Quantificazione in vivo del fatturato proteico nell'invecchiamento C. Elegans utilizzando Dendra2 fotoconvertibile

Summary

Presentato qui è un protocollo per monitorare la degradazione della proteina huntingtina fusa al fluoroforo fotoconvertibile Dendra2.

Abstract

Le proteine sono sintetizzate e degradate costantemente all'interno di una cellula per mantenere l'omeostasi. Essere in grado di monitorare la degradazione di una proteina di interesse è fondamentale per comprendere non solo il suo ciclo di vita, ma anche per scoprire gli squilibri nella rete proteostasi. Questo metodo mostra come monitorare la degradazione della proteina huntingtina che causa la malattia. Due versioni di huntingtina fusa a Dendra2 sono espresse nel sistema nervoso C. elegans: una versione fisiologica o una con un tratto espanso e patogeno di glutammine. Dendra2 è una proteina fluorescente fotoconvertibile; su un breve impulso ultravioletto di irradiazione (UV), Dendra2 commuta i suoi spettri di eccitazione/emissione dal verde al rosso. Simile a un esperimento di pulse-chase, il turnover del red-Dendra2 convertito può essere monitorato e quantificato, indipendentemente dall'interferenza da nuovo sintetizzato verde-Dendra2. Utilizzando la microscopia a base confocale e grazie alla trasparenza ottica di C. elegans,è possibile monitorare e quantificare la degradazione della huntingtina-Dendra2 in un organismo vivente e invecchiato. La huntingtina-Dendra2 neuronale è parzialmente degradata subito dopo la conversione e cancellata ulteriormente nel tempo. I sistemi che controllano la degradazione sono carenti in presenza di huntingtina mutata e sono ulteriormente compromessa dall'invecchiamento. I sottotipi neuronali all'interno dello stesso sistema nervoso presentano diverse capacità di turnover per huntingtina-Dendra2. Nel complesso, il monitoraggio di qualsiasi proteina di interesse fusa in Dendra2 può fornire informazioni importanti non solo sul suo degrado e sugli attori della rete proteostasis coinvolti, ma anche sulla sua posizione, traffico e trasporto.

Introduction

Il proteoma di un organismo vivente si rinnova costantemente. Le proteine sono continuamente degradate e sintetizzate in base alla domanda fisiologica di una cellula. Alcune proteine vengono rapidamente eliminate, mentre altre sono più vissute. Il monitoraggio delle dinamiche delle proteine è un compito più semplice, più accurato e meno invasivo quando si utilizzano proteine fluorescenti geneticamente codificate (FP). Le FP si formano automaticamente e possono essere fuse in qualsiasi proteina di interesse (POI), ma non richiedono enzimi per piegare o hanno bisogno di cofattori risparmiano per^{l'ossigeno 1}. Una nuova generazione di SP è stata recentemente progettata per cambiare colore all'irradiazione con un impulso luminoso di lunghezza d'onda determinata. Questi FP fotoattivabili (PAFP) consentono l'etichettatura e il tracciamento dei POI, o degli organelli o delle cellule in cui risiedono, e di esaminare i loro parametri quantitativi e/o qualitativi². Gli FP consentono di tracciare qualsiasi movimento, direzionalità, tasso di locomozione, coefficiente di diffusione, frazioni mobili o frazioni immobili, il tempo in cui risiede in un vano cellulare, nonché il suo tasso di avvicendamento. Per organelli specifici, è possibile determinare eventi di fissione e fusione. Per un particolare tipo di cella, è possibile stabilire la posizione di una cella, la velocità di divisione, il volume e la forma. Fondamentalmente, l'uso di PAFP consente il monitoraggio senza visualizzazione continua e senza interferenze da qualsiasi sonda appena sintetizzata. Studi sia nelle cellule che in organismi interi hanno impiegato con successo PAFP per affrontare questioni biologiche in vivo, come lo sviluppo di cancro e metastasi, l'assemblaggio o lo smontaggio del citoscheletro e le interazioni RNA-DNA/proteina³. In questo manoscritto, la microscopia leggera e i PAFP sono utilizzati per scoprire i tassi di rotazione della huntingtina proteica incline all'aggregazione (HTT) in vivo in un modello C. elegans della malattia neurodegenerativa.

Il protocollo qui descritto quantifica la stabilità e la degradazione della proteina di fusione huntingtina-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 è un PAFP⁴ monomerico di seconda generazione che cambia irreversibilmente i suoi spettri di emissione/eccitazione dal verde al rosso in risposta ai raggi UV o alla luce blu visibile, con un aumento della sua intensità fino a 4.000-fold^5,6. L'huntingtina è la proteina responsabile della malattia di Huntington (HD), un disturbo neurodegenerativo ereditario fatale. Huntingtina exon-1 contiene un tratto di glutammine (CAG, Q). Quando la proteina è espressa con oltre 39Q, si trasforma male in una proteina mutante, tossica e patogena. Mutant HTT è incline all'aggregazione e porta alla morte e degenerazione delle cellule neuronali, sia come specie oligomeriche corte o come amiloidi altamente strutturati più grandi^{7 .}

Il nematode è un sistema modello per studiare l'invecchiamento e la neurodegenerazione grazie alla sua facilità di manipolazione, natura isogenica, breve durata di vita e la sua trasparenza ottica⁸. Per studiare la stabilità dell'HTT in vivo, un costrutto di fusione è stato espresso nel sistema nervoso di C. elegans. Un transgene HTT-D2 contenente un tratto fisiologico di 25Q (HTTQ25-D2) o un tratto patologico di 97Q (HTTQ97-D2) è sovraespresso pan-neuronalmente per tutta la durata del nematode⁹. Sottoponendo C. elegans dal vivo a un breve e concentrato punto di luce, un singolo neurone viene commutato foto e l'HTT-D2 convertito viene tracciato nel tempo. Per stabilire la quantità di HTT-D2 degradata, la differenza tra il segnale rosso dell'HTT-D2 appena convertito viene confrontata con il segnale rosso rimanente di HTT-D2 dopo un determinato periodo di tempo. Pertanto, diventa possibile studiare come la huntingtina viene degradata quando si trova nella sua forma espansa e tossica rispetto alla sua forma fisiologica; come i neuroni anteriori o posteriori rispondono in modo diverso alla presenza di Q97 rispetto al Q25, specialmente in periodi di tempo prolungati; e come il collasso della rete proteostasi (PN) durante l'invecchiamento contribuisca alle differenze nei tassi di degradazione. Questi risultati descrivono solo una piccola serie di osservazioni sul fatturato di HTT-D2. Tuttavia, molte altre questioni biologiche rilevanti sia per il campo dell'aggregazione proteica che per la proteostasi possono essere affrontate con questa applicazione in vivo.

Protocol

1. Generazione di C. elegans che esprimono proteina di fusione neuronale Huntingtina-Dendra2

1. Clonare il gene che codifica il POI in un vettore di espressione nematode (cioè, pPD95_75, Addgene #1494), con l'enzima di restrizione tradizionale digest¹⁰, Gibson assembly^11,o qualsiasi metodo di scelta. Inserire un promotore per guidare l'espressione in un tessuto desiderato o in una fase di sviluppo desiderata. Inserire il fluoroforo Dendra2 N o C nel telaio con il POI.
2. Generare C. elegan transgenici che esprimano il costrutto di fusione (ad esempio, tramite microiniezione)¹².
   NOTA: Il plasmide che trasporta il transgene rimarrà come un array extracromosomico. L'integrazione del costrutto non è necessaria, ma può essere eseguita se lo si desidera¹³. In questo protocollo, C. elegans sono stati microiniettati con un plasmide che trasporta il costrutto di fusione huntingtina exon 1-Dendra2 (HTT-D2) sotto il controllo del promotore pan-neuronale Prgef-1. La spina dorsale di espressione C. elegans è stata ottenuta da Kreis et al.¹⁴, la huntingtina exon 1 con Q25 o Q97 è stata ottenuta da Juenemann et al.¹⁵, e Dendra2 è stato ottenuto da Hamer et al.¹⁶.

2. Corrispondenza dell'età e manutenzione di C. elegans

1. L'età corrisponde a tutti i nematodi sincronizzandosi con il trattamento della soluzione ipoclotorite alcalina¹⁷ o tramite deposizione delle uova per 4 h a 20 gradi centigradi. Per la deposizione delle uova, mettere 10 adulti gravidi su un supporto di crescita nematode appena seminato (NGM) piastra e lasciare per 4 h prima di rimuovere. Le uova deposte in questo lasso di tempo daranno origine a nematodi sincronizzati.
2. Mantenere sperimentale C. elegans su nematode crescita media (NGM) piastre seminato con la fonte di cibo batterico E. coli OP50, seguendo l'allevamento nematode standard¹⁸.
3. Coltivare nematodi a 20 gradi centigradi fino allo stadio desiderato. Per questo protocollo, le età richieste sono giorni 4 e 10.
   NOTA: I giovani adulti al giorno 4 possono essere identificati dalla presenza di uova nelle loro gonadi e dalla loro elevata mobilità. I nematodi invecchiati 10 sono post-fertili e subiscono il deterioramento dei tessuti e il declino della locomotiva¹⁹.
4. Per i nematodi del giorno 10, passaggio giornaliero dopo la fase L4 al giorno 3, una volta che i nematodi sono fertili, per evitare una popolazione mista.

3. Preparazione di vetrini di microscopia per l'imaging

1. Preparare i vetrini di microscopia il giorno dell'imaging. In un forno a microonde, sciogliere l'agarose di grado generale ad una concentrazione del 3% (w/v) in ddH₂O. Lasciare raffreddare leggermente.
2. Tagliare la punta di una punta di pipetta da 1 mL e aspirare circa 400 lofdi di agarose fuse. Posizionare delicatamente alcune gocce di agarose su uno scivolo di vetro pulito e posizionare immediatamente un altro scivolo sulla parte superiore, assicurandosi che si crei un sottile cuscinetto di agarose tra i due. Lasciare asciugare prima di scivolare delicatamente o sollevare il riscivolo superiore.
3. Posizionare i vetrini del cuscinetto agarose in un contenitore umidificato per evitare che si asciughino. Questi possono essere utilizzati entro 2-3 h.
   NOTA: Evitare la formazione di piccole bolle nell'agarose, in quanto i nematodi possono essere intrappolati all'interno.

4. Definizione dei parametri del microscopio confocale

NOTA: prima di montare i nematodi e l'acquisizione dei dati, definire tutte le impostazioni del software di acquisizione confocale. Le impostazioni possono essere adattate all'hardware di imaging e al software di scelta.

1. Aprire il software confocale e definire le impostazioni di imaging laser. Impostare il percorso della luce per l'eccitazione/emissione per dendra2 verde a 486-553 nm e per il rosso Dendra2 a 580-740 nm. Regolare la potenza e il guadagno di entrambi i canali / laser in base all'intensità del fluoroforo. Non modificare il guadagno digitale o offset e impostare il foro stenopeico come completamente aperto.
2. Definire l'impostazione di acquisizione: selezionare una modalità canale sequenziale e passare alla traccia ogni fotogramma. Impostare la modalità di scansione come frame e la dimensione del fotogramma su 1.024 x 1.024, con un passaggio di linea pari a 1. Impostare la media su 2 e il metodo media per media e la modalità di linea unidirezionale. Impostare la profondità di bit su 8 bit.
3. Definire le impostazioni delle acquisizioni multidimensionali per la conversione di Dendra2. Per la conversione e lo sbiancamento utilizzare il set di laser a diodo da 405 nm al 60% di energia energetica. Se disponibile, attivare il GaAsP sbiancante sicuro per proteggere i rilevatori.
4. Selezionare una serie temporale di due cicli, con un intervallo di 0,0 ms compresi tra e inizio e arresto normali. Iniziare lo sbiancamento dopo la scansione 1 di 2 e ripetere per 30 iterazioni. Smettere di sbiancare quando l'intensità scende al 50%.
5. Definire la velocità di acquisizione/dimora dei pixel in modo rapido (ad es. massimo 12) per la conversione e velocità media (ad es., medio 5) per l'acquisizione di un'immagine snap.
   NOTA: i parametri di sbiancamento qui definiti sono linee guida. Per altri POS con tag Dendra2, le impostazioni di alimentazione laser e le iterazioni e i valori di sbiancamento devono essere stabiliti empiricamente.

5. Montaggio di C. elegans su vetrini di microscopia

NOTA: Se possibile, posizionare uno stereomicroscopio di montaggio vicino alla configurazione del microscopio confocale e montare i nematodi appena prima dell'imaging.

1. Sulla vetrina di copertina in vetro sul lato opposto del pad agarose, disegnare una finestra con quattro quadrati con un pennarello permanente e numerati.
2. Pipette 15 - L di levamisole al centro del pad agarose. La concentrazione di levamisole varia a seconda dell'età del nematode: quando si immagina il giorno 4 nematodi utilizzare 2 mM levamisole; quando il giorno di imaging 10 nematodi utilizzano levamisole 0,5 mM.
3. Trasferire quattro nematodi nel liquido utilizzando un plettro filo. Con l'aiuto di un plettro ciglia, spostare delicatamente ogni singolo nematode in un quadrato della finestra. Girare la ciglia in modo che qualsiasi traccia di E. coli OP50 viene diluita e il suo sfondo fluorescente non interferisce con l'acquisizione del segnale.
4. Attendere che i nematodi smettano quasi di muoversi e posizionare delicatamente uno slip di copertura sopra il liquido per immobilizzare i nematodi nello strato di levamisole tra il pad agarose e lo slip di copertura.
5. Posizionare la diapositiva rovesciata sullo stage confocale per immaginare i nematodi.

6. Conversione di Dendra2 verde: Acquisizione dei dati al momento zero

NOTA: Gli esperimenti di pulse-chase iniziano convertendo in modo irreversibile la proteina di fusione Dendra2 da un fluoroforo verde che emette in uno rosso.

1. Utilizzando l'oculare del microscopio, individuare il primo nematode con un obiettivo 20x sotto fluorescenza verde. Concentrarsi sulla testa o sulla coda e passare alla modalità confocale.
2. Avviare la scansione laser dal vivo con il laser blu 488 nm per visualizzare il verde Dendra2 nel canale verde EGFP (es. Selezionare un singolo neurone e metterlo a fuoco. Ingrandire 3x e aumentare la destinazione del raggio laser⁴.
   NOTA: Selezionare un neurone per nematode. Ogni neurone costituirà un campione o un punto dati.
3. Trovare il piano di proiezione massimo e, in base alla luminosità del fluoroforo, aumentare o diminuire il guadagno o la potenza laser per ottenere un'immagine satura ma non sovraesposta identificabile dall'indicatore della gamma di colori. Una volta definito, interrompere la scansione.
   NOTA: Non irradiare il campione per troppo tempo o con troppa potenza, poiché l'eccitazione con luce blu visibile 488 nm può anche convertire Dendra2, anche se lentamente e meno efficiente⁴.
4. Nel software, aprire la scheda per selezionare le aree di interesse (ROI) e disegnare un primo ROI intorno al neurone selezionato. Definire una seconda regione di interesse più grande che comprende la testa del nematode e compreso il primo ROI.
5. Nelle impostazioni di sbiancamento, selezionare per il primo ROI da acquisire, sbiancare e analizzare. Selezionare per il secondo ROI da acquisire e analizzare ma non sbiancare.
6. Impostare la velocità di scansione al massimo (cioè, abitano pixel veloce) e avviare l'esperimento per convertire i neuroni Dendra2 selezionati.
   NOTA: Una volta che l'esperimento è fatto l'immagine acquisita si tradurrà in due immagini: uno prima e uno dopo la conversione. Per il canale verde, la prima immagine dovrebbe avere un segnale verde più alto che diminuisce nella seconda immagine a causa della conversione del Dendra2 verde. Per il canale rosso, la prima immagine deve essere negativa e non deve mostrare alcun segnale, con un segnale rosso che appare nell'immagine post conversione. Se il segnale verde non diminuisce, la conversione non si è verificata e le impostazioni, come la potenza laser 405 o il numero di iterazioni, devono essere modificate. Se c'è un segnale rosso nella prima immagine, allora la potenza laser a 488 nm utilizzata era troppo alta e una parte del Dendra2 verde era già stata convertita in rosso. In questo caso, dovrebbe essere selezionato un nuovo neurone/nematode.
7. Subito dopo la conversione, avviare la scansione in tempo reale con il laser verde 561 nm per visualizzare Dendra2 nel canale rosso (es. Trovare la messa a fuoco e la rispettiva proiezione massima del neurone convertito utilizzando l'indicatore del colore intervallo per evitare la sovraesposizione.
8. Impostare rapidamente la velocità di scansione su una velocità di abitatura inferiore (ad esempio, 5x) e acquisire un'immagine istantanea di entrambi i canali con una risoluzione più alta. Questa immagine è definita come timepoint zero (T0) dopo la conversione.
   NOTA: la velocità di acquisizione dell'immagine convertita può essere variata. Tuttavia, una volta scelto, questa velocità deve rimanere costante per tutta la raccolta dei dati.
9. Salvare la scansione con un nome e/o un numero identificabili, seguito dall'etichetta zero del tempo (T0).
   NOTA: Si consiglia inoltre di salvare l'immagine dell'esperimento di conversione (passaggio 6.6) per illustrare la mancanza di segnale rosso prima della conversione e il suo aspetto in seguito.

7. Imaging del Dendra2 rosso convertito per l'acquisizione dei dati in un secondo momento selezionato

1. Per monitorare la degradazione di Dendra2 nel tempo, definire un secondo punto temporale per ricreare lo stesso nematode/neurone. Selezionare sperimentalmente il secondo timepoint per affrontare qualsiasi questione biologica pertinente. Per il protocollo descritto qui, Dendra2 è immagine sia a 2 h (T2) e 24 h (T24) post conversione.
   1. Al momento selezionato, trovare lo stesso nematode/neurone con l'uso dell'oculare e della fluorescenza rossa.
   2. Aprire l'immagine T0 del rispettivo nematodo/neurone e ricaricare/riutilizzare le impostazioni dell'immagine. Assicurarsi che le impostazioni di acquisizione dell'istantanea siano esattamente le stesse quando si acquisiscono le immagini T0, T2 e T24 h.
   3. Scansione dal vivo nel canale rosso, portare il neurone rosso convertito a fuoco. Poiché il Dendra2 rosso si degrada nel tempo, l'indicatore di intervallo mostrerà una proiezione massima meno intensa. Non modificare i parametri di acquisizione e ottenere un'istantanea alla stessa velocità (ad esempio, 5x) della prima immagine.
2. Per monitorare la degradazione di Dendra2 dopo 4 ore o più, salvare i nematodi dopo la conversione.
   1. Rimuovere il vetrino dal microscopio subito dopo la conversione e l'imaging dei quattro nematodi. Rimuovere delicatamente il coperchio e con l'uso di un plettro di filo, sollevare ogni nematode dal pad agarose.
   2. Posizionare ogni nematode singolarmente su una piastra NGM opportunamente etichettata e identificabile.
   3. Per il secondo punto, montare nuovamente il nematode su un pad agarose fresco e procedere con l'imaging del Dendra2 rosso convertito seguendo le istruzioni nella sezione 6.

8. Analisi dell'immagine di Dendra2 convertito

NOTA: l'analisi della degradazione di Dendra2 viene eseguita con il software Fiji/ImageJ²⁰.

1. Aprire Figi e trascinare il file .lsm nella barra Fiji. Aprire l'immagine T0 scattata subito dopo la conversione e l'immagine dello stesso nematode scattata nel momento selezionato dopo la conversione (T2 o T24 h).
   NOTA: Per monitorare la degradazione della proteina di interesse fusa in Dendra2 solo il canale rosso deve essere analizzato.
2. Stabilire i parametri di misurazione dal menu: Analizzare Imposta misure. Selezionare le funzioni Area e Densità integrata.
3. Selezionare l'immagine ottenuta con il canale rosso. Selezionate lo strumento selezione poligono dalla barra Figi.
4. Identificare il neurone convertito sull'immagine T0 e disegnare un ROI intorno ad esso utilizzando lo strumento di selezione.
   1. Per identificare correttamente i contorni del neurone, evidenziare le soglie di intensità selezionando dalla barra Immagine Proprietà Adjust (Regolare) Soglia. Trascinare il cursore a barre per delineare la soglia e tracciare intorno all'area con lo strumento poligono. Per generare un ROI accurato, è anche possibile utilizzare il contorno del neurone selezionato dal canale verde.
5. Una volta effettuata la selezione nella finestra del canale rosso, premere Analizza Misurare. Verrà visualizzata una finestra popup denominata Risultati che includerà i valori ROI per Area, IntDene RawIntDen.
6. Eseguire lo stesso processo di selezione e misurazione per l'immagine del secondo punto temporale (T2 o T24 h).
7. Copiare i valori ottenuti in un software per fogli di calcolo, facendo attenzione a registrare in modo appropriato i valori in T0 dopo la conversione e in T2 o T24 h dopo la conversione.

9. Calcolo del rapporto di degradazione di Dendra2

1. Per calcolare il rapporto di degradazione, assegnare prima un valore di 1 (o 100%) volta la degradazione dal punto zero del tempo (cioè subito dopo la conversione, quando tutto il Rosso Dendra2 convertito è ancora presente). Ciò deriva dalla divisione del valore di IntRawDen di T0 per se stesso.
2. Per calcolare la riduzione del segnale di intensità Dendra2 rosso nel tempo e la degradazione, dividere il valore di RawIntDen del secondo punto temporale (ad esempio, T2 o T24 h) per il valore di RawIntDen di T0. Il numero risultante deve essere minore di 1. Questi valori possono anche essere espressi come percentuali, definendo T0 come 100%.
3. Ripetere la sezione 7 per ogni nematodo convertito. Per una rappresentazione grafica della degradazione di Dendra2, rappresentare graficamente un grafico a dispersione o a barre con i valori percentuali o di rapporto della diminuzione della fluorescenza ottenuti nell'asse y. Applicare qualsiasi analisi statistica desiderata e illustrarla sul grafico.

Representative Results

Due ceppi di nematodi che esprimono il frammento di proteina huntingtina esoneso-1 nel telaio con la proteina fotoconvertibile Dendra2 sono stati ottenuti tramite microiniezione e i plasmidi sono stati mantenuti come un array extracromosomico. Il costrutto di fusione è stato espresso in tutto il sistema nervoso C. elegans dallo sviluppo durante l'invecchiamento. In questo caso, hTT-D2 conteneva il tratto fisiologico di 25 poliglutamine (HTTQ25-D2, Figura 1A) o una ripetizione completamente penetrante e patogena con 97 glutammine (HTTQ97-D2, Figura 1B). Inizialmente la proteina di fusione è stata testata per assicurarsi che sia cambiata dal suo spettro verde al suo spettro rosso dopo l'irradiazione UV. L'HTT-D2 è passato con successo dal verde al rosso esclusivamente all'interno della regione illuminata. Secondo la potenza e le iterazioni dell'impulso UV, e a seconda del piano z e della penetrazione del raggio laser attraverso la cuticola del nematode, una porzione definita di HTT-D2 è stata convertita, ma non tutti. Un segnale rosso apparve all'interno dei neuroni fotoconvertiti, colocalizzando con il verde non convertito HTT-D2(Figura 1C,D). Grazie alla precisione dei fasci fotoni a scansione laser è stato possibile convertire un ROI preciso corrispondente a un singolo neurone. Prima della conversione, nessun segnale rosso era visibile quando il campione era eccitato nel canale rosso (Figura 2A). All'irradiazione UV, il segnale verde è diminuito quando l'HTT-D2 è stato convertito e un segnale rosso è finalmente apparso (Figura 2B). L'HTT-D2 è stato poi degradato nel tempo, con conseguente riduzione dei livelli di HTT-D2 rosso (Figura 2C) e un possibile aumento del segnale verde HTT-D2, come più proteina di fusione è stato appena sintetizzato. Poiché una diminuzione significativa era già prominente a 2 h dopo la conversione, questo intervallo per rilevare e quantificare la degradazione di HTT-D2 è stato mantenuto. È importante notare che la degradazione non è l'unico processo che può verificarsi dopo la conversione di HTT-D2. L'HTT-D2 convertito potrebbe essere trafficato e trasportato lungo gli assoni, con conseguente diminuzione del segnale rosso non a causa della distanza. Tuttavia, con le impostazioni impiegate qui e nel breve lasso di tempo di 2 h, non è stata osservata alcuna diffusione del segnale rosso, probabilmente a causa del fatto che poco HTT-D2 è stato spostato dal soma all'assone. Inoltre, la conversione e l'imaging di un singolo soma neuronale intero ha contribuito ad escludere gli effetti della diffusione dell'HTT-D2 all'interno dello stesso neurone, perché tutti i compartimenti cellulari venivano analizzati simultaneamente. Per studiare sia la diffusione che il trasporto/traffico è consigliabile ottenere immagini di ingrandimento più veloci e più elevate e tracciare una frazione più piccola e possibilmente più motile della proteina di interesse. È anche importante notare che all'interno di una serie di esperimenti, ogni animale rappresentava una ripetizione biologica. È stato immaginato un solo neurone per nematode, ogni animale è stato immaginato una volta per sessione e l'imaging si è verificato in tre sessioni, che costituivano ripetizioni tecniche. Le tre sessioni hanno richiesto che gli animali siano sincronizzati su piastre fresche prima di ogni esperimento il giorno 4 o il giorno 10, consentendo qualsiasi variabilità ambientale è imposta sui nematodi. Tre sessioni tengono conto anche dell'eventualità derivante dall'installazione dell'imaging (ad esempio, la potenza del laser varia a causa di una diversa temperatura tra gli esperimenti). Tutte le repliche biologiche ottenute durante le tre sessioni (un minimo di 20 animali) sono state considerate campioni individuali e utilizzati per stabilire una significatività statistica.

Dopo aver confermato che entrambi i ceppi C. elegans HTT-D2 erano efficaci e aver stabilito i parametri di conversione ottimali, sono state studiate le differenze tra il turnover di una proteina HTT-D2 che causa la malattia (cioè HTTQ97-D2) rispetto al suo controllo fisiologicamente rilevante (HTTQ25-D2). In primo luogo, è stata osservata la degradazione di HTT-D2 in diversi neuroni (Figura 3). È noto che i sottotipi di neuroni all'interno del sistema nervoso del nematode variano nella loro attività metabolica e morfologia²¹, possibilmente facendo la differenza nella degradazione e nel ribilanciamento del proteoma. I neuroni della regione di coda sono stati confrontati con quelli della testa e si sono trovati significativamente più attivi (Figura 3A). Questa scoperta era valida solo per HTTQ25-D2 e non per patogeni HTTQ97-D2, suggerendo che il PN non era in grado di rimuovere l'HTT-D2 contenente si estende più lungo glutammina in tutto il sistema nervoso (Figura 3B).

Per confermare ulteriormente che il sistema modello si è comportato come previsto, gli esperimenti di conversione sono stati eseguiti per un periodo più lungo, consentendo ai percorsi di degradazione delle cellule di eliminare quasi completamente la proteina di interesse (Figura 4). Infatti, c'era significativamente più degradazione del controllo HTTQ25-D2 24 h dopo la conversione che dopo 2 h nei neuroni della testa, e ampiamente più nei neuroni della coda (Figura 4A). Ancora una volta, i neuroni della coda posteriore hanno rimosso più attivamente l'HTT-D2 rosso, anche in un aumento del tempo. Una tendenza simile è stata rilevata per la malattia-causante HTTQ97-D2, con una leggera riduzione del segnale rosso HTT-D2 oltre 24 h. Tuttavia, HTTQ97-D2 non è stato rimosso così prontamente come HTTQ25-D2, soprattutto dopo 24 h. Può darsi che solo la solubile frazione HTTQ97-D2 sia degradata in modo efficiente, tenendo conto della diminuzione iniziale del segnale rosso e della sua ulteriore lieve diminuzione nel tempo. È importante sottolineare che c'erano due popolazioni di neuroni dopo 24 h: una con un tasso di degradazione più alto e una in cui il segnale rosso HTT-D2 non è stato affatto degradato, o potenzialmente addirittura aumentato (Figura 4B). Il segnale aumentato e stabile rappresenta forse specie già aggregate o continuamente aggregate che erano sostanzialmente più difficili da cancellare dalle cellule a causa della loro natura amiloide strettamente imballata. Queste inclusioni, presenti esclusivamente quando i tratti di glutammina hanno superato la soglia di 40 ripetizioni, e che sono apparse microscopicamente come foci, sono state ipotizzate per accumularsi come depositi che non possono essere facilmente rimossi²². È anche possibile che un aumento del segnale fluorescente rosso sia stato un artefatto derivante da problemi tecnici (ad esempio, l'uso di parametri di acquisizione errati, prestazioni sub-par della configurazione della microscopia o un processo di recupero/montaggio errato). Quando si acquisiscono immagini per lunghi periodi di tempo, queste variabili devono essere prese in considerazione.

Infine, poiché i disturbi neurodegenerativi come la MH si manifestano nella vita adulta, è stato osservato l'effetto dell'invecchiamento sul tasso di degradazione dell'HTT-D2. Sono stati eseguiti esperimenti di conversione nelle regioni di testa e di coda dei nematodi giovani (giorno 4) e vecchi (giorno 10) in entrambi i ceppi HTT-D2 (Figura 5). Per i neuroni della testa, non c'è stato alcun cambiamento significativo nel tasso di degradazione a causa dell'invecchiamento nell'età di HTTQ25-D2 e HTTQ97-D2, probabilmente perché HTT-D2 è stato rimosso ugualmente per tutta la vita di ogni nematode. Tuttavia, è stato registrato un cambiamento molto significativo quando si confrontano vecchi nematodi contenenti un tratto di glutammina patologica o fisiologica. L'HTTQ97-D2 non è stato degradato in modo efficiente come HTTQ25-D2, evidenziando l'incapacità del PN di rimuovere le specie aggregate e possibilmente tossiche di huntingtina nei nematodi più vecchi (Figura 5A). Ancora una volta, è stato osservato un ricambio più attivo e significativo nei neuroni della coda. Come nei neuroni della testa, un ricambio più robusto di HTTQ25-D2 non è stato osservato nei neuroni della coda dei giovani nematodi rispetto alla coorte più vecchia, e la degradazione era uguale al giorno 4 e al giorno 10. Al contrario, cambiamenti significativi nei tassi di degradazione tra il controllo e i ceppi patogeni HTT-D2 sono apparsi nei nematodi del giorno 4, diventando ancora più significativi al giorno 10. È importante sottolineare che i neuroni della coda sono stati in grado di far fronte all'HTTQ97-D2 tossico nei giovani nematodi, il che indica che vari meccanismi PN concomitanti potrebbero essere al lavoro per rimuovere HTT-D2 (Figura 5B). Nel complesso, l'attività PN è diminuita nel tempo, probabilmente a causa degli effetti dannosi causati sia dall'invecchiamento che dalla presenza di aggregati.

Figura 1: C. elegans espresso huntingtina eson-1 fuso a Dendra2 nel sistema nervoso. (A) Giovane, giorno 4 C. elegans pan-neuronalmente esprimendo huntingtina esul-1 contenente 25 glutammine, fuso a Dendra2 nel suo stato di eccitazione/emissione verde non convertito. Barra della scala: 100 m. Gli inset mostrano un'immagine ingrandita della testa (in alto) e dei neuroni della coda (in basso). Barra della scala incassata - 10 m. (B) Giovane, giorno 4 C. elegans pan-neuronalmente esprimendo huntingtina eson-1 contenente 97 glutammine, fusa a Dendra2 nel suo stato di eccitazione/emissione verde non convertito. Barra di scala: 100 m. Gli inset mostrano un'immagine ingrandita della coda (in alto) e della testa (in basso) neuroni, e la testa di un giorno 7 nematode (all'estrema destra). Barra della scala inimpostata: 10 xm. Le punte di freccia bianche indicano i foci HTTQ97-D2, raffiguranti aggregati huntingtina. (C) Immagine di unione canale di HTTQ25-D2 con la conversione della regione di testa. Box rappresenta la porzione di tutti i C. elegan che è stato irradiato UV. Barra di scala: 100 m. Inset mostra l'emissione di Dendra2 a 488 nm (superiore, verde) e a 561 nm (in basso, rosso). Barra della scala : 10 m.(D) Immagine di unione del canale HTTQ97-D2 con conversione della regione di testa. Barra della scala - 100 m. Box rappresenta la porzione di tutto il C. elegans che è stato irradiato UV. Inset mostra l'emissione Dendra2 a 488 nm (superiore, verde) e il valore a 561 nm (inferiore, rosso). Barra di scala : 10 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: HTT-D2 rosso convertito diminuito nel tempo in singoli neuroni. Neuroni della coda di HTTQ25-D2. Due neuroni sono mostrati contemporaneamente e in modo indipendente fotoconvertito. Le immagini rappresentano in sequenza tre punti temporali: (A) Prima dell'irradiazione (prima), (B) immediatamente dopo l'irradiazione (conversione) e (C) 2 h dopo l'irradiazione (dopo). Il pannello superiore (canale verde) rappresenta il segnale HTT-D2 raccolto a 486-553 nm eccitazione/emissione. La regione bianca di interesse delimita i neuroni che sono stati irradiati. Il pannello centrale (canale rosso) mostra il segnale HTT-D2 convertito raccolto a 580-740 nm eccitazione/emissione. Il pannello inferiore è un'unione dei due canali. Barra della scala: 5 m per tutte le immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: I neuroni della testa e della coda hanno mostrato diversi tassi di degradazione. I grafici a barre delle colonne mostrano la percentuale di intensità rossa rispetto al valore iniziale al momento della conversione (ad esempio, 100%). Il segnale Dendra2 rosso convertito è diminuito complessivamente nell'intervallo di 2 h quando HTT-D2 è stato degradato all'interno dei neuroni di C. elegans. All'interno del sistema nervoso del sistema nervoso i sottotipi neuronali mostravano diversi tassi di degradazione, con i neuroni della coda che mostravano un turnover più attivo, ma solo nei nematodi che trasportavano un tratto di poliglutamina non patogeno. (A) Quantificazione della degradazione nella testa HTTQ25-D2 rispetto ai neuroni della coda. Media : SD, test t dello studente a due code non accoppiato. N - 23-28 campioni/nematodi immagine per regione, P < 0,05. (B) Quantificazione della degradazione nella testa HTTQ97-D2 rispetto ai neuroni della coda. Media : SD, test t dello studente a due code non accoppiato. N - 23-28 campioni/nematodi immagine per regione, ns - non-significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: HTTQ97-D2 non è stato eliminato in modo significativo dopo 24 h. I grafici a barre delle colonne mostrano la percentuale di intensità rossa rispetto al valore iniziale al momento della conversione (ad esempio, 100%). Il segnale Dendra2 rosso convertito è diminuito come HTT-D2 è stato degradato all'interno dei neuroni di C. elegans. HTT-D2 ha mostrato diversi tassi di degradazione. Anche per periodi di tempo più lunghi dopo la conversione, l'HTT-D2 patogeno non poteva essere rimosso rispetto al suo controllo sano. (A) Quantificazione del tasso di degradazione nell'HTTQ25-D2 in due punti temporali dopo la conversione (2 h e 24 h) sia nei neuroni della testa che in quella della coda. Media : SD, analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). N - 21-28 campioni/nematodi immagine per ora/area, P < 0,05, p < 0.0001. (B) Quantificazione del tasso di degradazione nell'HTTQ97-D2 in due punti temporali dopo la conversione (2 h e 24 h) sia nei neuroni della testa che in quella della coda. Media : SD, analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di confronto multiplo di Tukey.  N - 21-28 campioni/nematodi immagine per tempo/regione, ns - non significativo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: I nematodi vecchi e giovani che esprimono il patogeno HTT-D2 non lo degradano in modo efficiente. I grafici a barre delle colonne mostrano la percentuale di intensità rossa rispetto al valore iniziale al momento della conversione (ad esempio, 100%). Il segnale Dendra2 rosso convertito è diminuito come HTT-D2 è stato degradato all'interno dei neuroni. Come il nematode invecchiato, la sua capacità di degradare patogeno HTT-D2 è stato ulteriormente alterato in tutto il suo sistema nervoso. (A) Quantificazione del tasso di degradazione dei neuroni testa dei neonati giovani (giorno 4) e di vecchi (giorno 10) HTTQ25-D2 rispetto ai nematodi HTTQ97-D2 corrispondenti all'età. Media : SD, analisi unidirezionale della varianza (ANOVA). N : 23-28 campioni/nematodi immagine per deformazione/giorno, p < 0.0001. (B) Tasso di degradazione 2 h dopo la conversione nei neuroni della coda dei neonati giovani (giorno 4) e vecchi (giorno 10) HTTQ25-D2, rispetto ai nematodi HTTQ97-D2 corrispondenti all'età. Media : SD, analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) seguita dal test post hoc di confronto multiplo di Tukey. N - 23-28 campioni/nematodi immagine per deformazione al giorno, P < 0,05, P < 0,001, p < 0,001, p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Per comprendere la funzione di una proteina è importante comprenderne la sintesi, la posizione e la degradazione. Con lo sviluppo di FP nuovi, stabili e luminosi, la visualizzazione e il monitoraggio dei POI sono diventati più facili ed efficienti. I PAFP di fusione geneticamente espressi come Dendra2 sono posizionati in modo univoco per studiare la stabilità di un POI. Dopo l'esposizione alla luce viola-blu, Dendra2 si rompe in una posizione precisa all'interno di una triade di aminoacidi conservati. Il fluoroforo subisce un piccolo cambiamento strutturale, con conseguente spostamento completo degli spettri dal verde al rosso²³. Questo cambiamento consente il rilevamento e il monitoraggio di qualsiasi POI collegato a Dendra2. Infatti, questi costrutti di fusione sono stati utilizzati per creare un ceppo di reporter C. elegans per studiare il sistema ubiquitina-proteasome in vivo¹⁶. Dendra2 è stato anche impiegato per comprendere la vulnerabilità dei sottotipi neuronali selettivi e la loro capacità di trattare con le proteine della poliglutamina espansa²⁴, o monitorare l'induzione dell'autofagia nei modelli di malattia del motoneurone²⁵.

Un protocollo è presentato qui per monitorare in vivo la degradazione della huntingtina, una proteina soggetta ad aggregazione correlata alla malattia in modo non invasivo. Dopo aver generato con successo un modello neuronale C. elegans della MH, esprimendo HTT-D2 pan-neuronalmente, sono stati quantificati i tassi di degradazione dell'HTT espanso e patogeno rispetto alla sua controparte fisiologica. Sono state osservate notevoli differenze tra i sottotipi neuronali, tra i nematodi giovani e quelli invecchiati, e tra la capacità del PN di affrontare i carichi tossici di glutammina nel tempo. Questa tecnica può anche essere applicata per seguire la posizione e il movimento della huntingtina così come il suo destino quando vengono introdotte le perturbazioni al PN. l'abbattimento di siRNA di chaperones chiave o la somministrazione di composti che inibiscono l'attività proteasosopuò possono scoprire la funzione e l'importanza di questi componenti nelle proteine soggette ad aggregazione: ad esempio, se il PN attiva nodi specifici per compensare le carenze²⁶. Può anche spiegare gli effetti dannosi causati da una malattia rispetto a quelli di invecchiamento normale.

Anche se molte domande diverse possono essere affrontate utilizzando questa tecnica, una volta generato un modello desiderato, è necessario stabilire i parametri di conversione e rilevamento corretti per ottenere dati affidabili. Fondamentale è anche determinare le impostazioni di conversione che consentono una resa sufficiente delle proteine attivate senza fotosbiancamento o fototossicità e senza conversione indesiderata. Inoltre, per ogni proteina studiata all'interno di un sistema modello specifico, ex vivo o in vivo, è necessario stabilire sperimentalmente un periodo di tempo sufficientemente grande da consentire una quantificazione accurata del tasso di degradazione.

Dendra2 offre una serie di vantaggi rispetto ad altri PAFP: 1) è monomerico e molto luminoso; 2) ha una fotoconversione ad alto contrasto e un segnale fotoconvertito stabile; 3) può essere attivato con bassa fototossicità da un laser blu da 488 nm, che fa parte della maggior parte delle configurazioni hardware confocali; 4) matura in modo efficiente a 37 gradi centigradi per l'applicazione nelle cellule dei mammiferi; 5) non ha effetti collaterali tossici se espresso per lunghi periodi di tempo^23,27; e 6) il sistema non è influenzato da variazioni nei livelli di espressione tra o all'interno di un organismo o di una cellula, in quanto viene quantificato solo il rapporto del segnale Dendra2 prima e dopo la conversione. Tutte le proprietà elencate rendono Dendra2 un fluoroforo ideale per tracciare le dinamiche proteiche in tempo reale e monitorare il destino delle cellule.

Sfortunatamente, le proteine di fusione Dendra2 soffrono di alcune limitazioni comuni dell'etichettatura delle proteine fluorescenti. Il costrutto è una specie chimerica spesso sovraespressa sperimentalmente nei sistemi biologici, anche se l'espressione endogena potrebbe essere stabilita tramite l'ingegneria genomica. Il tasso di degradazione di Dendra2 stesso influenza potenzialmente la degradazione della proteina bersaglio, anche se è stata descritta come una proteina altamente stabile e longeva²⁷. Inoltre, Dendra2 non è adatto a tracciare le proteine con fatturati molto veloci in quanto potrebbe non avere il tempo per la propria corretta maturazione. Infine, i laser da 405 nm, che non sono comuni, sono preferiti per una foto-switch efficiente, anche se sono più tossici per il campione. Infatti, meno luce blu fototoelettrica può essere utilizzato sia per visualizzare verde Dendra2 e convertirlo quando la potenza del laser è ad alta intensità. Questa particolare caratteristica deve sempre essere tenuta a mente, in quanto l'esposizione prolungata produrrà conversioni indesiderate e misurazioni potenzialmente errate. Infine, può essere problematico utilizzare Dendra2 in combinazione con fluorofori verdi o rossi. Tuttavia, molti PaFP diversi sono disponibili per studiare la dinamica di diverse proteine contemporaneamente.

Gli esperimenti che utilizzano Dendra2 e altri PAFP sono stati collegati al recupero della fluorescenza dopo il fotosbleaching (FRAP) e alle tecniche di etichettatura radioattiva dell'incarico degli impulsi. In un contesto FRAP è impossibile distinguere le proteine che rientrano in un ROI dalla proteina fluorescente appena costituita, ed è necessario un monitoraggio e una visualizzazione costanti del campione. Con Dendra2, vengono generate due popolazioni chiaramente distinguibili che possono essere osservate in modo indipendente nel tempo in modo che la forma "inattiva" sostituita e di nuova sintesi di Dendra2 verde possa essere tracciata e quantificata¹⁶. Dendra2 è anche una sonda utile nella microscopia super-risoluzione come la microscopia fluorescente a riflessione interna totale (TIRF)²⁸ e la microscopia di localizzazione fotoattiva (PALM)²⁹. Nel prossimo futuro tali progressi consentiranno una migliore localizzazione e il monitoraggio potenzialmente di singole molecole di qualsiasi POI, consentendo di scoprire differenze più sottili all'interno e tra i campioni e, in ultima analisi, di produrre nuove informazioni sulla vita e sul destino di qualsiasi POI all'interno di un sistema biologico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-Agar Kobe I	Carl Roth GmbH + Co. KG	5210.2	NGM component
Agarose, Universal Grade	Bio & Sell GmbH	BS20.46.500	Mounting slide component
BD Bacto Peptone	BD-Bionsciences	211677	NGM component
Deckgläser-18x18mm	Carl Roth GmbH + Co. KG	0657.2	Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27	Carl Zeiss AG		Objective
Fiji/ImageJ 1.52p	NIH		Analysis Software
Levamisole Hydrochloride	AppliChem GmbH	A4341	Anesthetic
LSM710-ConfoCor3	Carl Zeiss AG		Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope	Leica Camera AG		Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2	this paper		C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2	this paper		C. elegans strain
OP50 Escherichia coli	CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC)	OP50	Nematode food source
Sodium Chloride	Carl Roth GmbH + Co. KG	3957.2	NGM component
Standard-Objektträger	Carl Roth GmbH + Co. KG	0656.1	Glass slides
ZEN2010 B SP1	Carl Zeiss AG		Confocal acquisition software