Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.

Abstract

Proteine werden in einer Zelle ständig synthetisiert und abgebaut, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Die Möglichkeit, den Abbau eines Proteins von Interesse zu überwachen, ist der Schlüssel, um nicht nur seinen Lebenszyklus zu verstehen, sondern auch Ungleichgewichte im Proteostase-Netzwerk aufzudecken. Diese Methode zeigt, wie man den Abbau des krankheitserregenden Proteins Huntingtin nachverfolgt. Zwei Versionen von Huntingtin, die zu Dendra2 verschmolzen sind, werden im Nervensystem C. elegans ausgedrückt: eine physiologische Version oder eine mit einer erweiterten und pathogenen Strecke von Glutaminen. Dendra2 ist ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein; Bei einem kurzen ultravioletten (UV) Bestrahlungsimpuls schaltet Dendra2 seine Anregungs-/Emissionsspektren von grün auf rot. Ähnlich wie bei einem Puls-Chase-Experiment kann der Umsatz des umgebauten Rot-Dendra2 unabhängig von der Interferenz durch neu synthetisiertes Grün-Dendra2 überwacht und quantifiziert werden. Mit konfokaler Mikroskopie und aufgrund der optischen Transparenz von C. elegansist es möglich, den Abbau von Huntingtin-Dendra2 in einem lebenden, alternden Organismus zu überwachen und zu quantifizieren. Neuronale Huntingtin-Dendra2 wird kurz nach der Umwandlung teilweise abgebaut und im Laufe der Zeit weiter gerodet. Die Systeme, die den Abbau kontrollieren, sind in Gegenwart von mutiertem Huntingtin mangelhaft und durch das Altern weiter beeinträchtigt. Neuronale Subtypen innerhalb desselben Nervensystems weisen unterschiedliche Umsatzkapazitäten für Huntingtin-Dendra2 auf. Insgesamt kann die Überwachung jedes Proteins von Interesse, das zu Dendra2 verschmolzen ist, wichtige Informationen nicht nur über seine Verschlechterung und die Akteure des beteiligten Proteostase-Netzwerks liefern, sondern auch über seinen Standort, seinen Menschenhandel und seinen Transport.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Das Proteom eines lebenden Organismus erneuert sich ständig. Proteine werden kontinuierlich abgebaut und entsprechend dem physiologischen Bedarf einer Zelle synthetisiert. Einige Proteine werden schnell eliminiert, während andere länger gelebt werden. Die Überwachung der Proteindynamik ist eine einfachere, genauere und weniger invasive Aufgabe bei der Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine (FPs). FPs bilden sich autokatalytisch und können mit jedem Protein von Interesse (POI) verschmolzen werden, erfordern aber keine Enzyme, um Kofaktoren zu falten oder zu benötigen, außer Sauerstoff1. Eine neuere Generation von FPs wurde vor kurzem entwickelt, um die Farbe bei Bestrahlung mit einem Lichtimpuls von bestimmter Wellenlänge zu schalten. Diese photoaktivierbaren FPs (PAFPs) ermöglichen die Kennzeichnung und Nachverfolgung von POIs oder der Organellen oder Zellen, in denen sie sich befinden, und ihre quantitativen und/oder qualitativen Parameter zu untersuchen2. FPs ermöglichen es, die Bewegung, Die Richtung, die Bewegungsrate, den Diffusionskoeffizienten, die beweglichen oder unbeweglichen Fraktionen, die Zeit, zu der sie sich in einem Mobilfunkfach befindet, sowie die Fluktuationsrate zu verfolgen. Für bestimmte Organellen können Fortbewegung und Transport oder Spalt- und Fusionsereignisse bestimmt werden. Für einen bestimmten Zelltyp können die Position, die Division, das Volumen und die Form einer Zelle festgelegt werden. Entscheidend ist, dass die Verwendung von PAFPs tracking ohne kontinuierliche Visualisierung und ohne Interferenzen von neu synthetisierten Sonden ermöglicht. Studien sowohl an Zellen als auch an ganzen Organismen haben ERFOLGREICH PAFPs eingesetzt, um biologische Fragen in vivo zu behandeln, wie die Entwicklung von Krebs und Metastasen, die Montage oder Demontage des Zytoskeletts und DIE INTERAKTIONen zwischen RNA-DNA/Protein3. In diesem Manuskript werden Lichtmikroskopie und PAFPs verwendet, um die Fluktuationsraten des aggregationsanfälligen Proteins Huntingtin (HTT) in vivo in einem C. elegans Modell neurodegenerativer Erkrankungen aufzudecken.

Das hier beschriebene Protokoll quantifiziert die Stabilität und den Abbau des Fusionsproteins huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 ist eine monomere PAFP4 der zweiten Generation, die ihre Emissions-/Erregungsspektren als Reaktion auf UV oder sichtbares blaues Licht irreversibel von grün auf rot umstellt, mit einer Erhöhung ihrer Intensität um bis zu 4.000-fache5,6. Huntingtin ist das Protein, das für die Huntington-Krankheit (HUNTINGTON), eine tödliche erbliche neurodegenerative Störung, verantwortlich ist. Huntingtin exon-1 enthält eine Strecke von Glutaminen (CAG, Q). Wenn das Protein mit über 39Q exprimiert wird, wird es zu einem mutierten, toxischen und pathogenen Protein verkommen. Mutante HTT ist anfällig für Aggregation und führt zu neuronalen Zelltod und Degeneration, entweder als kurze oligomere Arten oder als größere hoch strukturierte Amyloide7.

Das Nematode ist ein Modellsystem zur Untersuchung von Alterung und Neurodegeneration dank seiner einfachen Manipulation, isogenen Natur, kurzen Lebensdauer und seiner optischen Transparenz8. Um die Stabilität von HTT in vivo zu untersuchen, wurde ein Fusionskonstrukt im Nervensystem von C. elegansausgedrückt. Ein HTT-D2-Transgen, das entweder eine physiologische Dehnung von 25Qs (HTTQ25-D2) oder eine pathologische Strecke von 97Qs (HTTQ97-D2) enthält, wird während der gesamten Lebensdauer der Nematode panneuronal überexprimiert9. Durch die Unterwerfung von lebenden C. elegans einem kurzen und fokussierten Lichtpunkt wird ein einzelnes Neuron photoswitched und der konvertierte HTT-D2 im Laufe der Zeit verfolgt. Um die Menge an HTT-D2 abgebaut zu ermitteln, wird die Differenz zwischen dem roten Signal des frisch umwandelten HTT-D2 mit dem verbleibenden roten Signal von HTT-D2 nach einem bestimmten Zeitraum verglichen. Daher wird es möglich zu untersuchen, wie Huntingtin abgebaut wird, wenn es in seiner erweiterten und toxischen Form im Vergleich zu seiner physiologischen Form gefunden wird; wie vordere oder hintere Neuronen unterschiedlich auf das Vorhandensein von Q97 im Vergleich zu Q25 reagieren, insbesondere über längere Zeiträume; und wie der Zusammenbruch des Proteostase-Netzwerks (PN) während des Alterns zu den Unterschieden bei den Abbauraten beiträgt. Diese Ergebnisse beschreiben nur eine kleine Reihe von Beobachtungen zum Umsatz von HTT-D2. Mit dieser In-vivo-Anwendung können jedoch viele weitere biologische Fragen behandelt werden, die sowohl für den Bereich der Proteinaggregation als auch für die Proteostase relevant sind.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Erzeugung von C. elegans, die neuronales Huntingtin-Dendra2-Fusionsprotein exdrücken

  1. Klonen Sie das Gen, das für die POI kodiert, in einem Nematodenexpressionsvektor (d. h. pPD95_75, Addgene #1494), durch traditionelles Restriktionsenzym digest10, Gibson Assembly11oder jede Methode ihrer Wahl. Fügen Sie einen Promotor ein, um den Ausdruck in einem gewünschten Gewebe oder in einem gewünschten Entwicklungsstadium zu fördern. Setzen Sie das Dendra2-Fluorophor entweder N- oder C-terminal in den Rahmen mit dem POI ein.
  2. Generieren Sie transgene C. elegane, die das Fusionskonstrukt ausdrücken (z.B. durch Mikroinjektion)12.
    HINWEIS: Das Plasmid, das das Transgen trägt, bleibt als extrachromosomales Array erhalten. Die Integration des Konstrukts ist nicht notwendig, kann aber bei Bedarf13durchgeführt werden. In diesem Protokoll wurden C. elegans mit einem Plasmid mikroinjiziert, das das Fusionskonstrukt Huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) unter der Kontrolle des panneuronalen Promotors Prgef-1trug. Das C. elegans Expression Backbone wurde aus Kreis et al.14gewonnen, das Huntingtin exon 1 mit Q25 oder Q97 wurde von Juenemann et al.15bezogen und Dendra2 wurde von Hamer et al.16bezogen.

2. Altersabgleich und Aufrechterhaltung von C. elegans

  1. Alter passen alle Nematoden durch Synchronisierung entweder mit alkalischer Hypochlorit-Lösung Behandlung17 oder über Eiablage für 4 h bei 20 °C. Für die Eiablage 10 gravid Erwachsene auf eine frisch gesäte Nematoden-Wachstumsmedienplatte (NGM) legen und 4 h vor dem Entfernen lassen. Die in dieser Zeitgelegten Eier führen zu synchronisierten Nematoden.
  2. Halten Sie experimentelle C. elegans auf Nematoden-Wachstumsmedien (NGM)-Platten, die mit der bakteriellen Nahrungsquelle E. coli OP50 gesät sind, nach Standard-Nematodenhaltung18.
  3. Nematoden bei 20 °C auf das gewünschte Stadium anbauen. Für dieses Protokoll sind die erforderlichen Altersgruppen die Tage 4 und 10.
    HINWEIS: Junge Erwachsene an Tag 4 können durch das Vorhandensein von Eiern in ihren Gonaden und ihre hohe Beweglichkeit identifiziert werden. Im Alter von Tag 10 Nematoden sind post-fruchtbar, und unterziehen Gewebe Verschlechterung und LokomotivenRückgang19.
  4. Für Tag 10 Nematoden, Durchgang täglich nach der L4-Stufe an Tag 3, einmal Nematoden fruchtbar sind, um eine gemischte Bevölkerung zu vermeiden.

3. Herstellung von Mikroskopienschlitten für die Bildgebung

  1. Bereiten Sie die Mikroskopie-Dias am Tag der Bildgebung vor. In einer Mikrowelle bei einer Konzentration von 3% (w/v) in ddH2O schmelzen allgemeine Sanarose schmelzen. Leicht abkühlen lassen.
  2. Schneiden Sie die Spitze einer 1 ml Pipettespitze und aspirieren Sie etwa 400 l geschmolzene Agarose. Legen Sie vorsichtig ein paar Tropfen Agarose auf eine saubere Glasrutsche und legen Sie sofort eine weitere Rutsche auf die Oberseite, um sicherzustellen, dass ein dünnes Pad Agarose zwischen den beiden erstellt wird. Trocknen lassen, bevor man sanft gleitet oder die Oberseite abrutscht.
  3. Legen Sie die Agarose-Pad-Rutschen in einen befeuchteten Behälter, um ein Austrocknen zu verhindern. Diese können innerhalb von 2-3 h verwendet werden.
    HINWEIS: Vermeiden Sie die Bildung von kleinen Blasen in der Agarose, da die Nematoden darin gefangen werden können.

4. Definition konfokaler Mikroskopparameter

HINWEIS: Definieren Sie vor der Montage der Nematoden und der Datenerfassung alle Einstellungen für die konfokale Erfassungssoftware. Die Einstellungen können an die Bildverarbeitungshardware und Software der Wahl angepasst werden.

  1. Öffnen Sie die konfokale Software und definieren Sie die Laser-Imaging-Einstellungen. Stellen Sie den Lichtpfad für Anregung/Emission für den grünen Dendra2 auf 486-553 nm und für den roten Dendra2 auf 580-740 nm ein. Passen Sie die Leistung und Verstärkung beider Kanäle/Laser entsprechend der Intensität des Fluorophors an. Ändern Sie nicht die digitale Verstärkung oder den Versatz und stellen Sie das Loch als vollständig geöffnet ein.
  2. Definieren Sie das Erfassungs-Setup: Wählen Sie einen sequenziellen Kanalmodus aus und wechseln Sie die Spur jedes Frames. Legen Sie den Scanmodus als Frame und die Rahmengröße auf 1.024 x 1.024 mit einem Linienschritt von 1 fest. Legen Sie die Mittelung auf 2 und den Mittelwert nach Methode und Modus der unidirektionalen Linie fest. Stellen Sie die Bittiefe auf 8 Bit ein.
  3. Definieren Sie die mehrdimensionalen Erfassungseinstellungen für die Konvertierung von Dendra2. Für die Umwandlung und Dasbleichung verwenden Sie den 405 nm Diodenlaser mit 60% Energieleistung. Wenn verfügbar, aktivieren Sie den sicheren BleichgaAsP, um die Detektoren zu schützen.
  4. Wählen Sie eine Zeitreihe von zwei Zyklen mit einem Intervall von 0,0 ms dazwischen und normalem Start und Stopp aus. Beginnen Sie mit dem Bleichen nach dem Scannen 1 von 2 und wiederholen Sie 30 Iterationen. Hören Sie auf zu bleichen, wenn die Intensität auf 50% sinkt.
  5. Definieren Sie die Geschwindigkeit der Erfassung/Pixelverweilung so schnell (z. B. maximal = 12) für die Konvertierung und mittlere Geschwindigkeit (z. B. Medium = 5) für die Aufnahme eines Fangbildes.
    HINWEIS: Die hier definierten Bleichparameter sind Richtlinien. Für andere Dendra2-markierte POIs müssen die Laserleistungseinstellungen und Bleichiterationen und -werte empirisch festgelegt werden.

5. Montage von C. elegans auf Mikroskopie-Dias

HINWEIS: Wenn möglich, legen Sie ein Montage-Stereomikroskop in der Nähe des konfokalen Mikroskop-Setups und montieren Sie die Nematoden kurz vor der Bildgebung.

  1. Zeichnen Sie auf der Glasabdeckung auf der gegenüberliegenden Seite des Agarose-Pads ein Fenster mit vier Quadraten mit einem permanenten Marker und nummerieren Sie es.
  2. Pipette 15 L Levamisol in der Mitte des Agarose-Pads. Die Konzentration von Levamisol variiert je nach Alter der Nematode: Wenn Bild4 Nematoden 2 mM Levamisol verwenden; wenn Bildtag 10 Nematoden 0,5 mM Levamisol verwenden.
  3. Vier Nematoden mit einem Drahtpickinz in die Flüssigkeit geben. Mit Hilfe einer Wimpernpickung bewegen Sie jeden einzelnen Nematoden vorsichtig auf ein Fensterquadrat. Schwenken Sie die Wimpern, so dass jede Spur von E. coli OP50 verdünnt wird und ihr fluoreszierender Hintergrund die Signalaufnahme nicht beeinträchtigt.
  4. Warten Sie, bis die Nematoden fast aufhören, sich zu bewegen, und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf auf die Flüssigkeit, um die Nematoden in der Schicht von Levamisol zwischen dem Agarose-Pad und dem Deckelschlupf zu immobilisieren.
  5. Platzieren Sie die umgekehrte Folie auf der konfokalen Bühne, um die Nematoden abzubilden.

6. Umwandlung des grünen Dendra2: Datenerfassung zum Zeitpunkt Null

HINWEIS: Die Puls-Chase-Experimente beginnen damit, das Dendra2-Fusionsprotein irreversibel von einem grün emittierenden Fluorophor in ein rotes zu wandeln.

  1. Mit dem Okular des Mikroskops, lokalisieren Sie die erste Nematode mit einem 20-fachen Objektiv unter grüner Fluoreszenz. Konzentrieren Sie sich auf den Kopf oder Schwanz und wechseln Sie in den konfokalen Modus.
  2. Starten Sie das Live-Laserscannen mit dem 488 nm blauen Laser, um den grünen Dendra2 im grünen EGFP-Kanal (ex/em = 486-553 nm) zu visualisieren. Wählen Sie ein einzelnes Neuron aus und rücken Sie es in den Fokus. Zoomen Sie in 3x und erhöhen Sie das Ziel desLaserstrahls 4.
    HINWEIS: Wählen Sie ein Neuron pro Nematode. Jedes Neuron bildet eine Probe oder einen Datenpunkt.
  3. Finden Sie die maximale Projektionsebene und, je nach Helligkeit des Fluorophors, erhöhen oder verringern Sie die Verstärkung oder Laserleistung, um ein gesättigtes, aber nicht überbelichtetes Bild zu erhalten, das durch den Farbbereichsindikator identifizierbar ist. Sobald dies definiert ist, beenden Sie den Scanvorgang.
    HINWEIS: Bestrahlen Sie die Probe nicht zu lange oder mit zu viel Leistung, da die Anregung mit sichtbarem blauen 488 nm Licht auch Dendra2 umwandeln kann, wenn auch langsam und weniger effizient4.
  4. Öffnen Sie in der Software die Registerkarte, um die Interessengebiete (ROIs) auszuwählen und einen ersten ROI um das ausgewählte Neuron zu zeichnen. Definieren Sie eine größere zweite Region von Interesse, die den Kopf der Nematode und den ersten ROI umfasst.
  5. Wählen Sie in den Bleicheinstellungen aus, ob der erste ROI erfasst, gebleicht und analysiert werden soll. Wählen Sie aus, ob der zweite ROI erfasst und analysiert, aber nicht gebleicht werden soll.
  6. Stellen Sie die Geschwindigkeit des Scannens auf das Maximum (d. h. schnelle Pixelverweilung) ein und starten Sie das Experiment, um die ausgewählten Dendra2-Neuronen zu konvertieren.
    HINWEIS: Sobald das Experiment abgeschlossen ist, führt das aufgenommene Bild zu zwei Bildern: einem vor und einem nach der Konvertierung. Für den grünen Kanal sollte das erste Bild ein höheres grünes Signal haben, das im zweiten Bild durch die Konvertierung des grünen Dendra2 abnimmt. Für den roten Kanal sollte das erste Bild negativ sein und kein Signal anzeigen, wobei ein rotes Signal im Nachversionsbild erscheint. Wenn das grüne Signal nicht nachlässt, ist die Konvertierung nicht erfolgt, und die Einstellungen, z. B. die 405-Laserleistung oder die Anzahl der Iterationen, sollten geändert werden. Wenn es ein rotes Signal im ersten Bild gibt, dann war die 488 nm Laserleistung zu hoch und ein Teil des grünen Dendra2 wurde bereits in Rot umgewandelt. In diesem Fall sollte ein neues Neuron/Nematode ausgewählt werden.
  7. Unmittelbar nach der Konvertierung starten Sie das Live-Scannen mit dem grünen 561 nm Laser, um Dendra2 im roten Kanal zu visualisieren (ex/em = 580-740 nm). Finden Sie den Fokus und die entsprechende maximale Projektion des konvertierten Neurons mit dem Bereichsfarbindikator, um eine Überbelichtung zu vermeiden.
  8. Stellen Sie die Scanrate schnell auf eine niedrigere Pixelverweilgeschwindigkeit (z. B. 5x) ein und erfassen Sie ein Schnappschussbild beider Kanäle mit einer höheren Auflösung. Dieses Bild wird nach der Konvertierung als Zeitpunkt Null (T0) definiert.
    HINWEIS: Die Aufnahmegeschwindigkeit für das konvertierte Bild kann variiert werden. Nach der Auswahl muss diese Geschwindigkeit jedoch während der gesamten Datenerfassung konstant bleiben.
  9. Speichern Sie den Scan mit einem identifizierbaren Namen und/oder einer identifizierbaren Nummer, gefolgt von der Zeit-Null-Beschriftung (T0).
    HINWEIS: Es ist ratsam, auch das Bild des Konvertierungsexperiments (Schritt 6.6) zu speichern, um das Fehlen eines roten Signals vor der Konvertierung und sein Anschließendes Aussehen zu veranschaulichen.

7. Bildgebung des konvertierten roten Dendra2 zur Datenerfassung zu einem ausgewählten zweiten Zeitpunkt

  1. Um den Dendra2-Abbau im Laufe der Zeit zu verfolgen, definieren Sie einen zweiten Zeitpunkt, um das gleiche Nematoden/Neuron neu abzubilden. Wählen Sie den zweiten Zeitpunkt experimentell aus, um relevante biologische Fragen zu behandeln. Für das hier beschriebene Protokoll wird Dendra2 sowohl bei 2 h (T2) als auch bei 24 h (T24) nach der Konvertierung abgebildet.
    1. Am gewählten Zeitpunkt finden Sie das gleiche Nematoden/Neuron mit der Verwendung des Okulars und der roten Fluoreszenz.
    2. Öffnen Sie das T0-Bild des jeweiligen Nematoden/Neurons und laden/wiederverwenden Sie die Bildeinstellungen. Stellen Sie sicher, dass die Erfassungseinstellungen des Snapshots beim Erfassen der T0-, T2- und T24 h-Images genau gleich sind.
    3. Scannen Live im roten Kanal, bringen Sie das konvertierte rote Neuron in den Fokus. Da der rote Dendra2 im Laufe der Zeit abnimmt, zeigt die Reichweitenanzeige eine weniger intensive maximale Projektion. Ändern Sie keine Erfassungsparameter und erhalten Sie einen Snapshot mit der gleichen Geschwindigkeit (z. B. 5x) wie das erste Bild.
  2. Um den Abbau von Dendra2 nach 4 h oder länger zu verfolgen, retten Sie die Nematoden nach der Konvertierung.
    1. Entfernen Sie den Dia sofort nach dem Konvertieren und der Abbildung der vier Nematoden aus dem Mikroskop. Entfernen Sie vorsichtig den Coverslip und heben Sie mit einem Drahtpickel jede Nematode aus dem Agarose-Pad.
    2. Legen Sie jede Nematode einzeln auf eine entsprechend gekennzeichnete und identifizierbare NGM-Platte.
    3. Montieren Sie das Nematode zum zweiten Zeitpunkt wieder auf ein frisches Agarosepad und fahren Sie mit der Abbildung des umgebauten roten Dendra2 nach den Anweisungen in Abschnitt 6 fort.

8. Bildanalyse des konvertierten Dendra2

HINWEIS: Die Analyse des Abbaus von Dendra2 wird mit Fidschi/ImageJ Software20durchgeführt.

  1. Öffnen Sie Fidschi und ziehen Sie die .lsm-Datei in die Fidschi-Leiste. Öffnen Sie das Direkt nach der Konvertierung aufgenommene T0-Bild und das Bild desselben Nematodens, das am ausgewählten Zeitpunkt nach der Konvertierung aufgenommen wurde (T2 oder T24 h).
    HINWEIS: Um den Abbau des zu Dendra2 verschmolzenen Proteins zu verfolgen, muss nur der rote Kanal analysiert werden.
  2. Legen Sie die Messparameter aus dem Menü fest: Analysieren | Messen einstellen. Wählen Sie die Funktionen Fläche und integrierte Dichte aus.
  3. Wählen Sie das Bild aus, das mit dem roten Kanal erhalten wurde. Wählen Sie das Polygonauswahlwerkzeug in der Fidschi-Leiste aus.
  4. Identifizieren Sie das konvertierte Neuron auf dem T0-Bild und zeichnen Sie mit dem Auswahltool einen ROI um sie herum.
    1. Um die Konturen des Neurons richtig zu identifizieren, markieren Sie die Intensitätsschwellen, indem Sie aus dem Balken Bild | Anpassen | Schwellenwert. Ziehen Sie den Balkencursor, um den Schwellenwert abzugrenzen und diesen Bereich mit dem Polygonwerkzeug zu verfolgen. Um einen genauen ROI zu erzeugen, ist es auch möglich, die Kontur des ausgewählten Neurons aus dem grünen Kanal zu verwenden.
  5. Sobald die Auswahl im Fenster des roten Kanals vorgenommen wurde, drücken Sie Analysieren | Maßnahme. Ein Popupfenster mit dem Namen Ergebnisse wird angezeigt und enthält die ROI-Werte für Area, IntDenund RawIntDen.
  6. Führen Sie den gleichen Auswahl- und Messprozess für das Bild des zweiten Zeitpunkts (T2 oder T24 h) durch.
  7. Kopieren Sie die erhaltenen Werte in eine Tabellenkalkulationssoftware, wobei Sie darauf achten, die Werte nach der Konvertierung bei T0 und nach der Konvertierung bei T2 oder T24 h entsprechend aufzuzeichnen.

9. Berechnung des Verhältnisses der Dendra2-Degradation

  1. Um das Abbauverhältnis zu berechnen, weisen Sie zunächst einen Wert von 1 (oder 100%) zu. zeit, um die Degradation vom Zeitpunkt Null (d.h. kurz nach der Konvertierung, wenn alle roten Dendra2 konvertierten ist noch vorhanden). Dies ergibt sich aus der Aufteilung des Wertes von IntRawDen von T0 selbst.
  2. Um die Reduktion des roten Dendra2-Intensitätssignals im Zeitverlauf und den Abbau zu berechnen, dividieren Sie den Wert von RawIntDen des zweiten Zeitpunkts (z. B. T2 oder T24 h) durch den Wert des RawIntDen von T0. Die resultierende Zahl sollte kleiner als 1 sein. Diese Werte können auch als Prozentsätze ausgedrückt werden, indem T0 als 100 % definiert wird.
  3. Wiederholen Sie Abschnitt 7 für jede konvertierte Nematode. Für eine grafische Darstellung des Abbaus von Dendra2, diagrammen Sie ein Streudiagramm oder Balkendiagramm mit den Prozent- oder Verhältniswerten der Fluoreszenzabnahme, die in der y-Achse erhalten wurde. Wenden Sie die gewünschte statistische Analyse an und veranschaulichen Sie sie im Diagramm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Zwei Nematodenstämme, die das Huntingtin-Exon-1-Proteinfragment im Rahmen mit dem photoconvertibleprotein Dendra2 exzessierten, wurden durch Mikroinjektion erhalten und die Plasmide wurden als extrachromosomales Array gehalten. Das Fusionskonstrukt wurde im gesamten C. elegans Nervensystem von der Entwicklung während des alternden Alterung ausgedrückt. Hier enthielt HTT-D2 entweder die physiologische 25 Polyglutamin-Dehnung (HTTQ25-D2, Abbildung 1A) oder eine vollständig penetrante und pathogene Wiederholung mit 97 Glutaminen (HTTQ97-D2, Abbildung 1B). Zunächst wurde das Fusionsprotein getestet, um sicherzustellen, dass es bei UV-Bestrahlung von seinem grünen auf sein rotes Spektrum umgestellt wurde. HTT-D2 wurde erfolgreich von Grün auf Rot ausschließlich im beleuchteten Bereich umgestellt. Je nach Leistung und Iteration des UV-Impulses und je nach Z-Ebene und Penetranz des Laserstrahls durch die Nagelhaut des Nematoden wurde ein definierter Teil des HTT-D2 umgewandelt, aber nicht alle. Ein rotes Signal erschien innerhalb der fotokonvertierten Neuronen, kolokalisierend mit dem grünen nicht konvertierten HTT-D2 (Abbildung 1C,D). Durch die Genauigkeit der Laserscanning-Photonenstrahlen war es möglich, einen präzisen ROI entsprechend einem einzelnen Neuron umzuwandeln. Vor der Konvertierung war kein rotes Signal sichtbar, wenn die Probe im roten Kanal angeregt wurde (Abbildung 2A). Bei UV-Bestrahlung verringerte sich das grüne Signal, als HTT-D2 umgewandelt wurde und schließlich ein rotes Signal erschien (Abbildung 2B). HTT-D2 wurde dann im Laufe der Zeit abgebaut, was zu einer Verringerung der Roten HTT-D2 (Abbildung 2C) und einer möglichen Erhöhung des grünen HTT-D2-Signals führte, da mehr Fusionsprotein neu synthetisiert wurde. Da ein signifikanter Rückgang bereits bei 2 h nach der Konvertierung deutlich war, wurde dieses Intervall zur Erkennung und Quantifizierung des Abbaus von HTT-D2 beibehalten. Es ist wichtig zu beachten, dass degradation nicht der einzige Prozess ist, der nach der Konvertierung von HTT-D2 auftreten kann. Die umgebaute HTT-D2 konnte mit Axonen befahren und transportiert werden, was zu einer Abnahme des roten Signals führte, das nicht auf die Räumung zurückzuführen ist. Bei den hier verwendeten Einstellungen und über die kurze Zeitspanne von 2 h wurde jedoch keine Ausbreitung des roten Signals beobachtet, möglicherweise aufgrund der Tatsache, dass wenig HTT-D2 vom Soma zum Axon verschoben wurde. Darüber hinaus half die Umwandlung und Abbildung eines einzelnen neuronalen Soma, die Auswirkungen der HTT-D2-Diffusion innerhalb desselben Neurons auszuschließen, da alle zellulären Kompartimente gleichzeitig analysiert wurden. Um sowohl Diffusion als auch Transport/Handel zu untersuchen, ist es ratsam, schnelle und höhere Vergrößerungsbilder zu erhalten und einen kleineren und möglicherweise mehr motilen Anteil des Proteins von Interesse zu verfolgen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass jedes Tier innerhalb einer Reihe von Experimenten eine biologische Wiederholung darstellte. Es wurde nur ein Neuron pro Nematode abgebildet, jedes Tier wurde einmal pro Sitzung abgebildet, und die Bildgebung erfolgte über drei Sitzungen, die technische Wiederholungen darstellten. Die drei Sitzungen erforderten, dass die Tiere vor jedem Experiment entweder am 4. oder 10. Tag auf frischen Platten synchronisiert werden, so dass die Umweltvariabilität den Nematoden auferlegt wird. Drei Sitzungen berücksichtigen auch die Variabilität, die sich aus der Bildgebung ergibt (z. B. die Laserleistung variiert aufgrund einer unterschiedlichen Temperatur zwischen den Experimenten). Alle biologischen Replikate, die während der drei Sitzungen (mindestens 20 Tiere) gewonnen wurden, wurden als Einzelproben betrachtet und zur Feststellung der statistischen Signifikanz verwendet.

Nach der Bestätigung der Wirksamkeit der beiden C. elegans HTT-D2-Stämme und der Festlegung der optimalen Umwandlungsparameter wurden die Unterschiede zwischen dem Umsatz eines krankheitserregenden HTT-D2-Proteins (d. h. HTTQ97-D2) im Vergleich zu seiner physiologisch relevanten Kontrolle (HTTQ25-D2) untersucht. Zunächst wurde der Abbau von HTT-D2 in verschiedenen Neuronen beobachtet (Abbildung 3). Es ist bekannt, dass Subtypen von Neuronen innerhalb des Nervensystems der Nematode in ihrer metabolischen Aktivität und Morphologievariieren 21, möglicherweise einen Unterschied in der Degradation und Neuausrichtung des Proteoms. Die Neuronen der Schwanzregion wurden mit denen des Kopfes verglichen und erwiesen sich als deutlich aktiver (Abbildung 3A). Dieser Befund galt nur für HTTQ25-D2 und nicht für pathogene HTTQ97-D2, was darauf hindeutet, dass der PN nicht in der Lage war, HTT-D2 zu entfernen, das längere Glutamindehnungen im gesamten Nervensystem enthält (Abbildung 3B).

Um weiter zu bestätigen, dass sich das Modellsystem wie erwartet verhielt, wurden über einen längeren Zeitraum Umwandlungsexperimente durchgeführt, die es den Abbaupfaden der Zellen ermöglichten, das von Interesse beaufstandete Protein fast vollständig zu eliminieren (Abbildung 4). Tatsächlich gab es nach der Umwandlung signifikant mehr Verschlechterung der Kontrolle HTTQ25-D2 24 h als nach 2 h in den Kopfneuronen und weit mehr in den Schwanzneuronen (Abbildung 4A). Auch hier entfernten die hinteren Schwanzneuronen aktiver rote HTT-D2, auch über einen erhöhten Zeitraum. Ein ähnlicher Trend wurde für das krankheitserregende HTTQ97-D2 festgestellt, mit einer sehr leichten Reduktion des roten HTT-D2-Signals über 24 h. HTTQ97-D2 wurde jedoch nicht so leicht entfernt wie HTTQ25-D2, insbesondere nach 24 h. Es kann sein, dass nur die lösliche HTTQ97-D2 Fraktion effizient abgebaut wird, was für die anfängliche Abnahme des roten Signals und seine weitere milde Abnahme im Laufe der Zeit verantwortlich ist. Wichtig ist, dass es nach 24 h zwei Populationen von Neuronen gab: eine mit einer höheren Abbaurate und eine, bei der das rote HTT-D2-Signal überhaupt nicht abgebaut oder potenziell sogar erhöht wurde (Abbildung 4B). Erhöhtes und stabiles Signal stellen möglicherweise bereits aggregierte oder kontinuierlich aggregierte Arten dar, die aufgrund ihrer eng gepackten Amyloid-Natur wesentlich schwieriger aus den Zellen zu räumen waren. Diese Einschlüsse, die ausschließlich dann vorhanden sind, wenn Glutamin-Strecken die 40-Wiederholungsschwelle überschreiten und die mikroskopisch als Brennpunkte erschienen, wurden als Ablagerungen vermutet, die nicht leicht entfernt werden können22. Es ist auch möglich, dass eine Erhöhung des roten Fluoreszenzsignals ein Artefakt war, das aus technischen Problemen resultierte (z. B. Verwendung falscher Erfassungsparameter, unterdurchschnittliche Leistung des Mikroskopisierungs-Setups oder ein fehlerhafter Wiederherstellungs-/Montageprozess). Bei der Erfassung von Bildern über längere Zeiträume müssen diese Variablen berücksichtigt werden.

Schließlich, weil neurodegenerative Erkrankungen wie Huntington im Erwachsenenleben manifestieren, wurde die Wirkung des Alterns auf die Rate der HTT-D2-Degradation beobachtet. Konvertierungsexperimente wurden in den Kopf- und Schwanzregionen von jungen (Tag 4) im Vergleich zu alten (Tag 10) Nematoden in beiden HTT-D2-Stämmen durchgeführt (Abbildung 5). Für die Kopfneuronen, Es gab keine signifikante Änderung in der Rate der Abbau durch Alterung während der Lebensdauer von HTTQ25-D2 und HTTQ97-D2, möglicherweise, weil HTT-D2 wurde gleichmäßig während der gesamten Lebensdauer jedes Nematoden entfernt. Beim Vergleich alter Nematoden, die entweder eine pathologische oder eine physiologische Glutamindehnung enthalten, wurde jedoch eine sehr signifikante Veränderung festgestellt. HTTQ97-D2 wurde nicht so effizient abgebaut wie HTTQ25-D2, was die Unfähigkeit des PN unterstreicht, aggregierte und möglicherweise toxische Arten von Huntingtin in älteren Nematoden zu entfernen (Abbildung 5A). Auch hier wurde ein aktiverer und signifikanter Erdumschlag in den Schwanzneuronen beobachtet. Wie bei den Kopfneuronen wurde ein robusterer Umsatz von HTTQ25-D2 in den Schwanzneuronen junger Nematoden im Vergleich zur älteren Kohorte nicht beobachtet, und der Abbau war an Tag 4 und Tag 10 gleich. Umgekehrt traten signifikante Veränderungen der Abbauraten zwischen der Kontrolle und den pathogenen HTT-D2-Stämmen in jungen Tag 4 Nematoden auf und wurden an Tag 10 noch signifikanter. Wichtig ist, dass Schwanzneuronen in der Lage waren, mit toxischen HTTQ97-D2 in jungen Nematoden fertig zu werden, was veranschaulicht, dass verschiedene gleichzeitige PN-Mechanismen am Werk sein könnten, um HTT-D2 zu entfernen (Abbildung 5B). Insgesamt nahm die PN-Aktivität im Laufe der Zeit ab, möglicherweise aufgrund nachteiliger Auswirkungen, die sowohl durch das Altern als auch durch das Vorhandensein von Aggregaten verursacht wurden.

Figure 1
Abbildung 1: C. elegans exprimiertes Huntingtin exon-1 verschmolzen zu Dendra2 im Nervensystem. (A) Jung, Tag 4 C. elegans pan-neuronal exon-1 mit 25 Glutaminen, verschmolzen zu Dendra2 in seinem unkonvertierten grünen Anregungs-/Emissionszustand. Skala bar = 100 m. Insets zeigen ein vergrößertes Bild des Kopfes (oben) und der Schwanz (unten) Neuronen. Inset scale bar = 10 m. (B) Jung, Tag 4 C. elegans pan-neuronal exzierend Huntingtin Exon-1 mit 97 Glutaminen, verschmolzen zu Dendra2 in seinem unkonvertierten grünen Erregungs-/Emissionszustand. Skala bar = 100 m. Insets zeigen ein vergrößertes Bild des Schwanzes (oben) und des Kopfes (unten) Neuronen, und der Kopf eines Tages 7 Nematoden (ganz rechts). Einschub-Skala-Bar = 10 m. Weiße Pfeilspitzen zeigen auf HTTQ97-D2-Brennpunkte, die Huntingtin-Aggregate darstellen. (C) Kanalzusammenführungsbild von HTTQ25-D2 mit Konvertierung des Kopfbereichs. Box stellt den Teil des gesamten C. elegans dar, der UV-bestrahlt wurde. Skala bar = 100 'm. Inset zeigt die Dendra2-Emission bei 488 nm (oben, grün) und die bei 561 nm (unten, rot). Skala bar = 10 m. (D) Kanalzusammenführungsbild von HTTQ97-D2 mit Konvertierung des Kopfbereichs. Skala bar = 100 m. Box stellt den Teil der gesamten C. elegans dar, der UV-bestrahlt wurde. Inset zeigt die Dendra2-Emission bei 488 nm (oben, grün) und die mit 561 nm (unten, rot). Maßstabsleiste = 10 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Konvertiertes rotes HTT-D2 verringerte sich im Laufe der Zeit in einzelnen Neuronen. Schwanzneuronen von HTTQ25-D2. Zwei Neuronen werden gleichzeitig und unabhängig fotokonvertiert gezeigt. Bilder zeigen sequenziell drei Zeitpunkte: (A) Vor der Bestrahlung (vor), (B) unmittelbar nach der Bestrahlung (Umwandlung) und (C) 2 h nach Bestrahlung (nach). Oberpanel (grüner Kanal) stellt HTT-D2 Signal bei 486-553 nm Anregung/Emission gesammelt. Die weiße Region von Interesse umgibt die neuronen, die bestrahlt wurden. Das mittlere Panel (roter Kanal) zeigt das konvertierte HTT-D2-Signal, das bei 580-740 nm Anregung/Emission gesammelt wird. Das untere Panel ist eine Zusammenführung der beiden Kanäle. Skalenbalken = 5 m für alle Bilder. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Kopf- und Schwanzneuronen wiesen unterschiedliche Abbauraten auf. Spaltenbalkendiagramme zeigen den Prozentsatz der roten Intensität relativ zum Anfangswert zum Zeitpunkt der Konvertierung (d. h. 100 %). Konvertiertes rotes Dendra2-Signal verringerte sich insgesamt über das 2 h-Intervall, da HTT-D2 innerhalb der Neuronen von C. elegansabgebaut wurde. Innerhalb des Nervensystems der Nematode zeigten neuronale Subtypen unterschiedliche Abbauraten, wobei Schwanzneuronen einen aktiveren Umsatz zeigten, aber nur bei Nematoden, die eine nicht pathogene Polyglutamindehnung trugen. (A) Quantifizierung des Abbaus in HTTQ25-D2 Kopf-gegen-Schwanz-Neuronen. Mittleres SD, ungepaarter zweischwanzer Student-T-Test. N = 23-28 Samples/Nematoden pro Region abgebildet, *P < 0,05. (B) Quantifizierung des Abbaus in HTTQ97-D2 Kopf-gegen-Schwanz-Neuronen. Mittleres SD, ungepaarter zweischwanzer Student-T-Test. N = 23-28 Samples/Nematoden pro Region abgebildet, ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: HTTQ97-D2 wurde nach 24 h nicht signifikant gelöscht. Spaltenbalkendiagramme zeigen den Prozentsatz der roten Intensität relativ zum Anfangswert zum Zeitpunkt der Konvertierung (d. h. 100 %). Konvertiertes rotes Dendra2-Signal verringerte sich, da HTT-D2 innerhalb der Neuronen von C. elegansabgebaut wurde. HTT-D2 zeigte unterschiedliche Abbauraten. Auch über längere Zeiträume nach der Umstellung konnte der pathogene HTT-D2 im Vergleich zu seiner gesunden Kontrolle nicht entfernt werden. (A) Quantifizierung der Abbaurate in HTTQ25-D2 zu zwei Zeitpunkten nach Umwandlung (2 h und 24 h) in Kopf- und Schwanzneuronen. Mittelwert - SD, einwegige Varianzanalyse (ANOVA). N = 21-28 Samples/Nematoden pro Zeit/Region abgebildet, *P < 0,05, ****P < 0,0001. (B) Quantifizierung der Abbaurate in HTTQ97-D2 zu zwei Zeitpunkten nach Umwandlung (2 h und 24 h) in Kopf- und Schwanzneuronen. Mittelwert sD, einwegige Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Multiple Comparison Post-hoc-Test.  N = 21-28 Samples/Nematoden pro Zeit/Region abgebildet, ns = nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Alte und junge Nematoden, die das pathogene HTT-D2 exdrücken, haben es nicht effizient abgebaut. Spaltenbalkendiagramme zeigen den Prozentsatz der roten Intensität relativ zum Anfangswert zum Zeitpunkt der Konvertierung (d. h. 100 %). Konvertierte rote Dendra2 Signal verringert, wie HTT-D2 wurde innerhalb der Neuronen abgebaut. Als das Nematode alterte, wurde seine Fähigkeit, pathogene HTT-D2 zu degradieren, zusätzlich im gesamten Nervensystem beeinträchtigt. (A) Quantifizierung der Abbaurate in den Kopfneuronen junger (Tag 4) und alter (Tag 10) HTTQ25-D2-Nematoden im Vergleich zu altersgerechten HTTQ97-D2-Nematoden. Mittelwert - SD, einwegige Varianzanalyse (ANOVA). N = 23-28 Proben/Nematoden pro Stamm/Tag, ****P < 0,0001. (B) Abbaurate 2 h nach Umwandlung in die Schwanzneuronen von jungen (Tag 4) und alten (Tag 10) HTTQ25-D2 Nematoden, im Vergleich zu altersgerechten HTTQ97-D2 Nematoden. Mittelwert sD, einwegige Varianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Tukeys Multiple Comparison Post-hoc-Test. N = 23-28 Samples/Nematoden pro Stamm/Tag, *P < 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seine Synthese, Seinen Standort und seine Degradation zu verstehen. Mit der Entwicklung neuartiger, stabiler und heller FPs ist die Visualisierung und Überwachung von POIs einfacher und effizienter geworden. Genetisch exprimierte Fusions-PAFPs wie Dendra2 sind einzigartig positioniert, um die Stabilität eines POI zu untersuchen. Bei der Exposition gegenüber lila-blauem Licht bricht Dendra2 an einer genauen Stelle innerhalb eines Dreiklangs konservierter Aminosäuren. Das Fluorophor erfährt einen kleinen Strukturwandel, was zu einer vollständigen Verschiebung der Spektren von grün auf rot23führt. Diese Verschiebung ermöglicht die Erkennung und Überwachung von POI, die mit Dendra2 verbunden sind. Tatsächlich wurden diese Fusionskonstrukte zuerst verwendet, um eine C. elegans Reporter-Sorte zu erstellen, um das Ubiquitin-Proteasom-System in vivo16zu untersuchen. Dendra2 wurde auch eingesetzt, um die Verletzlichkeit selektiver neuronaler Subtypen und ihre Fähigkeit zu verstehen, mit erweiterten Polyglutaminproteinen umzugehen24, oder die Induktion der Autophagie in Modellen der motorischen Neuronenkrankheit zu überwachen25.

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, um in vivo den Abbau von Huntingtin, einem krankheitsbedingten Aggregations-anfälligen Protein, auf nichtinvasive Weise zu überwachen. Nach der erfolgreichen Generierung eines neuronalen C. elegans Modells der Huntington-Krankheit, das HTT-D2 panneuronal exzessikulierte, wurden die Abbauraten von expandiertem und pathogenem HTT im Vergleich zu seinem physiologischen Pendant quantifiziert. Auffällige Unterschiede wurden zwischen neuronalen Subtypen, zwischen jungen und alten Nematoden und zwischen der Fähigkeit des PN beobachtet, mit toxischen Glutaminbelastungen im Laufe der Zeit umzugehen. Diese Technik kann auch angewendet werden, um den Ort und die Bewegung von Huntingtin sowie sein Schicksal zu verfolgen, wenn Störungen gegenüber dem PN eingeführt werden. siRNA-Knockdown von Schlüsselchaperonen oder Verabreichung von Verbindungen, die die Proteasomaktivität hemmen, können die Funktion und Bedeutung dieser Komponenten in aggregationsanfälligen Proteinen aufdecken: zum Beispiel, ob der PN bestimmte Knoten aktiviert, um Mängel auszugleichen26. Es kann auch die schädlichen Auswirkungen durch eine Krankheit im Vergleich zu denen des normalen Alterns verursacht erklären.

Obwohl viele verschiedene Fragen mit dieser Technik beantwortet werden können, müssen, sobald ein gewünschtes Modell generiert wurde, korrekte Konvertierungs- und Erkennungsparameter festgelegt werden, um zuverlässige Daten zu erhalten. Entscheidend ist auch die Bestimmung von Umwandlungseinstellungen, die eine ausreichende Ausbeute an aktiviertem Protein ohne Photobleich- oder Phototoxizität und ohne unerwünschte Umwandlung ermöglichen. Darüber hinaus ist es für jedes untersuchte Protein innerhalb eines spezifischen Modellsystems, entweder ex vivo oder in vivo, notwendig, experimentell einen ausreichend großen Zeitraum festzulegen, um eine genaue Quantifizierung der Abbaurate zu ermöglichen.

Dendra2 bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber anderen PAFPs: 1) es ist monomeric und sehr hell; 2) es hat eine kontrastreiche Photokonvertierung und ein stabiles fotokonvertiertes Signal; 3) es kann mit geringer Phototoxizität durch einen blauen 488 nm Laser aktiviert werden, der Teil der meisten konfokalen Hardware-Setups ist; 4) es reift effizient bei 37 °C für die Anwendung in Säugetierzellen; 5) es hat keine toxischen Nebenwirkungen, wenn es für längere Zeitausgedrückt 23,27; und 6) das System wird nicht durch Variationen der Expressionsniveaus zwischen oder innerhalb eines Organismus oder einer Zelle beeinflusst, da nur das Verhältnis des Dendra2-Signals vor und nach der Umwandlung quantifiziert wird. Alle aufgeführten Eigenschaften machen Dendra2 zu einem idealen Fluorophor, um die Proteindynamik in Echtzeit zu verfolgen und das Zellschicksal zu überwachen.

Leider leiden Dendra2-Fusionsproteine unter einigen häufigen Einschränkungen der Fluoreszenz-Proteinkennzeichnung. Das Konstrukt ist eine chimäre Art, die in biologischen Systemen oft experimentell überexprimiert wird, obwohl die endogene Expression durch genomische Technik festgestellt werden könnte. Die Abbaurate von Dendra2 selbst beeinflusst potenziell den Abbau des Zielproteins, obwohl es als hochstabiles, langlebiges Protein beschrieben wurde27. Darüber hinaus ist Dendra2 nicht geeignet, Proteine mit sehr schnellen Umsätzen zu verfolgen, da es möglicherweise keine Zeit für seine eigene richtige Reifung hat. Schließlich werden 405 nm Laser, die selten sind, für effizientes Photoswitching bevorzugt, obwohl sie giftiger für die Probe sind. In der Tat kann weniger phototoxisches blaues Licht verwendet werden, um sowohl grünes Dendra2 zu visualisieren und zu konvertieren, wenn die Laserleistung bei hoher Intensität ist. Diese besondere Eigenschaft sollte immer im Auge behalten werden, da eine längere Exposition zu unerwünschten Umwandlungen und potenziell falschen Messungen führt. Schließlich kann es problematisch sein, Dendra2 in Kombination mit grünen oder roten Fluorophoren zu verwenden. Es stehen jedoch viele verschiedene PAFPs zur Verfügung, um die Dynamik mehrerer Proteine gleichzeitig zu untersuchen.

Experimente, die Dendra2 und andere PAFPs verwenden, wurden mit der Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichung (FRAP) und radioaktiven Puls-Chase-Etikettierungstechniken in Verbindung gebracht. In einer FRAP-Einstellung ist es unmöglich, Proteine, die wieder in einen ROI eindringen, von neu gebildetem fluoreszierendem Protein zu unterscheiden, und eine ständige Überwachung und Visualisierung der Probe ist erforderlich. Mit Dendra2 werden zwei klar unterscheidbare Populationen erzeugt, die im Laufe der Zeit unabhängig beobachtet werden können, so dass die ersetzte und neu synthetisierte "inaktive" Form des grünen Dendra216nachverfolgt und quantifiziert werden kann. Dendra2 ist auch eine nützliche Sonde in der Superauflösungsmikroskopie wie der gesamten inneren Reflexionsfluoreszenzmikroskopie (TIRF)28 und der Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie (PALM)29. In naher Zukunft werden solche Fortschritte eine bessere Lokalisierung und potenziell einzelne Molekülverfolgung eines beliebigen POI ermöglichen, so dass subtilere Unterschiede innerhalb und zwischen Proben aufgedeckt werden können und letztendlich neue Informationen über das Leben und Schicksal eines poI innerhalb eines biologischen Systems liefern.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Imaging Core Facility des Leibniz-Forschungsinstituts für Molekulare Pharmakologie Berlin (FMP) für die Bereitstellung der Bildgebung. Darüber hinaus möchten wir uns bei Diogo Feleciano bedanken, der das Dendra2-System im Labor aufgebaut und Anweisungen gegeben hat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85, (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24, (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42, (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1, (1), 15005 (2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7, (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70, (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10, (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10, (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48, (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9, (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42, (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5, (4), 105 (2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101, (6), 1522-1528 (2011).
In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter <em>C. Elegans</em> mit Photoconvertible Dendra2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter