Summary
Hier beschrijven we hoe we Drosophila kunnen synchroniseren met een circadiane dag. Dit is de eerste en belangrijkste stap die nodig is voor het bestuderen van biologische ritmes en chronobiologie.
Abstract
Bijna universeel onder organismen coördineert circadiane ritmes de biologische activiteit tot de baan van de aarde rond de zon. Om factoren te identificeren die dit ritme creëren en om de resulterende uitgangen te begrijpen, is het entrainment van modelorganismen nodig om circadiane tijdpunten te definiëren. Hier detailleren we een procedure om veel Drosophila te trainen tot een gedefinieerd circadiane ritme. Verder beschrijven we post-entrainment stappen om monsters voor te bereiden op immunofluorescentie, nucleïnezuur, of eiwit extractie-gebaseerde analyse.
Introduction
Bijna alle organismen op aarde, van de grootste tot eencellige, hebben een interne biologische klok met een cyclus van ongeveer een dag. Dit staat bekend als de Circadiane ritme (bedacht in 1953 door Franz Halberg uit de Latijnse termen circa = ongeveer / ongeveer en "sterft" = dag)1. Hoewel componenten van de kernklok bekend zijn en hun rudimentaire mechanismen van functie geconceptualiseerd, is er nog veel te begrijpen over hoe biologische ritmes worden gehandhaafd door het hele lichaam. Belangrijk is dat verkeerde regelgeving van biologische ritmes wordt geassocieerd met slechte gezondheidsresultaten, waaronder slechte geheugenvorming, slaapstoornissen, seizoensgebonden affect disorder, depressie, bipolaire stoornis, diabetes, obesitas, neurodegeneratie, en kanker2,3,4,5.
Drosophila is een vaststaand model voor onderzoek van circadiane biologie. Genetisch en biochemisch aaneenbaar, grote aantallen zijn gemakkelijk in te leiden (zoals zal worden aangetoond). In feite, alle zeven publicaties aangehaald als belangrijke publicaties van steun bij de toekenning van de Nobelprijs voor de ontdekking van circadiane ritmes leveraged deze sterke punten van de Drosophila model6,7,8,9,10,11,12.
Daarnaast tonen we effectieve strategieën voor het verzamelen van getrainde vliegen ten behoeve van immunofluorescentie, nucleïnezuur of analyse op basis van eiwitextractie. Met behulp van deze strategieën, kan men verwerken en opslaan van grotere hoeveelheden monsters voor analyse in de toekomst. Deze methoden zijn zeer voordelig omdat ze reproduceerbaar zijn en honderden getrainde vliegen kunnen opleveren die deel kunnen uitmaken van een grote gegevenspool.
Protocol
1. Vliegvoedselproductie
- Bereid per 1 L water vliegvoer bestaande uit 4,69 g gedroogde melasse, 19,70 g droge actieve gist, 87,22 g maïsmeel en 7,83 g agar.
- Combineer de hierboven genoemde inhoud in een crockpot en zet de warmte op 250 °F. Meng goed en ingrediënten worden toegevoegd.
- Houd het deksel op de crockpot als de vlieg voedsel wordt verwarmd, terwijl ook het mengen van de inhoud om de 10 minuten totdat het een rollende kook bereikt. Laat de rollende kook 20 minuten aanhouden voordat u het vuur uitzet.
- Voeg 83,60 mL water toe en houd het deksel van de crockpot eraf als het voedsel afkoelt.
- Meng en nota van de temperatuur van het voedsel om de 10 minuten met een glazen thermometer. Vermijd het laten van een laag van de film vestigen op de top van het voedsel.
- Zodra het voedsel is afgekoeld tot 60 °C, voeg 10,44 mL Tegosept en 5,51 mL propionzuur per liter water toegevoegd (zie stap 1.1).
- Meng goed en zet het vuur tot 60 °C om te voorkomen dat het voedsel te koel wordt.
- Pomp het vliegvoedsel indien nodig met behulp van de Droso-filler.
- Voor smalle flacons pomp je 10 mL en voor 6 oz vierkante bodem flessen pomp 60 mL.
2. Het verzamelen van vliegen van bepaalde leeftijd
- Monitorflessen van wilde typevliegen die gedurende 5-7 dagen bij 25 °C zijn opgeslagen totdat grote hoeveelheden pop (ongeveer 200 poppen) aan de zijkant van de fles zijn bevestigd. De gebruikte flessen zijn 6 oz Drosophila stock flessen met vierkante bodems.
- Maak bestaande volwassenen uit de fles. Ofwel tip de volwassenen in een nieuwe fles of plaats ze in 70% ethanol. Gebruik het doffe uiteinde van een #0 penseel om alle resterende volwassenen in het vliegvoedsel te duwen. Zorg ervoor dat u de verfborstel afvegen met 70% ethanol voor en na gebruik.
- Laat geruimde flessen 3 dagen zitten in een couveuse van 25 °C om de volgende generatie te laten afsluiten. Deze vliegen zullen tussen 0 en 3 dagen oud zijn.
3. Vliegscheiding
- Na 3 dagen, scheiden mannetjes van vrouwtjes en het verzamelen van het gewenste aantal voor elk geslacht voor elk van de vier tijdpunten. Vliegen kunnen worden onderscheiden door seks door genitaliën te onderzoeken; mannen hebben donkere afgeronde genitaliën, terwijl vrouwtjes lichtere, meer puntige genitaliën hebben. Vrouwtjes zijn ook veel groter dan mannelijke vliegen.
- Gebruik een CO2 anesthesie pad om effectief te scheiden van de vliegen en onderscheid te maken tussen de geslachten. Verplaats de vliegen met verfborstels om te voorkomen dat ze te doden.
- Verzamel 100 mannetjes en 100 vrouwtjes voor elk keer punt, met 50 mannetjes per flesje en 100 vrouwtjes per flesje. Mannen hebben de neiging om agressiever te zijn en hun sociale interacties leiden tot veel sterfgevallen wanneer er 100 individuen in een flesje. De vrouwtjes-tot 100 individuen- zijn onaangetast terwijl opgenomen in de flacon.
- Voer de collecties uit op de volgende tijdstippen: ZT1, ZT7, ZT13 en ZT19 (Tabel 1). Houd er rekening mee dat collecties in het donker (ZT12-ZT24) lichtgevoelig zijn, terwijl ZT0-ZT11-collecties worden uitgevoerd tijdens licht-op-tijden en kamerverlichting kan worden ingeschakeld. Houd er rekening mee dat twee afzonderlijke incubators worden gebruikt met omgekeerde lichtpatronen van 12 uur om alle collecties overdag en niet 's nachts te laten plaatsvinden.
- Gebruik overtollige vliegen om nieuwe flessen vliegen te maken voor toekomstige entrainment. Plaats 25 vrouwtjes met 5-7 mannetjes in elke nieuwe fles en plaats in de couveuse op 25 °C.
4. Vlieg incubatie
- Laat de vliegen te blijven in het licht geregeld incubators voor 3-5 dagen om circadiane entrainment te laten optreden. Zorg ervoor dat couveuses lichtdicht zijn, omdat zelfs kleine hoeveelheden lichtvervuiling de entrainment verstoren.
5. Immunofluorescentiefixatie
- Bereid na de entrainment nieuwe flacons van fixatieoplossing voor monsters die zullen worden gebruikt voor immunofluorescentie. Voeg voorafgaand aan het verwijderen van de vliegen uit de couveuse 4,8 mL van 4% formaldehyde verdund in 1x PBS + 0,1% Tween-20 toe aan elke nieuwe smalle flacon voor elke 100 vliegen die gefixeerd moeten worden. Elke flacon zal 100 mannelijke of 100 vrouwelijke Circadian entrained vliegen huisvesten. Plaats de smalle flesjes in ijs.
6. Immunofluorescentieverzameling
- Bij het verzamelen van de vliegen uit de couveuse voor immunofluorescentie, verwijder de dop van de fles en snel omkeren van de fles in de trechter. Tik de vliegen voorzichtig in de oplossing via de trechter om de vliegen in de flacon te begeleiden; combineren twee buizen van de 50 mannetjes voor een totaal van 100 mannetjes in een flesje en gebruik een enkele buis van 100 vrouwtjes voor de andere flacon.
- ZT13- en ZT19-collecties uitvoeren in het donker; gebruik maken van een rood licht om te zien als drosophila zijn veel minder gevoelig voor deze lichte golflengten en zijn daarom minder gevoelig voor lichtvervuiling13. Cryptochrome eiwit, in het bijzonder, is bijzonder gevoelig voor blauw licht, die moet worden vermeden14.
- Om de blootstelling aan licht te verminderen, zorg ervoor dat de ruimte van de collectie is lichtdicht met alle bronnen van licht geblokkeerd of bedekt. Wikkel deze flacons in folie zodat ZT13- en ZT19-vliegen niet worden blootgesteld aan licht wanneer ze in de volgende stap op de gekeerde mixer worden geplaatst. ZT1- en ZT7-vliegen zijn niet lichtgevoelig en kunnen zonder foliebekleding op de mixer worden geplaatst.
7. Nuterende mixer en opslag
- Nadat de vliegen zijn verzameld, tape de bovenkant van de flacons met fixatieve om morsen te voorkomen en plaats ze op de nutating mixer op 165 RPM bij 4 °C voor 4 uur. De vliegen zijn niet langer lichtgevoelig na deze fixatiestap, dus folie kan worden verwijderd om te controleren of de oplossing beweegt en vliegen worden ondergedompeld in het fixatiemiddel.
- Na het verwijderen van de vlieg met flesjes uit de gekneilde mixer verwijder de formaldehyde en was drie keer met 3.000 μL van 1x PBS, het omkeren van de flacon met elke wasbeurt.
- Bewaar de flacons met immunofluorescentiemonsters op 4 °C om toekomstige immunofluorescentie15te afwachten .
8. Inzameling voor eiwitextractie
- Bereid vier buizen van 50 mL en een Dewar met vloeibare stikstof voor het behoud van monsters voor eiwitextractie
- Voor het verzamelen van vliegen voor eiwit- of nucleïnezuurextractie, breng vliegen van de flessen naar de buis op dezelfde manier als in stap 6.1 en snel cap de buis om het vrijkomen van vliegen te voorkomen en plaats de buis in vloeibare stikstof te breken bevriezen.
9. Opslag voor eiwitextractie
- Bewaar snap bevroren monsters voor eiwitextractie bij -80 °C. Deze kunnen worden verwerkt volgens het eiwitextractieprotocol dat geschikt is voor downstream-analyse, inclusief immunoblotting16.
Representative Results
Gecontroleerde circadiane entrainment stelt onderzoekers in staat om biologie te onderzoeken op specifieke tijdstippen gedurende de circadiane dag met behulp van de ZT1-ZT19 timing schema's of om tijd-punten toe te voegen als dat nodig is. Hier gebruiken we licht en duisternis om vliegen naar circadiane cycli te leiden en de entrainment te verifiëren door immunoblotting en immunofluorescentieanalyse van het periodeeiwit, een marker voor circadiane entrainment(figuur 1). Bij correcte entrainment moeten periodeiwitten een kenmerkend intensiteits- en mobiliteitspatroon hebben(figuur 1A) en zichtbaar zijn op specifieke locaties in het ZT1-brein(figuur 1B). Hoewel andere variabelen, waaronder voedsel en temperatuur, circadiane entrainment kunnen beïnvloeden, is licht het meest eenvoudig en betrouwbaar om17te controleren. Voor het doel van deze methoden worden de couveusetemperaturen constant gehouden, afhankelijk van cerebrale klokneuronen die worden beïnvloed door licht voor entrainment18.
Figuur 1: Verificatie van de entrainment. (A) Het immunoblotting van hele celextracten die zijn bereid uit hoofden van getrainde vliegen vertoont canonieke patronen van periode-eiwitmobiliteit en -intensiteit19. 1.4 vrouwelijke hoofden van elk van de aangegeven Tijdtgeber tijden (ZT) werden geanalyseerd met behulp van een anti-Per antilichaam. (B) Immunofluorescentie van ingespannen hersenen verzameld bij ZT, waar het period eiwit wordt gevonden in een karakteristiek patroon (onderste panelen, nagemaakt uit Helfrich-Forster20). Getoond zijn beelden genomen uit verschillende delen van de hersenen, het vastleggen van alle neuronen naar verwachting period eiwit bevatten op ZT1. Schaalbalk is 40 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
| ZT1 ZT1 | ZT7 ZT7 | ZT13 ZT13 | ZT19 ZT19 |
| Licht tussen 10.00 en 22.00 uur | Licht tussen 10.00 en 22.00 uur | Donker tussen 9.00 en 21.00 uur | Donker tussen 9.00 en 21.00 uur |
| Verzameld om 11 uur na 1 uur in het licht | Verzameld om 17.00 uur na 7 uur in het licht | Verzameld om 10 uur na 1 uur in het donker | Verzameld om 16.00 uur na 7 uur in het donker |
Tabel 1: ZT1-ZT19 Circadian Rhythm Timing Schedules.
Discussion
Onderzoekers maken gebruik van dit entrainment protocol met succes en consistentie. Deze procedure maakt het mogelijk om een grote samplingpool te fixeren die kan worden opgeslagen voor toekomstige analyses. Bovendien behoudt deze strategie de neurologische patronen die door entrainment voor toekomstig onderzoek worden veroorzaakt.
Fixatie voor opslag is een belangrijk onderdeel van het entrainment proces als het helpt om hersenweefsel te stabiliseren en het zorgt voor meer tijd om elke hersenen te analyseren van de data pool dus het minimaliseren van afval van de hersenen die levensvatbaarheid verliezen als gevolg van de leeftijdvan 21. Het belangrijkste doel is om zo veel mogelijk vliegen te trainen, zodat er continue inventaris beschikbaar is voor hoofddissecties en uiteindelijk immunofluorescentie of eiwitextractie om de bevindingen te observeren en te bepalen of de resultaten van groot vertrouwen zijn. Om ervoor te zorgen dat circadiaanse entrainment wordt bewaard door middel van fixatie, is het integraal dat elke bron van lichtvervuiling wordt geëlimineerd. Het fixatieproces maakt het mogelijk om Drosophila op te slaan met behoud van de neurologische "tijdstempel", zodat ze later kunnen worden ontleed en geanalyseerd zonder merkbare verschillen voor vliegen die worden ontleed en onmiddellijk na de entrainment immunofluorescentie hebben ondergaan. Voor fixatie voorafgaand aan immunofluorescentie heeft het lab met consistentie bepaald dat vliegen ten minste maximaal 1 maand levensvatbaar zijn. Fixaties voor westerse vlek eiwit extractie maken de hersenen levensvatbaar voor onbepaalde tijd wanneer opgeslagen bij -80 °C.
Een andere kritische protocolstap is het sexen van de vliegen. Het is belangrijk dat deze stap nauwkeurig wordt gedaan als het hebben van beide geslachten in dezelfde flacon voorafgaand aan fixatie kan leiden tot paring, die nieuwe vliegen die van jongere leeftijd en corrupte eiwitanalyse zal opleveren als mannen per ongeluk worden onderzocht in plaats van vrouwen of vice versa. Bovendien is het bij sexing belangrijk om larvenmonsters te verwijderen die soms aan vrouwtjes zijn gehecht. Dit voorkomt de ontwikkeling van nieuwe nakomelingen in de vrouwelijke flacon die potentieel kunnen corrumperen resultaten.
De volgende stap voor het entrainment protocol kan zijn met items die verband houden met data-analyse. De focus van het protocol is eiwitlokalisatie, maar als er andere variabelen zijn die worden beïnvloed door circadiane entrainment, moeten ze worden verkend via nieuwe wegen, waarbij vaak eiwit- of nucleïnezuurextractie nodig is. Daarnaast zijn er andere eiwitten van de hersenen die nog steeds kunnen worden geanalyseerd via dit protocol. De experimenten in verband met het protocol analyseerden bepaalde eiwitten, maar de lijst van genen en eiwitten die een rol spelen in de circadiane biologie is niet uitgeput. Het protocol is effectief in het bereiken van het doel van het vaststellen van een circadiane ritme, maar de toepassingen zijn breed.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
Speciale dank aan de Universiteit van Missouri-Kansas City en de Jeffrey L. Price laboratorium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
