Summary
Burada, Drosophila'yı sirkadiyen bir güne nasıl senkronize edebileceğimizi anlatıyoruz. Bu biyolojik ritim ve kronobiyoloji eğitimi için gerekli ilk ve en önemli adımdır.
Abstract
Organizmalar arasında neredeyse evrensel olan sirkadiyen ritimler biyolojik aktiviteyi Dünya'nın Güneş'in etrafındaki yörüngesine koordine eder. Bu ritmi yaratan faktörleri belirlemek ve elde edilen çıktıları anlamak için model organizmaların tanımlanmış sirkadiyen zaman noktalarına yer alması gerekir. Burada tanımlı bir sirkadiyen ritim birçok Drosophila entrain için bir prosedür detay. Ayrıca, immünoresans, nükleik asit veya protein ekstraksiyonu tabanlı analiz için numune hazırlamak için eğitim sonrası adımları ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Introduction
Dünya'daki hemen hemen tüm organizmalar, en büyüğünden tek hücreliye kadar, yaklaşık bir günlük bir döngüye sahip bir iç biyolojik saate sahiptir. Bu Sirkadiyen ritim olarak bilinir (1953 yılında Franz Halberg tarafından Latince terimler circa = hakkında / yaklaşık ve "ölür" = gün)1icat. Çekirdek saatin bileşenleri bilinse ve işlevin temel mekanizmaları kavramsallaştırılsa da, biyolojik ritimlerin vücutta nasıl korunup korundukları hakkında hala anlaşılması gereken çok şey vardır. Önemli olarak, biyolojik ritimlerin yanlış düzenlenmesi kötü hafıza oluşumu, uyku bozuklukları, mevsimsel etki bozukluğu, depresyon, bipolar bozukluk, diyabet, obezite, nörodejenerasyon ve kanser2,3,,4,5dahil olmak üzere kötü sağlık sonuçları ile ilişkilidir.
Drosophila sirkadiyen biyoloji nin araştırılması için iyi kurulmuş bir modeldir. Genetik ve biyokimyasal olarak çıkarılabilir, çok sayıda kolayca eğitilir (gösterilecek gibi). Aslında, sirkadiyen ritimleri keşfi için Nobel Ödülü verilmesinde destek anahtar yayınlar olarak belirtilen,tüm yedi yayınlar Drosophila modeli6,7,8,,9,10,11,12bu güçlü kaldıraçlı .
Ayrıca, immünoresans, nükleik asit veya protein ekstraksiyonu tabanlı analiz amacıyla entrained sinektoplamak için etkili stratejiler gösteriyoruz. Bu stratejileri kullanarak, gelecekte analiz için daha büyük miktarlarda numuneyi işleyebilir ve depolayabiliriz. Bu yöntemler, tekrarlanabilir olmaları ve büyük bir veri havuzunun parçası olabilecek yüzlerce gergin sinek üretebildikleri için çok avantajlıdır.
Protocol
1. Fly gıda üretimi
- Her 1 L su için 4,69 g kurutulmuş pekmez, 19,70 g kuru aktif maya, 87,22 g mısır unu ve 7,83 g agar dan oluşan sinek liyat hazırlayın.
- Yukarıda listelenen içeriği bir güveçte birleştirin ve ısıyı 250 °F'ye çevirin. Mix yanı sıra malzemeler eklenir.
- Sinek gıda ısıtma gibi crockpot üzerinde kapak tutun da bir haddeleme kaynatın ulaşana kadar her 10 dakikada bir içeriğini karıştırma. Haddeleme kaynama yalıtma ısı kapatmadan önce 20 dakika boyunca devam etmesine izin verin.
- 83,60 mL su ekleyin ve gıda soğudukça tencerenin kapağını kapalı tutun.
- Karışımı ve bir cam termometre ile her 10 dakikada bir gıda sıcaklığını kaydedin. Bir film tabakasının yemeğin üzerine yerleşmesine izin vermekten kaçının.
- Gıda lar 60 °C'ye soğuduktan sonra, eklenen suyun litresine 10,44 mL Tegosept ve 5,51 mL propiyonik asit ekleyin (bkz. adım 1.1).
- İyice karıştırın ve yiyeceklerin çok serin olmasını önlemek için 60 °C'ye kadar ısıtın.
- Droso-dolgu kullanarak gerektiği gibi sinek gıda pompalayın.
- Dar şişeler için, pompa 10 mL ve 6 oz kare alt şişe pompa 60 mL.
2. Tanımlanmış yaşta sinek toplama
- Şişenin yan tarafına büyük miktarlarda pupa (yaklaşık 200 pupa) bağlanına kadar 25 °C'de 5-7 gün boyunca saklanan yabani tip sineklerin monitör şişeleri. Kullanılan şişekare dipleri ile 6 oz Drosophila stok şişevardır.
- Mevcut yetişkinleri şişeden temizleyin. Ya yeni bir şişe içine yetişkin ucu ya da% 70 etanol yerleştirin. Kalan yetişkinleri sinek yiyeceğine itmek için #0 bir fırçanın donuk ucunu kullanın. Kullanımdan önce ve sonra boya fırçasını %70 etanol ile sildiğime emin olun.
- Temizlenmiş şişelerin 25 °C'lik bir kuluçka makinesinde 3 gün boyunca oturmasını bekleyin ve böylece yeni neslin kapanmasına izin verin. Bu sinekler 0 ile 3 günlük arasında olacak.
3. Sinek ayırma
- 3 gün sonra, dişilerden ayrı erkek ve dört zaman puan her biri için her cinsiyet için istenen sayıyı toplamak. Sinekler cinsel organı inceleyerek cinsiyetle ayırt edilebilir; erkeklerde koyu yuvarlak cinsel organlar, kadınlarda ise daha açık ve sivri cinsel organlar vardır. Dişiler de erkek sineklerden çok daha büyüktür.
- Sinekleri etkili bir şekilde ayırmak ve cinsiyetleri ayırt etmek için bir CO2 anestezi pedi kullanın. Onları öldürmemek için boya fırçaları ile sinekler taşıyın.
- Her zaman noktası için 100 erkek ve 100 kadın toplayın, şişe başına 50 erkek ve şişe başına 100 kadın. Erkekler daha agresif olma eğilimindedir ve bir şişe de 100 bireyler olduğunda sosyal etkileşimleri ölümlere yol açar. 100'e kadar olan dişiler, şişede bulunurken etkilenmezler.
- Koleksiyonları aşağıdaki zaman noktalarında gerçekleştirin: ZT1, ZT7, ZT13 ve ZT19 (Tablo 1). Karanlıkta yapılan koleksiyonların (ZT12-ZT24) ışığa duyarlı olduğunu, ZT0-ZT11 koleksiyonlarının ışık açık saatlerinde yapıldığını ve oda ışıklarının açık olabileceğini unutmayın. Tüm koleksiyonların bir gecede değil, gün içinde gerçekleşmesine izin vermek için ters 12 saatlik ışık desenleriyle iki ayrı kuluçka makinesi nin kullanıldığını lütfen unutmayın.
- Gelecekteki entrainment için sinek yeni şişe oluşturmak için aşırı sinekkullanın. Her yeni şişeye 5-7 erkekli 25 dişi yerleştirin ve 25 °C'de kuvöze yerleştirin.
4. Sinek kuluçka
- Sirkadiyen entrainment gerçekleşmesi için 3-5 gün boyunca Hafif düzenlenmiş kuvözlerde kalmak için sinekler izin verin. Kuvözlerin Hafif sıkı olduğundan emin olun, çünkü az miktarda ışık kirliliği bile eğitimi bozacaktır.
5. İmmünofluoresans fiksasyonu
- Entrainment sonra, immünoresans için kullanılacak örnekler için fiksasyon çözeltisi yeni şişeler hazırlamak. Sinekleri kuvözden çıkarmadan önce, sabitlenecek her 100 sinek için her yeni dar şişeye 1x PBS + %0,1 Ara-20'de seyreltilmiş %4 formaldehit 4.8 mL ekleyin. Her şişede 100 erkek ya da 100 dişi Sirkadiyen entrained sinek barındıracak. Dar şişeleri buza yerleştirin.
6. İmmünofluoresans toplama
- İmmünfloresan için kuvözden sinekleri toplarken, şişe kapağını çıkarın ve şişeyi huniye hızla ters çevirin. Yavaşça şişe içine sinekler rehberlik yardımcı olmak için huni ile çözüm içine sinekler dokunun; bir şişe de 100 erkek toplam 50 erkek iki tüp birleştirmek ve diğer şişe için 100 kadın tek bir tüp kullanın.
- ZT13 ve ZT19 koleksiyonlarını karanlıkta gerçekleştirin; drosophila olarak görmek için kırmızı ışık kullanmak çok daha az bu ışık dalga boylarına duyarlı ve bu nedenle ışık kirliliği daha az eğilimli13. Kriptokrom protein, özellikle, kaçınılmalıdır mavi ışığa özellikleduyarlıdır 14.
- Işık maruziyetini azaltmak için, toplama odasının herhangi bir ışık kaynağıyla kapalı veya kapalı olduğundan emin olun. Aşağıdaki adımda besleyici mikser üzerine yerleştirildiğinde ZT13 ve ZT19 sineklerinin ışığa maruz kalması için bu şişeleri folyoya sarın. ZT1 ve ZT7 sinekleri ışığa duyarlı değildir ve folyo kaplama olmadan mikser üzerine yerleştirilebilir.
7. Besleyici mikser ve depolama
- Sinekler toplandıktan sonra, dökülmeyi önlemek için fiksatif içeren şişelerin üstünü bantlayın ve 4 saat boyunca 4 °C'de 165 RPM'de besleyici mikserin üzerine yerleştirin. Sinekler bu fiksasyon adımından sonra artık ışığa duyarlı değildir, bu nedenle çözeltinin hareket halinde olduğunu doğrulamak için folyo çıkarılabilir ve sinekler fiksatife batırılır.
- Besleyici mikserden şişe içeren sineği çıkardıktan sonra formaldehiti çıkarın ve 3.000 μL 1x PBS ile üç kez yıkayın ve her yıkamada şişeyi ters çevirin.
- Gelecekte immünoresans15beklemek için immünoresans örneklerini taşıyan şişeleri 4 °C'de saklayın.
8. Protein ekstraksiyonu için toplama
- Protein ekstraksiyonu için numunelerin korunması için dört adet 50 mL tüp ve sıvı nitrojen içeren bir Dewar hazırlayın
- Protein veya nükleik asit ekstraksiyonu için sinek toplamak için, transfer sinekler adım 6.1 aynı şekilde tüp şişe sinekler ve hızlı bir şekilde sineklerin salınımını önlemek için tüp kap ve dondurma snap sıvı nitrojen içine tüp yerleştirin.
9. Protein ekstraksiyonu için depolama
- -80 °C'de protein ekstraksiyonu için dondurulmuş numuneleri saklayın. Bunlar, immünoblotting16dahil olmak üzere, downstream analizi için uygun protein ekstraksiyon protokolüne göre işlenebilir.
Representative Results
Kontrollü sirkadiyen entrainment araştırmacılar ZT1-ZT19 zamanlama çizelgeleri kullanarak sirkadiyen gün boyunca belirli zaman noktalarında biyoloji incelemek veya gerektiğinde zaman noktaları eklemek için izin verir. Burada sirkadiyen döngülere sinekler eğitmek ve dönem proteinimmünoblotting ve immünofloresan analizi ile entrainment doğrulamak için ışık ve karanlık kullanın, sirkadiyen entrainment için bir belirteç(Şekil 1). Doğru entrainment üzerine, dönem proteinleri karakteristik bir yoğunluk ve hareketlilik deseni olmalıdır(Şekil 1A) ve ZT1 beyninde belirli yerlerde görünür olmalıdır (Şekil 1B). Gıda ve sıcaklık da dahil olmak üzere diğer değişkenler sirkadiyen entrainment etkileyebilir rağmen, ışık en basit ve güvenilir kontrol etmektir 17. Bu yöntemlerin amacı için, kuvöz sıcaklıkları sabit tutulur, entrainment için ışık etkilenir serebral saat nöronlar güvenerek18.
Şekil 1: Entrainment doğrulama. (A) Entrained sinek başlarından hazırlanan tüm hücre özlerinin immünoblotting dönem protein hareketliliği ve yoğunluğu kanonik desenler gösterir19. Belirtilen Zeitgeber zamanlarının her birinden 1.4 dişi kafa (ZT) anti-Per antikor kullanılarak analiz edildi. (B) ZT'de toplanan gergin beyinlerin immünororesansi, Dönem proteininin karakteristik bir desende bulunduğu yerde (alt paneller, Helfrich-Forster20'denyeniden oluşturulmuş). Gösterilen beynin farklı bölümlerinden alınan görüntüler, ZT1 dönem proteini içermesi beklenen tüm nöronları yakalamak. Ölçek çubuğu 40 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| ZT1 | ZT7 | ZT13 | ZT19 |
| 10:00 - 22:00 saatleri arasında ışık | 10:00 - 22:00 saatleri arasında ışık | 09:00 - 21:00 saatleri arasında karanlık | 09:00 - 21:00 saatleri arasında karanlık |
| Işıkta 1 saat sonra saat 11'de toplanır | Işıkta 7 saat sonra saat 17:00'de toplanır | Karanlıkta 1 saat sonra saat 10'da toplanır. | Karanlıkta 7 saat sonra saat 16:00'da toplanır |
Tablo 1: ZT1-ZT19 Sirkadiyen Ritim Zamanlama Çizelgeleri.
Discussion
Araştırmacılar başarı ve tutarlılık ile bu entrainment protokolü kullanır. Bu yordam, gelecekteki çözümleme için depolanabilir büyük bir örnekleme havuzu sabitleme sağlar. Ayrıca, bu strateji ileride muayene için entrainment tarafından indüklenen nörolojik desenleri korur.
Depolama için fiksasyon beyin dokusu stabilize etmek için yardımcı olur ve böylece yaş21nedeniyle canlılık kaybetmek beyinatık en aza indirmek veri havuzundan her beyin analiz etmek için daha fazla zaman sağlar gibi entrainment sürecinin önemli bir bileşenidir. Ana hedef, kafa diseksiyonları için sürekli envanter ve nihayetinde immünfloresans veya protein çıkarma bulguları gözlemlemek ve sonuçların yüksek güven olup olmadığını belirlemek için kullanılabilir böylece mümkün olduğunca çok sayıda sinek olarak sirkadiyen entrain etmektir. Sirkadiyen entrainment fiksasyon yoluyla korunmuş olduğundan emin olmak için, ışık kirliliği herhangi bir kaynak ortadan kaldırılır ayrılmaz bir parçasıdır. Fiksasyon süreci Drosophila'nın nörolojik "zaman damgasını" korurken depolanmasına olanak sağlar, böylece daha sonra incelenebilir ve incelenen ve entrainment'den hemen sonra immünororesan sintiman geçiren sineklerde gözle görülür bir farklılık olmaksızın analiz edilebilir. İmmünofloresan önce fiksasyon amacıyla, laboratuvar sinekler en az 1 aya kadar uygulanabilir olduğunu tutarlılık ile belirlemiştir. Batı leke proteini ekstraksiyonu için fiksasyonlar -80 °C'de depolandığında beyinleri süresiz olarak yaşanabilir hale getirir.
Bir diğer kritik protokol adımı da sineklerin seksiolmasıdır. Bu adımın, fiksasyondan önce her iki cinsin de aynı şişede olmasının çiftleşmeye yol açabileceği ve erkeklerin kazara dişiler ya da tam tersi yerine kazara incelendiğinde daha genç yaşta ve bozuk protein analizine yol açabileceği için doğru bir şekilde yapılması önemlidir. Ayrıca, seks yaparken zaman zaman dişilere bağlı larva örnekleri kaldırmak önemlidir. Bu potansiyel sonuçları bozabilir kadın şişe içinde yeni bir singen gelişimini önler.
Entrainment protokolü için bir sonraki adım veri analizi ile ilgili öğeler olabilir. Protokolün odak noktası protein lokalizasyonudur, ancak sirkadiyen entrainment tarafından etkilenen diğer değişkenler varsa, genellikle protein veya nükleik asit çıkarma gerektiren yeni yollar ile keşfedilmelidir. Ayrıca, hala bu protokol ile analiz edilebilir beynin diğer proteinler vardır. Protokolle ilişkili deneyler bazı proteinleri analiz etti ancak sirkadiyen biyolojide rol oynayan gen ve proteinlerin listesi tükenmedi. Protokol sirkadiyen bir ritim kurma hedefine ulaşmada etkili, ancak, uygulamalar geniş kapsamlıdır.
Disclosures
Hiçbiri.
Acknowledgments
Missouri-Kansas City Üniversitesi ve Jeffrey L. Price laboratuvarına özel teşekkürler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100-1000uL pipette | Eppendorf | ES-1000 | |
| 10-100uL pipette | Eppendorf | ES-100 | |
| 16% Paraformaldehyde Solution | 15710 | ||
| 1X PBS | Caisson Labs | PBL01-6X100ML | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423500 | |
| Anesthesia Filter Connection Kit | World Precision Instruments | EZ-251A | |
| Corn meal | Genesee Scientific | 62-100 | |
| Dried Molasses | Food Service Direct | OT280504 | |
| Droso-filler Food Pump | geneseesci.com | 59-169 | |
| Drosophila Stock bottles, 6 oz square bottom w/ Flugs | geneseesci.com | 32-130BF | |
| Drosophila vials, Narrow K-Resin super bulk | geneseesci.com | 32-118SB | |
| Dry active yeast | Genesee Scientific | 62-103 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15720 | |
| EZ Basic Anesthesia System | World Precision Instruments | EZ-175 | |
| Falcon Centrifuge tubes | Corning | 352097 | |
| Falcon round bottom tubes | Corning | 352057 | |
| Fine point Sharpie marker | Sharpie | 30001 | |
| Fisherbrand Nutating Mixer | Fisher Scientific | 88-861-043 | |
| Flugs-Narrow Plastic Vials | Genesee Scientific | 49-102 | |
| Glass Thermometer | Cole-Palmer | EW-08008-12 | |
| Liquid nitrogen hose | Thermo Scientific | 398202 | |
| Liquid nitrogen tank-Dewar | Cooper Surgical Inc | 900109-1 | |
| Liquid nitrogen transfer vessel | Electron Mircoscopy Sciences | 61891-02 | |
| Paintbrushes(Red Sable) Size #0 | Electro Microscopy Sciences | 66100-00 | This is used to separate the flies via sex without causing injury. |
| Plastic funnel | Plews and Edelmann | 570-75-062 | |
| Polarizing light microscope | Microscope Central | 1100100402241 | Used to more clearly view Drosophila during sexing |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-100U | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-1M | |
| ProPette Pipette Tips | MTC Bio Incorporated | P5200-5M | |
| Propionic Acid | Sigma Aldrich | P1386-1L | |
| Rayon Balls | Genesee Scientific | 51-100 | |
| Reynolds wrap standard aluminum foil | Staples | 1381273 | |
| Roaster Oven (Crockpot) | Hamilton Beach | 32950 | |
| Scotch 810 Magic Tape | Electron Microscopy Sciences | 77300 | |
| Spray bottle with trigger | US Plastic | 66446 | Used to spray ethanol to clean work bend areas |
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-258 | |
| Thermo Scientific Drosophila Incubator | Thermo Scientific | 3990FL | |
| Thermo Scientific Revco 4 degree Lab fridge | ThermoFisher Scientific | REL7504D | |
| Thermo Scientific Revco Lab Freezer | ThermoFisher Scientific | REL7504A | |
| Tween 20 | Anatrace | T1003-1-GA |
References
- Halberg, F. Some physiological and clinical aspects of 24-hour periodicity. The Journal-Lancet. 73 (1), 20-32 (1953).
- Smarr, B. L., Jennings, K. J., Driscoll, J. R., Kriegsfeld, L. J. A time to remember: the role of circadian clocks in learning and memory. Behavioral Neuroscience. 128 (3), 283-303 (2014).
- Leng, Y., Musiek, E. S., Hu, K., Cappuccio, F. P., Yaffe, K. Association between circadian rhythms and neurodegenerative diseases. The Lancet. Neurology. 18 (3), 307-318 (2019).
- Hood, S., Amir, S.
- Sulli, G., Lam, M. T. Y., Panda, S. Interplay between Circadian Clock and Cancer: New Frontiers for Cancer Treatment. Trends in Cancer. 5 (8), 475-494 (2019).
- Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39 (2 Pt 1), 369-376 (1984).
- Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312 (5996), 752-754 (1984).
- Siwicki, K. K., Eastman, C., Petersen, G., Rosbash, M., Hall, J. C. Antibodies to the period gene product of Drosophila reveal diverse tissue distribution and rhythmic changes in the visual system. Neuron. 1 (2), 141-150 (1988).
- Hardin, P. E., Hall, J. C., Rosbash, M. Feedback of the Drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature. 343 (6258), 536-540 (1990).
- Liu, X., et al. The period gene encodes a predominantly nuclear protein in adult Drosophila. Journal of Neuroscience. 12 (7), 2735-2744 (1992).
- Vosshall, L. B., Price, J. L., Sehgal, A., Saez, L., Young, M. W. Block in nuclear localization of period protein by a second clock mutation, timeless. Science (New York, N.Y). 263 (5153), 1606-1609 (1994).
- Price, J. L., et al. double-time is a novel Drosophila clock gene that regulates period protein accumulation. Cell. 94 (1), 83-95 (1998).
- Hanai, S., Hamasaka, Y., Ishida, N. Circadian entrainment to red light in Drosophila: requirement of Rhodopsin 1 and Rhodopsin 6. Neuroreport. 19 (14), 1441-1444 (2008).
- Vinayak, P., et al. Exquisite light sensitivity of Drosophila melanogaster cryptochrome. PLoS Genetics. 9 (7), e1003615 (2013).
- Kelly, S. M., Elchert, A., Kahl, M. Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains. Journal of Visualized Experiments. (129), e56174 (2017).
- Au-Eslami, A., Au-Lujan, J. Western Blotting: Sample Preparation to Detection. Journal of Visualized Experiments. (44), e2359 (2010).
- Fan, J. Y., Muskus, M. J., Price, J. L. Entrainment of the Drosophila circadian clock: more heat than light. Science's signal Transduction Knowledge Environment. (413), pe65 (2007).
- Miyasako, Y., Umezaki, Y., Tomioka, K. Separate sets of cerebral clock neurons are responsible for light and temperature entrainment of Drosophila circadian locomotor rhythms. Journal of Biological Rhythms. 22 (2), 115-126 (2007).
- Edery, I., Zwiebel, L. J., Dembinska, M. E., Rosbash, M. Temporal phosphorylation of the Drosophila period protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (6), 2260-2264 (1994).
- Helfrich-Forster, C. The neuroarchitecture of the circadian clock in the brain of Drosophila melanogaster. Microscopy Research and Technique. 62 (2), 94-102 (2003).
- Price, J. L. Genetic screens for clock mutants in Drosophila. Methods in Enzymology. 393, 35-60 (2005).
