~60% van larven door 5 dpi (Figuur 4A). Phagocyt clustergebied, macrofaag rekrutering en neutrofiele rekrutering variëren zowel in de loop van de tijd als tussen larven, waarbij sommige trending up tijdens het experiment en sommige oplossen in de loop van de tijd (Figuur 4B, C, D).
Figuur 1: Representatieve overlevingsanalyse van geïnfecteerde larven. Aspergillus-geïnfecteerdelarven werden blootgesteld aan voertuigcontrole (DMSO) of dexamethason (Dex) en de overleving werd gecontroleerd. Gegevens vertegenwoordigen drie samengevoegde replica's. Gemiddelde injectie CFUs: DMSO = 30, Dex = 29 (p-waarde en hazard ratio werden berekend door Cox proportionele hazard regressie analyse, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Representatieve CFU-tellingen van individuele geïnfecteerde larven onmiddellijk na injectie (0 dpi) en tijdens infectiekuur (2, 3, 5 en 7 dpi). Acht geïnfecteerde larven werden gehomogeniseerd en geplateerd om CFU voor elk tijdspunt te tellen en te repliceren. (A) Voorbeeldgegevens van één replica. Elk punt vertegenwoordigt één larve, staven vertegenwoordigen middelen voor elk tijdpunt. (B) CFU-tellingen werden genormaliseerd tot de CFU-telling op 0 dpi voor elke replica en drie replica's werden samengevoegd. De gegevens werden vergeleken tussen experimentele omstandigheden met behulp van analyse van variantie en samengevat in termen van geschatte marginale middelen en standaardfouten. Asterix vertegenwoordigt statistische significantie in vergelijking met CFU bij 0 dpi (*p < 0,05, **p < 0,01, ****p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: Representatieve beelden van infectie-experimenten. PTU-behandelde larven met fluorescerende macrofagen (mpeg1:H2B-GFP) en neutrofielen (lyz:BFP) werden geïnjecteerd met RFP-expresserende A. fumigatus. Levende, geïnfecteerde larven werden herhaaldelijk afgebeeld op 2, 3 en 5 dpi op een confocale microscoop. Maximale intensiteit Z-projectiebeelden worden weergegeven. Schema's van larven geven de locatie van de beeldvorming voor elk paneel aan. Alle schaalbalken vertegenwoordigen 100 μm, met uitzondering van de ingezette schaalbalken, die 25 μm zijn. (A) De getoonde afbeeldingen zijn afkomstig van een enkele larve genomen op 2, 3 en 5 dpi, wat een typische infectieprogressie vertegenwoordigt. Insets vertonen schimmelkieming op dag 3 en 5. (B) Representatief beeld van subset van larven die de infectie kunnen verwijderen, met lage schimmelbelasting en niet veel ontsteking bij 5 dpi. (C) Representatief beeld van de subset van larven waarin de infectie zich op latere tijdstippen uit de achterhersenen verspreidt. In deze afbeelding zijn schimmels, macrofagen en neutrofielen te vinden rond en onder het blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 4: Representatieve kwantificering van beeldvormingsexperimenten. Beelden van experimentele opstelling in figuur 3 werden geanalyseerd op schimmelkieming en leukocytenwerving. (A) Larven werden elke dag gescoord op de aanwezigheid van ontkiemde sporen en het percentage larven met kieming werd berekend. (B, C, D) Elke individuele larve wordt weergegeven als een andere kleurlijn. Fagocytcluster uiterlijk en grootte (B), macrofaag rekrutering (C) en neutrofiele rekrutering (D) werden gevolgd in de loop van het 5-daagse experiment voor elke larve. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Discussion
Het hier beschreven infectiemodel is gunstig voor het analyseren van de immuunresponsen van de gastheer, interacties tussen gastheer en pathogene ziekteverwekkers en schimmelpathogenese12,13,14,15. Deze informatie kan worden afgeleid uit de hoge resolutie beeldvorming van fluorescerende pathogenen en gastheercellen13,larvale overleving en CFU persistentie in de loop van de tijd.
De micro-injectietechniek is van cruciaal belang voor het succes van dit protocol en moet mogelijk worden aangepast bij het gebruik van verschillende micro-injectieapparatuur en -opstellingen. In het bijzonder zijn de druk en het tijdstip van injectie twee belangrijke variabelen en kunnen worden aangepast om ervoor te zorgen dat het volume dat door de naald wordt uitgeworpen ~ 3 nL is. De grootte van de naald zoals bepaald door het te knippen met een tang reguleert ook het aantal sporen dat wordt geïnjecteerd; hoewel een grotere opening weefselschade aan de larve kan veroorzaken. Aan de andere kant zal een te kleine opening de relatief grote sporen (>2 μm) niet naar buiten laten en kan leiden tot naaldverstopping. Als dit gebeurt, kan de naald opnieuw worden vastgeklemd om een iets grotere opening te hebben.
Andere protocollen voor micro-injection van bacteriën gebruiken PVP-40 om te helpen handhaven van een homogene injectie mengsel, maar we hebben geen voordeel gevonden in het gebruik van deze drager met Aspergillus sporen. Verstopping van de naald kan worden verholpen door het schimmelpreparaat grondig te vortexen om eventuele klonten te breken voordat de naald wordt geladen. Soms kan een verstopping in de naald ook worden losgemaakt door de druk of injectietijd tijdelijk te verhogen en de micro-injector te activeren terwijl de naald zich in de vloeistof rond de larven bevindt. De druk en injectietijd moeten dan opnieuw worden verlaagd tot eerdere niveaus. In andere gevallen kan een verstopping niet worden verwijderd en moet een nieuwe naald worden geladen en opnieuw worden gekalibreerd.
Dit protocol is ontworpen om ~30-70 sporen per larve te injecteren. Het is bekend dat op basis van de concentratie van het sporenpreparaat en het geïnjecteerde volume, dit aantal vrij laag is. Er is echter empirisch vastgesteld dat dit het aantal sporen is dat onder deze omstandigheden wordt geïnjecteerd. Waarom dit verschil optreedt is onbekend, maar het kan te wijten zijn aan sporen die in de naald klonteren. Onze eigen pogingen om grotere aantallen sporen te injecteren zijn grotendeels mislukt.
Om ervoor te zorgen dat ongeveer 30-70 sporen worden geïnjecteerd en de consistentie van de injecties in alle larven te behouden, controleert u het aantal sporen door te injecteren op de E3 rond de larven. Herhaal dit elke vijf tot zes larven tijdens alle injecties. Als het aantal sporen lijkt te veranderen, kan de druk en/of injectietijd worden aangepast om een consistent aantal sporen over meerdere larven te injecteren. Er moet echter voor worden gezorgd dat de injectiedosis voornamelijk in de achterhersenen blijft en de middenhersenen en voorhersenen niet vult.
Om een gelokaliseerde infectie te garanderen, moet de sporensuspensie in de ventrikel van de achterhersenen worden opgenomen. Dit kan worden gevisualiseerd door de fenolrode kleuring net na de injectie, hoewel de rode kleur met de tijd verspreidt. Voor injecties wordt het gebied rond het blaasje gebruikt om de ventrikel onder een hoek van 45°–65° door te prikken en te bereiken. Dit gebied heeft geen hoofdbloedvaten, veroorzaakt minder weefselschade en geneest onmiddellijk. Als de huid over de ventrikel wordt doorboord, kan de sporensuspensie worden uitgelekt, omdat de naald die moet worden gebruikt voor Aspergillus-sporeninjecties groter is dan die wordt gebruikt voor bacteriële suspensus. Tevergeefs geïnjecteerde of per ongeluk beschadigde larven kunnen worden gemarkeerd door een paar keer in de dooier te injecteren om een rode markering te creëren of door de larve met de naald uit de rij te slepen. Nadat een set injecties is voltooid, moeten deze larven worden verwijderd en verwijderd voordat de rest van de plaat wordt gewassen. E3 zonder methyleenblauw wordt gebruikt om larven voorafgaand aan de injectie te verdoven en ook de larve na de injecties te houden, omdat methyleenblauw antischimmel is.
Op het moment van injectie vertegenwoordigen CFU-tellingen het aantal levensvatbare sporen in de geïnfecteerde gastheer. Als de sporen echter ontkiemen tot hyphae, kunnen deze tijdens homogenisatie worden opgesplitst in afzonderlijke levensvatbare "schimmeleenheden" en kunnen ze aanleiding geven tot meerdere kolonies. Of een ononderbroken meercellige hypha kan aanleiding geven tot een enkele kolonie, wat resulteert in een gemiddelde, maar onnauwkeurige weergave van de schimmellast. Dit kan worden verzacht door de CFU-tellingen te combineren met longitudinale microscopie van individuele larven, die visuele gegevens biedt over het lot van geïnjecteerde sporen.
In vergelijking met het zoogdiersysteem is het infectiemodel van de zebravislarve bijzonder belangrijk vanwege de optische toegankelijkheid. De rekrutering en respons van aangeboren immuuncellen kan worden gevisualiseerd in een levende intacte gastheer. Dit kan worden opgenomen met genetische of chemische remming van moleculaire doelen om te analyseren hoe elk doelwit de macrofaag of neutrofiele reactie tegen Aspergillus-sporen bij een levend dier beïnvloedt.
Terwijl de zebravis larve Aspergillus infectie model blijft instrumenteel in het beschrijven van verschillende aspecten van IA12,13,14,15,16,17,18,19,20,22, er zijn andere gebieden van uitbreiding. Vanaf de gastheerzijde wordt het gebruikt om immuunresponsen op cellulair niveau te beschrijven, maar dit kan worden uitgebreid om immuunmechanismen op moleculair niveau te analyseren door het te combineren met gerichte morfolino, CRISPR, stabiele mutantlijnen of chemische blootstelling. Een kanttekening is dat homologues voor alle bekende aangeboren immuunwegcomponenten van zoogdieren niet zijn geïdentificeerd bij zebravissen.
Van de pathogene kant is virulentie van verschillende soorten en stammen beschreven. Een veelbelovende manier van toekomstig onderzoek is het gebruik van mutante Aspergillus stammen om te testen hoe specifieke genen of eiwitten bijdragen als virulentie factoren. Daardoor kunnen nieuwe antischimmelmiddelen worden ontwikkeld om deze eiwitten aan te pakken. Huidige antischimmelmiddelen hebben een lage werkzaamheid bij menselijke patiënten en er is een groeiende resistentie tegen deze geneesmiddelen bij schimmels28. Dit in vivo model kan worden gebruikt om te onderzoeken waarom deze geneesmiddelen falen en als tussenmodel om de werkzaamheid van nieuwe antischimmelmiddelen te testen. Over het algemeen kunnen de bevindingen die met behulp van dit model worden ontdekt, de toekomstige ontwikkeling van effectieve behandelingen voor met Aspergillusgeïnfecteerde patiënten vergemakkelijken.
Disclosures
Geen conflicten of financiële belangen om bekend te maken.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Allergy And Infectious Diseases van de National Institutes of Health onder awardnummer K22AI134677. De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële opvattingen van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont forceps #5 | Roboz Surgical Instrument Co. | RS-5045 | |
| Eyepiece reticle | Microscope World | RETR10 | For calibrating needles, used in Stereomicroscope |
| Microinjector setup: Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Footswitch | Applied Scientific Instrumentation | FTSW | |
| Micro pipet holder kit | Applied Scientific Instrumentation | M-Pip | |
| Pressure injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Micromanipulator setup: Micromanipulator | Narashige (Tritech) | M-152 | |
| Magnetic stand and plate | Tritech | MINJ-HBMB | |
| Needle puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ-745 | |
| Tissuelyser II | Qiagen | 85300 | To homogenize larvae |
| Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agarose | Fisher | BP160-500 | |
| Ampicillin sodium salt | Fisher | AAJ6380706 | |
| BSA, fraction V | VWR | AAJ65855-22 | |
| Kanamycin sulfate | Fisher | AAJ1792406 | |
| L spreaders | Fisher | 14 665 230 | |
| Microcapillary needles (no filament) | World Precision Instruments (WPI) | TW100-3 | |
| Microloader pipet tips | VWR | 89009-310 | To load the needle with Aspergillus suspension |
| Miracloth | VWR | EM475855-1R | To filter Aspergillus suspension |
| N-phenylthiourea | Fisher | AAL0669009 | To prevent pigmentation |
| Phenol red, 1% solution | Fisher | 57254 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate, methanesulfonic acid salt) | Fisher | AC118000500 | To anesthetize larvae |
| Tween-20 | Fisher | BP337-500 | |
| Media and Solutions | Components/Recipe | ||
| E3 media: 60x E3 | 17.2 g NaCl, 0.76 g KCl, 2.9 g CaCl2, 4.9 g MgSO4 · 7H2O, to 1 L with H2O | ||
| 1x E3 | 16.7 ml 60x stock, 430 ul 0.05 M NaOH, to 1 L with H2O (optional: + 3 ml 0.01% methylene blue) | ||
| Tricaine stock solution | 2 g Tricaine, 5 g Na2HPO4 · 7H2O, 4.2 ml 60X E3, to 500 ml with H2O, pH to 7.0-7.5 with NaOH | ||
| Glucose minimal media (GMM) agar: GMM agar | 10 g Glucose (Dextrose), 50 ml 20x Nitrate salts, 1 ml TE, to 1 L with H2O, pH to 6.5 with NaOH, + 16 g Agar, autoclave | ||
| 20x Nitrate salts | 120 g NaNO3, 10.4 g KCl, 10.4 g, MgSO4 · 7H2O, 30.4 g, KH2PO4, to 1 L with H2O, autoclave | ||
| Trace elements (TE) | 2.20 g ZnSO4 · 7H2O, 1.10 g H3BO3, 0.50 g MnCl2 · 4H2O, 0.16 g FeSO4 · 7H2O, 0.16 g CoCl2 · 6H2O, 0.16 g CuSO4 · 5H2O, 0.11 g (NH4)6Mo7O24 · 4H2O, 5.00 g Na2EDTA, to 100 ml with H2O, dissolve stirring overnight, autoclave |
References
- Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
- Denning, D. W. Invasive aspergillosis. Clinical Infectious Diseases. 26 (4), 781-803 (1998).
- Dagenais, T. R., Keller, N. P. Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 22 (3), 447-465 (2009).
- Lin, S. J., Schranz, J., Teutsch, S. M. Aspergillosis case-fatality rate: systematic review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 32 (3), 358-366 (2001).
- Mirkov, I., Popov, A., Lazovic, B., Glamoclija, J., Kataranovski, M. Usefulness of animal models of aspergillosis in studying immunity against Aspergillus infections. Journal de Mycologie Médicale. 29 (1), 84-96 (2019).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. Journal of Clinical Investigation. 69 (3), 617-631 (1982).
- Behnsen, J., et al. Environmental dimensionality controls the interaction of phagocytes with the pathogenic fungi Aspergillus fumigatus and Candida albicans. PLoS Pathogens. 3 (2), 13 (2007).
- Torraca, V., Mostowy, S. Zebrafish Infection: From Pathogenesis to Cell Biology. Trends in Cell Biology. 28 (2), 143-156 (2018).
- Rosowski, E. E., et al. The Zebrafish as a Model Host for Invasive Fungal Infections. Journal of Fungi. 4 (4), (2018).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development. 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 254-330 (2003).
- Knox, B. P., et al. Distinct innate immune phagocyte responses to Aspergillus fumigatus conidia and hyphae in zebrafish larvae. Eukaryotic Cell. 13 (10), 1266-1277 (2014).
- Rosowski, E. E., et al. Macrophages inhibit Aspergillus fumigatus germination and neutrophil-mediated fungal killing. PLoS Pathogens. 14 (8), 1007229 (2018).
- Koch, B. E. V., Hajdamowicz, N. H., Lagendijk, E., Ram, A. F. J., Meijer, A. H. Aspergillus fumigatus establishes infection in zebrafish by germination of phagocytized conidia, while Aspergillus niger relies on extracellular germination. Scientific Reports. 9 (1), 12791 (2019).
- Pazhakh, V., Ellett, F., Croker, B. A. beta-glucan-dependent shuttling of conidia from neutrophils to macrophages occurs during fungal infection establishment. PLoS Biology. 17 (9), 3000113 (2019).
- Herbst, S., et al. Phagocytosis-dependent activation of a TLR9-BTK-calcineurin-NFAT pathway co-ordinates innate immunity to Aspergillus fumigatus. EMBO Molecular Medicine. 7 (3), 240-258 (2015).
- Shah, A., et al. Calcineurin Orchestrates Lateral Transfer of Aspergillus fumigatus during Macrophage Cell Death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 194 (9), 1127-1139 (2016).
- Jain, S., et al. Selenate sensitivity of a laeA mutant is restored by overexpression of the bZIP protein MetR in Aspergillus fumigatus. Fungal Genetics and Biology. 117, 1-10 (2018).
- Jones, C. N., et al. Bifunctional Small Molecules Enhance Neutrophil Activities Against Aspergillus fumigatus in vivo and in vitro. Frontiers in Immunology. 10, 644 (2019).
- Rosowski, E. E., He, J., Huisken, J., Keller, N. P., Huttenlocher, A. Efficacy of voriconazole against A. fumigatus infection depends on host immune function. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 00917-00919 (2019).
- Herbst, S., et al. A new and clinically relevant murine model of solid-organ transplant aspergillosis. Disease Models and Mechanisms. 6 (3), 643-651 (2013).
- Knox, B. P., Huttenlocher, A., Keller, N. P. Real-time visualization of immune cell clearance of Aspergillus fumigatus spores and hyphae. Fungal Genetics and Biology. 105, 52-54 (2017).
- Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. Journal of Visualized Experiments. (98), e52788 (2015).
- Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology. 3 (6), 522-527 (2001).
- Elsalini, O. A., Rohr, K. B. Phenylthiourea disrupts thyroid function in developing zebrafish. Development Genes and Evolution. 212 (12), 593-598 (2003).
- Huemer, K., et al. zWEDGI: Wounding and Entrapment Device for Imaging Live Zebrafish Larvae. Zebrafish. 14 (1), 42-50 (2017).
- Huemer, K., et al. Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (128), e56340 (2017).
- Perlin, D. S., Shor, E., Zhao, Y. Update on Antifungal Drug Resistance. Current Clinical Microbiology Reports. 2 (2), 84-95 (2015).
