Summary
Her beskriver vi hvordan vi synkroniserer Drosophila til en circadian dag. Dette er det første og viktigste trinnet som er nødvendig for å studere biologiske rytmer og kronologi.
Abstract
Nesten universelle blant organismer koordinerer døgnrytmen biologisk aktivitet til jordens bane rundt solen. For å identifisere faktorer som skaper denne rytmen og for å forstå de resulterende utgangene, er det nødvendig med entrainment av modellorganismer til definerte circadian tidspunkter. Her beskriver vi en prosedyre for å trene mange Drosophila til en definert døgnrytme. Videre beskriver vi ettertreningstrinn for å forberede prøver for immunofluorescence, nukleinsyre eller proteinutvinningsbasert analyse.
Introduction
Nesten alle organismer på jorden, fra den største ned til enkeltcellet, har en intern biologisk klokke med en syklus på omtrent en dag. Dette er kjent som døgnrytmen (skapt i 1953 av Franz Halberg fra de latinske termene circa = om / omtrent og "dør" = dag)1. Selv om komponenter i kjerneklokken er kjent og deres rudimentære funksjonsmekanismer konseptualisert, er det fortsatt mye å forstå om hvordan biologiske rytmer opprettholdes i hele kroppen. Viktigere, feilregulering av biologiske rytmer er forbundet med dårlige helseutfall, inkludert dårlig minnedannelse, søvnforstyrrelser, sesongmessige lidelser, depresjon, bipolar lidelse, diabetes, fedme, nevrodegenerasjon og kreft2,,3,,4,,5.
Drosophila er en veletablert modell for undersøkelse av circadian biologi. Genetisk og biokjemisk tractable, store tall er lett innkadert (som vil bli vist). Faktisk, alle syv publikasjoner sitert som viktige publikasjoner av støtte i tildeling av Nobelprisen for oppdagelsen av døgnrytmer utnyttet disse styrkene til Drosophila modell6,7,8,9,10,11,12.
I tillegg viser vi effektive strategier for å samle inn innrente fluer i forbindelse med enten immunofluorescence, nukleinsyre eller proteinutvinningsbasert analyse. Ved hjelp av disse strategiene kan man behandle og lagre større mengder prøver for analyse i fremtiden. Disse metodene er svært fordelaktige ved at de er reproduserbare og kan gi hundrevis av innrente fluer som kan være en del av et stort datautvalg.
Protocol
1. Fly matproduksjon
- Per hver 1 l vann, forberede fly mat bestående av 4,69 g tørket melasse, 19,70 g tørr aktiv gjær, 87,22 g mais måltid og 7,83 g agar.
- Kombiner innholdet som er oppført ovenfor i en crockpot og vri varmen til 250 °F. Bland godt som ingredienser er tilsatt.
- Hold lokket på crockpot som fly mat er oppvarming samtidig blande innholdet hver 10 min til den når en rullende koke. La rullekoken fortsette i 20 min før du slår av varmen.
- Tilsett 83,60 ml vann og hold lokket på crockpot av når maten avkjøles.
- Bland og registrer temperaturen på maten hver 10 min med et glasstermometer. Unngå å la et lag med film bosette seg på toppen av maten.
- Når maten er avkjølt til 60 °C, tilsett 10,44 ml Tegosept og 5,51 ml propionsyre per liter vann tilsatt (se trinn 1.1).
- Bland godt og skru opp varmen opp til 60 °C for å hindre at maten blir for kald.
- Pump flymaten etter behov ved hjelp av Droso-fyllstoffet.
- For smale hetteglass, pumpe 10 ml og for 6 oz firkantede bunnflasker pumpe 60 ml.
2. Samle fluer av definert alder
- Overvåk flasker med ville fluer lagret ved 25 °C i 5-7 dager til store mengder pupa (ca. 200 pupa) er festet til siden av flasken. Flaskene som brukes er 6 oz Drosophila lagerflasker med firkantede bunner.
- Fjern eksisterende voksne fra flasken. Enten tips de voksne i en ny flaske eller legg dem i 70% etanol. Bruk den kjedelige enden av en #0 pensel til å presse eventuelle gjenværende voksne inn i flymaten. Pass på å tørke børsten ned med 70% etanol før og etter bruk.
- La ryddet flasker sitte i 3 dager i en 25 °C inkubator for å tillate neste generasjon å eklose. Disse fluene vil være mellom 0 og 3 dager gamle.
3. Fly separasjon
- Etter 3 dager, skille menn fra kvinner og samle ønsket nummer for hvert kjønn for hver av de fire tidspoeng. Fluer kan differensieres ved kjønn ved å undersøke kjønnsorganer; menn har mørke avrundede kjønnsorganer mens kvinner har lettere, mer spisse kjønnsorganer. Hunnene er også mye større enn mannlige fluer.
- Bruk en CO2 anestesipute for effektivt å skille fluene og skille mellom kjønnene. Flytt fluene med pensler for å unngå å drepe dem.
- Samle 100 menn og 100 kvinner for hvert tidspunkt, med 50 menn per hetteglass og 100 kvinner per hetteglass. Menn har en tendens til å være mer aggressive og deres sosiale interaksjoner fører til mange dødsfall når det er 100 individer i et hetteglass. Hunnene opptil 100 individer- påvirkes upåvirket mens de finnes i hetteglasset.
- Utfør samlingene på følgende tidspunkter: ZT1, ZT7, ZT13 og ZT19 (tabell 1). Vær oppmerksom på at samlinger gjort i mørket (ZT12-ZT24) er lysfølsomme, mens ZT0-ZT11-samlinger gjøres under lystider og romlys kan være på. Vær oppmerksom på at to separate inkubatorer brukes med inverse 12 timers lysmønstre for å tillate at alle samlinger kan skje i løpet av dagen og ikke over natten.
- Bruk overflødige fluer for å lage nye flasker fluer for fremtidig inntrainment. Plasser 25 kvinner med 5-7 menn i hver ny flaske og plasser i inkubatoren ved 25 °C.
4. Fly inkubasjon
- La fluene holde seg i lette regulerte inkubatorer i 3-5 dager for å tillate circadian entrainment å skje. Sørg for at inkubatorer er lette fordi selv små mengder lysforurensning vil forstyrre entrainment.
5. Immunofluorescence fiksering
- Etter entrainment, forberede nye hetteglass med fiksering løsning for prøver som vil bli brukt til immunofluorescence. Før du fjerner fluene fra inkubatoren, tilsett 4,8 ml 4% formaldehyd fortynnet i 1x PBS + 0,1% Tween-20 til hvert nytt smalt hetteglass for hver 100 fluer som skal fikses. Hvert hetteglass vil huse 100 mannlige eller 100 kvinnelige Circadian entrained fluer. Legg de smale hetteglassene i is.
6. Kolleksjon av immunofluorescence
- Når du samler fluene fra inkubatoren for immunofluorescence, fjern flaskehetten og inverter flasken raskt i trakten. Trykk forsiktig fluene inn i løsningen via trakten for å veilede fluene inn i hetteglasset; kombinere to rør av de 50 hannene for totalt 100 menn i ett hetteglass og bruke et enkelt rør på 100 kvinner for det andre hetteglasset.
- Utfør ZT13- og ZT19-samlinger i mørket; bruke et rødt lys for å se som drosophila er langt mindre følsomme for disse lysbølgelengder og er derfor mindre utsatt for lysforurensning13. Cryptochrome protein, spesielt, er spesielt følsom for blått lys, som må unngås14.
- For å redusere lyseksponeringen må du sørge for at oppsamlingsrommet er lett stramt med eventuelle lyskilder blokkert eller dekket. Pakk disse hetteglassene i folie slik at ZT13 og ZT19 fluer ikke utsettes for lys når de plasseres på nutating mikseren i følgende trinn. ZT1- og ZT7-fluene er ikke lysfølsomme og kan plasseres på mikseren uten foliebelegg.
7. Nutating mikser og lagring
- Etter at fluene er samlet, tape toppen av hetteglassene som inneholder fikseringsmiddel for å unngå søl og plassere dem på nutating mikseren ved 165 RPM ved 4 ° C i 4 timer. Fluene er ikke lenger lette følsomme etter dette fikseringstrinnet, så folie kan fjernes for å verifisere at løsningen beveger seg og fluer blir nedsenket i fikseringen.
- Etter å ha fjernet fluen som inneholder hetteglass fra nutating mikseren, fjern formaldehyd og vask tre ganger med 3000 μL 1x PBS, inverterer hetteglasset med hver vask.
- Oppbevar hetteglassene som bærer immunofluorescence prøver ved 4 °C for å avvente fremtidig immunofluorescence15.
8. Innsamling for proteinekstraksjon
- Forbered fire 50 ml rør og en Dewar som inneholder flytende nitrogen for bevaring av prøver for proteinutvinning
- For å samle fluer for protein eller nukleinsyreekstraksjon, overfør fluer fra flaskene til røret på samme måte som i trinn 6.1 og avsette raskt røret for å forhindre frigjøring av fluer og legg røret i flytende nitrogen for å smekker fryse.
9. Lagring for proteinekstraksjon
- Oppbevar frosne prøver for proteinekstraksjon ved -80 °C. Disse kan behandles i henhold til proteinutvinningsprotokollen som passer for nedstrøms analyse, inkludert immunoblotting16.
Representative Results
Kontrollert circadian entrainment gjør det mulig for forskere å undersøke biologi på bestemte tidspunkter gjennom circadian dagen ved hjelp av ZT1-ZT19 timing tidsplaner eller å legge til tidspunkter etter behov. Her bruker vi lys og mørke til å trene fluer til circadian sykluser og verifisere entrainment ved immunoblotting og immunofluorescence analyse av perioden protein, en markør for circadian entrainment (Figur 1). Ved riktig inntrainment bør periodeproteiner ha et karakteristisk intensitets- og mobilitetsmønster (figur 1A) og skal være synlig på bestemte steder i ZT1-hjernen (figur 1B). Selv om andre variabler, inkludert mat og temperatur, kan påvirke circadian entrainment, er lyset mest enkelt og pålitelig å kontrollere17. I forbindelse med disse metodene holdes inkubatortemperaturer konstante, avhengig av cerebral klokkenevroner som påvirkes av lys for entrainment18.
Figur 1: Verifisering av entrainment. (A)Immunoblotting av hele celleekstrakter utarbeidet fra hoder av innrente fluer viser kanoniske mønstre av periodeproteinmobilitet og intensitet19. 1,4 kvinnelige hoder fra hver av de angitte Zeitgeber-tidene (ZT) ble analysert ved hjelp av et anti-Per antistoff. (B)Immunofluorescence av innrente hjerner samlet ved ZT, hvor periodeproteinet finnes i et karakteristisk mønster (bunnpaneler, gjenskapt fra Helfrich-Forster20). Vist er bilder tatt fra forskjellige deler av hjernen, fange alle nevroner forventes å inneholde periode protein ved ZT1. Skala bar er 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| ZT1 (andre personer) | ZT7 Leilighet | ZT13 Leilighet | ZT19 Leilighet |
| Lys mellom 10 am til 22:00 | Lys mellom 10 am til 22:00 | Mørk mellom 09:00-21:00 | Mørk mellom 09:00-21:00 |
| Samlet kl 11 etter 1 time i lys | Samlet kl 17:00 etter 7 timer i lys | Samlet på 10 am etter 1 time i mørket | Samlet på 4 pm etter 7 timer i mørket |
Tabell 1: ZT1-ZT19 Circadian Rhythm Timing Tidsplaner.
Discussion
Forskere benytter denne entrainment protokollen med suksess og konsistens. Denne prosedyren gjør det mulig å fikse et stort utvalgsutvalg som kan lagres for fremtidig analyse. I tillegg bevarer denne strategien de nevrologiske mønstrene indusert av entrainment for fremtidig undersøkelse.
Fiksering for lagring er en viktig del av entrainment prosessen som det bidrar til å stabilisere hjernevev og det gir mer tid til å analysere hver hjerne fra datautvalget og dermed minimere avfall fra hjernen som mister levedyktighet på grunn avalder 21. Hovedmålet er å circadian entrain så mange fluer som mulig, slik at det er kontinuerlig inventar tilgjengelig for hode disseksjoner og til slutt immunofluorescence eller protein utvinning for å observere funnene og avgjøre om resultatene er av høy tillit. For å sikre at circadian entrainment bevares gjennom fiksering, er det integrert at enhver kilde til lysforurensning elimineres. Fikseringsprosessen gjør det mulig for Drosophila å bli lagret samtidig som den opprettholder sitt nevrologiske "tidsstempel" slik at de kan dissekeres senere og analyseres uten merkbare forskjeller til fluer som dissekeres og har gjennomgått immunofluorescence umiddelbart etter trening. I forbindelse med fiksering før immunofluorescence har laboratoriet bestemt med konsistens at fluer er levedyktige minst opptil 1 måned. Fikseringer for vestlige flekkproteinekstraksjon gjør hjernen levedyktig på ubestemt tid når den oppbevares ved -80 °C.
Et annet kritisk protokolltrinn er sexing av fluene. Det er viktig at dette trinnet gjøres nøyaktig som å ha begge kjønn i samme hetteglass før fiksering kan føre til parring, noe som vil gi nye fluer som er av yngre alder og korrupt proteinanalyse hvis menn ved et uhell undersøkes i stedet for kvinner eller omvendt. I tillegg, når du sexing er det viktig å fjerne larverprøver som til tider er festet til kvinner. Dette forhindrer utvikling av nye avkom inne i det kvinnelige hetteglasset som potensielt kan ødelegge resultatene.
Det neste trinnet for entrainment-protokollen kan være med elementer relatert til dataanalyse. Fokuset i protokollen er protein lokalisering, men hvis det er andre variabler som påvirkes av circadian entrainment, må de utforskes gjennom nye veier, ofte krever protein eller nukleinsyre utvinning. I tillegg er det andre proteiner i hjernen som fortsatt kan analyseres via denne protokollen. Eksperimentene knyttet til protokollen analyserte visse proteiner, men listen over gener og proteiner som spiller en rolle i circadian biologi er ikke oppbrukt. Protokollen er effektiv i å oppnå målet om å etablere en døgnrytme, men søknadene er omfattende.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Spesiell takk til University of Missouri-Kansas City og Jeffrey L. Price laboratoriet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
