Summary
ここで提示される光変換可能なフルオロフォアDendra2に融合したタンパク質ハンチンチンの分解を監視するプロトコルが提示される。
Abstract
タンパク質は、恒常性を維持するために細胞内で絶えず合成され、分解されます。目的のタンパク質の分解を監視できることは、そのライフサイクルを理解するだけでなく、プロテオスタシスネットワークの不均衡を明らかにする鍵です。この方法は、疾患を引き起こすタンパク質ハンチンチンの分解を追跡する方法を示す。Dendra2に融合したハンチンチンの2つのバージョンは、C.エレガンス神経系で発現される:生理学的バージョンまたはグルタミンの拡大および病原性ストレッチを有する1つ。Dendra2は光変換可能な蛍光タンパク質です。短い紫外線(UV)照射パルスの際に、Dendra2は、その励起/発光スペクトルを緑から赤に切り替えます。パルス追跡実験と同様に、変換された赤デンドラ2の回転率は、新たに合成された緑色Dendra2からの干渉に関係なく、監視および定量化することができる。共焦点顕微鏡を用いて、そしてC.エレガンスの光学的透明性のために、生きている、老化した生物のハンチンタン-Dendra2の劣化を監視し、定量することができる。ニューロンハンチンデンドラ2は、変換後すぐに部分的に分解され、時間の経過とともにさらにクリアされます。分解を制御するシステムは、変異型ハンチンチンの存在下で欠損し、加齢に伴ってさらに損なわれる。同じ神経系内のニューロンサブタイプは、ハンチンデンドラ2に対して異なるターンオーバー能力を示す。全体として、Dendra2に融合した関心のあるタンパク質を監視することは、その劣化および関与するプロテオスタシスネットワークのプレーヤーだけでなく、その位置、人身売買、輸送に関する重要な情報を提供することができます。
Introduction
生物のプロテオームは常に自分自身を更新しています。タンパク質は、細胞の生理的要求に応じて連続的に分解され、合成されます。一部のタンパク質は迅速に排除され、他のタンパク質はより長生きします。タンパク質のダイナミクスを監視することは、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質(FP)を使用する場合、より簡単で正確で侵襲性の低いタスクです。FPは自己触媒的に形成され、目的の任意のタンパク質(POI)に融合することができるが、酵素を必要としない、または酸素1のために補因子を保存する必要はない。最近、新世代のFPは、決定された波長の光パルスで照射時に色を切り替える設計を行いました。これらの光活性化可能なFP(PAFP)は、POI、またはそれらが存在するオルガネラまたは細胞の標識および追跡を可能にし、そしてそれらの定量的および/または質的パラメータ2を調べることを可能にする。FPは、POIの動き、方向性、移動速度、拡散係数、移動画分対不動分数、1つのセルラーコンパートメントに存在する時間、および回転率を追跡することを可能にします。特定のオルガネラの場合、移動および輸送、または核分裂および核融合事象を決定することができる。特定のセルタイプでは、セルの位置、分割率、体積、形状を設定できます。重要なことに、PAFPの使用は、連続的な視覚化なしで、新しく合成されたプローブからの干渉なしに追跡を可能にする。細胞および生物全体の研究は、がんや転移の発生、細胞骨格の組み立てまたは分解、RNA-DNA/タンパク質相互作用3などの生体内の問題に対処するためにPAFPをうまく採用している。本稿では、軽い顕微鏡法とPAFPを用いて、神経変性疾患のC.エレガンスモデルにおいて生体内の凝集しやすいタンパク質ハンチンチン(HTT)の回転率を明らかにする。
ここで説明するプロトコルは、融合タンパク質ハンチン-デンドラ2(HTT-D2)の安定性および分解を定量化する。Dendra2は、UVまたは可視青色光のいずれかに応答して発光/励起スペクトルを緑色から赤色に不可逆的に切り替える第2世代単量体PAFP4であり、その強度は最大4,000倍5、66に増加する5。ハンチンチンは、ハンチントン病(HD)、致命的な遺伝性神経変性疾患を引き起こす原因となるタンパク質です。ハンチンエキソン-1は、グルタミンのストレッチが含まれています (CAG, Q).タンパク質が39Q以上で発現すると、変異体、有毒、病原性タンパク質に誤って折り畳まれ、タンパク質が誤って発現します。変異HTTは凝集しやすく、ニューロン細胞死および変性を招き、短いオリゴマー種として、またはより大きな高度に構造化されたアミロイド7と同じである。
線虫は、その操作の容易さ、アイソジェニックな性質、短い寿命、および光学的透明性8のおかげで老化と神経変性を研究するためのモデルシステムである。生体内でHTTの安定性を研究するために、C.エレガンスの神経系に融合構造が発現した。25Qs(HTTQ25-D2)の生理学的ストレッチまたは97Qs(HTTQ97-D2)の病理学的ストレッチのいずれかを含むHTT-D2トランスジーンは、線虫の寿命9を通して汎ニューロンを過剰発現する。生きたC.エレガンスを短く焦点を合わせた光の点に当てることによって、単一のニューロンが光交換され、変換されたHTT-D2が時間の経過とともに追跡される。HTT-D2分解量を確立するために、新たに変換されたHTT-D2の赤色信号との差は、決定された期間の後のHTT-D2の残りの赤色信号と比較される。したがって、その生理学的形態と比較して、ハンチンチンが拡大し、有毒な形態で見つかった場合にどのように分解されるかを調べることができ、その結果として、より多くのハンチンチンが分解される可能性があります。Q97対Q25の存在に対して、前ニューロンまたは後部ニューロンがどのように異なって反応するか、特に長期間にわたって。老化時のプロテオスタシスネットワーク(PN)の崩壊が分解率の違いにどう寄与しているか。これらの結果は、HTT-D2の売上高に関する少数の観測値のみを記述します。しかし、タンパク質凝集とプロテオスタシスの両方の分野に関連する多くの生物学的な質問は、このin vivoアプリケーションで対処することができます。
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Protocol
ニューロンハンチン-デンドラ2融合タンパク質を発現するC.エレガンスの生成
- 線虫発現ベクター(すなわち、pPD95_75、addgene #1494)でPOIをコードする遺伝子をクローン化し、従来の制限酵素消化酵素10、ギブソンアセンブリ11、または任意の任意の選択方法によって。プロモーターを挿入して、所望の組織または所望の発達段階で発現を駆動させる。Dendra2フルオロフォアをPOIとフレームにN-またはC末端に挿入します。
- 融合構造を発現するトランスジェニックC.エレガンスを生成(例えば、マイクロインジェクションを介して)12.
注: トランスジーンを運ぶプラスミドは、染色体外配列として残ります。コンストラクトの統合は必要ありませんが、必要であれば13.このプロトコルにおいて、C.エレガンスは、汎神経プロモーター Prgef-1の制御下で融合構築物ハンチンチンエキソン1-Dendra2(HTT-D2)を運ぶプラスミドをマイクロインジェクションした。C.エレガンス発現骨格は、クレイスら14から得られた、Q25またはQ97のいずれかを有するハンチンチンエキソン1は、ジュエンマンら15から得られ、デンドラ2はハマーららから得られた。
2. C.エレガンスの年齢マッチングとメンテナンス
- 年齢は、アルカリ次亜塩素酸溶液処理17または20°Cで4時間産卵を介していずれかの同期させることにより、すべての線虫と一致する。産卵の場合は、10人の大人を新しい播種線虫増殖培地(NGM)プレートに置き、取り除く前に4時間放置します。この時間スパンで産卵した卵は、同期した線虫を生み出す。
- 試験的なC.エレガンスを、標準的な線虫の畜産18に続いて、細菌の食料源大腸菌OP50を播種した線虫増殖培地(NGM)プレートに保管する。
- 目的の段階に20°Cで線虫を成長させる。このプロトコルの場合、必要な年齢は 4 日目と 10 日です。
注:4日目の若い成人は、生殖腺に卵が存在し、その高い可動性によって識別することができます。10日目の線虫は肥沃な後、組織悪化と機関車の衰退を受ける19. - 10日目の線虫については、3日目のL4ステージ後の毎日の通過は、一度線虫が肥沃になると、混合集団を避ける。
3. イメージング用顕微鏡スライドの作成
- イメージングの日に顕微鏡スライドを準備します。電子レンジでは、ddH2Oで3%(w/v)の濃度で一般グレードのアガロースを溶かして、わずかに冷却します。
- 1 mL ピペットチップの先端を切り、溶かしたアガロースを約 400 μL 吸い上げます。きれいなガラスのスライドにアガロースの数滴をそっと置き、すぐに別のスライドを上に置き、2つの間にアガロースの薄いパッドが作成されるようにします。上のスライドをそっと滑ったり持ち上げたりする前に乾かします。
- アガロースパッドのスライドを加湿容器に入れ、乾燥を防ぎます。これらは2-3時間以内に使用することができる。
注:線虫が内部に閉じ込められる可能性がありますので、アガロースの小さな泡の形成を避けてください。
4. 共焦点顕微鏡パラメータの定義
注: 線虫を取り付けてデータを取得する前に、コンフォーカル取得ソフトウェアのすべての設定を定義します。この設定は、選択したイメージングハードウェアおよびソフトウェアに合わせて調整できます。
- 共焦点ソフトウェアを開き、レーザーイメージング設定を定義します。緑デンドラ2(486-553 nm)、赤色デンドラ2(580-740 nm)の励起/発光の光路を設定します。両方のチャンネル/レーザーのパワーとゲインを、蛍光素の強度に合わせて調整します。デジタルゲインまたはオフセットを変更せず、ピンホールを完全に開く設定にしないでください。
- 集録設定を定義する:シーケンシャルチャンネルモードを選択し、フレームごとにトラックを切り替えます。スキャン モードをフレームとして、フレーム サイズを 1,024 x 1,024 に設定し、行ステップは 1 です。平均を 2 に設定し、平均法と単一方向線のモードで平均を設定します。ビット深度を 8 ビットに設定します。
- Dendra2 の変換に関する多次元集録設定を定義します。変換および漂白のために60%のエネルギー力で設定された405 nmダイオードレーザーを使用してください。可能な場合は、検出器を保護するために安全な漂白GaAsPをアクティブにします。
- 2 サイクルの時系列を選択し、その間に 0.0 ミリ秒間隔を設定し、通常の開始と停止を行います。2 の 1 をスキャンした後に漂白を開始し、30 回の繰り返しを繰り返します。強度が50%に低下したら、漂白を停止します。
- 取得/ピクセルのドウェルの速度を、高速(最大 = 12)変換用、および中速度(例えば、中= 5)でスナップ画像をキャプチャする速度を定義します。
注: ここで定義されている漂白パラメータはガイドラインです。他のDendra2タグ付きPOIの場合、レーザーパワー設定と漂白反復と値を経験的に確立する必要があります。
5. C.エレガンスを顕微鏡スライドに取り付ける
注:可能であれば、取り付け実体顕微鏡を共焦点顕微鏡の設定の近くに置き、画像化の直前に線虫を取り付けます。
- アガロースパッドの反対側のガラスカバースライドに、永久的なマーカーを持つ4つの正方形を持つウィンドウを描き、それらを番号付けします。
- アガロースパッドの中央にレバミゾールのピペット15 μL。レバミゾールの濃度は線虫の年齢によって異なります:画像化4日目の線虫が2mMレバミゾールを使用する場合。10日目の線虫をイメージングする場合は、0.5 mMレバミソールを使用します。
- ワイヤーピックを使用して、液体に4線虫を転送します。まつげピックの助けを借りて、個々の線虫を窓の正方形にそっと動かします。大腸菌OP50の痕跡が希釈され、蛍光バックグラウンドがシグナル獲得を妨げないように、まつげを回転させます。
- 線虫がほとんど動かなくなるのを待ち、液体の上にカバースリップをそっと置き、アガロースパッドとカバースリップの間のレバミゾールの層に線虫を固定します。
- 線虫をイメージするために、反転したスライドを共焦点ステージに置きます。
6. 緑デンドラ2の変換:時間ゼロでのデータ取得
注:パルスチェイスの実験は、Dendra2融合タンパク質を緑色の発光フルオロフォアから赤いタンパク質に不可逆的に変換することから始まります。
- 顕微鏡の接眼レンズを使用して、緑色の蛍光の下で20倍の目的を持つ最初の線虫を見つけます。頭部または尾部に焦点を合わせ、共焦点モードに切り替えます。
- 488 nmの青色レーザーでライブレーザースキャンを開始し、EGFPグリーンチャンネル(ex/em = 486-553 nm)の緑色のDendra2を視覚化します。単一のニューロンを選択し、フォーカスに持って来ます.3倍ズームして、レーザービーム4のターゲットを増やします。
注: 線虫ごとに 1 つのニューロンを選択します。各ニューロンは、1 つのサンプルまたはデータ ポイントを構成します。 - 最大投影面を見つけ、フルオロフォアの明るさに応じて、ゲインまたはレーザーパワーを増減し、色範囲インジケータで識別可能な飽和しているが露出過多の画像を得る。この定義が完了したら、スキャンを停止します。
注:可視青色の488 nm光を有する励起はまた、ゆっくりとかつあまり効率的ではないがDendra2を変換することができるように、あまりにも長い間、またはあまりにも多くの電力でサンプルを照射しないでください4. - ソフトウェアで、タブを開いて対象領域(ROI)を選択し、選択したニューロンの周囲に最初のROIを描画します。線虫の頭部を包含し、第1のROIを含む、より大きな第2の関心領域を定義する。
- 漂白設定で、取得、漂白、分析する最初のROIを選択します。2 番目の ROI を取得して分析するが、漂白は行わない場合に選択します。
- スキャンの速度を最大(すなわち、高速ピクセルのドウェル)に設定し、選択されたDendra2ニューロンを変換する実験を開始する。
メモ:実験が完了すると、取得した画像は、変換前と変換後の2つの画像になります。緑のチャンネルの場合、最初の画像は緑色のDendra2の変換によって2番目の画像で減少する緑色の信号を持っている必要があります。赤チャンネルの場合、最初の画像は負で信号を表示しない必要があり、変換後の画像には赤色の信号が表示されます。緑色の信号が減少しない場合は、変換が行われず、405 レーザーパワーや反復回数などの設定を変更する必要があります。最初の画像に赤色の信号がある場合、使用される488nmレーザーパワーが高すぎて、緑色のDendra2の一部がすでに赤に変換されています。この場合、新しいニューロン/線虫を選択する必要があります。 - 変換後すぐに、緑色の 561 nm レーザーでライブスキャンを開始し、デンドラ 2 を赤チャンネルで視覚化します (ex/em = 580-740 nm)。過剰露出を避けるために範囲色インジケーターを使用して、変換されたニューロンのフォーカスとそれぞれの最大投影を見つけます。
- スキャン速度を低いピクセルのドウェル速度(例えば5倍)にすばやく設定し、両方のチャンネルのスナップショット画像を高い解像度で取得します。この画像は、変換後のタイムポイント 0 (T0) として定義されます。
注: 変換された画像の取得速度は変更できます。ただし、選択した場合、この速度はデータ収集全体で一定に保たれる必要があります。 - スキャンを、識別可能な名前または番号、その後にタイム ゼロ ラベル (T0) を付けて保存します。
注:変換前の赤信号の欠如とその後の外観を示すために、変換実験(ステップ6.6)の画像を保存することをお勧めします。
7. 選択した第二の時点でのデータ取得のための変換された赤いDendra2の画像化
- Dendra2 の経時劣化を追跡するには、同じ線虫/ニューロンを再イメージ化する 2 番目のタイムポイントを定義します。関連する生物学的問題に対処するために、実験的に2番目のタイムポイントを選択します。ここで説明するプロトコルについては、Dendra2は、変換後2h(T2)と24時間(T24)の両方で画像化される。
- 選択した時点で、接眼と赤の蛍光を使用して同じ線虫/ニューロンを見つけます。
- それぞれの線虫/ニューロンのT0画像を開き、画像設定をリロード/再利用します。T0、T2、および T24 h イメージを取得する場合は、スナップショットの取得設定が正確に同じであることを確認します。
- スキャンは、赤いチャネルに生きて, フォーカスに変換された赤いニューロンをもたらします.赤いDendra2は時間の経過とともに劣化するので、範囲インジケータは、より強い最大投影を示します.取得パラメータを変更せず、最初の画像と同じ速度(例えば5倍)でスナップショットを取得しないでください。
- Dendra2の劣化を4時間以上経過後に追跡するには、変換後に線虫を救出してください。
- 4本の線虫を変換してイメージングした直後に、顕微鏡からスライドを取り外します。カバースリップをそっと取り外し、ワイヤーピックを使用して、アガロースパッドから各線虫を持ち上げます。
- 各線虫を適切にラベル付けされたNGMプレートに個別に配置します。
- 2番目の時間ポイントについては、線虫を新鮮なアガロースパッドに再度取り付け、セクション6の指示に従って変換された赤いDendra2のイメージングを進めます。
8. 変換されたデンドラ2の画像解析
注意:Dendra2の劣化の分析は、フィジー/ImageJソフトウェア20で行われます。
- フィジーを開き、.lsm ファイルをフィジー バーにドラッグ アンド ドロップします。変換直後に撮影したT0画像と、変換後に選択した時点で撮影した同じ線虫の画像(T2またはT24h)を開きます。
注: Dendra2 に融合した目的のタンパク質の分解を追跡するには、赤いチャネルのみを分析する必要があります。 - メニューから測定パラメータを設定する:分析 |測定を設定する。[面積]および[統合密度]機能を選択します。
- 赤チャンネルで取得した画像を選択します。フィジーバーからポリゴン選択ツールを選択します。
- T0 画像上の変換されたニューロンを識別し、選択ツールを使用して周囲の ROI を描画します。
- ニューロンの輪郭を適切に識別するには、バーの[画像]から選択して強度のしきい値をハイライト表示します。調整 |しきい値:バーカーソルをドラッグして、ポリゴン ツールを使用して、しきい値を示し、この領域を追跡します。正確なROIを生成するために、緑色チャネルから選択したニューロンの輪郭を使用することもできる。
- 赤チャンネルウィンドウで選択が完了したら、分析 |測定します。[結果]という名前のポップアップ ウィンドウが表示され、[エリア]、[IntDen]、および[RawIntDen]の ROI 値が表示されます。
- 2番目のタイムポイントの画像に対して同じ選択と測定の処理を行う(T2またはT24h)。
- 取得した値をスプレッドシートソフトウェアにコピーし、変換後のT0で値を適切に記録し、変換後のT2またはT24時間に適切に記録するように注意してください。
デンドラ2分解率の計算
- 劣化率を計算するには、まず 1 (または 100%)を時間を設定すると、時間がゼロの時点から(つまり、変換直後に、変換された赤デンドラ2のすべてがまだ存在する場合)これは、T0 の IntRawDen の値を単独で除算した結果です。
- 赤色Dendra2強度信号の減少を経時に、分解して算出するために、第2の時点のRawIntDenの値(例えば、T2またはT24h)をT0のRawIntDenの値で割る。結果の数値は 1 未満である必要があります。これらの値は、T0 を 100% として定義する割合として表すこともできます。
- 変換された線虫ごとにセクション7を繰り返します。Dendra2 の劣化をグラフィカルに表現する場合、散布図または棒グラフを、y 軸で取得した蛍光減少の割合または比率の値を使用してグラフ化します。目的の統計分析を適用し、グラフ上に図示します。
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Representative Results
光変換可能なタンパク質Dendra2を有するフレーム内のハンチンチンエキソン-1タンパクフラグメントを発現する2つの線虫株がマイクロインジェクションを介して得られ、プラスミドを染色体外配列として保持した。融合構築物は、老化を通じて発達から全体のC.エレガン神経系で発現した。ここで、HTT-D2は、生理学的25ポリグルタミンストレッチ(HTTQ25-D2、図1A)または97グルタミンで完全に浸透および病原性反復を含んでいた(HTTQ97-D2、図1B)。当初、融合タンパク質は、UV照射時に緑色スペクトルから赤色スペクトルに変化することを確認するためにテストされました。HTT-D2 は、ライトされた領域内で緑から赤に切り替え成功しました。UVパルスのパワーと繰り返しに従い、線虫のキューティクルを通るレーザービームのZ平面と貫通に応じて、HTT-D2の定義された部分が変換されたが、すべてではない。光変換されたニューロン内に赤信号が現れ、緑色の非変換HTT-D2と共局化した(図1C,D)。レーザー走査光子ビームの精度により、単一ニューロンに対応する正確なROIを変換することが可能であった。変換前に、サンプルが赤チャネルで励起されたとき、赤信号は見えませんでした(図2A)。UV照射時に、HTT-D2が変換され、最終的に赤信号が現れたときに緑色の信号が減少した(図2B)。その後、HTT-D2は時間の経過とともに分解され、より多くの融合タンパク質が新たに合成され、赤HTT-D2(図2C)のレベルが低下し、緑色のHTT-D2シグナルが増加する可能性があります。変換後2時間で顕著な減少が既に顕著であったため、HTT-D2の劣化を検出および定量するためのこの間隔は維持された。HTT-D2 の変換後に発生する可能性があるのは、劣化以外のプロセスであることに注意してください。変換されたHTT-D2は、輸送され、軸索に沿って輸送することができ、その結果、クリアランスによる赤信号の減少が生じる。しかし、ここで採用された設定と2時間の短い期間にわたって、赤信号の広がりは、おそらく少しHTT-D2が相馬から軸索に移動したという事実のために、観察されなかった。さらに、すべての細胞コンパートメントが同時に分析されていたため、単一のニューロン全体の相馬を変換およびイメージングすると、同じニューロン内でHTT-D2拡散の影響を排除するのに役立ちました。拡散または輸送/人身売買の両方を研究するには、高速かつ高倍率画像を取得し、関心のあるタンパク質のより小さく、おそらくより多くのモチル分率を追跡することをお勧めします。また、一連の実験の中で、各動物が1つの生物学的繰り返しを表していることに注意することも重要です。1つの線虫につき1つのニューロンのみが画像化され、各動物はセッションごとに1回画像化され、イメージングは3回のセッションで行われ、技術的な繰り返しを構成した。3つのセッションでは、4日目または10日目の各実験の前に新鮮なプレート上で動物を同期させ、線虫に課せられる環境変動を可能にする必要があります。3つのセッションはまた、設定されたイメージングから生じる変動性を考慮します(例えば、実験間の温度が異なるため、レーザーパワーが変化します)。3回のセッションで得られたすべての生物学的複製(最低20匹)を個々のサンプルと見なし、統計的有意性を確立するために利用した。
両方のC.エレガンスHTT-D2株が有効であることを確認し、最適な変換パラメータを確立した後、生理学的関連制御(HTTQ25-D2)と比較して、疾患を引き起こすHTT-D2タンパク質(すなわち、HTTQ97-D2)の代謝との間の差異を調査した。まず、異なるニューロンにおけるHTT-D2の劣化が観察された(図3)。線虫の神経系内のニューロンのサブタイプは、代謝活性および形態21において変化し、プロテオームの分解および再バランスに違いをもたらす可能性が知られている。尾部のニューロンを頭部のニューロンと比較し、有意に活性であることが分かった(図3A)。この知見はHTTQ25-D2に対してのみ有効であり、病原性HTTQ97-D2には有効ではなく、PNが神経系全体に長いグルタミンストレッチを含むHTT-D2を除去できなかったことを示唆している(図3B)。
モデルシステムが期待通りに動作することをさらに確認するために、より長い期間にわたって変換実験を行い、細胞の分解経路が目的のタンパク質をほぼ完全に排除することを可能にした(図4)。実際、ヘッドニューロンでは2時間後より変換後の制御HTTQ25-D2 24時間の分解が有意に多く、尾神経細胞では広範囲に多かった(図4A)。繰り返しますが、後尾ニューロンは、より積極的に赤いHTT-D2を除去しました, でも、増加した期間にわたって.同様の傾向が疾患を引き起こすHTTQ97-D2に対して検出され、24時間にわたって赤色HTT-D2シグナルが非常にわずかに減少した。しかし、HTTQ97-D2は、特に24時間後にHTTQ25-D2ほど容易に除去されなかった。可溶性HTTQ97-D2画分のみが効率的に分解され、赤信号の初期減少と時間の経過とともにさらに軽度の減少を考慮してよい。重要なのは、24時間後にニューロンの2つの集団があった:1つは分解率が高く、もう1つは赤いHTT-D2信号が全く劣化しなかったか、あるいは潜在的に増加した(図4B)。増加し、安定した信号は、おそらくそれらのしっかりと詰まったアミロイドの性質のために細胞からクリアすることが実質的に困難であった既に凝集または継続的に凝集した種を表す。これらの包含物は、グルタミン伸縮が40反復閾値を超えたときに排他的に存在し、かつ、病巣として顕微鏡的に現れた、容易に除去することができない沈着物として蓄積すると仮定されている22。また、赤蛍光シグナルの増加は、技術的な問題(例えば、誤った取得パラメータの使用、顕微鏡設定のサブパー性能、誤った回収/取り付けプロセス)に起因するアーティファクトであった可能性もあります。より長い期間にわたって画像を取得する場合、これらの変数を考慮する必要があります。
最後に、成人期におけるHDなどの神経変性疾患が現れるため、HTT-D2分解の速度に対する老化の影響が観察された。HTT-D2株の両方で若い(4日目)と古い(10日目)線虫の頭部と尾部での変換実験を行った(図5)。頭部ニューロンについては、HTTQ25-D2およびHTTQ97-D2の両方の寿命内における老化による劣化率に有意な変化はなかった。しかし、病理学的または生理的グルタミンストレッチのいずれかを含む古い線虫を比較する際に非常に有意な変化が記録された。HTTQ97-D2はHTTQ25-D2ほど効率的に分解されておらず、PNが古い線虫の凝集した有毒種のハンチンチンを除去できないことを強調した(図5A)。繰り返しますが、尾神経細胞のより活発で有意なターンオーバーが観察された。頭部ニューロンと同様に、HTTQ25-D2のより強いターンオーバーは、古いコホートと比較して若い線虫の尾ニューロンでは観察されず、分解は4日目と10日目に等しかった。逆に、対照と病原性HTT-D2株との間の分解速度の有意な変化は、若い4日目の線虫に現れ、10日目には更に重要になっていった。重要なことに、尾神経細胞は若い線虫における有毒なHTTQ97-D2に対処することができ、様々な付随するPNメカニズムがHTT-D2を除去するために働いているかもしれないことを示す(図5B)。全体として、PN活性は、おそらく老化と凝集体の存在の両方によって引き起こされる有害な影響のために、時間の経過とともに減少した。
図1:C.エレガンスは、神経系においてデンドラ2に融合したハンチンチンエキソン-1を発現した。(A)若い、4日目C.エレガンスは、25個のグルタミンを含むハンチンチンエキソン-1を汎ニューロンに発現し、未変換の緑色励起/発光状態でDendra2に融合した。スケールバー = 100 μm. インセットは、頭部(上)と尾(下)のニューロンの拡大画像を示します。インセットスケールバー=10μm(B)ヤング、第4日C.エレガンスは97グルタミンを含むハンチンチンエキソン-1を汎ニューロンに発現し、未変換の緑色励起/発光状態でDendra2に融合した。Bスケールバー= 100 μm.インセットは、尾(上)と頭部(下)ニューロンの拡大画像と、7日目の線虫(右端)の頭部を示します。インセットスケールバー = 10 μm. 白い矢印は HTTQ97-D2 フォチを指し、ハンチンチン凝集体を描いています。(C) ヘッド領域の変換を伴う HTTQ25-D2 のチャンネルマージ画像。ボックスは、UV照射されたC.エレガンス全体の部分を表す。スケールバー = 100 μm. インセットは、Dendra2 放出を 488 nm (上、緑) および 561 nm (下部、赤) で示しています。スケールバー= 10 μm(D) ヘッド領域の変換を伴うHTTQ97-D2のチャンネルマージ画像。スケールバー= 100 μm. ボックスは、UV照射されたC. エレガンス全体の部分を表します。インセットは、488 nm(上、緑)でデンドラ2放出を示し、561 nm(下、赤)で発光します。スケールバー= 10 μm.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:単一ニューロンにおいて、変換された赤HTT-D2が時間の経過とともに減少した。HTTQ25-D2の尾神経細胞。2つのニューロンが同時に、そして独立して光変換されて示される。画像は、(A)照射前(前)、照射直後(変換)、照射後(C)2時間(後)の3つの時点を順次描写する。上パネル(緑のチャネル)は486-553 nmの励起/放出で集められたHTT-D2信号を表す。関心のある白色領域は、照射されたニューロンを表します。中央のパネル(赤チャネル)は、580-740 nmの励起/放出で収集された変換されたHTT-D2信号を示しています。下部のパネルは、2 つのチャネルを結合します。スケールバー = すべての画像に対して 5 μm。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:頭部と尾部のニューロンは異なる分解率を示した。列棒グラフは、変換時の初期値に対する赤強度の割合(すなわち、100%)を示す。変換赤デンドラ2信号は、HTT-D2がC.エレガンスのニューロン内で分解された2時間間隔にわたって全体的に減少した。線虫の神経系ニューロンサブタイプの中では、異なる分解速度を示し、尾ニューロンはより活発なターンオーバーを示したが、非病原性ポリグルタミンストレッチを運ぶ線虫でのみ示された。(A) HTTQ25-D2頭部と尾部ニューロンの分解の定量化。平均±SD、ペアになっていない両側の学生のt検定。N = 23-28 サンプル/線虫は領域ごとにイメージ化され、*P < 0.05。(B) HTTQ97-D2頭部と尾部ニューロンの分解の定量化平均±SD、ペアになっていない両側の学生のt検定。N = 23-28 サンプル/線虫は領域ごとに画像化され、ns = 有意ではない。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:HTTQ97-D2は24時間後に有意にクリアされなかった。列棒グラフは、変換時の初期値に対する赤強度の割合(すなわち、100%)を示す。変換赤デンドラ2信号は、HTT-D2がC.エレガンスのニューロン内で分解されたとして減少した。HTT-D2は異なる劣化率を示した。変換後の長期間にわたっても、病原性HTT-D2は、その健康なコントロールと比較して除去することができませんでした。(A) 頭と尾の両方のニューロンで変換後の2つの時点(2時間および24時間)におけるHTTQ25-D2の分解速度の定量化。平均値±SD、分散の一方向分析(ANOVA)。N = 時間/領域あたり 21-28 サンプル/線虫画像, *P < 0.05, ****P < 0.0001.(B) ヘッドニューロンとテールニューロンの変換後の2点(2時間および24時間)におけるHTTQ97-D2の分解速度の定量化。平均値±SD、一方向分散分析(ANOVA)の後にTukeyの多重比較後の検定が続いた。 N = 時間/領域あたり 21~28 サンプル/線虫画像、ns = 非有意。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:病原性HTT-D2を発現する老若の線虫は、それを効率的に分解しなかった。列棒グラフは、変換時の初期値に対する赤強度の割合(すなわち、100%)を示す。変換赤デンドラ2信号は、HTT-D2がニューロン内で分解されたとして減少した。線虫が老化するにつれて、病原性HTT-D2を分解する能力は、神経系全体でさらに損なわれた。(A) 若い(4日目)および古い(10日目)HTTQ25-D2線虫の頭部の分解速度を、年齢に合わせたHTTQ97-D2線虫と比較して定量化する。平均値±SD、分散の一方向分析(ANOVA)。N = 23-28 サンプル/線虫はひずみ/日ごとに画像化され、****P < 0.0001。(B) 若い(4日目)および古い(10日目)HTTQ25-D2線虫の尾ニューロンにおける変換後の2時間の分解率は、年齢に一致したHTTQ97-D2線虫と比較した。平均値±SD、一方向分散分析(ANOVA)の後にTukeyの多重比較後の検定が続いた。N = 23-28 サンプル/線虫はひずみ/日ごとに画像化され、*P < 0.05、***P < 0.001、****P < 0.0001。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
タンパク質の機能を理解するには、その合成、位置、分解を理解することが重要です。新しく、安定した、明るいFPの開発に伴い、POIの可視化と監視がより簡単かつ効率的になりました。Dendra2のような遺伝的に発現した融合PAFPは、POIの安定性を研究するためにユニークに配置されています。紫色の青色光に曝されると、Dendra2は保存されたアミノ酸のトライアド内の正確な位置で壊れます。この蛍光体は小さな構造変化を起こし、スペクトルが緑から赤23に完全にシフトします。このシフトはDendra2にリンクされているPOIの検出および監視を可能にする。実際、これらの融合構造は、最初に、生体内16のユビキチン-プロテアソーム系を研究するためにC.エレガンスレポーター株を作成するために使用された。Dendra2はまた、選択的神経サブタイプの脆弱性および拡大したポリグルタミンタンパク質24に対処する能力を理解するためにも用いられた、または運動ニューロン疾患25のモデルにおけるオートファジーの誘導を監視する。
ここでは、非侵襲的な方法で疾患に関連する凝集しやすいタンパク質であるハンチンチンの分解をインビボで監視するプロトコルが提示されています。HDのニューロンC.エレガンスモデルを正常に生成した後、HTT-D2汎ニューロンを発現し、その生理学的対応物と比較して拡張および病原性HTTの分解率を定量化した。神経亜型、若年線種間、および時間の経過とともに有毒なグルタミン負荷に対処するPNの能力の間で顕著な違いが観察された。この技術は、PNへの摂動が導入されたときのハンチンチンの位置と動き、そしてその運命に従うためにも適用することができる。プロテアソーム活性を阻害する主要なシャペロンのsiRNAノックダウンまたはプロテアソーム活性を阻害する化合物の投与は、凝集しやすいタンパク質におけるこれらの成分の機能および重要性を明らかにすることができる:例えば、PNが欠乏を補うために特定のノードを活性化するかどうか26。また、通常の老化の疾患と比較して病気によって引き起こされる有害な影響を説明することができます。
この手法を使用してさまざまな疑問を解決できますが、目的のモデルが生成されたら、信頼できるデータを取得するために正しい変換および検出パラメータを確立する必要があります。また、光漂白や光毒性を伴わず、望ましくない変換を行うことなく、活性化タンパク質の十分な収量を可能にする変換設定を決定することも重要です。さらに、特定のモデル系内で研究されたタンパク質毎に、ex vivoまたはin vivoのいずれにおいても、分解速度の正確な定量化を可能にする十分に大きい期間を実験的に確立する必要がある。
Dendra2は他のPAFPsに対して一連の利点を提供しています:1)それは単量体であり、非常に明るいです。2)それは高コントラストの光変換と安定した光変換信号を有する。3)それはほとんどの共焦点ハードウェアのセットアップの一部である青488 nmレーザーによって低い光毒性と活性化することができる。4)哺乳動物細胞での適用のために37°Cで効率よく成熟する。5)長期間23、27,27のために発現すると毒性の副作用はありません。6)変換前後のDendra2シグナルの比のみが定量化されるので、システムは、生物または細胞間または細胞内の発現レベルの変動の影響を受けません。すべてのリストされた特性は、Dendra2をリアルタイムでタンパク質ダイナミクスを追跡し、細胞の運命を監視するための理想的な蛍光素を作ります。
残念なことに、Dendra2融合タンパク質は蛍光タンパク質標識のいくつかの一般的な制限に苦しんでいます。この構造は、ゲノム工学を介して内因性発現を確立することができるが、しばしば生物学的系において実験的に過剰発現するキメラ種である。Dendra2自体の分解速度は、標的タンパク質の分解に影響を及ぼす可能性があるが、非常に安定した長生きタンパク質27と記載されている。さらに、Dendra2は、それ自身の適切な成熟のための時間を持っていないかもしれないので、非常に速いターンオーバーを持つタンパク質を追跡するのに適していません。最後に、サンプルに対してより毒性があるものの、非まれである405 nmレーザーが効率的な光スイッチングに好ましい。実際、光毒性の低い青色光は、緑色のDendra2を視覚化し、レーザーパワーが高い強度にあるときに変換するために利用することができます。長時間の暴露は望ましくない変換を生成し、潜在的に間違った測定値を生成するので、この特定の機能は、常に心に留めておく必要があります。最後に、緑または赤色のフルオロフォアと組み合わせてDendra2を使用することは問題になる可能性があります。しかし、複数のタンパク質のダイナミクスを同時に調べるには、多くの異なるPAFPが利用できます。
Dendra2および他のPAFPを利用した実験は、光漂白(FRAP)および放射性パルス追跡標識技術後の蛍光回復に関連している。FRAP設定では、新たに形成された蛍光タンパク質からROIに再入するタンパク質を区別することは不可能であり、サンプルの一定のモニタリングと可視化が必要です。Dendra2を用いて、2つの明確に区別可能な集団が生成され、時間の経過とともに独立して観察することができるので、置換され、新たに合成された「非アクティブ」形態の緑色Dendra2を追跡し、定量化することができる16。Dendra2は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRF)28や光活性化局在化顕微鏡(PALM)29などの超分解能顕微鏡検査においても有用なプローブ29である。28近い将来、このような進歩は、POIのより良い局在化と潜在的に単一分子追跡を可能にし、サンプル内およびサンプル間のより微妙な違いを明らかにし、最終的には生物学的システム内のPOIの生命と運命に関する新しい情報を生み出すことを可能にする。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、DFG(KI-1988/5-1からJK、ニューロキュア・ド・エクセレンス・クラスター・オブ・エクセレンス・オブ・エクセレンス・オブ・MLPによるニューロキュア博士フェローシップ)の資金調達を認めています。また、ライプニッツ分子薬理研究所ベルリン(FMP)のイメージングコア施設が、イメージングを提供していることを認めます。また、Dendra2システムを設置し、指示を提供してくれたディオゴ・フェレシアーノさんに感謝申し上げたいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
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