I Vivo Kvantificering af protein omsætning i Aging C. Elegans bruger Photoconvertible Dendra2

Summary

Præsenteret her er en protokol til at overvåge nedbrydningen af proteinet huntingtin smeltet til fotokonvertible fluorophore Dendra2.

Abstract

Proteiner syntetiseres og nedbrydes konstant i en celle for at opretholde homøostase. At være i stand til at overvåge nedbrydningen af et protein af interesse er nøglen til at forstå ikke kun dets livscyklus, men også for at afdække ubalancer i proteostasenetværket. Denne metode viser, hvordan man kan spore nedbrydningen af det sygdomsskabende protein huntingtin. To versioner af huntingtin smeltet til Dendra2 er udtrykt i C. elegans nervesystem: en fysiologisk version eller en med en udvidet og patogen strækning af glutaminer. Dendra2 er et fotokonverterende fluorescerende protein; ved en kort ultraviolet (UV) bestrålingspuls, skifter Dendra2 sin excitation/emission spektre fra grøn til rød. Svarende til en puls-chase eksperiment, kan omsætningen af den konverterede rød-Dendra2 overvåges og kvantificeres, uanset indblanding fra nyligt syntetiseret grøn-Dendra2. Ved hjælp af konfoalbaseret mikroskopi og på grund af den optiske gennemsigtighed i C. eleganser det muligt at overvåge og kvantificere nedbrydningen af huntingtin-Dendra2 i en levende, aldrende organisme. Neuronal huntingtin-Dendra2 nedbrydes delvist kort efter omdannelse og ryddes yderligere over tid. De systemer, der styrer nedbrydningen, er mangelfulde i tilstedeværelsen af mutant huntingtin og forringes yderligere ved ældning. Neuronale undertyper inden for samme nervesystem har forskellige omsætningskapaciteter for huntingtin-Dendra2. Samlet set kan overvågning af ethvert protein af interesse, der er smeltet sammen med Dendra2, give vigtige oplysninger ikke blot om dets nedbrydning og aktørerne i det involverede proteostasisnetværk, men også om dets placering, menneskehandel og transport.

Introduction

Proteomet i en levende organisme fornyer sig konstant. Proteiner nedbrydes og syntetiseres løbende i henhold til en celles fysiologiske behov. Nogle proteiner er hurtigt elimineret, mens andre er længere levetid. Overvågning protein dynamik er en enklere, mere præcis, og mindre invasiv opgave, når du bruger genetisk kodede fluorescerende proteiner (FPs). FPs form autocatalytisk og kan smeltes til ethvert protein af interesse (POI), men kræver ikke enzymer til at folde eller har brug for cofaktorer spare for ilt¹. En nyere generation af FPs er for nylig blevet manipuleret til at skifte farve på bestråling med en lys puls af bestemt bølgelængde. Disse fotoaktive FP'er (PAFPs) gør det muligt at mærke og spore POI'er eller de organeller eller celler, de bor i, og at undersøge deres kvantitative og/eller kvalitative parametre². FPs gør det muligt at spore enhver POI's bevægelse, retningsbestemthed, sats for bevægelse, diffuseringskoefficient, mobil versus immobile fraktioner, den tid, den er bosat i en cellulær rum, samt dens omsætningshastighed. For specifikke organeller kan bevægelse og transport eller fissions- og fusionshændelser bestemmes. For en bestemt celletype kan der oprettes en celles placering, delingshastighed, volumen og form. Afgørende, brugen af PAFPs tillader sporing uden kontinuerlig visualisering og uden interferens fra enhver nyligt syntetiseret sonde. Undersøgelser både i celler og i hele organismer har med succes anvendt PAFPs til at behandle biologiske spørgsmål in vivo, såsom udvikling af kræft og metastase, samling eller demontering af cytoskeleton, og RNA-DNA/protein interaktioner³. I dette manuskript anvendes let mikroskopi og PAFPs til at afdække omsætningsraten for det sammenlægningsudsatte protein huntingtin (HTT) in vivo i en C. elegans model af neurodegenerative sygdomme.

Den her beskrevne protokol kvantificerer stabiliteten og nedbrydningen af fusionsproteinet huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 er en anden generations monomerisk PAFP^4, der uigenkaldeligt skifter sin emission / excitation spektre fra grøn til rød som reaktion på enten UV eller synligt blåt lys, med en stigning i dens intensitet på op til 4.000-fold^5,6. Huntingtin er det protein, der er ansvarligt for at forårsage Huntingtons Sygdom (HS), en dødelig arvelig neurodegenerativ lidelse. Huntingtin exon-1 indeholder en strækning af glutaminer (CAG, Q). Når proteinet udtrykkes med over 39Q, misfolds det til et mutant, giftigt og patogent protein. Mutant HTT er tilbøjelig til sammenlægning og fører til neuronal celledød og degeneration, enten som korte oligomerarter eller som større højt strukturerede amyloider⁷.

Den nematode er en model system til at studere aldring og neurodegeneration takket være dens lethed af manipulation, isogene natur, kort levetid, og dens optiske gennemsigtighed⁸. For at studere stabiliteten af HTT in vivo, en fusion konstruktion blev udtrykt i nervesystemet af C. elegans. En HTT-D2 transgene, der indeholder enten en fysiologisk strækning på 25Qs (HTTQ25-D2) eller en patologisk strækning på 97Qs (HTTQ97-D2) er overudtrykt pan-neuronalt hele nematodens levetid⁹. Ved at udsætte levende C. elegans for en kort og fokuseret lyspunkt, en enkelt neuron er photoswitched og den konverterede HTT-D2 spores over tid. For at bestemme mængden af HTT-D2 forringet sammenlignes forskellen mellem det røde signal fra den nykonverterede HTT-D2 med det resterende røde signal fra HTT-D2 efter en bestemt periode. Det bliver derfor muligt at undersøge, hvordan huntingtin nedbrydes, når det findes i sin udvidede og toksiske form i forhold til dets fysiologiske form; hvordan forreste eller bageste neuroner reagerer forskelligt på tilstedeværelsen af Q97 versus Q25, især over længere perioder; og hvordan sammenbruddet af proteostase-netværket (PN) under aldring bidrager til forskellene i nedbrydningshastigheder. Disse resultater beskriver kun et lille sæt bemærkninger om omsætningen i HTT-D2. Men mange flere biologiske spørgsmål, der er relevante for både området for proteinaggregering og proteostase, kan behandles med denne in vivo-applikation.

Protocol

1. Generation af C. elegans udtrykker neuronal Huntingtin-Dendra2 fusion protein

1. Klone genkodning af POI i en nematode udtryk vektor (dvs. pPD95_75, Addgene #1494), ved traditionelle begrænsning enzym digest¹⁰, Gibson forsamling¹¹, eller enhver metode valg. Indsæt en promotor for at drive udtryk i et ønsket væv eller på et ønsket udviklingsstadiet. Sæt Dendra2 fluorophore enten N- eller C-terminalt i rammen med POI.
2. Der genereres transgene C. elegans, der udtrykker fusionskonstruktionen (f.eks. via mikroinjektion)¹².
   BEMÆRK: Plasmid bærer transgene vil forblive som en ekstrachromosomal array. Integration af konstruktionen er ikke nødvendig, men kan udføres, hvis det^{ønskes 13}. I denne protokol blev C. elegans mikroinjected med en plasmid, der bar fusionskonstruktionen huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) under kontrol af pan-neuronal promotor Prgef-1. C. elegans udtryk rygraden blev opnået fra Kreis et al.¹⁴, huntingtin exon 1 med enten Q25 eller Q97 blev fremstillet af Juenemann et al.¹⁵, og Dendra2 blev fremstillet af Hamer et al.¹⁶.

2. Aldersmatchning og vedligeholdelse af C. elegans

1. Alder matcher alle nematoder ved synkronisering enten med alkalisk hypochloritopløsningsbehandling¹⁷ eller via æglægning i 4 timer ved 20 °C. For æglægning, sted 10 gravid voksne på en frisk seedet nematode vækst media (NGM) plade og lad i 4 timer før du fjerner. Æggene lagt i denne tidspan vil give anledning til synkroniserede nematoder.
2. Hold eksperimentelle C. elegans på NGM-plader (nematodevækstmedier) med den bakterielle fødekilde E. coli OP50 efter standard nematodeholdmandshold¹⁸.
3. Nematoder dyrkes ved 20 °C til det ønskede stadium. For denne protokol er de krævede aldre dage 4 og 10.
   BEMÆRK: Unge voksne på dag 4 kan identificeres ved tilstedeværelsen af æg i deres gonader og deres høje mobilitet. Alderen dag 10 nematoder er post-frugtbare, og gennemgå vævsforringelse og lokomotiv tilbagegang¹⁹.
4. For dag 10 nematoder, passage dagligt efter L4 fase på dag 3, når nematoder er frugtbare, for at undgå en blandet befolkning.

3. Forberedelse af mikroskopiske objektglas til billeddannelse

1. Forbered mikroskopi dias på dagen for billedbehandling. I en mikrobølgeovn smeltes den generelle kvalitet ved en koncentration på 3% (w/v) i ddH₂O. Lad det køle lidt af.
2. Skær spidsen af en 1 ml pipettespids og indsug ca. 400 μL smeltet agarose. Forsigtigt placere et par dråber af opstod på en ren glas dias og straks placere en anden slide på toppen, og sørg for, at en tynd pude af agarose er skabt mellem de to. Lad tørre, før du forsigtigt glider eller løfter den øverste glide af.
3. Anse agarosepudenser i en befugtet beholder for at forhindre dem i at tørre ud. Disse kan bruges inden for 2-3 timer.
   BEMÆRK: Undgå dannelse af små bobler i agarose, da nematoderne kan være fanget indeni.

4. Definition af konforosale mikroskopparametre

BEMÆRK: Før du monterer nematoderne og dataindsamlingen, skal du definere alle indstillinger på den konfostforskaffelsessoftware. Indstillingerne kan tilpasses den foretrukne billedhardware og software.

1. Åbn konfoalsoftwaren, og definer indstillingerne for laserbilledbehandling. Lysvejen for excitation/emission for grøn Dendra2 ved 486-553 nm og for rød Dendra2 ved 580-740 nm. Juster effekt og gevinst af begge kanaler / lasere i henhold til intensiteten af fluorophore. Du må ikke ændre den digitale forstærkning eller forskydning og indstille pinholet som helt åbent.
2. Definer anskaffelsesopsætningen: Vælg en sekventiel kanaltilstand, og skift spor i hver ramme. Indstil scanningstilstanden som ramme og rammestørrelsen som 1.024 x 1.024 med et linjetrin på 1. Indstil gennemsnit til 2, og gennemsnit ved middelværdi metode og tilstand af envejslinje. Indstil bitdybden til 8 bit.
3. Definer de flerdimensionale anskaffelsesindstillinger for konverteringen af Dendra2. Til konvertering og blegning anvendes 405 nm diodelaser indstillet til 60% energieffekt. Hvis det er muligt, aktiveres den sikre blegning GaAsP for at beskytte detektorerne.
4. Vælg en tidsserie med to cyklusser med et interval på 0,0 ms mellem og normal start og stop. Start blegning efter scanning 1 af 2 og gentag i 30 iterationer. Stop blegning, når intensiteten falder til 50%.
5. Definer anskaffelseshastigheden/pixelbosså så hurtigt (f.eks. maksimum = 12) for konvertering og middelhastighed (f.eks. medium = 5) for at opfange et snapbillede.
   BEMÆRK: De blegningsparametre, der er defineret her, er retningslinjer. For andre Dendra2 mærkede POI'er skal lasereffektindstillingerne og blegningsgentagelser og -værdier fastlægges empirisk.

5. Montering af C. elegans på mikroskopiske objektglas

BEMÆRK: Hvis det er muligt, skal du placere et monteringstermicroskop tæt på det konfootiske mikroskopopsætning og montere nematoderne lige før billedbehandling.

1. På glasdækslet dias på den modsatte side af agarose pad, tegne et vindue med fire firkanter med en permanent markør og nummerere dem.
2. Pipette 15 μL levamisole i midten af agarosepuden. Koncentrationen af levamisole vil variere alt efter nematodens alder: Når billeddag 4 nematoder bruger 2 mM levamisole; når billeddag 10 nematoder bruger 0,5 mM levamisole.
3. Fire nematoder overføres til væsken ved hjælp af et trådplukke. Ved hjælp af en øjenvippe pick, forsigtigt flytte hver enkelt nematode til et vindue firkantet. Drej øjenvipperne, så ethvert spor af E. coli OP50 fortyndes, og dens fluorescerende baggrund ikke forstyrrer signalerhvervelsen.
4. Vent på nematoderne næsten holder op med at bevæge sig og læg forsigtigt en dækslet på væsken for at immobilisere nematoderne i levamisolelaget mellem agarosepuden og dækslet.
5. Placer det omvendte dias på konfosokosetapen for at afbilde nematoderne.

6. Konvertering af grønne Dendra2: Dataindsamling på tid nul

BEMÆRK: Puls-chase eksperimenter starter ved uigenkaldeligt at konvertere Dendra2 fusion protein fra en grøn udsender fluorophore til en rød.

1. Ved hjælp af mikroskopets okular skal du finde den første nematode med et 20x-mål under grøn fluorescens. Fokuser på hovedet eller halen og skift til konfocytringstilstand.
2. Start live laserscanning med 488 nm blå laser for at visualisere den grønne Dendra2 i EGFP grøn kanal (ex / em = 486-553 nm). Vælg en enkelt neuron og bringe det i fokus. Zoom ind 3x og øge målet for laserstrålen⁴.
   BEMÆRK: Vælg en neuron pr. nematode. Hver neuron vil udgøre en prøve eller datapunkt.
3. Find det maksimale projektionsplan, og forøg eller reducer forstærkningen eller lasereffekten i henhold til fluorophores lysstyrke for at opnå et mættet, men ikke overeksponeret billede, der kan identificeres ved indikatoren for farveområdet. Når dette er defineret, skal du stoppe scanningen.
   BEMÆRK: Prøven må ikke bestråles for længe eller med for meget kraft, da excitation med synligt blåt 488 nm lys også kan konvertere Dendra2, omend langsomt og mindre^{effektivt 4}.
4. I softwaren skal du åbne fanen for at vælge de pågældende områder (RO'er) og tegne et første investeringsafkast omkring den valgte neuron. Definer en større anden region af interesse, der omfatter nematoden hoved og herunder den første ROI.
5. I blegning indstillinger, vælge for den første ROI, der skal erhverves, bleget, og analyseres. Vælg for den anden ROI, der skal erhverves og analyseres, men ikke bleget.
6. Indstil scanningshastigheden til maksimum (dvs. hurtig pixelboring) og start eksperimentet for at konvertere de valgte Dendra2 neuroner.
   BEMÆRK: Når eksperimentet er udført, vil det erhvervede billede resultere i to billeder: et før og et efter konvertering. For den grønne kanal, bør det første billede har en højere grønt signal, der aftager i det andet billede på grund af konvertering af den grønne Dendra2. For den røde kanal skal det første billede være negativt og vise intet signal, med et rødt signal, der vises i efterkonverteringsbilledet. Hvis det grønne signal ikke formindskes, blev konverteringen ikke foretaget, og indstillingerne, såsom 405 lasereffekten eller antallet af gentagelser, bør ændres. Hvis der er et rødt signal i det første billede, så 488 nm laser effekt, der anvendes var for høj, og en del af den grønne Dendra2 var allerede konverteret til rød. I dette tilfælde skal der vælges en ny neuron/nematode.
7. Umiddelbart efter konverteringen, start live scanning med den grønne 561 nm laser til at visualisere Dendra2 i den røde kanal (ex / em = 580-740 nm). Find fokus og respektive maksimale projektion af den konverterede neuron ved hjælp af området farve indikator for at undgå overeksponering.
8. Indstil hurtigt scanningshastigheden til en lavere pixelbobehastighed (f.eks. 5x), og få et øjebliksbillede af begge kanaler med en højere opløsning. Dette billede defineres som tidspointnrul (T0) efter konvertering.
   BEMÆRK: Anskaffelseshastigheden for det konverterede billede kan varieres. Men når denne hastighed er valgt, skal den være konstant under hele dataindsamlingen.
9. Gem scanningen med et identificerbart navn og/eller tal efterfulgt af tidsnulmærkningen (T0).
   BEMÆRK: Det er tilrådeligt også at gemme billedet af konverteringseksperimentet (trin 6.6) for at illustrere manglen på rødt signal før konvertering og dets udseende bagefter.

7. Billedbehandling af konverteret rød Dendra2 til dataindsamling på et valgt andet tidspunkt

1. For at spore Dendra2 nedbrydning over tid, definere et andet timepoint for at reimage den samme nematode / neuron. Vælg det andet tidspunkt eksperimentelt for at løse alle relevante biologiske spørgsmål. For den protokol, der er beskrevet her, er Dendra2 afbildet både på 2 h (T2) og 24 h (T24) efter konvertering.
   1. På det valgte tidspunkt, finde den samme nematode / neuron med brug af okular og rød fluorescens.
   2. Åbn T0-billedet af den pågældende nematode/neuron, og genindlæs/genbrug billedindstillingerne. Sørg for, at snapshottets anskaffelsesindstillinger er nøjagtig de samme, når du anskaffer T0-, T2- og T24-h-billederne.
   3. Scanning live i den røde kanal, bringe den konverterede røde neuron i fokus. Da den røde Dendra2 nedbrydes med tiden, viser områdeindikatoren en mindre intens maksimal projektion. Du må ikke ændre nogen anskaffelsesparametre og få et øjebliksbillede med samme hastighed (f.eks. 5x) som det første billede.
2. For at spore nedbrydningen af Dendra2 efter 4 timer eller længere skal nematoderne reddes efter omregning.
   1. Fjern diaset fra mikroskopet umiddelbart efter konvertering og billeddannelse af de fire nematoder. Fjern forsigtigt betrækslysen, og løft hver nematode fra agarosepuden ved hjælp af en trådplukke.
   2. Hver nematode placeres individuelt på en passende mærket og identificerbar NGM-plade.
   3. For andet gang punkt, monteres nematoden igen på en frisk agarosepude og fortsætte med billeddannelse af den konverterede røde Dendra2 efter instruktionerne i afsnit 6.

8. Billedanalyse af konverteret Dendra2

BEMÆRK: Analyse af nedbrydningen af Dendra2 udføres med Fiji/ImageJ software²⁰.

1. Åbn Fiji, og træk og slip .lsm-filen til Fiji-linjen. Åbn det T0-billede, der er taget lige efter konverteringen, og billedet af den samme nematode, der er taget på det valgte tidspunkt efter konverteringen (T2 eller T24 h).
   BEMÆRK: For at spore nedbrydningen af det rent protein, der smeltes sammen med Dendra2, er det kun den røde kanal, der skal analyseres.
2. Fastst følgende måleparametre fra menuen: Analysér | Angiv målinger. Vælg funktionerne Område og Integreret Tæthed.
3. Vælg det billede, der er opnået med den røde kanal. Vælg markeringsværktøjet for polygon på fijilinjen.
4. Identificer den konverterede neuron på T0-billedet, og tegn et investeringsafkast omkring den ved hjælp af markeringsværktøjet.
   1. For korrekt at identificere konturerne af neuron, fremhæve intensiteten tærskler ved at vælge fra baren Billede | Juster | Tærskel. Træk i søjlemarkøren for at afgrænse tærsklen og spore rundt om dette område med polygonværktøjet. For at generere en nøjagtig ROI, er det også muligt at bruge konturen af den valgte neuron fra den grønne kanal.
5. Når valget er foretaget i det røde kanalvindue, skal du trykke på Analysér | Mål. Der vises et pop op-vindue med navnet Resultater , som indeholder værdierne for investeringsafkast for Område, IntDenog RawIntDen.
6. Udfør den samme udvælgelses- og måleproces for billedet af det andet punkt (T2 eller T24 h).
7. Kopier de opnåede værdier til et regnearkssoftware, idet du skal sikre dig, at værdierne på T0 efter konverteringen og T2 eller T24 h efter konverteringen registrerer værdierne korrekt.

9. Beregning af forholdet mellem Dendra2 nedbrydning

1. Hvis du vil beregne nedbrydningsforholdet, skal du først tildele en værdi på 1 (eller 100 %) til tiden nedbrydningen fra tidspunkt nul (dvs. lige efter konvertering, når alle de røde Dendra2 konverteret er stadig til stede). Dette skyldes, at værdien af IntRawDen af T0 divideres med sig selv.
2. Hvis du vil beregne reduktionen af det røde Dendra2-intensitetssignal over tid og nedbrydningen, divideres værdien af RawIntDen af det andet tidspunkt (f.eks. T24 h) med værdien af RawIntDen of T0. Det resulterende tal skal være mindre end 1. Disse værdier kan også udtrykkes som procenter, der definerer T0 som 100%.
3. Gentag afsnit 7 for hver nematode, der konverteres. For en grafisk repræsentation af nedbrydningen af Dendra2 skal du kortlægge et punktområde eller en søjlegraf med den procentdel eller forholdet mellem fluorescensfald, der er opnået i y-aksen. Anvend enhver ønsket statistisk analyse og illustrere det på grafen.

Representative Results

To nematodestammer, der udtrykker huntingtin exon-1-proteinfragmentet i rammen med det fotokonvertible protein Dendra2, blev opnået via mikroinjektion, og plasmiderne blev holdt som et ekstrakromosomt array. Fusionskonstruktionen blev udtrykt i hele C. elegans nervesystem fra udvikling gennem hele aldringen. Her indeholdt HTT-D2 enten den fysiologiske 25 polyglutaminstræk (HTTQ25-D2, figur 1A) eller en fuldt penetrant og patogen gentagelse med 97 glutaminer (HTTQ97-D2, figur 1B). I første omgang blev fusionsproteinet testet for at sikre, at det skiftede fra sit grønne spektrum til dets røde spektrum ved UV-bestråling. HTT-D2 skiftede fra grøn til rød udelukkende inden for det oplyste område. Ifølge magt og iterationer af UV-puls, og afhængigt af z-plan og penerance af laserstrålen gennem neglebånd af nematoden, en defineret del af HTT-D2 blev konverteret, men ikke alle. Et rødt signal dukkede op i de fotokonverterede neuroner, colocalizing med den grønne nonconverted HTT-D2 (Figur 1C, D). På grund af nøjagtigheden af laserscanning fotonstråler var det muligt at konvertere en præcis ROI svarende til en enkelt neuron. Før konverteringen var der ikke noget rødt signal synligt, da prøven blev ophidset i den røde kanal (figur 2A). Ved UV-bestråling aftager det grønne signal, efterhånden som HTT-D2 blev konverteret, og der endelig kom et rødt signal (Figur 2B). HTT-D2 blev derefter nedbrudt over tid, hvilket resulterede i en reduktion i niveauet af rød HTT-D2 (Figur 2C) og en mulig stigning i det grønne HTT-D2 signal, da mere fusionsprotein for nylig blev syntetiseret. Da et betydeligt fald allerede var fremtrædende ved 2 timer efter konverteringen, blev dette interval for detektering og kvantificering af nedbrydningen af HTT-D2 opretholdt. Det er vigtigt at bemærke, at nedbrydning ikke er den eneste proces, der kan opstå efter konvertering af HTT-D2. Konverteret HTT-D2 kunne smugles og transporteres langs axoner, hvilket resulterer i et fald i det røde signal ikke på grund af clearance. Men med de indstillinger, der anvendes her og i løbet af den korte tidsperiode på 2 timer, ingen spredning af det røde signal blev observeret, muligvis på grund af det faktum, at lidt HTT-D2 blev flyttet fra soma til axon. Endvidere, konvertering og billeddannelse en enkelt hel neuronal soma hjalp udelukke virkningerne af HTT-D2 diffusion inden for samme neuron, fordi alle cellulære rum blev analyseret samtidigt. For at studere både diffusion eller transport / menneskehandel er det tilrådeligt at opnå hurtige og højere forstørrelse billeder og spore en mindre og muligvis mere motile brøkdel af protein af interesse. Det er også vigtigt at bemærke, at hvert dyr inden for en række forsøg repræsenterede en biologisk gentagelse. Kun én neuron per nematode blev afbildet, hvert dyr blev afbildet en gang pr session, og billeddannelse fandt sted over tre sessioner, som udgjorde tekniske gentagelser. De tre sessioner krævede, at dyrene blev synkroniseret på friske plader før hvert forsøg enten på dag 4 eller dag 10, hvilket giver mulighed for, at nematoderne pålægges nogen miljøvariation. Tre sessioner tager også højde for eventuelle variabiliteter som følge af billeddannelsen (f.eks. varierer lasereffekten på grund af en anden temperatur mellem eksperimenterne). Alle biologiske replikater, der blev opnået under de tre sessioner (mindst 20 dyr), blev betragtet som individuelle prøver og anvendt til at fastslå statistisk signifikans.

Efter at have bekræftet, at begge C. elegans HTT-D2-stammer var effektive og etablerede de optimale konverteringsparametre, blev forskellene mellem omsætningen af et sygdomsforårsagent HTT-D2-protein (dvs. HTTQ97-D2) sammenlignet med dets fysiologisk relevante kontrol (HTTQ25-D2) undersøgt. For det første blev nedbrydningen af HTT-D2 hos forskellige neuroner observeret (figur 3). Det er kendt, at undertyper af neuroner i nematodens nervesystem varierer i deres metaboliske aktivitet og morfologi^21,muligvis gøre en forskel i nedbrydningen og afbalancering af proteomet. Neuronerne i haleregionen blev sammenlignet med hovedets og viste sig at være betydeligt mere aktive (figur 3A). Dette fund var kun gyldigt for HTTQ25-D2 og ikke for patogen HTTQ97-D2, hvilket tyder på, at PN ikke var i stand til at fjerne HTT-D2, der indeholder længere glutamin strækninger i hele nervesystemet (Figur 3B).

For yderligere at bekræfte, at modelsystemet opførte sig som forventet, blev der udført konverteringsforsøg over en længere periode, hvilket gjorde det muligt for cellernes nedbrydningsveje at fjerne det pågældende protein næsten fuldstændigt (figur 4). Faktisk var der betydeligt mere nedbrydning af kontrol HTTQ25-D2 24 h efter konvertering end efter 2 timer i hovedet neuroner, og i udstrakt grad mere i halen neuroner (Figur 4A). Igen, den bageste hale neuroner mere aktivt fjernet rød HTT-D2, selv over en øget tid. En lignende tendens blev påvist for det sygdomsforseende HTTQ97-D2 med en meget lille reduktion af det røde HTT-D2-signal over 24 timer. HTTQ97-D2 blev dog ikke fjernet så let som HTTQ25-D2, især efter 24 timer. Det kan være, at kun den opløselige HTTQ97-D2 fraktion er effektivt forringet, tegner sig for den indledende faldende af det røde signal og dens yderligere milde fald over tid. Vigtigere er det, at der var to populationer af neuroner efter 24 timer: en med en højere nedbrydningshastighed og en, hvor det røde HTT-D2-signal slet ikke blev nedbrudt eller potentielt endda øget (figur 4B). Øget og stabilt signal repræsenterer muligvis allerede aggregerede eller kontinuerligt aggæterende arter, som var væsentligt sværere at rydde fra cellerne på grund af deres tætpakkede amyloidkarakter. Disse indeslutninger, der udelukkende er til stede, når glutamin strækker sig over 40 gentage tærskel, og som syntes mikroskopisk som foci, har været en hypotese at akkumulere som indskud, der ikke let kan fjernes²². Det er også muligt, at en stigning i det røde fluorescerende signal var en artefakt som følge af tekniske problemer (f.eks. brug af forkerte anskaffelsesparametre, sub-par performance af mikroskopiopsætningen eller en fejlagtig gendannelses-/monteringsproces). Når du erhverver billeder over længere tid, skal der tages hensyn til disse variabler.

Endelig, fordi neurodegenerative lidelser såsom HS-manifest i voksenlivet, blev effekten af aldring på hastigheden af HTT-D2 nedbrydning observeret. Konverteringsforsøg blev udført i hoved- og haleområderne for unge (dag 4) versus gamle (dag 10) nematoder i begge HTT-D2-stammer (figur 5). For hovedneuroner var der ingen signifikant ændring i nedbrydningshastigheden på grund af ældning inden for levetiden for både HTTQ25-D2 og HTTQ97-D2, muligvis fordi HTT-D2 blev fjernet ligeligt i hele levetiden for hver nematode. Der blev imidlertid registreret en meget signifikant ændring ved sammenligning af gamle nematoder, der indeholder enten en patologisk eller en fysiologisk glutaminstræk. HTTQ97-D2 blev ikke nedbrudt så effektivt som HTTQ25-D2, hvilket understreger PN's manglende evne til at fjerne aggregerede og muligvis giftige arter af huntingtin i ældre nematoder (figur 5A). Igen, en mere aktiv og betydelig omsætning i halen neuroner blev observeret. Som i hovedneuroner blev der ikke observeret en mere robust omsætning af HTTQ25-D2 i haleneneurne hos unge nematoder sammenlignet med den ældre kohorte, og nedbrydningen var lig med dag 4 og dag 10. Omvendt viste der sig signifikante ændringer i nedbrydningsraten mellem kontrol og de patogene HTT-D2-stammer i unge dag 4-nematoder og blev endnu mere signifikante på dag 10. Vigtigere er det, hale neuroner var i stand til at klare giftige HTTQ97-D2 i unge nematoder, hvilket illustrerer, at forskellige samtidige PN mekanismer kan være på arbejde for at fjerne HTT-D2 (Figur. 5B). Samlet set faldt PN-aktiviteten over tid, muligvis på grund af skadelige virkninger forårsaget af både aldring og tilstedeværelsen af aggregater.

Figur 1: C. elegans udtrykt huntingtin exon-1 smeltet til Dendra2 i nervesystemet. (A) Unge, dag 4 C. elegans pan-neuronally udtrykke huntingtin exon-1 indeholdende 25 glutaminer, smeltet til Dendra2 i sin ukonverterede grønne excitation / emission tilstand. Skalabar = 100 μm. Insets viser et forstørret billede af hovedet (øverst) og halen (nederst) neuroner. Inset skala bar = 10 μm. (B) Unge, dag 4 C. elegans pan-neuronally udtrykke huntingtin exon-1 indeholdende 97 glutaminer, smeltet til Dendra2 i sin ukonverterede grønne excitation / emission tilstand. Skalabar = 100 μm. Insets viser et forstørret billede af halen (øverst) og hovedet (nederst) neuroner, og lederen af en dag 7 nematode (yderst til højre). Inset skalabar = 10 μm. Hvide pilespidser peger på HTTQ97-D2 foci, der viser huntingtinaggregater. (C) Kanalfletning billede af HTTQ25-D2 med konvertering af hovedet region. Box repræsenterer den del af hele C. elegans, der er blevet UV bestrålet. Skalabar = 100 μm. Inset viser Dendra2-emissionen ved 488 nm (top, grøn) og ved 561 nm (bund, rød). Skalabjælke = 10 μm. (D) Kanalfletningsbillede af HTTQ97-D2 med konvertering af hovedområdet. Skalabar = 100 μm. Rubrik repræsenterer den del af hele C. elegans, der er blevet UV-bestrålet. Inset viser Dendra2-emissionen ved 488 nm (top, grøn) og ved 561 nm (bund, rød). Skalabjælke = 10 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Konverteret rød HTT-D2 faldt over tid i enkelte neuroner. Hale neuroner af HTTQ25-D2. To neuroner vises samtidigt og uafhængigt fotokonverteret. Billeder viser tre tidspunkter: (A) Før bestråling (før), (B) umiddelbart efter bestråling (omdannelse) og (C) 2 timer efter bestråling (efter). Toppanel (grøn kanal) repræsenterer HTT-D2-signal indsamlet ved 486-553 nm excitation/emission. Den hvide region af interesse afgrænser de neuroner, der er blevet bestrålet. Det midterste panel (rød kanal) viser det konverterede HTT-D2-signal indsamlet ved 580-740 nm excitation/emission. Det nederste panel er en sammenfletning af de to kanaler. Skalabjælke = 5 μm for alle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Hoved og hale neuroner udstillet forskellige nedbrydning satser. Søjlelinjediagrammer viser procentdelen af rød intensitet i forhold til den oprindelige værdi på konverteringsdyst (dvs. 100 %). Konverteret rødt Dendra2-signal faldt samlet over intervallet på 2 timer, da HTT-D2 blev nedbrudt inden for neuronerne i C. elegans. Inden for nematodens nervesystem udviste neuronale undertyper forskellige nedbrydningshastigheder, hvor haleneneuroner viste en mere aktiv omsætning, men kun i nematoder, der bar en nonpathogen polyglutamin-strækning. (A) Kvantificering af nedbrydningen i HTTQ25-D2 hoved versus hale neuroner. Mean ± SD, uparrede to-tailed Student's t-test. N = 23-28 prøver/nematoder afbildet pr. region, *P < 0,05. (B) Kvantificering af nedbrydning i HTTQ97-D2 hoved versus hale neuroner. Mean ± SD, uparrede to-tailed Student's t-test. N = 23-28 prøver/nematoder afbildet pr. region, ns = ikke-signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: HTTQ97-D2 blev ikke ryddet væsentligt efter 24 timer. Søjlelinjediagrammer viser procentdelen af rød intensitet i forhold til den oprindelige værdi på konverteringsdyst (dvs. 100 %). Konverteret rødt Dendra2 signal faldt, da HTT-D2 blev nedbrudt inden for neuronerne af C. elegans. HTT-D2 udviste forskellige nedbrydningshastigheder. Selv over længere perioder efter omdannelsen kunne patogene HTT-D2 ikke fjernes i forhold til dens sunde kontrol. (A) Kvantificering af nedbrydningshastigheden i HTTQ25-D2 to tid efter omregning (2 timer og 24 timer) hos både hoved- og haleneuroner. Middel ± SD, envejsanalyse af varians (ANOVA). N = 21-28 prøver/nematoder afbildet pr. time/område, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Kvantificering af nedbrydningshastigheden i HTTQ97-D2 to tid efter omdannelse (2 timer og 24 timer) hos både hoved- og haleneuroner. Middel ± SD, envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukey's Multiple Comparison post hoc-test.  N = 21-28 prøver/nematoder afbildet pr. tid/område, ns = ikke-signifikant. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Gamle og unge nematoder, der udtrykker den patogene HTT-D2, forringede det ikke effektivt. Søjlelinjediagrammer viser procentdelen af rød intensitet i forhold til den oprindelige værdi på konverteringsdyst (dvs. 100 %). Konverteret rødt Dendra2 signal faldt som HTT-D2 blev forringet i neuroner. Da nematoden var ældet, blev dens evne til at nedbryde patogen htt-D2 desuden svækket i hele nervesystemet. (A) Kvantificering af nedbrydningshastigheden hos hovedneuroner hos unge (dag 4) og gamle (dag 10) HTTQ25-D2-nematoder sammenlignet med alderssvarende HTTQ97-D2-nematoder. Middel ± SD, envejsanalyse af varians (ANOVA). N = 23-28 prøver/nematoder afbildet pr. stamme/dag, ****P < 0,0001. (B) Nedbrydningshastighed 2 timer efter omdannelse i haleneuroner hos unge (dag 4) og gamle (dag 10) HTTQ25-D2-nematoder sammenlignet med alderssvarende HTTQ97-D2-nematoder. Middel ± SD, envejsanalyse af varians (ANOVA) efterfulgt af Tukey's Multiple Comparison post hoc-test. N = 23-28 prøver/nematoder afbildet pr. stamme/dag, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

For at forstå et proteins funktion er det vigtigt at forstå dets syntese, placering og nedbrydning. Med udviklingen af nye, stabile og lyse FPs, visualisering og overvågning POI'er er blevet lettere og mere effektiv. Genetisk udtrykt fusion PAFPs såsom Dendra2 er unikt positioneret til at studere stabiliteten af en POI. Ved udsættelse for lilla-blåt lys, Dendra2 pauser på et præcist sted inden for en triade af bevarede aminosyrer. Fluorophore gennemgår en lille strukturel ændring, hvilket resulterer i en fuldstændig skift af spektre fra grøn til rød²³. Dette skift giver mulighed for detektering og overvågning af alle IP er knyttet til Dendra2. Faktisk blev disse fusion konstruktioner først brugt til at skabe en C. elegans reporter stamme til at studere ubiquitin-proteasome system in vivo¹⁶. Dendra2 blev også anvendt til at forstå sårbarheden af selektive neuronale undertyper og deres evne til at håndtere ekspanderede polyglutaminproteiner²⁴, eller overvåge induktion af autofagi i modeller af motorneuronsygdom²⁵.

En protokol præsenteres her for at overvåge in vivo nedbrydningen af huntingtin, et sygdomsrelateret aggregeringsudsat protein på en noninvasiv måde. Efter at have genereret en neuronal C. elegans-model af HS, der udtrykker HTT-D2 pan neuronally, blev nedbrydningsraten for udvidet og patogen HTT sammenlignet med dens fysiologiske modstykke kvantificeret. Der blev observeret slående forskelle mellem neuronale undertyper, mellem unge og alderen nematoder, og mellem PN's evne til at håndtere giftige glutaminbelastninger over tid. Denne teknik kan også anvendes til at følge placeringen og bevægelsen af huntingtin samt dens skæbne, når forstyrrelser til PN indføres. siRNA knockdown af centrale chaperoner eller administration af forbindelser, der hæmmer proteasom aktivitet kan afdække funktionen og betydningen af disse komponenter i aggregering-udsatte proteiner: for eksempel, om PN aktiverer specifikke noder for at kompensere for mangler²⁶. Det kan også forklare de skadelige virkninger forårsaget af en sygdom i forhold til dem af normal aldring.

Selv om mange forskellige spørgsmål kan løses ved hjælp af denne teknik, når en ønsket model er blevet genereret, skal der etableres korrekte konverterings- og detektionsparametre for at opnå pålidelige data. Også afgørende er at bestemme konverteringsindstillinger, der giver mulighed for tilstrækkeligt udbytte af aktiveret protein uden photobleaching eller fototoksicitet og uden uønsket konvertering. For hvert undersøgt protein i et specifikt modelsystem, enten ex vivo eller in vivo, er det desuden nødvendigt eksperimentelt at fastsætte en periode, der er tilstrækkelig stor til, at nedbrydningshastigheden kan kvantificeres nøjagtigt.

Dendra2 tilbyder en række fordele i forhold til andre PAFPs: 1) det er monomerisk og meget lyse; 2) det har en høj kontrast fotoomvending og en stabil fotokonverteret signal; 3) det kan aktiveres med lav fototoksicitet af en blå 488 nm laser, som er en del af de fleste konfocy hardware opsætninger; 4) det effektivt modnes ved 37 °C til påføring i pattedyrceller; 5) det har ingen toksiske bivirkninger, når den udtrykkes i længere tid^23,27; og 6) systemet påvirkes ikke af variationer i ekspressionsniveauerne mellem eller inden for en organisme eller celle, da forholdet mellem Dendra2-signalet før og efter omregningen kvantificeres. Alle anførte egenskaber gør Dendra2 til en ideel fluorophore til sporing af proteindynamik i realtid og overvågning af cellesk skæbne.

Desværre lider Dendra2-fusionsproteiner af nogle almindelige begrænsninger i fluorescerende proteinmærkning. Konstruktionen er en kimær art, der ofte eksperimentelt overudtrykt i biologiske systemer, selv om endogene udtryk kunne etableres via genomisk teknik. Nedbrydningshastigheden af Dendra2 selv påvirker muligvis nedbrydningen af målproteinet, selv om det er blevet beskrevet som et meget stabilt, langlivet protein²⁷. Desuden er Dendra2 ikke egnet til at spore proteiner med meget hurtig omsætning, da den måske ikke har tid til sin egen korrekte modning. Endelig, 405 nm lasere, som er ualmindelige, foretrækkes for effektiv photoswitching, selv om de er mere giftige for prøven. Faktisk kan mindre fototoksisk blåt lys udnyttes til både at visualisere grøn Dendra2 og konvertere det, når lasereffekten er ved høj intensitet. Denne særlige funktion bør altid holdes for øje, da langvarig eksponering vil producere uønsket konvertering og potentielt forkerte målinger. Endelig kan det være problematisk at bruge Dendra2 i kombination med grønne eller røde fluorofores. Men, mange forskellige PAFPs er tilgængelige til at undersøge dynamikken i flere proteiner samtidigt.

Forsøg med dendra2 og andre PAFPs har været forbundet med fluorescensgensgenvinding efter fotobleaching (FRAP) og radioaktive puls-chase mærkningsteknikker. I en FRAP-indstilling er det umuligt at skelne proteiner, der igen kommer ind i et investeringsafkast, fra nydannet fluorescerende protein, og konstant overvågning og visualisering af prøven er nødvendig. Med Dendra2 genereres to klart skelnelige populationer, der kan observeres uafhængigt over tid, så den erstattede og nyligt syntetiserede "inaktive" form af grøn Dendra2 kan spores og kvantificeres¹⁶. Dendra2 er også en nyttig sonde i super opløsning mikroskopi såsom total intern refleksion fluorescerende mikroskopi (TIRF)²⁸ og fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM)²⁹. I den nærmeste fremtid sådanne fremskridt vil give mulighed for bedre lokalisering og potentielt enkelt molekyle sporing af enhver POI, gør det muligt at afdække mere subtile forskelle inden for og mellem prøver og i sidste ende giver nye oplysninger om liv og skæbne for enhver POI inden for et biologisk system.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software