Summary
Hier beschreiben wir, wie man Drosophila mit einem zirkadianen Tag synchronisiert. Dies ist der erste und wichtigste Schritt, der für das Studium biologischer Rhythmen und Chronobiologie notwendig ist.
Abstract
Fast universell unter Organismen koordinieren zirkadiane Rhythmen die biologische Aktivität zur Erdumlaufbahn um die Sonne. Um Faktoren zu identifizieren, die diesen Rhythmus erzeugen, und um die resultierenden Ergebnisse zu verstehen, ist eine Verzug von Modellorganismen zu definierten zirkadianen Zeitpunkten erforderlich. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um viele Drosophila zu einem definierten zirkadianen Rhythmus zu verangelten. Darüber hinaus beschreiben wir die Schritte nach der Entrainment-Ausbildung, um Proben für Immunfluoreszenz, Nukleinsäure oder proteinextraktionsbasierte Analysen vorzubereiten.
Introduction
Fast alle Organismen auf der Erde, von der größten bis zu den einzelligen, haben eine innere biologische Uhr mit einem Zyklus von etwa einem Tag. Dies wird als der circadiane Rhythmus (geprägt 1953 von Franz Halberg aus den lateinischen Begriffen circa = ungefähr und "stirbt" = Tag)1bekannt. Obwohl Komponenten der Kernuhr bekannt sind und ihre rudimentären Funktionsmechanismen konzeptioniert sind, gibt es immer noch viel zu verstehen, wie biologische Rhythmen im ganzen Körper gepflegt werden. Wichtig ist, dass eine Fehlregulation biologischer Rhythmen mit schlechten gesundheitlichen Ergebnissen verbunden ist, einschließlich schlechter Gedächtnisbildung, Schlafstörungen, saisonalen Affektstörungen, Depressionen, bipolarer Störung, Diabetes, Adipositas, Neurodegeneration und Krebs2,3,4,5.
Drosophila ist ein etabliertes Modell für die Erforschung der zirkadianen Biologie. Genetisch und biochemisch bestückbar, sind große Zahlen leicht eingespannt (wie gezeigt). In der Tat, alle sieben Publikationen als Schlüsselpublikationen der Unterstützung bei der Verleihung des Nobelpreises für die Entdeckung von zirkadianen Rhythmen genannt nutzten diese Stärken des Drosophila Modells6,7,8,9,10,11,12.
Darüber hinaus zeigen wir effektive Strategien zum Sammeln von eingespannten Fliegen zum Zwecke der Immunfluoreszenz, Nukleinsäure oder Proteinextraktions-basierten Analysen. Mit diesen Strategien kann man größere Mengen von Proben für die Analyse in der Zukunft verarbeiten und speichern. Diese Methoden sind insofern sehr vorteilhaft, als sie reproduzierbar sind und Hunderte von eingespannten Fliegen ergeben können, die Teil eines großen Datenpools sein können.
Protocol
1. Fliegenfutterproduktion
- Pro 1 L Wasser, zubereiten Fliegenfutter bestehend aus 4,69 g getrockneten Melasse, 19,70 g trockene aktive Hefe, 87,22 g Maismehl und 7,83 g Agar.
- Kombinieren Sie den oben aufgeführten Inhalt in einem Topf topf und drehen Sie die Hitze auf 250 °F. Mischen Sie gut und Zutaten hinzugefügt werden.
- Halten Sie den Deckel auf dem Topf, wie die Fliege Nahrung erhitzt wird, während auch mischen Sie den Inhalt alle 10 min, bis es ein rollendes Kochen erreicht. Lassen Sie das Walzen 20 min weiterlaufen, bevor Sie die Hitze ausschalten.
- 83,60 ml Wasser hinzufügen und den Deckel des Topfes abhalten, wenn das Essen abkühlt.
- Mischen und notieren Sie die Temperatur des Lebensmittels alle 10 min mit einem Glasthermometer. Vermeiden Sie es, eine Schicht Film auf dem Essen absetzen zu lassen.
- Sobald das Essen auf 60 °C abgekühlt ist, fügen Sie 10,44 ml Tegosept und 5,51 ml Propionsäure pro Liter Wasser hinzu (siehe Schritt 1.1).
- Gut mischen und bis zu 60 °C wärmen, um zu verhindern, dass das Essen zu kühl wird.
- Pumpen Sie das Fliegenfutter nach Bedarf mit dem Droso-Füllstoff.
- Für schmale Fläschchen, Pumpe 10 ml und für 6 Unzen quadratische Bodenflaschen Pumpe 60 ml.
2. Sammeln von Fliegen definierten Alters
- Überwachen Sie Flaschen von Wildfliegen, die 5-7 Tage lang bei 25 °C gelagert werden, bis große Mengen Pupa (ca. 200 Welpen) an der Seite der Flasche befestigt sind. Die verwendeten Flaschen sind 6 oz Drosophila Lagerflaschen mit quadratischen Böden.
- Löschen Sie bestehende Erwachsene aus der Flasche. Entweder die Erwachsenen in eine neue Flasche kippen oder in 70% Ethanol geben. Verwenden Sie das stumpfe Ende eines #0 Pinsels, um alle verbleibenden Erwachsenen in das Fliegenfutter zu schieben. Achten Sie darauf, den Pinsel vor und nach dem Einsatz mit 70% Ethanol abzuwischen.
- Freigegebene Flaschen 3 Tage in einem 25 °C-Inkubator sitzen lassen, damit die nächste Generation ausschließen kann. Diese Fliegen werden zwischen 0 und 3 Tage alt sein.
3. Fliegentrennung
- Nach 3 Tagen, trennen Männchen von Weibchen und sammeln die gewünschte Zahl für jedes Geschlecht für jeden der vier Zeitpunkte. Fliegen können durch die Untersuchung von Genitalien nach Geschlecht unterschieden werden; Männchen haben dunkel abgerundete Genitalien, während Weibchen hellere, spitzere Genitalien haben. Weibchen sind auch viel größer als männliche Fliegen.
- Verwenden Sie ein CO2-Anästhesiepad, um die Fliegen effektiv zu trennen und zwischen den Geschlechtern zu unterscheiden.2 Bewegen Sie die Fliegen mit Pinsel, um zu vermeiden, sie zu töten.
- Sammeln Sie 100 Männchen und 100 Weibchen für jeden Zeitpunkt, mit 50 Männchen pro Durchstechflasche und 100 Weibchen pro Durchstechflasche. Männer neigen dazu, aggressiver zu sein und ihre sozialen Interaktionen führen zu vielen Todesfällen, wenn es 100 Personen in einer Durchstechflasche gibt. Die Weibchen bis zu 100 Individuen sind nicht betroffen, während sie in der Durchstechflasche enthalten sind.
- Führen Sie die Sammlungen zu folgenden Zeitpunkten durch: ZT1, ZT7, ZT13 und ZT19 (Tabelle 1). Beachten Sie, dass Sammlungen im Dunkeln (ZT12-ZT24) lichtempfindlich sind, während ZT0-ZT11-Kollektionen während der Lichteinlaufzeiten durchgeführt werden und Raumleuchten eingeschaltet sein können. Bitte beachten Sie, dass zwei separate Inkubatoren mit inversen 12-Stunden-Lichtmustern verwendet werden, damit alle Sammlungen tagsüber und nicht über Nacht stattfinden können.
- Verwenden Sie überschüssige Fliegen, um neue Flaschen von Fliegen für zukünftige Entrainment zu erstellen. 25 Weibchen mit 5-7 Männchen in jede neue Flasche geben und bei 25 °C in den Inkubator stellen.
4. Fliegeninkubation
- Lassen Sie die Fliegen 3-5 Tage in lichtregulierten Inkubatoren bleiben, damit zirkadiane Eingriffe auftreten können. Stellen Sie sicher, dass die Inkubatoren lichtdicht sind, da selbst geringe Mengen an Lichtverschmutzung die Einbahnung stören.
5. Immunfluoreszenzfixierung
- Nach der Einschulung neue Fläschchen mit Fixierlösung für Proben vorbereiten, die zur Immunfluoreszenz verwendet werden. Bevor Sie die Fliegen aus dem Inkubator entfernen, fügen Sie 4,8 ml 4% Formaldehyd in 1x PBS + 0,1% Tween-20 zu jeder neuen schmalen Durchstechflasche für jede 100 Fliegen, die fixiert werden sollen. Jede Durchstechflasche wird 100 männliche oder 100 weibliche circadian entrained Fliegen beherbergen. Legen Sie die schmalen Fläschchen in Eis.
6. Immunfluoreszenz-Sammlung
- Beim Sammeln der Fliegen aus dem Inkubator für Immunfluoreszenz, entfernen Sie die Flaschenkappe und schnell die Flasche in den Trichter invertiert. Tippen Sie vorsichtig die Fliegen in die Lösung über den Trichter, um die Fliegen in die Durchstechflasche zu führen; kombinieren Sie zwei Tuben der 50 Männchen für insgesamt 100 Männchen in einer Durchstechflasche und verwenden Sie eine einzige Röhre von 100 Weibchen für die andere Durchstechflasche.
- Führen Sie ZT13- und ZT19-Kollektionen im Dunkeln durch; verwenden Sie ein rotes Licht, um zu sehen, wie Drosophila sind weit weniger empfindlich auf diese Lichtwellenlängen und sind daher weniger anfällig für Lichtverschmutzung13. Insbesondere Cryptochrome-Protein ist besonders empfindlich gegenüber blauem Licht, das vermieden werden muss14.
- Um die Lichteinstrahlung zu reduzieren, stellen Sie sicher, dass der Raum der Sammlung hell dicht ist, wenn lichtdurchetzte oder abgedeckte Lichtquellen vorhanden sind. Wickeln Sie diese Fläschchen in Folie, so dass die ZT13- und ZT19-Fliegen im folgenden Schritt nicht dem Licht ausgesetzt sind, wenn sie auf den Nutmischer gelegt werden. ZT1- und ZT7-Fliegen sind nicht lichtempfindlich und können ohne Folienabdeckung auf den Mischer gelegt werden.
7. Nuten Mischer und Lagerung
- Nachdem die Fliegen gesammelt wurden, kleben Sie die Oberseite der Fläschchen, die fixativ sind, um Verschüttungen zu vermeiden, und legen Sie sie bei 165 Umdrehungen/min bei 4 °C für 4 h auf den Nutmischer. Die Fliegen sind nach diesem Fixierungsschritt nicht mehr lichtempfindlich, sodass Folie entfernt werden kann, um zu überprüfen, ob sich die Lösung bewegt und Fliegen in das Fixierungsmittel eingetaucht werden.
- Nach dem Entfernen der Fliege mit Fläschchen aus dem Nutmischer entfernen Sie das Formaldehyd und waschen Sie dreimal mit 3.000 l 1x PBS, wobei die Durchstechflasche mit jeder Wäsche invertiert wird.
- Bewahren Sie die Durchstechflaschen mit Immunfluoreszenzproben bei 4 °C auf, um die zukünftige Immunfluoreszenz15abzuwarten.
8. Sammlung zur Proteinextraktion
- Bereiten Sie vier 50 ml-Röhrchen und einen Dewar-haltigen flüssigen Stickstoff zur Konservierung von Proben für die Proteinextraktion vor
- Zum Sammeln von Fliegen für die Protein- oder Nukleinsäureextraktion, übertragen Sie Fliegen von den Flaschen in das Rohr in der gleichen Weise wie in Schritt 6.1 und schnell kappen sie das Rohr, um die Freisetzung von Fliegen zu verhindern und legen Sie das Rohr in flüssigen Stickstoff, um gefrieren.
9. Lagerung für die Proteinextraktion
- Snap-Gefrorene Proben für die Proteinextraktion bei -80 °C lagern. Diese können gemäß dem für die nachgelagerte Analyse geeigneten Proteinextraktionsprotokoll verarbeitet werden, einschließlich Immunoblotting16.
Representative Results
Kontrollierte zirkadiane Verzierung ermöglicht es Forschern, Biologie zu bestimmten Zeitpunkten während des zirkadianen Tages mit den ZT1-ZT19-Zeitplänen zu untersuchen oder bei Bedarf Zeitpunkte hinzuzufügen. Hier verwenden wir Licht und Dunkelheit, um Fliegen zu zirkadianen Zyklen zu veranlassen und die Verwicklung durch Immunoblotting und Immunfluoreszenzanalyse des Periodenproteins, einem Marker für die zirkadiane Verzierung (Abbildung 1), zu überprüfen. Nach korrekter Einschließung sollten Periodenproteine ein charakteristisches Intensitäts- und Mobilitätsmuster aufweisen (Abbildung 1A) und an bestimmten Stellen im ZT1-Gehirn sichtbar sein (Abbildung 1B). Obwohl andere Variablen, einschließlich Nahrung und Temperatur, die zirkadiane Verzierung beeinflussen können, ist Licht am einfachsten und zuverlässigsten, um17zu kontrollieren. Für die Zwecke dieser Methoden werden die Inkubatortemperaturen konstant gehalten und basieren auf zerebralen Uhrneuronen, die durch Licht für die Einbahnung beeinflusst werden18.
Abbildung 1: Überprüfung der Ausbildung. (A) Die Immunoblotting ganzer Zellextrakte, die aus Köpfen von eingeschlossenen Fliegen hergestellt werden, zeigen kanonische Muster der Periodenproteinmobilität und -intensität19. 1.4 weibliche Köpfe aus jeder der angegebenen Zeitgeberzeiten (ZT) wurden mit einem Anti-Per-Antikörper analysiert. (B) Immunfluoreszenz der bei ZT gesammelten entrainierten Gehirne, wo das Periodenprotein in einem charakteristischen Muster (Bodenplatten, nachgebaut aus Helfrich-Forster20 )gefunden wird. Gezeigt werden Bilder aus verschiedenen Abschnitten des Gehirns, die alle Neuronen erfassen, die Period-Protein bei ZT1 enthalten sollen. Die Maßstabsleiste ist 40 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| Licht zwischen 10.00 - 22.00 Uhr | Licht zwischen 10.00 - 22.00 Uhr | Dunkel zwischen 9.00 - 21.00 Uhr | Dunkel zwischen 9.00 - 21.00 Uhr |
| Abgeholt um 11 Uhr nach 1 Stunde im Licht | Abgeholt um 17 Uhr nach 7 Stunden im Licht | Gesammelt um 10 Uhr nach 1 Stunde im Dunkeln | Abgeholt um 16 Uhr nach 7 Stunden im Dunkeln |
Tabelle 1: ZT1-ZT19 Circadian Rhythm Timing Schedules.
Discussion
Die Forscher nutzen dieses Einfeinerprotokoll mit Erfolg und Konsistenz. Dieses Verfahren ermöglicht die Fixierung eines großen Samplingpools, der für zukünftige Analysen gespeichert werden kann. Darüber hinaus bewahrt diese Strategie die neurologischen Muster, die durch die Einschulung für zukünftige Untersuchungen induziert werden.
Fixierung für die Speicherung ist ein wichtiger Bestandteil des Entrainment-Prozesses, da es hilft, Das Hirngewebe zu stabilisieren und es ermöglicht mehr Zeit, um jedes Gehirn aus dem Datenpool zu analysieren, wodurch Abfälle aus Gehirnen, die Lebensfähigkeit durch das Alter21verlieren. Das Hauptziel ist es, so viele Fliegen wie möglich zu zirkadianen Zufeinern, so dass es eine kontinuierliche Bestandsaufnahme für Kopfsektionen und letztlich Immunfluoreszenz oder Proteinextraktion gibt, um die Ergebnisse zu beobachten und festzustellen, ob die Ergebnisse von hohem Vertrauen sind. Um sicherzustellen, dass die zirkadiane Verdrängung durch Fixierung erhalten bleibt, ist es integral, dass jede Lichtverschmutzungsquelle beseitigt wird. Der Fixierungsprozess ermöglicht es, Dass Drosophila unter Beibehaltung seines neurologischen "Zeitstempels" gespeichert werden kann, so dass sie später seziert und ohne erkennbare Unterschiede zu Fliegen analysiert werden können, die seziert werden und unmittelbar nach der Einschulung einer Immunfluoreszenz unterzogen wurden. Für die Zwecke der Fixierung vor der Immunfluoreszenz hat das Labor mit Konsistenz festgestellt, dass Fliegen mindestens bis zu einem Monat lebensfähig sind. Fixierungen für die westliche Blotproteinextraktion machen das Gehirn bei -80 °C auf unbestimmte Zeit lebensfähig.
Ein weiterer kritischer Protokollschritt ist das Sexing der Fliegen. Es ist wichtig, dass dieser Schritt genau durchgeführt wird, da beide Geschlechter in der gleichen Durchstechflasche vor der Fixierung zu einer Paarung führen können, was zu neuen Fliegen führt, die jüngeren Alters sind und korrupte Proteinanalyse, wenn Männchen versehentlich untersucht werden anstelle von Weibchen oder umgekehrt. Darüber hinaus ist es beim Sexing wichtig, Larvenproben zu entfernen, die manchmal an Weibchen befestigt sind. Dies verhindert die Entwicklung neuer Nachkommen in der weiblichen Durchstechflasche, die potenziell korrupte Ergebnisse.
Der nächste Schritt für das Entrainment-Protokoll kann mit Elementen im Zusammenhang mit der Datenanalyse sein. Der Schwerpunkt des Protokolls liegt auf der Proteinlokalisierung, aber wenn es andere Variablen gibt, die durch zirkadiane Verzierung beeinflusst werden, müssen sie durch neue Wege erforscht werden, die oft eine Protein- oder Nukleinsäureextraktion erfordern. Zusätzlich, Es gibt andere Proteine des Gehirns, die noch über dieses Protokoll analysiert werden können. Die mit dem Protokoll verbundenen Experimente analysierten bestimmte Proteine, aber die Liste der Gene und Proteine, die in der zirkadianen Biologie eine Rolle spielen, ist noch nicht erschöpft. Das Protokoll ist effektiv bei der Erreichung des Ziels der Etablierung eines zirkadianen Rhythmus, aber die Anwendungen sind weitreichend.
Disclosures
nichts.
Acknowledgments
Besonderer Dank geht an die University of Missouri-Kansas City und das Jeffrey L. Price Labor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
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