تقييم معدلات تخليق البروتينات في Caenorhabditis elegans
Summary
هنا، نقدم ونصف طريقة غير نشطة وغير فاشية لتقييم تخليق البروتين في الجسم الحي، وذلك باستخدام الخيطية Caenorhabditis elegans والانتعاش fluorescence بعد photobleaching (FRAP). ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع الشاشات الوراثية و / أو الدوائية لتحديد التعديلات الجديدة من تخليق البروتين.
Abstract
الحفاظ على البروتيوم صحية أمر ضروري للخلايا والكائنات الحية التوازن. إن االتوازن بين التحكم في البروتينات الترانسية وتدهورها يُحرّض على العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر. ويعتبر تراجع آليات مراقبة الجودة في البروتوستاسيس سمة مميزة للشيخوخة. لا تزال الطرق الكيميائية الحيوية للكشف عن تخليق البروتينات من جديد محدودة ، ولها عيوب عديدة ولا يمكن تنفيذها في الخلايا الحية أو الحيوانات. Caenorhabditis elegans ، كونها شفافة وتعديلها وراثيا بسهولة ، هو نموذج ممتاز لرصد معدلات تخليق البروتين باستخدام تقنيات التصوير. هنا، نقدم ونصف طريقة لقياس تخليق البروتين في الجسم الحي باستخدام الفلوريسينت الانتعاش بعد photobleaching (FRAP). الحيوانات المعدلة وراثيا التي تعبر عن البروتينات الفلورية في خلايا أو أنسجة محددة هي المشعة من قبل مصدر الضوء القوي مما يؤدي إلى الفلورسينس photobleaching. بدوره, تقييم الفلوريسنس الانتعاش يدل على تخليق البروتين الجديد في الخلايا و / أو الأنسجة ذات الاهتمام. وبالتالي، فإن الجمع بين الديدان الخيطية المعدلة وراثيا، والتدخلات الوراثية و/ أو الدوائية جنبا إلى جنب مع التصوير الحي لمعدلات تخليق البروتين يمكن أن يلقي الضوء على آليات التوسط في انهيار البروتيوستا المعتمد على العمر.
Introduction
تخليق البروتين وتدهوره أمر ضروري للتحلل الكائنات الحية. وهناك العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر بتحريض من إنتاج البروتين المعيب1,2. من أجل قياس معدلات ترجمة البروتين العالمية، وهناك تقنيات البيوكيميائية مثل التنميط الريبوسومي، الذي ينطوي على التسلسل العميق لشظايا الحمض النوويrna محمية الريبوسوم لرصد التعبير وكذلك تخليق البروتين رواية3. هذا الأسلوب، بالإضافة إلى كونه قراءة غير مباشرة لمعدلات الترجمة، كما زيادة رنا جمعية لا يعني بالضرورة زيادة الترجمة، لديها عيوب تقنية، مثل التكلفة العالية وشرط كمية كبيرة من المواد الأولية. من ناحية أخرى، الأساليب القائمة على البروتيوميكس تسمح لكمّ البروتين المباشر عن طريق التوصيف الأيضي النبضي متبوعاً بتحليل قياس الطيف الكتلي4،5. ومع ذلك، هذا هو نهج شبه كمية مع دقة زمنية محدودة التي لا يمكن استخدامها بسهولة في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يتم توزيع التوسيم للبروتين بشكل غير متساو في الحيوان/الأنسجة ذات الاهتمام. والأهم من ذلك، يمكن لكل من هاتين الطريقتين إخفاء اختلافات خاصة بالأنسجة أو الخلايا في معدلات ترجمة البروتين في الحيوانات أو الأنسجة بالكامل، على التوالي.
Caenorhabditis elegans هو كائن سهل الاستخدام نموذج يمكن زراعته في أعداد كبيرة6. بالإضافة إلى ذلك، تسمح قابلية الوراثية والشفافية للتصوير الحي في الجسم الحي. يصف هذا البروتوكول منهجية الكشف عن معدلات تخليق البروتين باستخدام استرداد الفلوريسنس بعد التحسس الضوئي (FRAP). نحن نستفيد من التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية، إما في الكائن الحي كله أو في أنسجة محددة / خلايا. ويمكن للحيوانات المحورة وراثيا إما أن تعبر عن GFP باستخدام مروج للجينات، التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع/ على الصعيد العالمي أو مروج خاص بالأنسجة لاستهداف أنواع محددة من الخلايا. ويمكن توسيع هذه التقنية إلى المروج محددة لدراسة معدلات تخليق البروتين من بروتين معين.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتين التوليف التشكيل ضروري للجسم المثلي الكائنات الحية. أثناء الشيخوخة، العالمية وكذلك تخليق البروتين محددة هو مضطرب. وتكشف الدراسات الحديثة عن حقيقة أن توازن ترجمة البروتين يتحكم مباشرة في الشيخوخة والشيخوخة ليس مجرد نتيجة ثانوية لعملية الشيخوخة. على وجه الخصوص، المكونات الأساسية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر تشانيوتاكيس م. وكوناكيس ك. لتسجيل الفيديو وتحريره. يتم تمويل شركة K.P. من منحة من المؤسسة اليونانية للبحث والابتكار والأمانة العامة للبحوث والتكنولوجيا (GSRT). يتم تمويل N.T. من خلال منح من مجلس البحوث الأوروبي (ERC – GA695190 – MANNA) ، وبرامج إطار عمل المفوضية الأوروبية ، ووزارة التعليم اليونانية.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| Agarose pads 2% | |||
| Calcium chloride dehydrate (CaCl2∙2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholesterol | SERVA Electrophoresis | 17101.01 | |
| cycloheximide | Sigma-Aldrich | C-7698 | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon Corporation | SMZ645 | |
| edc-3(ok1427);Ex[punc-119GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Axio Imager Z2 | |
| Escherichia coli OP50 strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Fluorescence dissecting stereomicroscope | Zeiss | SteREO Lumar V12 | |
| Greiner Petri dishes (60 x 15 mm) | Sigma-Aldrich | P5237 | |
| ife-2(ok306);Ex[pife-2GFP, pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| image analysis software | Fiji | https://fiji.sc | |
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| LB liquid medium | |||
| M9 buffer | |||
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Microscope slides (75 x 25 x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Microsoft Office 2011 Excel software package | Microsoft Corporation, Redmond, USA | ||
| N2;Ex[pife-2GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[psod-3GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| N2;Ex[punc-119GFP; pRF4] | Tavernarakis lab | Maintain animals at 20 °C | |
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Nematode growth medium (NGM) agar plates | |||
| Nystatin stock solution | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Phosphate buffer | |||
| Sodium chloride (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Standard equipment for preparing agar plates (autoclave, Petri dishes, etc.) | |||
| Standard equipment for maintaining worms (platinum wire pick, incubators, etc.). | |||
| statistical analysis software | GraphPad Software Inc., San Diego, USA | GraphPad Prism software package | |
| Streptomycin | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| UV Crosslinker | Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254 | ||
| Worm pick |
References
- Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans. Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).
- Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing. Ageing Research Reviews. 23, 75-89 (2015).
- Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources. Cell. 157 (3), 624-635 (2014).
- Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space. Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).
- Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies. Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Kourtis, N., Tavernarakis, N. Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo. PLoS One. 4 (2), 4547 (2009).
- Parker, R., Sheth, U. P bodies and the control of mRNA translation and degradation. Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).
- Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans. Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).
- Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).
- Keith, S. A., et al. Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway. PLoS Genetics. 12 (2), 1005823 (2016).
- Kumsta, C., et al. The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy. Nature Communications. 10 (1), 5648 (2019).
- Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease. Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).
