Summary
Aqui, detalhamos como sincronizar drosophila a um dia circadiano. Este é o primeiro e mais importante passo necessário para o estudo de ritmos biológicos e cronobiologia.
Abstract
Quase universais entre organismos, ritmos circadianos coordenam a atividade biológica à órbita da Terra ao redor do Sol. Para identificar fatores que criam esse ritmo e entender as saídas resultantes, é necessária a entrada de organismos modelos para pontos de tempo circadianos definidos. Aqui detalhamos um procedimento para entrar muitos Drosophila a um ritmo circadiano definido. Além disso, detalhamos as etapas pós-entratinação para preparar amostras para imunofluorescência, ácido nucleico ou análise baseada em extração de proteínas.
Introduction
Quase todos os organismos da Terra, do maior até o único celular, têm um relógio biológico interno com um ciclo de cerca de um dia. Este é conhecido como o ritmo circadiano (cunhado em 1953 por Franz Halberg a partir dos termos latinos circa = cerca/aproximadamente e "morre" = dia)1. Embora os componentes do relógio central sejam conhecidos e seus mecanismos rudimentares de função conceituados, ainda há muito o que entender sobre como os ritmos biológicos são mantidos em todo o corpo. É importante ressaltar que a má regulação dos ritmos biológicos está associada a desfechos de saúde ruins, incluindo má formação da memória, distúrbios do sono, transtorno de afeto sazonal, depressão, transtorno bipolar, diabetes, obesidade, neurodegeneração e câncer2,,3,4,5.
Drosophila é um modelo bem estabelecido para a investigação da biologia circadiana. Geneticamente e bioquimicamente tratáveis, grandes números são facilmente entranados (como será mostrado). De fato, todas as sete publicações citadas como principais publicações de apoio na concessão do Prêmio Nobel pela descoberta de ritmos circadianos alavancaram esses pontos fortes do modelo Drosophila6,,7,,8,9,,10,,11,12.
Além disso, mostramos estratégias eficazes para a coleta de moscas entratinadas para fins de imunofluorescência, ácido nucleico ou análise baseada em extração de proteínas. Utilizando essas estratégias, pode-se processar e armazenar quantidades maiores de amostras para análise no futuro. Esses métodos são muito vantajosos, pois são reprodutíveis e podem produzir centenas de moscas presas que podem fazer parte de um grande pool de dados.
Protocol
1. Produção de alimentos voadores
- Por cada 1 L de água, prepare comida de mosca composta por 4,69 g de melaço seco, 19,70 g de levedura ativa seca, 87,22 g de farinha de milho e 7,83 g de ágar.
- Misture o conteúdo listado acima em um pote e gire o calor para 250 °F. Misture bem como os ingredientes são adicionados.
- Mantenha a tampa sobre o pote de crock, pois o alimento de mosca está aquecendo, ao mesmo tempo em que mistura o conteúdo a cada 10 minutos até chegar a uma fervura. Deixe a fervura de rolamento continuar por 20 minutos antes de desligar o fogo.
- Adicione 83,60 mL de água e mantenha a tampa do pote de crockpot fora enquanto a comida esfria.
- Misture e regisse a temperatura do alimento a cada 10 minutos com um termômetro de vidro. Evite deixar uma camada de filme se acomodar em cima da comida.
- Uma vez que o alimento tenha esfriado a 60 °C, adicione 10,44 mL de Tegosept e 5,51 mL de ácido propínico por litro de água adicionado (ver passo 1.1).
- Misture bem e aumente o calor até 60 °C para evitar que a comida fique muito fria.
- Bombeie a comida de mosca conforme necessário usando o enchimento Droso.
- Para frascos estreitos, bombeie 10 mL e para garrafas de fundo quadrados de 6 oz bombear 60 mL.
2. Coleta de moscas de idade definida
- Monitore garrafas de moscas do tipo selvagem armazenadas a 25 °C por 5-7 dias até que grandes quantidades de pupa (cerca de 200 pupas) sejam anexadas ao lado da garrafa. As garrafas utilizadas são garrafas de calção Drosophila de 6 oz com fundo quadrado.
- Limpe os adultos existentes da garrafa. Ou coloca os adultos em uma garrafa nova ou coloca-os em 70% de etanol. Use a extremidade maçante de um pincel #0 para empurrar todos os adultos restantes para a comida de mosca. Certifique-se de limpar a escova de tinta com 70% de etanol antes e depois dos usos.
- Deixe as garrafas limpas descansarem por 3 dias em uma incubadora de 25 °C para permitir que a próxima geração se esclae. Estas moscas terão entre 0 e 3 dias de idade.
3. Separação de moscas
- Após 3 dias, separe os machos das fêmeas e colete o número desejado para cada sexo para cada um dos quatro pontos de tempo. As moscas podem ser diferenciadas pelo sexo examinando a genitália; os machos têm genitália arredondada escura, enquanto as fêmeas têm genitálias mais claras e pontiagudas. As fêmeas também são muito maiores que moscas machos.
- Use uma almofada de anestesia de CO2 para separar efetivamente as moscas e diferenciar entre os sexos. Mova as moscas com pincéis de tinta para evitar matá-las.
- Coletar 100 machos e 100 fêmeas para cada ponto de tempo, com 50 machos por frasco e 100 fêmeas por frasco. Os machos tendem a ser mais agressivos e suas interações sociais levam a muitas mortes quando há 100 indivíduos em um frasco. As fêmeas, com até 100 indivíduos, não são afetadas enquanto estão contidas no frasco.
- Realizar as coletas nos seguintes pontos de tempo: ZT1, ZT7, ZT13 e ZT19(Tabela 1). Observe que as coleções feitas no escuro (ZT12-ZT24) são sensíveis à luz, enquanto as coleções ZT0-ZT11 são feitas durante os horários de luz e as luzes da sala podem ser acesas. Observe que duas incubadoras separadas são usadas com padrões de luz inversos de 12 horas para permitir que todas as coleções ocorram durante o dia e não durante a noite.
- Use moscas em excesso para criar novas garrafas de moscas para futuras entranhas. Coloque 25 fêmeas com 5-7 machos em cada garrafa nova e coloque na incubadora a 25 °C.
4. Incubação de moscas
- Permita que as moscas permaneçam em incubadoras regulamentadas à luz por 3-5 dias para permitir que a entrada circadiana ocorra. Certifique-se de que as incubadoras são leves porque mesmo pequenas quantidades de poluição luminosa perturbarão a entrada.
5. Fixação de imunofluorescência
- Após a entrada, prepare novos frascos de solução de fixação para amostras que serão utilizadas para imunofluorescência. Antes de remover as moscas da incubadora, adicione 4,8 mL de 4% de formaldeído diluído em 1x PBS + 0,1% Tween-20 a cada novo frasco estreito para cada 100 moscas que devem ser fixadas. Cada frasco abrigará 100 moscas circadianas machos ou 100 fêmeas. Coloque os frascos estreitos no gelo.
6. Coleta de imunofluorescência
- Ao coletar as moscas da incubadora para imunofluorescência, remova a tampa da garrafa e inverta rapidamente a garrafa no funil. Toque suavemente as moscas na solução através do funil para ajudar a guiar as moscas para o frasco; combinar dois tubos dos 50 machos para um total de 100 machos em um frasco e usar um único tubo de 100 fêmeas para o outro frasco.
- Realizar coleções ZT13 e ZT19 no escuro; usar uma luz vermelha para ver como a drosophila são muito menos sensíveis a esses comprimentos de onda de luz e, portanto, são menos propensas à poluiçãoluminosa 13. A proteína criptocromática, em particular, é especialmente sensível à luz azul, que deve ser evitada14.
- Para reduzir a exposição à luz, certifique-se de que o quarto de coleta esteja leve e apertado com quaisquer fontes de luz bloqueadas ou cobertas. Enrole estes frascos em papel alumínio para que as moscas ZT13 e ZT19 não sejam expostas à luz quando colocadas no misturador de nozes na etapa seguinte. As moscas ZT1 e ZT7 não são sensíveis à luz e podem ser colocadas na batedeira sem cobertura de papel alumínio.
7. Misturador e armazenamento de nozes
- Depois que as moscas tiverem sido coletadas, tape a parte superior dos frascos contendo fixação para evitar derramamento e coloque-as na batedeira de nozes a 165 RPM a 4 °C por 4h. As moscas não são mais sensíveis à luz após esta etapa de fixação, por isso a folha pode ser removida para verificar se a solução está se movendo e as moscas estão sendo submersas no fixador.
- Depois de remover a mosca contendo frascos da batedeira de nozes, remova o formaldeído e lave três vezes com 3.000 μL de 1x PBS, invertendo o frasco a cada lavagem.
- Armazene os frascos com amostras de imunofluorescência a 4 °C para aguardar a futura imunofluorescência15.
8. Coleta para extração de proteínas
- Prepare quatro tubos de 50 mL e um Dewar contendo nitrogênio líquido para preservação de amostras para extração de proteínas
- Para coletar moscas para extração de proteína ou ácido nucleico, transfira moscas das garrafas para o tubo da mesma forma que na etapa 6.1 e tampar rapidamente o tubo para evitar a liberação de moscas e colocar o tubo em nitrogênio líquido para congelar.
9. Armazenamento para extração de proteínas
- Armazene amostras congeladas para extração de proteínas a -80 °C. Estes podem ser processados de acordo com o protocolo de extração de proteínas apropriado para análise a jusante, incluindo a imunoblotação16.
Representative Results
A entranção circadiana controlada permite que os pesquisadores examinem a biologia em pontos de tempo específicos durante todo o dia circadiano usando os horários de tempo ZT1-ZT19 ou adicionem pontos de tempo conforme necessário. Aqui usamos luz e escuridão para entrar em moscas para ciclos circadianos e verificar a entrada por imunobloquetação e análise de imunofluorescência da proteína do período, um marcador para a entrada circadiana(Figura 1). Após a entrada correta, as proteínas de período devem ter um padrão característico de intensidade e mobilidade(Figura 1A) e devem ser visíveis em locais específicos do cérebro ZT1(Figura 1B). Embora outras variáveis, incluindo alimentos e temperatura, possam influenciar a entrada circadiana, a luz é mais simples e confiável para controlar17. Para efeitos desses métodos, as temperaturas da incubadora são mantidas constantes, contando com neurônios de relógio cerebral que são influenciados pela luz para a entrada18.
Figura 1: Verificação da entrainment. (A) A Imunoblotting de extratos celulares inteiros preparados a partir de cabeças de moscas entratinadas mostra padrões canônicos de mobilidade e intensidade de proteínas de período19. 1,4 cabeças femininas de cada um dos tempos zeitgeber indicados (ZT) foram analisadas utilizando um anticorpo anti-Per. (B) Imunofluorescência de cérebros entratinados coletados em TV, onde a proteína do período é encontrada em um padrão característico (painéis inferiores, recriados a partir de Helfrich-Forster20). São mostradas imagens tiradas de diferentes seções do cérebro, capturando todos os neurônios esperados para conter proteína de período no ZT1. A barra de escala é de 40 μm. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| Luz entre 10:00 e 22:00 | Luz entre 10:00 e 22:00 | Escuro entre 9:00 e 21:00 | Escuro entre 9:00 e 21:00 |
| Coletado às 11:00 após 1 hora na luz | Coletado às 17:00 após 7 horas na luz | Coletado às 10:00 após 1 hora no escuro | Coletado às 16h após 7 horas no escuro |
Tabela 1: Horários de tempo de ritmo circadiano ZT1-ZT19.
Discussion
Os pesquisadores utilizam esse protocolo de entramento com sucesso e consistência. Este procedimento permite a fixação de uma grande piscina de amostragem que pode ser armazenada para análise futura. Além disso, essa estratégia preserva os padrões neurológicos induzidos pela entrada para exames futuros.
A fixação para armazenamento é um dos principais componentes do processo de entranção, pois ajuda a estabilizar o tecido cerebral e permite mais tempo para analisar cada cérebro a partir do pool de dados, minimizando assim os resíduos de cérebros que perdem viabilidade devido aos21anos . O objetivo principal é circadiano entrar o maior número possível de moscas para que haja inventário contínuo disponível para dissecções de cabeça e, em última instância, imunofluorescência ou extração de proteínas para observar os achados e determinar se os resultados são de alta confiança. Para garantir que a entranção circadiana seja preservada através da fixação, é fundamental que qualquer fonte de poluição luminosa seja eliminada. O processo de fixação permite que a Drosophila seja armazenada mantendo seu "timetamp" neurológico para que possam ser dissecados posteriormente e analisados sem diferenças perceptíveis para moscas que são dissecadas e sofreram imunofluorescência imediatamente após a entrada. Para fins de fixação antes da imunofluorescência, o laboratório determinou com consistência que as moscas são viáveis pelo menos até 1 mês. Fixações para extração de proteína de mancha ocidental tornam os cérebros viáveis indefinidamente quando armazenados a -80 °C.
Outro passo crítico do protocolo é o sexing das moscas. É importante que este passo seja feito com precisão, pois ter ambos os sexos no mesmo frasco antes da fixação pode levar ao acasalamento, o que produzirá novas moscas que são de idade mais jovem e análise de proteínas corruptas se os machos forem acidentalmente examinados em vez de fêmeas ou vice-versa. Além disso, ao fazer sexo é importante remover amostras de larvas que às vezes são ligadas às fêmeas. Isso impede o desenvolvimento de novas descendências dentro do frasco feminino que poderiam potencialmente corromper resultados.
O próximo passo para o protocolo de entramento pode ser com itens relacionados à análise de dados. O foco do protocolo é a localização de proteínas, mas se há outras variáveis que são impactadas pela entranção circadiana, elas devem ser exploradas por novos caminhos, muitas vezes exigindo extração de proteínas ou ácidos nucleicos. Além disso, existem outras proteínas do cérebro que ainda podem ser analisadas através deste protocolo. Os experimentos associados ao protocolo analisaram certas proteínas, mas a lista de genes e proteínas que desempenham um papel na biologia circadiana não foi esgotada. O protocolo é eficaz no cumprimento do objetivo de estabelecer um ritmo circadiano, no entanto, as aplicações são amplas.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Agradecimentos especiais à Universidade do Missouri-Kansas City e ao laboratório Jeffrey L. Price.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
