Summary
Здесь мы подробно, как синхронизировать Drosophila в циркадный день. Это первый и самый важный шаг, необходимый для изучения биологических ритмов и хронобиологии.
Abstract
Почти универсальные среди организмов циркадные ритмы координируют биологическую активность на околоземной орбите вокруг Солнца. Для выявления факторов, создающих этот ритм, и для понимания полученных результатов требуется увлечение модельных организмов определенными циркадными точками времени. Здесь мы подробно процедуры для окутывать многие Drosophila в определенный циркадный ритм. Кроме того, мы подробно описаны шаги после вовлечения для подготовки образцов для иммунофторесценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка.
Introduction
Почти все организмы на Земле, от крупнейших до одноклеточных, имеют внутренние биологические часы с циклом около одного дня. Это известно как циркадный ритм (придуманный в 1953 году Францем Халбергом из латинских терминов около й о/приблизительно и "умирает"и день) 1. Хотя компоненты основных часов известны и их рудиментарные механизмы функции концептуализированы, есть еще много, чтобы понять о том, как биологические ритмы поддерживаются по всему телу. Важно отметить, что неправильное регулирование биологических ритмов связано с плохими результатами для здоровья, включая плохое формирование памяти, расстройства сна, сезонное расстройство влияет, депрессия, биполярное расстройство, диабет, ожирение, нейродегенерация, и рак2,3,4,5.
Дрозофила является устоявшейся моделью для исследования циркадной биологии. Генетически и биохимически уместным, большое количество легко перенапряжены (как будет показано). В самом деле, все семь публикаций цитируется в качестве ключевых публикаций поддержки в присуждении Нобелевской премии за открытие циркадных ритмов использовали эти сильные стороны модели Drosophila6,7,8,9,10,11,12.
Кроме того, мы показываем эффективные стратегии сбора поглощенных мух для целей иммунофлуоресценции, нуклеиновой кислоты или анализа на основе извлечения белка. Используя эти стратегии, можно обрабатывать и хранить большие объемы образцов для анализа в будущем. Эти методы очень выгодны тем, что они воспроизводятся и могут дать сотни поглощенных мух, которые могут быть частью большого пула данных.
Protocol
1. Производство продуктов питания на лету
- На каждые 1 л воды готовят мухомо пищу, состоящую из 4,69 г сушеной патоки, 19,70 г сухих активных дрожжей, 87,22 г кукурузной муки и 7,83 г агара.
- Объедините содержимое, перечисленное выше, в кастрюле и поверните тепло до 250 градусов по Фаренгейту. Хорошо перемешать, как ингредиенты добавляются.
- Держите крышку на кастрюлю, как муха пища нагревается, а также смешивания содержимого каждые 10 минут, пока не достигнет кипения. Разрешить прокатки кипения продолжать в течение 20 минут, прежде чем выключить огонь.
- Добавьте 83,60 мл воды и держите крышку кастрюли, как пища охлаждается.
- Смешайте и замитмите температуру пищи каждые 10 минут со стеклянным термометром. Не позволяйте слой пленки оседают на верхней части пищи.
- После того, как пища остынет до 60 градусов по Цельсию, добавьте 10,44 мл тегосепта и 5,51 мл пропионовой кислоты на литр добавленной воды (см. шаг 1.1).
- Хорошо перемешайте и поверните нагреть до 60 градусов по Цельсию, чтобы предотвратить слишком прохладное питание.
- Насос летать пищи по мере необходимости с помощью Droso-наполнителя.
- Для узких флаконов, насос 10 мл и для 6 унций квадратных нижних бутылок насоса 60 мл.
2. Сбор мух определенного возраста
- Монитор бутылки диких мух типа хранится при 25 градусов по Цельсию в течение 5-7 дней, пока большое количество куколки (около 200 куколок) прилагаются к стороне бутылки. Бутылки используются 6 унций Drosophila фондовых бутылок с квадратным дном.
- Очистим существующих взрослых от бутылки. Либо наконечник взрослых в новую бутылку или поместите их в 70% этанола. Используйте унылый конец #0, чтобы подтолкнуть оставшихся взрослых в пищу мухи. Будьте уверены, чтобы протереть краску щеткой вниз с 70% этанола до и после использования.
- Разрешить очищены бутылки сидеть в течение 3 дней в инкубаторе 25 градусов по Цельсию, чтобы для следующего поколения, чтобы исключить. Этим мухам будет от 0 до 3 дней.
3. Разделение мух
- Через 3 дня отделяем самцов от самок и собираем нужное количество для каждого пола для каждого из четырех пунктов времени. Мухи могут быть дифференцированы по полу путем изучения гениталий; мужчины имеют темные округлые гениталии в то время как женщины имеют более светлые, более остроконечные гениталии. Самки также намного крупнее самцов мух.
- Используйте CO2 анестезии площадку эффективно отделить мух и различать полов. Перемещение мух с краской кисти, чтобы избежать их убийства.
- Соберите 100 мужчин и 100 женщин для каждой точки времени, с 50 мужчин на флакон и 100 женщин на флакон. Мужчины, как правило, более агрессивным и их социальные взаимодействия приводят к много смертей, когда Есть 100 человек во флаконе. Самки до 100 особей не затрагиваются, находясь во флаконе.
- Выполняем коллекции в следующих точках времени: NoT1, NoT7, ЗТ13 и ЗТ19(таблица 1). Обратите внимание, что коллекции, выполненные в темное время суток (ЗТ12-ЗТ24), светочувствительны, в то время как коллекции ЗТ0-ЗТ11 выполнены во время освещения и света комнаты. Обратите внимание, что два отдельных инкубатора используются с обратными 12-часовыми световыми узорами, позволяющими всем коллекциям происходить в течение дня, а не на ночь.
- Используйте лишние мухи, чтобы создать новые бутылки мух для будущего вовренности. Поместите 25 самок с 5-7 самцами в каждую новую бутылку и поместите в инкубатор при 25 градусов по Цельсию.
4. Инкубация мух
- Разрешить мухам оставаться в свет регулируется инкубаторов в течение 3-5 дней, чтобы циркадные увлечение происходит. Убедитесь, что инкубаторы светоемкие, потому что даже небольшое количество светового загрязнения будет беспокоить увлечение.
5. Фиксация иммунофлюоресценции
- После заезда подготовьте новые флаконы фиксационерного раствора для образцов, которые будут использоваться для иммунофлуоресценции. Перед удалением мух из инкубатора добавьте 4,8 мл 4% формальдегида, разбавленного в 1x PBS, и 0,1% Tween-20 к каждому новому узкому флакону на каждые 100 мух, которые должны быть зациклены. Каждый флакон будет в доме 100 мужчин или 100 женщин circadian заключенных мух. Поместите узкие флаконы во льду.
6. Коллекция иммунофлуоресценции
- При сборе мух из инкубатора для иммунофлуоресценции, удалить крышку бутылки и быстро инвертировать бутылку в воронку. Аккуратно нажмите мух в раствор через воронку, чтобы помочь направлять мух во флакон; объединить две трубки из 50 мужчин в общей сложности 100 мужчин в одном флаконе и использовать одну трубку из 100 женщин для другого флакона.
- Выполняем коллекции Т13 и Т19 в темноте; использовать красный свет для того, чтобы увидеть, как дрозофила гораздо менее чувствительны к этим длинам волн света и, следовательно, менее склонны к световомузагрязнению 13. Криптохромный белок, в частности, особенно чувствителен к синему свету, которого следуетизбегать 14.
- Чтобы уменьшить воздействие света, убедитесь, что комната сбора свет плотно с любыми источниками света заблокированы или покрыты. Оберните эти флаконы в фольгу так, чтобы мухи ЗТ13 и ЗТ19 не подвергались воздействию света при размещении на гайке смесителя на следующем этапе. Мухи ЗТ1 и ЗТ7 не светочувствительны и могут быть помещены на смеситель без покрытия фольгой.
7. Питательный смеситель и хранение
- После того, как мухи были собраны, лента верхней части флаконов, содержащих фиксатор, чтобы избежать разлива и поместить их на ореховый смеситель при 165 об /мин при 4 градусов по Цельсию в течение 4 ч. Мухи больше не светочувствительны после этого шага фиксации, так что фольга может быть удалена, чтобы проверить решение движется и мухи погружаются в фиксатор.
- После удаления мухи, содержащей флаконы из орехового смесителя удалить формальдегид и мыть три раза с 3000 йл 1x PBS, инвертирование флакона с каждой стирки.
- Храните флаконы с образцами иммунофторесценции при 4 градусах Цельсия в ожидании будущего иммунофлюоресценции15.
8. Сбор для извлечения белка
- Подготовка четырех трубок объемом 50 мл и двойки, содержащей жидкий азот, для сохранения образцов для извлечения белка
- Для сбора мух для извлечения белка или нуклеиновой кислоты, передача мух из бутылок в трубку таким же образом, как в шаге 6.1 и быстро крышка трубки, чтобы предотвратить высвобождение мух и поместить трубку в жидкий азот, чтобы оснастки заморозить.
9. Хранение для извлечения белка
- Храните замороженные образцы для извлечения белка при -80 градусов по Цельсию. Они могут быть обработаны в соответствии с протоколом извлечения белка подходит для анализа вниз по течению, в том числеиммуноблоттинг 16.
Representative Results
Контролируемое циркадные обучения позволяет исследователям изучать биологию в определенных точках времени в течение циркадного дня с помощью графиков времени ЗТ1-ЗТ19 или при необходимости добавлять точки времени. Здесь мы используем свет и тьму, чтобы уведить мух до циркадных циклов и проверить увлечение иммуноблоттингом и иммунофлуоресценцией анализа белка периода, маркером циркадного обучения(рисунок 1). При правильном затренчении, период белки должны иметь характерную интенсивность и подвижность картины (Рисунок 1A) и должны быть видны в определенных местах в мозгеNo 1 (рисунок 1B). Хотя другие переменные, включая пищу и температуру, могут влиять на циркадные обучения, свет является наиболее простым и надежным дляуправления 17. Для целей этих методов, температура инкубатора держится постоянн, полагаясь на нейроны часов мозга которые повлияно на светом для entrainment18.
Рисунок 1: Проверка натренированности. (A)Иммуноблотирование экстрактов целых клеток, подготовленных из головок обученных мух, показывает канонические закономерности подвижности и интенсивностибелка периода 19. 1.4 женские головки от каждого из показанных времен zeitgeber (ЗТ) были проанализированы используя антитело anti-Per. (B) Иммунофлуоресценция перенапряженного мозга, собранного в ЗТ, где белок периода находится в характерном рисунке (нижние панели, воссозданные из Helfrich-Forster20). Показаны изображения, взятые из различных разделов мозга, захватив все нейроны, как ожидается, содержат белок периода на ЗТ1. Шкала бар составляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| ЗТ1 | ЗТ7 | ЗТ13 | ЗТ19 |
| Свет с 10:00 до 22:00 | Свет с 10:00 до 22:00 | Темно с 9 утра до 9 вечера | Темно с 9 утра до 9 вечера |
| Собрано в 11 утра после 1 часа в свете | Собрано в 17:00 после 7 часов в свете | Собрано в 10 утра после 1 часа в темноте | Собрано в 16:00 после 7 часов в темноте |
Таблица 1: Графики времени циркадного ритма NO1-ЗТ19.
Discussion
Исследователи используют этот протокол увлечение с успехом и последовательности. Эта процедура позволяет зафиксировать большой пул выборки, который может храниться для будущего анализа. Кроме того, эта стратегия сохраняет неврологические модели, вызванные увлечением для будущего обследования.
Фиксация для хранения является одним из основных компонентов процесса увлечение, как это помогает стабилизировать ткани мозга, и это позволяет больше времени для анализа каждого мозга из пула данных, таким образом, минимизируя отходы из мозга, которые теряют жизнеспособность из-завозраста 21. Основная цель состоит в том, чтобы циркадные увлечение как можно больше мух, как это возможно, так что существует непрерывный инвентаризации доступны для головы вскрытия и в конечном итоге иммунофторесценции или извлечения белка для наблюдения за выводами и определить, если результаты имеют высокую уверенность. Для обеспечения того, чтобы циркадное увлечение сохранясь путем фиксации, является неотъемлемой частью того, что любой источник светового загрязнения устраняется. Процесс фиксации позволяет дрозофилы храниться при сохранении его неврологических "timestamp", так что они могут быть вскрыты позже и проанализированы без каких-либо заметных различий для мух, которые вскрыты и подверглись иммунофлюоресценции сразу после влечения. Для целей фиксации до иммунофлуоресценции, лаборатория определила с консистенцией, что мухи являются жизнеспособными по крайней мере до 1 месяца. Фиксации для западной экстракции белка пятно сделать мозг жизнеспособным на неопределенный срок при хранимом при -80 градусов по Цельсию.
Другим важным шагом протокола является сексинг мух. Важно, что этот шаг делается точно, как с обоих полов в том же флаконе до фиксации может привести к спариванию, что даст новые мухи, которые имеют более молодого возраста и коррумпированных анализ белка, если мужчины случайно рассмотрены вместо женщин или наоборот. Кроме того, при половом акте важно удалить образцы личинок, которые иногда прикрепляются к самкам. Это предотвращает развитие нового потомства внутри женского флакона, который потенциально может повредить результаты.
Следующим шагом для протокола обучения могут быть элементы, связанные с анализом данных. Основное внимание в протоколе уделяется локализации белка, но если есть другие переменные, которые влияют на циркадное увлечение, они должны быть изучены с помощью новых путей, часто требующих извлечения белка или нуклеиновой кислоты. Кроме того, Есть другие белки мозга, которые все еще могут быть проанализированы с помощью этого протокола. Эксперименты, связанные с протоколом, анализировали определенные белки, но список генов и белков, которые играют роль в циркадной биологии, не исчерпан. Протокол эффективен в достижении цели установления циркадного ритма, однако, приложения являются широкими.
Disclosures
Ни один.
Acknowledgments
Особая благодарность Университету Миссури-Канзас-Сити и лаборатории Джеффри Л. Прайса.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
