Summary
在这里，我们详细介绍了如何将果蝇与昼夜日同步。这是研究生物节律和计时生物学的第一个，也是最重要的步骤。
Abstract
在生物体中几乎普遍，昼夜节律协调生物活动到地球绕太阳的轨道。为了确定产生这种节奏的因素并了解结果的输出，需要将模型生物体约束到定义的昼夜时间点。在这里，我们详细介绍了一个程序，使许多果蝇进入一个定义的昼夜节律。此外，我们详细介绍了为免疫荧光、核酸或蛋白质提取分析准备样品的后约束步骤。
Introduction
地球上几乎所有的生物体，从最大到单细胞，都有一个内部生物钟，周期约为一天。这被称为Circadian节律（由弗朗茨·哈尔伯格在1953年从拉丁语术语约-约/约和"dies"-天创造）1。虽然核心时钟的成分是已知的，其基本的功能机制概念化，仍然有很多要了解如何生物节律在整个身体保持。重要的是，生物节律的调节不当与不良健康结果有关，包括记忆形成不良、睡眠障碍、季节性影响障碍、抑郁症、双相情感障碍、糖尿病、肥胖症、神经退化和癌症2、3、4、5。,4,52,
果蝇是研究昼夜生物学的成熟模型。在基因和生化上，大量数据很容易被训练（如图所示）。事实上，所有七份作为支持获得诺贝尔奖的出版物，都利用了果蝇,,模型,,,,6、7、8、9、10、11、126的这些9优势。781011
此外，我们展示有效的策略，收集被训练苍蝇的目的，无论是免疫荧光，核酸，或蛋白质提取为基础的分析。使用这些策略，可以处理和存储大量样品供将来分析。这些方法非常有利，因为它们是可重复的，可以产生数百只受约束的苍蝇，它们可以成为大型数据池的一部分。
Protocol
1. 飞食品生产
- 每1升水，准备飞食包括4.69克干糖蜜，19.70克干活性酵母，87.22克玉米粉和7.83克阿加。
- 将上面列出的内容物组合在陶罐中，将热量加热到 250 °F。 混合好，添加成分。
- 当苍蝇食物加热时，请将锅盖放在陶罐上，同时每 10 分钟混合一次，直到煮沸。在关闭热量之前，让滚动煮沸继续 20 分钟。
- 加入 83.60 mL 的水，并在食物冷却时将陶罐盖关闭。
- 每 10 分钟用玻璃温度计混合并记录食物的温度。避免让一层薄膜沉淀在食物的上面。
- 一旦食物冷却到60°C，每每升添加一升水的Tegosept和5.51 mL的丙酸（见步骤1.1）。
- 混合好，加热到60°C，以防止食物变得太凉。
- 根据需要使用 Droso 填充器泵送飞食。
- 对于窄瓶，泵 10 mL 和 6 盎司方形底部瓶泵 60 mL。
2. 收集规定年龄的苍蝇
- 监测野生型苍蝇的瓶在25°C下储存5-7天，直到大量的幼蝇（约200只幼蝇）附着在瓶的侧面。使用的瓶子是6盎司的果蝇库存瓶与方形底部。
- 将现有成人从瓶子中清除。要么给成年人小费，或者用70%的乙醇装好。使用一个沉闷的#0画笔推动任何剩余的成年人进入苍蝇的食物。使用前和使用后，请务必用 70% 乙醇擦拭油漆刷。
- 允许清除的瓶子在 25°C 的培养箱中坐 3 天，以便下一代能够关闭。这些苍蝇将在0到3天大。
3. 飞行分离
- 3天后，将男性与女性分开，并收集四个时间点中每个性别的所需数字。苍蝇可以通过检查生殖器来区分性别;男性有深色圆润的生殖器，而女性有更轻，更尖的生殖器。雌性苍蝇也比雄蝇大得多。
- 使用CO2 麻醉垫有效地分离苍蝇，区分性别。用油漆刷移动苍蝇，以免杀死它们。
- 每个时间点收集 100 个男性和 100 个女性，每瓶 50 名男性和每瓶 100 女性。男性往往更咄咄逼人，当小瓶中有100个人时，他们的社交互动会导致大量死亡。女性多达100人-不受影响，而包含在小瓶。
- 在以下时间点执行集合：ZT1、ZT7、ZT13 和 ZT19（表 1）。请注意，在黑暗中完成的集合 （ZT12-ZT24） 对光敏感，而 ZT0-ZT11 集合在开灯时完成，房间灯可以亮起。请注意，两个独立的孵化器采用逆反 12 小时光模式，允许所有收集在白天进行，而不是一夜之间发生。
- 使用多余的苍蝇创造新的苍蝇瓶，为未来的训练。将25个雌性与5-7名男性放在每个新瓶子中，并在25°C的培养箱中放置。
4. 飞孵化
- 允许苍蝇在受光调节的培养箱中停留3-5天，以允许昼夜感染发生。确保孵化器是光紧的，因为即使是少量的光污染也会干扰约束。
5. 免疫荧光固定
- 在灌制后，为用于免疫荧光的样品准备新的固定溶液瓶。在从培养箱中取出苍蝇之前，每100只要固定一只苍蝇，将稀释在1x PBS中稀释的4.8 mL的4%甲醛=0.1%Tween-20添加到每100只新的窄瓶中。每个小瓶将房子100雄蝇或100只雌性Circadian被训练苍蝇。将狭窄的小瓶放在冰中。
6. 免疫荧光收集
- 从培养箱中收集苍蝇进行免疫荧光时，取出瓶盖并快速将瓶子倒入漏斗中。通过漏斗轻轻将苍蝇点击到溶液中，帮助引导苍蝇进入小瓶;将50个雄性的两个管子组合在一个小瓶中，总共100个雄性，用一根100雌性的单管为另一个小瓶。
- 在黑暗中执行 ZT13 和 ZT19 集合;使用红灯，以看到嗜血杆菌是不太敏感，这些光波长，因此不太容易受到光污染13。特别是隐色素蛋白，对蓝光特别敏感，必须避免14。
- 为了减少光线照射，请确保收集室光线紧，任何光源都阻挡或遮盖。将这些小瓶包裹在铝箔中，以便 ZT13 和 ZT19 苍蝇在以下步骤中放置在螺母混合器上时不会暴露在光线下。ZT1 和 ZT7 苍蝇不对光敏感，可以放置在混合器上，无需箔覆盖。
7. 螺母混合器和存储
- 收集苍蝇后，将装有固定性物质的小瓶顶部胶带固定，以避免溢出，并在 4°C 时以 165 RPM 的转速将苍蝇放在螺母搅拌机上 4 小时。苍蝇在此固定步骤后不再对光敏感，因此可能会移除铝箔以验证溶液是否移动，并且苍蝇正在浸入固定器中。
- 从坚果搅拌机中去除含有小瓶的飞后，取出甲醛，用 3，000 μL 的 1x PBS 洗涤三次，每次洗涤后将小瓶反转。
- 将带有免疫荧光样品的小瓶储存在4°C，等待未来的免疫荧光15。
8. 蛋白质提取的收集
- 准备四个 50 mL 管和一个含有液氮的 Dewar，用于保存蛋白质提取样品
- 对于收集苍蝇的蛋白质或核酸提取，转移苍蝇从瓶子到管的方式与步骤6.1相同，并迅速封顶管，以防止苍蝇释放，并入液氮卡冻结。
9. 蛋白质提取储存
- 将捕捉冷冻样品储存在-80°C下进行蛋白质提取。 这些可以根据适合下游分析的蛋白质提取方案进行处理，包括免疫印迹16。
Representative Results
受控昼夜约束允许研究人员使用ZT1-ZT19计时表在整个昼夜特定时间点检查生物学，或根据需要添加时间点。在这里，我们使用光和黑暗来将苍蝇吸引到昼夜循环中，并通过免疫印迹和免疫荧光分析来验证周期蛋白的抑制，这是昼夜结合的标记（图1）。在正确的连接下，周期蛋白应具有特征强度和移动性模式（图1A），并且应在ZT1大脑的特定位置可见（图1B）。虽然其他变量，包括食物和温度，可以影响昼夜的应变，光是最简单和可靠的控制17。为了这些方法的目的，孵化器的温度保持不变，依靠受光影响的脑钟神经元进行约束18。
图1：约束验证。 （A） 从被训练苍蝇头部中提制的整细胞提取物的免疫印迹显示周期蛋白流动性和强度19的规范模式。1.4 使用抗 Per 抗体分析每个指示时代 （ZT） 的女性头部。（B） 在ZT收集的被约束大脑的免疫荧光，其中期间蛋白在一个特征模式中被发现（底部面板，从赫尔夫里希-福斯特20重现）。显示的图像取自大脑的不同部分，捕获所有预期在ZT1含有周期蛋白的神经元。比例线是 40 μm 。请单击此处查看此图的较大版本。
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| 上午10时至下午10时的灯光 | 上午10时至下午10时的灯光 | 上午9时至晚上9时之间黑暗 | 上午9时至晚上9时之间黑暗 |
| 上午11时在1小时后在光中收集 | 下午5点在光中收集 | 1 小时后上午 10 点收集 | 7 小时后于下午 4 点收集 |
表1：ZT1-ZT19循环节奏计时时间表。
Discussion
研究人员利用这种约束协议的成功和一致性。此过程允许固定可存储用于将来分析的大型采样池。此外，此策略还保留了由约束引起的神经模式，供将来检查使用。
存储固定是约束过程的一个主要组成部分，因为它有助于稳定脑组织，它允许更多的时间分析每个大脑从数据池，从而最大限度地减少浪费从大脑失去生存能力，由于年龄21。主要目标是昼夜结合尽可能多的苍蝇，以便有连续的库存可用于头部解剖，并最终免疫荧光或蛋白质提取，以观察发现，并确定结果是否高信心。为了确保通过固定来保持昼夜污染，消除任何光污染源都是不可或缺的。固定过程允许 储存果蝇 ，同时保持其神经"时间戳"，以便他们以后可以解剖和分析，没有明显的差异，被解剖和经历了免疫荧光后立即约束。为了在免疫荧光之前固定，实验室一致地确定苍蝇至少可行1个月。西方印迹蛋白提取的固定使大脑在-80°C储存时可以无限存活。
另一个关键的协议步骤是苍蝇的性。重要的是，这一步是准确的做，因为有两性在同一瓶之前固定可能导致交配，这将产生新的苍蝇是更年轻的年龄和腐败的蛋白质分析，如果男性被意外检查，而不是女性，反之亦然。此外，在做爱时，重要的是要去除有时附着在女性上幼虫的标本。这防止了女性小瓶内新后代的发展，从而可能破坏结果。
约束协议的下一步可能是与数据分析相关的项。该协议的重点是蛋白质定位，但如果还有其他变量受到昼夜约束的影响，则必须通过新的途径探索它们，这些变量通常需要蛋白质或核酸提取。此外，还有大脑的其他蛋白质，可能仍然通过这个协议进行分析。与协议相关的实验分析了某些蛋白质，但在昼夜生物学中发挥作用的基因和蛋白质清单尚未用尽。该协议在实现建立昼夜节律的目标方面是有效的，但是，其应用范围很广。
Disclosures
没有。
Acknowledgments
特别感谢密苏里大学堪萨斯城和杰弗里·普莱斯实验室。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
