Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma C. Elegans Protein Ciro Vivo Quantification

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

Burada fotoconvertible florofor Dendra2 erimiş protein huntingtin bozulmasını izlemek için bir protokol sunulmaktadır.

Abstract

Proteinler homeostazkorumak için bir hücre içinde sürekli olarak sentezlenir ve bozulur. İlgi çekici bir proteinin bozulmasını izleyebilmek sadece yaşam döngüsünü değil, aynı zamanda proteostaz ağındaki dengesizlikleri ortaya çıkarmak için de önemlidir. Bu yöntem, hastalığa neden olan protein huntingtin bozulmasıizlemek için nasıl gösterir. Dendra2'ye erimiş huntingtin'in iki versiyonu C. elegans sinir sisteminde ifade edilir: fizyolojik bir versiyonu veya glutaminlerin genişletilmiş ve patojenik uzantısı olan bir versiyonu. Dendra2 fotoconvertible floresan proteindir; kısa bir ultraviyole (UV) ışınlama darbesi üzerine, Dendra2 uyarma / emisyon spektrumları yeşilden kırmızıya değiştirir. Bir darbe-kovalamaca deneybenzer, dönüştürülmüş kırmızı-Dendra2 cirosu izlenebilir ve ölçülebilir, ne olursa olsun yeni sentezlenen yeşil-Dendra2 gelen girişim. Konfokal tabanlı mikroskopi ve C. elegansoptik şeffaflık nedeniyle kullanarak, bir canlı, yaşlanan organizmada huntingtin-Dendra2 bozulmasını izlemek ve ölçmek mümkündür. Nöronal huntingtin-Dendra2 dönüşümden kısa bir süre sonra kısmen bozulur ve zamanla daha da temizlenir. Bozulmayı kontrol eden sistemler mutant huntingtin varlığında eksiktir ve yaşlanma ile daha da bozulur. Aynı sinir sistemi içinde nöronal alt tiphuntingtin-Dendra2 için farklı ciro kapasiteleri sergiler. Genel olarak, Dendra2'ye kaynaşmış herhangi bir ilgi proteininin izlenmesi, sadece bozulması ve ilgili proteostasis ağının oyuncuları hakkında değil, aynı zamanda konumu, ticareti ve ulaşımı hakkında da önemli bilgiler sağlayabilir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Yaşayan bir organizmanın proteomu sürekli kendini yeniliyor. Proteinler bir hücrenin fizyolojik talebine göre sürekli olarak bozulur ve sentezlenir. Bazı proteinler hızla ortadan kaldırılırken, diğerleri daha uzun ömürlüdür. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler (LP)'ler kullanılırken protein dinamiklerinin izlenmesi daha basit, daha doğru ve daha az invaziv bir görevdir. FP'ler otokatalitik olarak oluşur ve herhangi bir ilgi proteinine (POI) kaynaşabilir, ancak enzimlerin katlanabilir veya oksijen1için tasarruf kofaktöre ihtiyaç duymasını gerektirmez. Yeni nesil LP'ler, belirlenen dalga boyundaki bir ışık darbesi ile ışınlama üzerine renk değiştirmek üzere tasarlandı. Bu fotoaktibl FP'ler (PAPC'ler) İçN'lerin veya içinde oturdukları organellerin veya hücrelerin etiketlemesine ve izlenmesine ve nicel ve/veya nitel parametrelerini incelemelerine olanak sağlar2. FP'ler, herhangi bir POI'nin hareketini, yönünü, hareket oranını, difüzyon katsayısını, mobil ve hareketsiz fraksiyonları, tek bir hücresel bölmede bulunduğu zamanı ve ciro oranını izlemeyi mümkün kılar. Belirli organeller için, hareket ve taşıma, ya da fizyon ve füzyon olayları belirlenebilir. Belirli bir hücre türü için, bir hücrenin konumu, bölme hızı, hacim ve şekil belirlenebilir. En önemlisi, PAAP'lerin kullanımı sürekli görselleştirme olmadan ve yeni sentezlenmiş herhangi bir sondanın müdahalesi olmadan izleme sağlar. Hem hücrelerde hem de bütün organizmalarda yapılan çalışmalar, kanser ve metastaz, sitoiskeletin montajı veya ayrışması ve RNA-DNA/protein etkileşimleri gibi biyolojik soruları vivo olarak ele almak için PADP'leri başarıyla istihdam etti3. Bu yazıda, ışık mikroskobu ve PAPC'ler nörodejeneratif hastalığın C. elegans modelinde in vivo in agregasyona eğilimli protein huntingtinin (HTT) ciro oranlarını ortaya çıkarmak için kullanılır.

Burada açıklanan protokol, huntingtin-Dendra2 (HTT-D2) füzyon proteininin stabilitesini ve bozulmasını ölçer. Dendra2 ikinci nesil monomerik PAFP4 geri dönülmez ya UV veya görünür mavi ışık yanıt olarak yeşil den kırmızı emisyon / uyarma spektrumları anahtarları, kadar yoğunluğunda bir artış ile 4,000 kat5,6. Huntingtin Huntington hastalığı (HD), ölümcül bir kalıtsal nörodejeneratif bozukluk neden sorumlu proteindir. Huntingtin exon-1 glutaminler (CAG, Q) bir streç içerir. Protein 39Q üzerinde ifade edildiğinde, bir mutant içine yanlış, toksik, ve patojenik protein. Mutant HTT toplama yatkındır ve nöronal hücre ölümü ve dejenerasyona yol açar, ya kısa oligomerik türler olarak ya da daha büyük yüksek yapılandırılmış amiloidler7.

Nematod manipülasyon kolaylığı sayesinde yaşlanma ve nörodejenerasyon eğitimi için bir model sistemidir, izojenik doğa, kısa ömrü, ve optik şeffaflık8. In vivo HTT stabilitesini incelemek için, bir füzyon yapısı C. eleganssinir sisteminde ifade edildi. 25Qs (HTTQ25-D2) fizyolojik bir streç veya 97Qs (HTTQ97-D2) patolojik bir streç içeren bir HTT-D2 transgene nematod ömrü boyunca pan-nöronsal aşırı ifade edilir9. Canlı C. eleganları kısa ve odaklanmış bir ışık noktasına tabi tutarak, tek bir nöron fotoşunla çevrilir ve dönüştürülmüş HTT-D2 zaman içinde izlenir. Bozulmuş HTT-D2 miktarını belirlemek için, yeni dönüştürülmüş HTT-D2'nin kırmızı sinyali arasındaki fark, belirlenen bir süre sonra HTT-D2'nin kalan kırmızı sinyaliile karşılaştırılır. Bu nedenle, huntingtin fizyolojik formuna göre genişletilmiş ve toksik formunda bulunduğunda nasıl bozulduğunu araştırmak mümkün olur; anterior veya posterior nöronlar Q97 karşı Q25 varlığına farklı tepki nasıl, özellikle uzun sürelerde; ve yaşlanma sırasında proteostasis ağının (PN) çöküşünün bozulma oranlarındaki farklılıklara nasıl katkıda olduğu. Bu sonuçlar sadece HTT-D2'nin cirosu üzerine küçük bir gözlem kümesini açıklar. Ancak, protein toplama ve proteostaz alanı ile ilgili daha birçok biyolojik sorular bu in vivo uygulama ile ele alınabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Nöronal Huntingtin-Dendra2 füzyon proteinini ifade eden C. eleganların nesli

  1. Bir nematod ekspresyonu vektör (yani, pPD95_75, Addgene #1494), geleneksel restriksiyon enzim sindirimi10, Gibson montaj11, ya da seçim herhangi bir yöntem tarafından POI kodlama gen klon. İstenilen dokuda veya istenilen gelişim aşamasında ifade yi yönlendirmek için bir organizatör yerleştirin. Dendra2 florofor'u N- veya C-terminalolarak İçN ile çerçeveye yerleştirin.
  2. Füzyon yapısını ifade eden transgenik C elegans üretin (örn. mikroenjeksiyon yoluyla)12.
    NOT: Transgeni taşıyan plazmid ekkromozomal bir dizi olarak kalacaktır. Yapının entegrasyonu gerekli değildir, ancak istenirse yapılabilir13. Bu protokolde, C. elegans pan-nöronal promotör Prgef-1kontrolü altında füzyon yapı huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) taşıyan bir plazmid ile mikroenjekte edildi. C. elegans ekspresyonu omurgası Kreis ve ark.14'ten, Q25 veya Q97 ile huntingtin exon 1'den, Dendra2 ise 15 juenemann ve ark.15'ten,Dendra2 ise Hamer ve ark.16'danelde edilip edinildi.

2. Yaş eşleştirme ve C. elegans bakım

  1. Yaş, alkalin hipoklorit çözeltisi tedavisi17 ile veya 20 °C'de 4 saat boyunca yumurtlayarak tüm nematodlarla eşleşir. Yumurta döşeme için, taze tohumlu nematod büyüme medya (NGM) plaka üzerine 10 gravid yetişkin yerleştirin ve çıkarmadan önce 4 saat bırakın. Bu zaman açıklığı nda yatırılan yumurtalar senkronize nematodlara yol açacaktır.
  2. Nematod büyüme medya deneysel C. elegans tutun (NGM) plakaları bakteriyel gıda kaynağı E. coli OP50 ile tohumlu, standart nematod yetiştiriciliği aşağıdaki18.
  3. Nematodları 20 °C'de istenilen aşamaya kadar yetiştirin. Bu protokol için gerekli yaşlar 4 ve 10 gündür.
    NOT: 4. günde genç erişkinler, gonadlarında yumurta bulunması ve yüksek hareketlilikleri ile tanımlanabilir. 10 yaş arası nematodlar post-doğurgandır ve doku bozulması ve lokomotif düşüşüne uğrar19.
  4. Gün 10 nematodlar için, gün 3 L4 aşamasından sonra günlük geçiş, bir kez nematodlar doğurgan, karışık bir nüfus önlemek için.

3. Görüntüleme için mikroskopi slaytlarının hazırlanması

  1. Görüntüleme günü mikroskopi slaytlarını hazırlayın. Bir mikrodalga, genel sınıf eritmek% 3 (w / v) ddH2O. biraz soğumaya bırakın bir konsantrasyonda agarose.
  2. 1 mL pipet ucunu kesin ve yaklaşık 400 μL erimiş agarose aspire edin. Yavaşça temiz bir cam slayt üzerine agarose birkaç damla yerleştirin ve hemen üstüne başka bir slayt yerleştirin, agarose ince bir yastık ikisi arasında oluşturulan emin olun. Yavaşça kaydırmadan veya üst kaydırağı kaldırmadan önce kurumasını bekleyin.
  3. Agarose pad slaytları kurumasını önlemek için nemli bir kapta yerleştirin. Bunlar 2-3 saat içinde kullanılabilir.
    NOT: Nematodlar içinde sıkışıp olabilir gibi agarose küçük kabarcıklar oluşumunu önlemek.

4. Konfokal mikroskop parametrelerinin tanımı

NOT: Nematodları ve veri toplamayı monte etmeden önce, konfokal toplama yazılımındaki tüm ayarları tanımlayın. Ayarlar, tercih edilen görüntüleme donanımına ve yazılımlarına uyarlanabilir.

  1. Konfokal yazılımı açın ve lazer görüntüleme ayarlarını tanımlayın. 486-553 nm yeşil Dendra2 ve 580-740 nm kırmızı Dendra2 için uyarma / emisyon için ışık yolu ayarlayın. Florofor yoğunluğuna göre her iki kanalın/lazerin gücünü ve kazancını ayarlayın. Dijital kazancı veya mahsupı değiştirmeyin ve iğne deliğini tamamen açık olarak ayarlayın.
  2. Edinme kurulumunu tanımlayın: sıralı bir kanal modu seçin ve her kareyi izleyin. Tetkik modunu çerçeve olarak, çerçeve boyutunu ise 1 satır adımla 1.024 x 1.024 olarak ayarlayın. Ortalama yöntemi ve tek yönlü çizgi modu ile ortalama 2 ve ortalama ayarlayın. Bit derinliğini 8 bit olarak ayarlayın.
  3. Dendra2'nin dönüştürülmesi için çok boyutlu satınalma ayarlarını tanımlayın. Dönüştürme ve beyazlatma için 405 nm diyot lazer seti kullanın 60% enerji gücü. Varsa, dedektörleri korumak için güvenli ağartma GaAsP etkinleştirin.
  4. Arasında 0,0 ms aralığı olan iki döngüden oluşan bir zaman dizisi seçin ve normal başlangıç ve durdurma yı seçin. 2'nin 1'ini tarayıp 30 yineleme için tekrarlayın. Yoğunluk %50'ye düştüğünde beyazlatmayı durdurun.
  5. Edinme/piksel inhızını dönüştürme için hızlı (örn. maksimum = 12) ve anlık bir görüntüyü yakalamak için orta hız (örneğin, orta = 5) olarak tanımlayın.
    NOT: Burada tanımlanan ağartma parametreleri kılavuzdur. Diğer Dendra2 etiketli İçN'ler için lazer güç ayarları ve ağartma yinelemeleri ve değerleri ampirik olarak oluşturulmalıdır.

5. C. eleganların mikroskopi slaytlarına monte

NOT: Mümkünse, konfokal mikroskop kurulumuna yakın bir montaj stereomikroskopyerleştirin ve görüntülemeden hemen önce nematodları monte edin.

  1. Agarose ped in karşı tarafındaki cam kapak slayt, kalıcı bir marker ile dört kareler ile bir pencere çizmek ve onları numaralandırmak.
  2. Pipet 15 l levamisole agarose ped ortasında. Levamisole konsantrasyonu nematod un yaşına göre değişir: Görüntüleme günü 4 nematod2 mM levamisole kullanırken; görüntüleme günü 10 nematod0.5 mM levamisole kullanın.
  3. Bir tel çekme kullanarak sıvı içine dört nematod aktarın. Kirpik çekme yardımı ile, yavaşça bir pencere kare için her bir nematod taşıyın. Kirpik, E. coli OP50'nin herhangi bir izinin seyreltilmesi ve floresan arka planının sinyal edinimini etkilememesi için kirpikleri döndürün.
  4. Nematodların neredeyse hareket etmeyi bırakmasını bekleyin ve agarose ped ile kapak kayması arasındaki levamisole tabakasındaki nematodları hareketsiz hale getirmek için sıvının üzerine hafifçe bir kapak fişi yerleştirin.
  5. Nematodları görüntülemek için ters gelen slaydı konfokal sahneye yerleştirin.

6. Yeşil Dendra2 Dönüşüm: Zaman sıfır veri toplama

NOT: Darbe kovalamaca deneyleri, Dendra2 füzyon proteinini geri dönülmez bir şekilde yeşil yayan florofordan kırmızı bir proteine dönüştürerek başlar.

  1. Mikroskobun mercejini kullanarak, yeşil floresan altında 20x hedefi olan ilk nematod'u bulun. Baş veya kuyruk odaklanın ve konfokal moduna geçin.
  2. EGFP yeşil kanal (ex/ em = 486-553 nm) yeşil Dendra2 görselleştirmek için 488 nm mavi lazer ile canlı lazer tarama başlatın. Tek bir nöron seçin ve odak haline getirmek. Zoom 3x ve lazer ışını hedef artırmak4.
    NOT: Nematod başına bir nöron seçin. Her nöron bir örnek veya veri noktası oluşturacaktır.
  3. Maksimum projeksiyon düzlemini bulun ve floroforparlaklığına göre, renk aralığı göstergesi tarafından tanımlanan doymuş ancak aşırı pozlanmayan bir görüntü elde etmek için kazancı veya lazer gücünü artırın veya azaltın. Bu tanımlandıktan sonra, taramayı durdurun.
    NOT: Çok uzun süre veya çok fazla güç ile örnek ışınlama etmeyin, görünür mavi 488 nm ışık ile uyarma da Dendra2 dönüştürebilirsiniz gibi, yavaş ve daha az verimli de olsa4.
  4. Yazılımda, ilgi alanları (ROI) seçmek ve seçilen nöronun etrafına ilk yatırım getirisini çizmek için sekmeyi açın. Nematod'un başını ve ilk Yatırım Getirisi'ni kapsayan daha büyük bir ikinci ilgi bölgesi tanımlayın.
  5. Beyazlatma ayarlarında, elde edilecek, ağartılacak ve analiz edilecek ilk Yatırım Getirisi'ni seçin. İkinci Yatırım Getirisi'nin elde edilip analiz edilmesi ancak ağartılmamamasını seçin.
  6. Tarama hızını maksimuma ayarlayın (yani, hızlı piksel deyanımı) ve seçili Dendra2 nöronları dönüştürmek için denemeyi başlatın.
    NOT: Deneme yapıldıktan sonra elde edilen resim iki resimle sonuçlanır: biri dönüşümden önce ve diğeri dönüştürmeden önce ve diğeri. Yeşil kanal için, ilk görüntü yeşil Dendra2 dönüşüm nedeniyle ikinci görüntü azalır daha yüksek bir yeşil sinyal olmalıdır. Kırmızı kanal için, ilk görüntü negatif olmalı ve dönüşüm sonrası görüntüde kırmızı bir sinyal görünarak sinyal göstermemelidir. Yeşil sinyal azalmazsa, dönüştürme gerçekleşmedi ve 405 lazer gücü veya yineleme sayısı gibi ayarlar değiştirilmelidir. İlk görüntüde kırmızı bir sinyal varsa, kullanılan 488 nm lazer gücü çok yüksekti ve yeşil Dendra2'nin bir kısmı zaten kırmızıya dönüştürülmüştü. Bu durumda yeni bir nöron/nematod seçilmelidir.
  7. Dönüşümden hemen sonra, kırmızı kanalda (ex/em = 580-740 nm) Dendra2'yi görselleştirmek için yeşil 561 nm lazerle canlı tarama yapmaya başlayın. Aşırı pozlamayı önlemek için aralık renk göstergesini kullanarak dönüştürülmüş nöronun odak noktasını ve ilgili maksimum projeksiyonu bulun.
  8. Tbmöhız hızını daha düşük piksel inyanış hızına (örneğin, 5x) ayarlayın ve her iki kanalın anlık görüntüsünü daha yüksek çözünürlükte elde edin. Bu resim dönüştürmeden sonra zaman noktası sıfır (T0) olarak tanımlanır.
    NOT: Dönüştürülen görüntünün edinme hızı çeşitli olabilir. Ancak, bir kez seçildikten sonra, bu hız veri toplama boyunca sabit kalması gerekir.
  9. Tcan'ı tanımlanabilir bir ad ve/veya sayıyla kaydedin ve ardından sıfır etiketi (T0) seçin.
    NOT: Dönüştürme den önce kırmızı sinyal eksikliğini ve daha sonra görünümünü göstermek için dönüştürme deneyinin (adım 6.6) görüntüsünü kaydetmek de tavsiye edilir.

7. Seçilen ikinci zaman noktasında veri toplama için dönüştürülmüş kırmızı Dendra2'nin görüntülenmesi

  1. Zaman içinde Dendra2 bozulmasını izlemek için, aynı nematod/nöronu yeniden görüntülemek için ikinci bir zaman noktası tanımlayın. İlgili biyolojik sorunu çözmek için deneysel olarak ikinci zaman noktasını seçin. Burada açıklanan protokol için, Dendra2 hem 2 saat (T2) hem de 24 saat (T24) sonrası dönüşümde görüntülenir.
    1. Seçilen zaman diliminde, göz parçası ve kırmızı floresan kullanımı ile aynı nematod / nöron bulabilirsiniz.
    2. İlgili nematod/nöron T0 görüntüsünü açın ve görüntü ayarlarını yeniden yükleyin/yeniden kullanın. T0, T2 ve T24 h görüntülerini alırken anlık görüntünün edinme ayarlarının tam olarak aynı olduğundan emin olun.
    3. Kırmızı kanalda canlı tarama, odak dönüştürülmüş kırmızı nöron getirmek. Kırmızı Dendra2 zaman içinde bozulduğu için aralık göstergesi daha az yoğun bir maksimum projeksiyon gösterir. Herhangi bir edinme parametrelerini değiştirmeyin ve ilk görüntüyle aynı hızda (örneğin, 5x) anlık görüntü elde etmeyin.
  2. 4 saat veya daha uzun bir süre sonra Dendra2'nin bozulmasını izlemek için, dönüşümden sonra nematodları kurtarın.
    1. Dört nematodun dönüştürülmesive görüntülenmesinden hemen sonra slaytı mikroskoptan çıkarın. Kapak kapağını hafifçe çıkarın ve bir tel çekme kullanarak, agarose pedden her nematodu kaldırın.
    2. Her nematod'u uygun şekilde etiketlenmiş ve tanımlanabilir bir NGM plakasına ayrı ayrı yerleştirin.
    3. İkinci kez nokta için, taze bir agarose ped üzerine tekrar nematod monte ve bölüm 6 talimatları aşağıdaki dönüştürülmüş kırmızı Dendra2 görüntüleme ile devam edin.

8. Dönüştürülmüş Dendra2 görüntü analizi

NOT: Dendra2 bozulmasıanalizi Fiji / ImageJ yazılım20ile gerçekleştirilir.

  1. Fiji'yi açın ve .lsm dosyasını Fiji çubuğuna sürükleyip bırakın. Dönüşümden hemen sonra çekilen T0 görüntüsünü ve dönüşümden sonra seçilen zaman noktasında çekilen aynı nematod görüntüsünü (T2 veya T24 h) açın.
    NOT: Dendra2'ye kaynayan ilgi proteininin bozulmasını izlemek için sadece kırmızı kanalın analiz edilmesi gerekir.
  2. Menüden ölçüm parametrelerini belirleyin: Analiz | Ölçümleri Ayarlayın. Alan ve Tümleşik Yoğunluk işlevlerini seçin.
  3. Kırmızı kanalla elde edilen görüntüyü seçin. Fiji çubuğundan Çokgen Seçim Aracı'nı seçin.
  4. T0 görüntüsündeki dönüştürülmüş nöronu belirleyin ve seçim aracını kullanarak etrafına bir yatırım getirisi çizin.
    1. Nöronun hatlarını düzgün bir şekilde tanımlamak için, çubuk Görüntü'den seçerek yoğunluk eşiklerini vurgulayın | Ayarla | Eşik. Eşiğe dikkat etmek ve çokgen aracıyla bu alanı izlemek için çubuk imleci sürükleyin. Doğru bir yatırım getirisi oluşturmak için, yeşil kanaldan seçilen nöron kontur unu kullanmak da mümkündür.
  5. Seçim kırmızı kanal penceresinde yapıldıktan sonra Analiz Et | Ölçün. Sonuçlar adlı bir açılır pencere görüntülenir ve Alan, IntDenve RawIntDeniçin YG değerlerini içerir.
  6. İkinci zaman noktasının (T2 veya T24 h) görüntüsü için aynı seçim ve ölçüm işlemini gerçekleştirin.
  7. Elde edilen değerleri bir elektronik tablo yazılımına kopyalayın, dönüşümden sonra T0'daki değerleri ve dönüşümden sonra T2 veya T24 h değerlerini uygun şekilde kaydetmeye özen gösterir.

9. Dendra2 bozunma oranının hesaplanması

  1. Bozulma oranını hesaplamak için, önce 1 (veya %100) bir değer atayın zaman sıfırdan bozulma zaman (yani, dönüşüm hemen sonra, kırmızı Dendra2 dönüştürülmüş tüm hala mevcut olduğunda). Bu, T0 intRawDen değerini tek başına bölünmesi sonucu ortaya çıkar.
  2. Kırmızı Dendra2 yoğunluk sinyalinin zaman içinde azaltılmasını ve bozulmayı hesaplamak için, ikinci zaman noktasının RawIntDen değerini (örneğin, T2 veya T24 h) T0 RawIntDen değerine bölün. Elde edilen sayı 1'den az olmalıdır. Bu değerler, T0'ı %100 olarak tanımlayarak yüzde olarak da ifade edilebilir.
  3. Dönüştürülmüş her nematod için bölüm 7 tekrarlayın. Dendra2'nin bozulmasının grafik gösterimi için, y ekseninde elde edilen floresan düşüş yüzdesi veya oranı değerlerini içeren bir dağılım çizimi veya çubuk grafiği çizin. İstenilen herhangi bir istatistiksel analiz uygulayın ve grafiküzerinde gösterin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fotoconvertible protein Dendra2 ile çerçeve içinde huntingtin ekson-1 protein parçasını ifade eden iki nematod suşmikroenjeksiyon ile elde edilmiş ve plazmidler ekstrakromosomal dizi olarak tutulmuştur. Füzyon yapısı tüm C. elegans sinir sistemi gelişiminden yaşlanma boyunca ifade edildi. Burada HTT-D2 fizyolojik 25 poliglutamin streç (HTTQ25-D2, Şekil 1A)veya 97 glutamin (HTTQ97-D2, Şekil 1B)ile tam penetrant ve patojenik tekrar içeriyordu. Başlangıçta füzyon proteini, UV ışınlaması üzerine yeşil spektrumundan kırmızı spektrumuna değiştiğinden emin olmak için test edildi. HTT-D2, sadece ışıklı bölgede yeşilden kırmızıya başarıyla geçti. UV darbesinin gücüne ve yinelemelerine göre ve lazer ışınının nematod'un manilünden geçmesine bağlı olarak, HTT-D2'nin tanımlanmış bir kısmı dönüştürüldü, ama hepsi değil. Kırmızı bir sinyal fotoconverted nöronlar içinde ortaya çıktı, yeşil olmayan dönüştürmeli HTT-D2 ile kolokalize (Şekil 1C,D). Lazer tarama foton ışınlarının doğruluğu nedeniyle tek bir nörona karşılık gelen hassas bir yatırım getirisi dönüştürmek mümkün oldu. Dönüştürmeden önce, örnek kırmızı kanalda heyecanlandığında kırmızı sinyal görünmüyordu(Şekil 2A). UV ışınlaması üzerine, HTT-D2 dönüştürüldü ve kırmızı bir sinyal nihayet ortaya çıktı(Şekil 2B)olarak yeşil sinyal azaldı. HTT-D2 zaman içinde bozuldu, kırmızı HTT-D2 düzeylerinde bir azalma ile sonuçlanan(Şekil 2C) ve yeşil HTT-D2 sinyalolası bir artış, daha fazla füzyon proteini yeni sentezlendi. Dönüşümden sonra 2 saat te önemli bir düşüş ön plana çıktı, HTT-D2'nin bozulmasını tespit etmek ve ölçmek için bu aralık korunmuştür. HTT-D2'nin dönüştürülmesinden sonra oluşabilecek tek işlemin bozulma olmadığını unutmayın. Dönüştürülmüş HTT-D2 ticareti ve akson boyunca taşınan olabilir, kırmızı sinyal in bir azalma ile sonuçlanan açıklık nedeniyle değil. Ancak, burada ve 2 saat kısa bir süre içinde kullanılan ayarları ile, kırmızı sinyal hiçbir yayılma gözlenmedi, muhtemelen küçük HTT-D2 soma akson taşındı olması nedeniyle. Ayrıca, dönüşüm ve görüntüleme tek bir bütün nöronal soma aynı nöron içinde HTT-D2 difüzyon etkileri hariç yardımcı oldu, tüm hücresel bölmeleri aynı anda analiz ediliyordu çünkü. Hem difüzyon uyruğu hem de taşıma/ticareti incelemek için hızlı ve yüksek büyütme görüntüleri elde etmek ve ilgi proteininin daha küçük ve muhtemelen daha hareketli bir kısmını izlemek tavsiye edilir. Ayrıca, bir dizi deney de, her hayvanın bir biyolojik tekrarı temsil ettiğini belirtmek önemlidir. Nematod başına sadece bir nöron görüntülendi, her hayvan seans başına bir kez görüntülendi ve görüntüleme üç seans boyunca gerçekleşti, bu da teknik tekrarlar oluşturdu. Bu üç seans, hayvanların her deneyden önce 4. Üç seans, kurulumdan kaynaklanan herhangi bir değişkenliği de hesaba katar (örneğin, deneyler arasındaki farklı sıcaklık nedeniyle değişen lazer gücü). Üç seans boyunca elde edilen tüm biyolojik kopyalar (en az 20 hayvan) bireysel numune ler olarak kabul edildi ve istatistiksel anlamlılık oluşturmak için kullanıldı.

Her iki C. elegans HTT-D2 suşlarının etkili olduğunu doğruladıktan ve optimal dönüşüm parametrelerini oluşturduktan sonra, hastalığa neden olan HTT-D2 proteininin (httq97-D2) fizyolojik olarak ilgili kontrolü (HTTQ25-D2) ile karşılaştırıldığında cirosu arasındaki farklar araştırıldı. İlk olarak, farklı nöronlarda HTT-D2'nin bozulması gözlendi (Şekil 3). Bu nematod sinir sistemi içinde nöronların alt tipleri metabolik aktivite ve morfolojisi değişir bilinmektedir21, muhtemelen proteom bozulması ve yeniden dengeleme bir fark yaratmak. Kuyruk bölgesinin nöronları başınkilerle karşılaştırıldı ve önemli ölçüde daha aktif bulundu(Şekil 3A). Bu bulgu sadece HTTQ25-D2 için geçerliydi ve patojenik HTTQ97-D2 için değil, PN'nin sinir sistemi boyunca daha uzun glutamin uzanır içeren HTT-D2'yi çıkaramadığını düşündürmektedir(Şekil 3B).

Model sisteminin beklendiği gibi iyi bir şekilde işlettiğini doğrulamak için, dönüşüm deneyleri daha uzun bir süre boyunca gerçekleştirildi ve hücrelerin bozulma yollarının ilgi proteinini neredeyse tamamen ortadan kaldırmasına olanak sağladı(Şekil 4). Gerçekten de, kafa nöronlarında 2 saat sonra daha dönüşüm sonrası kontrol HTTQ25-D2 24 h önemli ölçüde daha fazla bozulma vardı, ve yaygın kuyruk nöronlarda daha fazla(Şekil 4A). Yine, posterior kuyruk nöronlar daha aktif kırmızı HTT-D2 kaldırıldı, hatta artan bir zaman layıcısı üzerinde. Benzer bir eğilim hastalığa neden olan HTTQ97-D2 için tespit edildi, kırmızı HTT-D2 sinyali çok hafif bir azalma ile 24 saat. Ancak, HTTQ97-D2 httq25-D2 gibi kolayca kaldırılmadı, özellikle sonra 24 saat. Sadece çözünen HTTQ97-D2 fraksiyonu verimli bir şekilde bozulmuş olabilir, kırmızı sinyalin ilk azalan ve zaman içinde daha hafif azalma için muhasebe. Daha da önemlisi, 24 saat sonra iki nöron popülasyonu vardı: biri daha yüksek bozulma oranına sahip, diğeri kırmızı HTT-D2 sinyalinin hiç bozulmadığı ya da potansiyel olarak arttığı(Şekil 4B). Artan ve kararlı sinyal muhtemelen zaten birleştirilmiş ya da sürekli olarak biraraya gelen türleri temsil eder ve bu türler sıkıca paketlenmiş amiloid yapısı nedeniyle hücrelerden temizlenmesi önemli ölçüde daha zordur. Glutamin uzanır 40 tekrar eşiği aştığında sadece mevcut olan bu eklemeler, ve mikroskobik olarak fosi olarak ortaya çıktı, kolayca kaldırılamaz mevduat olarak birikmesi için hipotez edilmiştir22. Kırmızı floresan sinyalindeki artışın teknik sorunlardan kaynaklanan bir obje olması da mümkündür (örn. yanlış edinme parametrelerinin kullanımı, mikroskopi kurulumunun alt par performansı veya hatalı bir kurtarma/montaj süreci). Daha uzun süreler boyunca görüntü elde ederken bu değişkenler dikkate alınmalıdır.

Son olarak, yetişkin yaşamında HD gibi nörodejeneratif bozukluklar ortaya çıktı, HTT-D2 bozulma oranı yaşlanmanın etkisi gözlendi. Hem HTT-D2 suşlarında genç (gün 4) ile eski (gün 10) nematodlarının baş ve kuyruk bölgelerinde dönüşüm deneyleri yapılmıştır(Şekil 5). Baş nöronlar için, httq25-D2 ve HTTQ97-D2 hem yaşam süresi içinde yaşlanmaya bağlı bozulma hızında önemli bir değişiklik yoktu, muhtemelen HTT-D2 her nematod ömrü boyunca eşit olarak kaldırıldı çünkü. Ancak, patolojik veya fizyolojik glutamin germe içeren eski nematodlar karşılaştırılırken çok önemli bir değişiklik kaydedildi. HTTQ97-D2, HTTQ25-D2 kadar verimli bir şekilde bozulmadı ve PN'nin yaşlı nematodlarda toplu ve muhtemelen zehirli huntingtin türlerini kaldıramadığını vurgulayarak(Şekil 5A). Yine kuyruk nöronlarında daha aktif ve önemli bir ciro gözlendi. Baş nöronlarda olduğu gibi, genç nematodların kuyruk nöronlarında yaşlı kohorta göre HTTQ25-D2'nin daha sağlam bir cirosu gözlenmedi ve bozulma 4. Buna karşılık, kontrol ve patojenik HTT-D2 suşları arasındaki bozulma oranlarında önemli değişiklikler genç gün 4 nematodlarda ortaya çıktı, 10. Daha da önemlisi, kuyruk nöronlar genç nematodlarda toksik HTTQ97-D2 ile başa çıkabildiler, bu da htt-D2'yi çıkarmak için çeşitli eşlik eden PN mekanizmalarının iş başında olabileceğini gösteriyor(Şekil. 5B). Genel olarak, PN aktivitesi zaman içinde azaldı, muhtemelen hem yaşlanma ve agregaların varlığı ndan kaynaklanan zararlı etkiler nedeniyle.

Figure 1
Şekil 1: C. elegans sinir sisteminde Dendra2'ye kaynaşmış huntingtin exon-1'i ifade etti. (A) Genç, gün 4 C. elegans pan-nöronally 25 glutamin içeren huntingtin exon-1 ifade, dendra2 dönüştürülmemiş yeşil uyarma / emisyon durumunda erimiş. Ölçek çubuğu = 100 μm. Insets baş (üst) ve kuyruk (alt) nöronlar büyütülmüş bir görüntü gösterir. Inset scale bar = 10 μm. (B) Genç, gün 4 C. elegans pan-nöronally 97 glutamin içeren huntingtin exon-1 ifade, dendra2 dönüştürülmemiş yeşil uyarma / emisyon durumunda erimiş. Ölçek çubuğu = 100 μm. Insets kuyruk (üst) ve baş (alt) nöronlar ve bir gün 7 nematod (en sağda) başkanı büyütülmüş bir görüntü gösterir. Inset scale bar = 10 μm. Beyaz ok uçları HTTQ97-D2 foci'ye işaret eder ve huntingtin agregalarını betimleer. (C) HTTQ25-D2'nin kanal birleştirme görüntüsü ve kafa bölgesinin dönüştürülmesi. Kutu UV ışınlanmış olan tüm C. elegans kısmını temsil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Inset 488 nm (üst, yeşil) ve 561 nm (alt, kırmızı) de Dendra2 emisyon gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. (D) HTTQ97-D2'nin kanal birleştirme görüntüsü ve kafa bölgesinin dönüştürülmesi. Ölçek çubuğu = 100 μm. Kutu, UV ışınlanmış tüm C. elegans kısmını temsil eder. Inset 488 nm (üst, yeşil) ve 561 nm (alt, kırmızı) de Dendra2 emisyon gösterir. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Dönüştürülmüş kırmızı HTT-D2 tek nöronlarda zaman içinde azalmıştır. HTTQ25-D2 kuyruk nöronlar. İki nöron aynı anda ve bağımsız olarak fotoconverted gösterilir. Görüntüler sırayla üç zaman noktasını tasvir eder: (A) ışınlamadan önce (önce), (B) ışınlamadan hemen sonra (dönüşüm) ve(C) ışınlamadan sonra (sonra) 2 h. Üst panel (yeşil kanal) 486-553 nm uyarma/emisyonda toplanan HTT-D2 sinyalini temsil eder. İlgi beyaz bölge Radyasyona maruz olan nöronları çizgi. Orta panel (kırmızı kanal) 580-740 nm uyarma/emisyon da toplanan dönüştürülmüş HTT-D2 sinyalini gösterir. Alttaki panel iki kanalın birleştirilmesidir. Ölçek çubuğu = Tüm görüntüler için 5 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Baş ve kuyruk nöronları farklı bozulma oranları sergiledi. Sütun çubuğu grafikleri, dönüşüm sırasındaki ilk değere göre kırmızı yoğunluğun yüzdesini (yani %100) gösterir. Dönüştürülmüş kırmızı Dendra2 sinyali, HTT-D2'nin C. elegansnöronları içinde bozulması yla 2 saatlik aralıkta genel olarak azaldı. Nematodsinir sistemi içinde nöronal alt tipleri farklı bozulma oranları sergiledi, kuyruk nöronlar daha aktif bir ciro gösteren, ama sadece nematodlarda nonpatojenik poliglutamin streç taşıyan. (A) HTTQ25-D2 baş ve kuyruk nöronları bozulmanın nicelikselleştirilmesi. Ortalama ± SD, eşleşmemiş iki kuyruklu öğrencinin t-testi. N = 23-28 örnekleri/nematodlar her bölge için görüntülenmi_ *P < 0,05. (B) HTTQ97-D2 baş ve kuyruk nöronları bozulmanın nicelikselleştirilmesi. Ortalama ± SD, eşleşmemiş iki kuyruklu öğrencinin t-testi. N = 23-28 örnekleri/nematodlar bölge başına görüntülenmi, ns = anlamlı değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: HTTQ97-D2 24 saat sonra önemli ölçüde temizlenmedi. Sütun çubuğu grafikleri, dönüşüm sırasındaki ilk değere göre kırmızı yoğunluğun yüzdesini (yani %100) gösterir. Dönüştürülmüş kırmızı Dendra2 sinyali, HTT-D2'nin C. elegansnöronları içinde bozulmasıyla azaldı. HTT-D2 farklı bozulma oranları sergiledi. Dönüşümden sonra daha uzun süreler bile, patojenik HTT-D2 sağlıklı kontrolü ile karşılaştırıldığında çıkarılamadı. (A) Hem baş hem de kuyruk nöronlarında dönüşümden sonra (2 saat ve 24 saat) iki zaman noktasında HTTQ25-D2'deki bozulma oranının ölçülmesi. Ortalama ± SD, varyans tek yönlü analizi (ANOVA). N = 21-28 örnek/nematodlar zaman/bölge başına, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Hem baş hem de kuyruk nöronlarında dönüşümden sonra (2 saat ve 24 saat) iki zaman noktasında HTTQ97-D2'deki bozulma oranının ölçülmesi. Ortalama ± SD, varyans tek yönlü analizi (ANOVA) tukey çoklu karşılaştırma sonrası hoc testi izledi.  N = 21-28 örnekleri/nematodlar zaman/bölge başına görüntülenmisin, ns = anlamlı değil. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Patojenik HTT-D2'yi ifade eden yaşlı ve genç nematodlar onu verimli bir şekilde bozmadı. Sütun çubuğu grafikleri, dönüşüm sırasındaki ilk değere göre kırmızı yoğunluğun yüzdesini (yani %100) gösterir. Dönüştürülmüş kırmızı Dendra2 sinyali, HTT-D2'nin nöronlar içinde bozulmasıyla azaldı. Nematod yaşlandıkça, patojenik HTT-D2'yi alçaltma yeteneği sinir sistemi boyunca ayrıca bozulmuştur. (A) Yaşa uyan HTTQ97-D2 nematodlarına göre genç (gün 4) ve yaşlı (gün 10) HTTQ25-D2 nematodlarının baş nöronlarında bozulma oranının ölçülmesi. Ortalama ± SD, varyans tek yönlü analizi (ANOVA). N = 23-28 numune/nematodlar süzme/gün başına görüntülenmi, ****P < 0,0001. (B) Genç (gün 4) ve eski (gün 10) HTTQ25-D2 nematodların kuyruk nöronlarında dönüşümden sonra bozulma oranı 2 saat, yaşa uyan HTTQ97-D2 nematodlarına göre. Ortalama ± SD, varyans tek yönlü analizi (ANOVA) tukey çoklu karşılaştırma sonrası hoc testi izledi. N = 23-28 numune/nematodlar süzme/gün başına görüntülenmi_ *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bir proteinin işlevini anlamak için sentezini, yerini ve bozulmasını anlamak önemlidir. Yeni, kararlı ve parlak LP'lerin geliştirilmesiyle, İçN'lerin görselleştirilmesi ve izlenmesi daha kolay ve verimli hale gelmiştir. Dendra2 gibi genetik olarak ifade edilen füzyon PAFP'leri bir İçN'nin stabilitesini incelemek için benzersiz bir konuma sahiptir. Mor-mavi ışığa maruz kaldıktan sonra, Dendra2 korunmuş amino asitlerin bir üçlü içinde kesin bir yerde tatili. Florofor küçük bir yapısal değişime uğrar, yeşildenkırmızı23spektrumun tam bir kayması ile sonuçlanan. Bu değişiklik, Dendra2'ye bağlı herhangi bir İçN'nin algılanmasına ve izlenmesine olanak tanır. Nitekim, bu füzyon yapıları ilk vivo16ubikitin-proteozo sistemi incelemek için bir C. elegans muhabiri suşu oluşturmak için kullanılmıştır. Dendra2 de seçici nöronal alt tiplerin kırılganlığını anlamak için istihdam edildi ve genişletilmiş poliglutamin proteinleri ile başa çıkmak için yeteneklerini24, veya motor nöron hastalığı modellerinde otofaji indüksiyon izlemek25.

Bir protokol burada huntingtin, noninvaziv bir şekilde bir hastalık ile ilgili agregasyon eğilimli protein bozulmasını izlemek için sunulmaktadır. HTT-D2 pan-nöronla ifade eden nöronal C. elegans hd modelini başarıyla ürettikten sonra, fizyolojik muadili ile karşılaştırıldığında genişletilmiş ve patojenik HTT'nin bozulma oranları ölçüldü. Nöronal alt tipler arasında, genç ve yaşlı nematodlar arasında ve PN'nin zamanla toksik glutamin yükleri ile başa çıkma kapasitesi arasında çarpıcı farklılıklar gözlenmiştir. Bu teknik, PN'ye tedirginlikler getirildiğinde huntingtin'in yerini ve hareketini ve kaderini takip etmek için de uygulanabilir. anahtar şaperonların siRNA nakavt veya proteozom aktivitesi inhibe bileşiklerin uygulanması agregasyon eğilimli proteinlerde bu bileşenlerin fonksiyonu ve önemini ortaya çıkarabilirsiniz: örneğin, PN eksiklikleri telafi etmek için belirli düğümleri aktive olsun26. Aynı zamanda normal yaşlanma ile karşılaştırıldığında bir hastalığın neden olduğu zararlı etkileri açıklayabilir.

Bu teknik kullanılarak birçok farklı soru ele alınabilse de, istenilen model oluşturulduktan sonra güvenilir veri elde etmek için doğru dönüştürme ve algılama parametreleri oluşturulmalıdır. Ayrıca fotobeyazrlama veya fototoksisite olmadan ve istenmeyen dönüşüm olmadan aktif protein yeterli verim için izin dönüşüm ayarlarını belirlemektir. Ayrıca, belirli bir model sistemi içinde her çalışılan protein için, ex vivo veya in vivo, deneysel olarak bozulma oranının doğru nicelleştirilmesi için yeterince büyük bir zaman dilimi kurmak gereklidir.

Dendra2 diğer PAFPs üzerinde avantajları bir dizi sunuyor: 1) monomerik ve çok parlak; 2) yüksek kontrastlı fotodönüşüm ve kararlı bir fotodönüşüm sinyali vardır; 3) en konfokal donanım kurulumları bir parçası olan mavi 488 nm lazer, düşük fototoksisite ile aktive edilebilir; 4) memeli hücrelerinde uygulama için 37 °C'de verimli bir şekilde olgunlaşır; 5) uzun süre ifade edildiğinde hiçbir toksik yan etkisi vardır23,27; ve 6) sistem, dönüşümden önce ve sonra Dendra2 sinyalinin oranı ölçülderken, bir organizma veya hücre arasındaki veya içindeki ifade düzeylerindeki değişimlerden etkilenmez. Listelenen tüm özellikler Dendra2'yi protein dinamiklerini gerçek zamanlı olarak izlemek ve hücre kaderini izlemek için ideal bir florofor haline getirilmiştir.

Ne yazık ki, Dendra2 füzyon proteinleri floresan protein etiketleme bazı ortak sınırlamalar muzdarip. Endojen ifade genommühendisliği yoluyla kurulabilse de, yapı genellikle deneysel olarak biyolojik sistemlerde aşırı ifade edilen bir şimerik türdür. Dendra2'nin bozulma oranı potansiyel olarak hedef proteinin bozulmasını etkiler, ancak son derece kararlı, uzun ömürlü bir protein olarak tanımlanmıştır27. Ayrıca, Dendra2 kendi uygun olgunlaşma için zaman olmayabilir gibi çok hızlı ciroları ile proteinleri izlemek için uygun değildir. Son olarak, 405 nm lazerler, hangi nadirdir, verimli fotoanahtarlama için tercih edilir, onlar örnek için daha toksik olmasına rağmen. Gerçekten de, daha az fototoksik mavi ışık hem yeşil Dendra2 görselleştirmek ve lazer gücü yüksek yoğunlukta olduğunda dönüştürmek için kullanılabilir. Uzun süreli maruz kalma istenmeyen dönüşüm ve potansiyel olarak yanlış ölçümler üreteceği için, bu özel özellik her zaman akılda tutulmalıdır. Son olarak, yeşil veya kırmızı floroforlarla birlikte Dendra2 kullanmak sorunlu olabilir. Ancak, birçok farklı PAPC aynı anda çeşitli proteinlerin dinamiklerini araştırmak için kullanılabilir.

Dendra2 ve diğer PAPC'leri kullanan deneyler, fotobeyazrlama (FRAP) ve radyoaktif darbe kovalama etiketleme tekniklerinden sonra floresan kurtarma ile ilişkilendirilmiştir. FRAP ayarında proteinlerin yeni oluşan floresan proteinden yeniden yatırım getirisini ayırt etmek mümkün değildir ve numunenin sürekli izlenmesi ve görselleştirilmesi gereklidir. Dendra2 ile, iki açıkça ayırt edilebilir popülasyonlar bağımsız yeşil Dendra2 değiştirilen ve yeni sentezlenmiş "inaktif" formu izlenebilir ve16ölçülebilir böylece zaman içinde gözlemlenebilir oluşturulur. Dendra2 aynı zamanda toplam iç yansıma floresan mikroskopi (TIRF)28 ve fotoaktivasyon lokalizasyon mikroskobu (PALM)29gibi süper çözünürlüklü mikroskopide de yararlıdır. Yakın gelecekte bu tür gelişmeler daha iyi lokalizasyon ve herhangi bir PoI potansiyel olarak tek molekül izleme sağlayacak, örnekler içinde ve arasında daha ince farklar ortaya çıkarmak için izin ve sonuçta biyolojik bir sistem içinde herhangi bir İçN hayatı ve kaderi hakkında yeni bilgiler elde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Biz DFG (KI-1988/5-1 JK, NeuroCure Doktora Bursu MLP mükemmellik NeuroCure Küme tarafından) finansman için kabul ediyoruz. Ayrıca Leibniz Moleküler Farmakoloji Enstitüsü Berlin Görüntüleme Çekirdek Tesisi (FMP) görüntüleme kurmak sağlamak için kabul ediyoruz. Buna ek olarak, laboratuvarda Dendra2 sistemini kuran ve talimatlar veren Diogo Feleciano'ya teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85, (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24, (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42, (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1, (1), 15005 (2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7, (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70, (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10, (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10, (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48, (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9, (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42, (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5, (4), 105 (2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101, (6), 1522-1528 (2011).
Fotodönüştürülebilir Dendra2 kullanarak Yaşlanma <em>C. Elegans</em> Protein Ciro Vivo Quantification
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter