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Biology

फोटोवर्टिबल Dendra2 का उपयोग कर एजिंग सी Elegans में प्रोटीन कारोबार के वीवो क्वांटिफिकेशन में

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

यहां प्रस्तुत प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल है जो फोटोकंवर्टिबल फ्लोरोफोर Dendra2 को फ्यूज किया गया है।

Abstract

प्रोटीन को होमोस्टेसिस बनाए रखने के लिए एक कोशिका के भीतर लगातार संश्लेषित और अपमानित किया जाता है। ब्याज की एक प्रोटीन के क्षरण की निगरानी करने में सक्षम होने के नाते न केवल अपने जीवन चक्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क में असंतुलन को उजागर करने के लिए । इस विधि से पता चलता है कि रोग पैदा करने वाले प्रोटीन हंटिंगटिन के क्षरण को कैसे ट्रैक किया जाए। Dendra2 से जुड़े हंटिंगटिन के दो संस्करण सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में व्यक्त किए जाते हैं: एक शारीरिक संस्करण या ग्लूटामाइंस के विस्तारित और रोगजनक खिंचाव के साथ एक। Dendra2 एक फोटोवर्टिबल फ्लोरोसेंट प्रोटीन है; एक छोटे पराबैंगनी (यूवी) विकिरण नाड़ी पर, Dendra2 हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्तेजन/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा स्विच । नाड़ी-चेस प्रयोग के समान, परिवर्तित लाल-Dendra2 के कारोबार की निगरानी और मात्रा निर्धारित की जा सकती है, चाहे नए संश्लेषित हरे-Dendra2 से हस्तक्षेप कुछ भी हो। कॉन्फोकल-आधारित माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना और सी एलिगेंसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता के कारण, जीवित, उम्र बढ़ने वाले जीव में हंटिंगटिन-Dendra2 के क्षरण की निगरानी और मात्रा निर्धारित करना संभव है। न्यूरोनल हंटिंगटिन-Dendra2 को रूपांतरण के तुरंत बाद आंशिक रूप से अपमानित किया जाता है और समय के साथ आगे मंजूरी दे दी जाती है। गिरावट को नियंत्रित करने वाली प्रणालियों में उत्परिवर्ती हंटिंगटिन की उपस्थिति में कमी होती है और उम्र बढ़ने के साथ और बिगड़ा होता है। एक ही तंत्रिका तंत्र के भीतर न्यूरोनल उपप्रकार हंटिंगटिन-Dendra2 के लिए विभिन्न कारोबार क्षमताओं का प्रदर्शन करते हैं। कुल मिलाकर, Dendra2 के लिए जुड़े ब्याज के किसी भी प्रोटीन की निगरानी न केवल इसके क्षरण और इसमें शामिल प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क के खिलाड़ियों पर महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकते हैं, लेकिन यह भी अपने स्थान, तस्करी, और परिवहन पर ।

Introduction

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जीव-जीव का प्रोटेम लगातार खुद का नवीनीकरण कर रहा है। प्रोटीन को कोशिका की शारीरिक मांग के अनुसार लगातार अपमानित और संश्लेषित किया जाता है। कुछ प्रोटीन जल्दी खत्म हो जाते हैं, जबकि अन्य लंबे समय तक रहते हैं। आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपीएस) का उपयोग करते समय प्रोटीन गतिशीलता की निगरानी करना एक सरल, अधिक सटीक और कम आक्रामक कार्य है। एफपीएस ऑटोटैक्टिटिक रूप से बनाते हैं और किसी भी प्रोटीन ऑफ इंटरेस्ट (पीओआई) में शामिल हो सकते हैं, लेकिन एंजाइमों को गुना करने की आवश्यकता नहीं है या ऑक्सीजन1के लिए कोफैक्टर बचाने की आवश्यकता नहीं है। एफपीएस की एक नई पीढ़ी को हाल ही में निर्धारित तरंगदैर्ध्य की हल्की नब्ज के साथ विकिरण पर रंग स्विच करने के लिए इंजीनियर किया गया है। ये फोटोएक्टिवेट एफपीएस (PAFPs) पीओआई, या ऑर्गेनेल्स या कोशिकाओं की लेबलिंग और ट्रैकिंग के लिए अनुमति देते हैं, और उनके मात्रात्मक और/या गुणात्मक मापदंडों की जांच करने के लिए2। एफपीएस किसी भी पीओआई के आंदोलन, दिशात्मकता, लोकोमोशन की दर, प्रसार के गुणांक, मोबाइल बनाम स्थिर अंशों को ट्रैक करना संभव बनाते हैं, यह समय एक सेलुलर डिब्बे में रहता है, साथ ही साथ इसकी कारोबार दर भी। विशिष्ट ऑर्गेनेल्स के लिए, लोकोमोशन और परिवहन, या विखंडन और संलयन घटनाओं का निर्धारण किया जा सकता है। एक विशेष सेल प्रकार के लिए, एक सेल की स्थिति, विभाजन की दर, मात्रा, और आकार स्थापित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण रूप से, PAFPs का उपयोग निरंतर दृश्य के बिना और किसी भी नए सिंथेटीकृत जांच से हस्तक्षेप के बिना ट्रैकिंग की अनुमति देता है। कोशिकाओं और पूरे जीवों दोनों में अध्ययन सफलतापूर्वक PAFPs को नियोजित किया है, जैसे कैंसर और मेटास्टेसिस के विकास, विधानसभा या साइटोस्केलेटन के disassembly, और आरएनए-डीएनए/प्रोटीन इंटरैक्शन3। इस पांडुलिपि में, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग के सी एलिगेंस मॉडल में वीवो में एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन हंटिंगटिन (एचटीटी) की कारोबार दरों को उजागर करने के लिए हल्के माइक्रोस्कोपी और पीएएफपी का उपयोग किया जाता है।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल फ्यूजन प्रोटीन हंटिंगटिन-Dendra2 (HTT-D2) की स्थिरता और गिरावट की मात्रा। Dendra2 एक दूसरी पीढ़ी के मोनोमेरिक PAFP4 है कि अपरिवर्तनीय या तो यूवी या दिखाई नीली रोशनी के जवाब में हरे रंग से लाल करने के लिए अपने उत्सर्जन/उत्तेजन स्पेक्ट्रा स्विच, ४,०००-गुना5, 6,6तक की तीव्रता में वृद्धि के साथ । हंटिंगटिन हंटिंगटन रोग (एचडी) के कारण, एक घातक वंशानुगत न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार के कारण जिम्मेदार प्रोटीन है। हंटिंगटिन एक्सान-1 में ग्लूटामाइंस (सीएजी, क्यू) का खिंचाव होता है। जब प्रोटीन 39Q से अधिक के साथ व्यक्त किया जाता है, यह एक उत्परिवर्ती, विषाक्त, और रोगजनक प्रोटीन में गलत गुना । उत्परिवर्ती एचटीटी एकत्रीकरण से ग्रस्त है और न्यूरोनल सेल मृत्यु और पतन की ओर जाता है, या तो छोटी अल्पाहारिक प्रजातियों के रूप में या बड़े अत्यधिक संरचित एमिलॉयड7के रूप में।

नेमाटोड उम्र बढ़ने और न्यूरोडिजेनरेशन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली है, जो इसकी हेरफेर की आसानी, आइसोजेनिक प्रकृति, छोटी उम्र और इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता8के लिए धन्यवाद है। वीवो में एचटीटी की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए, सी एलिगेंसके तंत्रिका तंत्र में एक संलयन निर्माण व्यक्त किया गया था। एक एचटीटी-डी 2 ट्रांसजीन जिसमें या तो 25Qs (HTTQ25-D2) का शारीरिक खिंचाव या 97Qs (HTTQ97-D2) का एक रोग खंड है, जो नेमाटोड के जीवनकाल9में पैन-न्यूरोनैली से अधिक है। लाइव सी एलिगेंस को प्रकाश के एक संक्षिप्त और केंद्रित बिंदु पर अधीन करके, एक न्यूरॉन फोटोस्विच किया जाता है और परिवर्तित एचटीटी-डी 2 को समय के साथ ट्रैक किया जाता है। एचटीटी-डी2 अवक्रमित की मात्रा स्थापित करने के लिए, हौसले से परिवर्तित एचटीटी-डी2 के रेड सिग्नल के बीच अंतर की तुलना निर्धारित अवधि के बाद एचटीटी-डी2 के शेष रेड सिग्नल से की जाती है । इसलिए, यह जांच करना संभव हो जाता है कि इसके शारीरिक रूप की तुलना में इसके विस्तारित और जहरीले रूप में पाए जाने पर हंटिंगटिन को कैसे अपमानित किया जाता है; कैसे पूर्वकाल या पीछे न्यूरॉन्स Q97 बनाम Q25 की उपस्थिति के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया, विशेष रूप से लंबे समय तक अवधि में; और कैसे उम्र बढ़ने के दौरान प्रोटेओस्टेसिस नेटवर्क (पीएन) के पतन क्षरण दरों में अंतर करने के लिए योगदान करते हैं । ये परिणाम केवल एचटीटी-डी2 के कारोबार पर टिप्पणियों के एक छोटे सेट का वर्णन करते हैं। हालांकि, प्रोटीन एकत्रीकरण और प्रोटेओस्टेसिस दोनों के क्षेत्र से संबंधित कई और जैविक प्रश्नों को वीवो एप्लिकेशन में इसके साथ संबोधित किया जा सकता है।

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Protocol

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1. न्यूरोनल हंटिंगटिन-Dendra2 फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त सी एलिगेंस की पीढ़ी

  1. पारंपरिक प्रतिबंध एंजाइम डाइजेस्ट 10, गिब्सनअसेंबली11,या पसंद की किसी भी विधि द्वारा एक सूत्रकृमि अभिव्यक्ति वेक्टर (यानी, pPD95_75, Addgene #1494) में पीओआई को एन्कोडिंग जीन क्लोन करें। एक प्रमोटर एक वांछित ऊतक में या एक वांछित विकास के चरण में अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए सम्मिलित करें। पीओआई के साथ फ्रेम में Dendra2 फ्लोरोफोर या तो एन या सी-मरणासन्न डालें।
  2. 12संलयन निर्माण (जैसे, माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से) व्यक्त ट्रांसजेनिक सी एलिगेंस उत्पन्न करें।
    नोट: ट्रांसजीन ले जाने वाला प्लाज्मिड एक एक्स्ट्राक्रोमोमोमल सरणी के रूप में रहेगा। निर्माण का एकीकरण आवश्यक नहीं है लेकिन यदि वांछित हो तो13किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल में, सी एलिगेंस को पैन-न्यूरोनल प्रमोटर प्रगेफ-1के नियंत्रण में फ्यूजन निर्माण हंटिंगटिन एक्सॉन 1-Dendra2 (HTT-D2) को ले जाने वाले प्लाज्मिड के साथ माइक्रोजेक्टेड किया गया था। सी एलिगेंस अभिव्यक्ति रीढ़ क्रेइस एट अल से प्राप्त की गई थी।14, या तो Q25 या Q97 के साथ हंटिंगटिन एक्सॉन 1 जुनेमान एट अल से प्राप्त किया गया था।15,और Dendra2 Hamer एट अल से प्राप्त किया गया था

2. आयु मिलान और सी Elegans के रखरखाव

  1. आयु क्षारीय हाइपोक्लोराइट समाधान उपचार17 के साथ या 20 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए अंडे बिछाने के माध्यम से सिंक्रोनाइज़ करके सभी सूत्रकृमि से मेल खाती है। अंडा बिछाने के लिए, एक हौसले से वरीयता प्राप्त सूत्रकृमि विकास मीडिया (एनजीएम) प्लेट पर 10 ग्रेविड वयस्कों को रखें और हटाने से पहले 4 घंटे के लिए छोड़ दें। इस समयानुसार रखे गए अंडे सिंक्रोनाइज्ड नेमाटोड को जन्म देंगे।
  2. मानक सूत्रकृमि पशुपालन18के बाद, बैक्टीरियल खाद्य स्रोत ई. कोलाई OP50 के साथ वरीयता प्राप्त नेमाटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर प्रायोगिक सी एलिगेंस रखें।
  3. मनचाए चरण में 20 डिग्री सेल्सियस पर निमाटोड उगाएं। इस प्रोटोकॉल के लिए, आवश्यक उम्र 4 और 10 दिन हैं।
    नोट: 4 दिन में युवा वयस्कों को उनके गोंड़ में अंडों की उपस्थिति और उनकी उच्च गतिशीलता से पहचाना जा सकता है। आयु वर्ग के दिन 10 सूत्रकृमि के बाद उपजाऊ हैं, और ऊतक गिरावट और लोकोमोटिव गिरावट19से गुजरना ।
  4. दिन 10 सूत्रकृमि के लिए, 3 दिन में L4 चरण के बाद दैनिक मार्ग, एक बार निमाटोड उपजाऊ होते हैं, मिश्रित आबादी से बचने के लिए।

3. इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोपी स्लाइड की तैयारी

  1. इमेजिंग के दिन माइक्रोस्कोपी स्लाइड तैयार करें। एक माइक्रोवेव में, पिघल सामान्य ग्रेड ddH2O. में 3% (w/v) की एकाग्रता पर एक एकाग्रता पर उठी थोड़ा ठंडा करने के लिए छोड़ दें ।
  2. 1 एमएल पिपेट टिप की नोक काटें और पिघले हुए एगर उठे के लगभग 400 माइक्रोन को एस्पिरेट करें। धीरे-धीरे एक साफ ग्लास स्लाइड पर एग्राज की कुछ बूंदें रखें और तुरंत शीर्ष पर एक और स्लाइड रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि दोनों के बीच एगर उठे का एक पतला पैड बनाया गया है। धीरे-धीरे फिसलने या शीर्ष स्लाइड को उठाने से पहले सूखने दें।
  3. एगर उठे पैड स्लाइड को एक आर्द्रीकृत कंटेनर में रखें ताकि उन्हें सूखने से रोका जा सके। इन्हें 2-3 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जा सकता है।
    नोट: एगर उठे में छोटे बुलबुले के गठन से बचें, क्योंकि सूत्रकृमि भीतर फंस सकते हैं।

4. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप मापदंडों की परिभाषा

नोट: सूत्रकृमि और डेटा अधिग्रहण को बढ़ाने से पहले, कॉन्फोकल एक्विजिशन सॉफ्टवेयर पर सभी सेटिंग्स को परिभाषित करें। सेटिंग्स इमेजिंग हार्डवेयर और पसंद के सॉफ्टवेयर के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

  1. कॉन्फोकल सॉफ्टवेयर खोलें और लेजर इमेजिंग सेटिंग्स को परिभाषित करें। ग्रीन Dendra2 के लिए 486-553 एनएम पर और लाल Dendra2 के लिए 580-740 एनएम पर उमंग/उत्सर्जन के लिए प्रकाश पथ निर्धारित करें । फ्लोरोफोर की तीव्रता के अनुसार दोनों चैनलों/लेजर की शक्ति और लाभ को समायोजित करें। डिजिटल गेन या ऑफसेट न बदलें और पिनहोल को पूरी तरह से खुला सेट करें।
  2. अधिग्रहण सेटअप को परिभाषित करें: अनुक्रमिक चैनल मोड का चयन करें और हर फ्रेम को ट्रैक करें। फ्रेम के रूप में स्कैन मोड सेट करें, और फ्रेम आकार 1,024 x 1,024 के रूप में, 1 के एक लाइन चरण के साथ। औसत को 2 सेट करें, और औसत विधि और एकदिशात्मक रेखा के मोड से। 8 बिट्स के लिए थोड़ी गहराई सेट करें।
  3. Dendra2 के रूपांतरण के लिए बहुआयामी अधिग्रहण सेटिंग्स को परिभाषित करें। रूपांतरण और ब्लीचिंग के लिए 60% ऊर्जा शक्ति पर 405 एनएम डायोड लेजर सेट का उपयोग करें। यदि उपलब्ध है, तो डिटेक्टरों की सुरक्षा के लिए सुरक्षित ब्लीचिंग GaAsP सक्रिय करें।
  4. बीच में 0.0 एमएस अंतराल के साथ दो चक्रों की एक समय श्रृंखला का चयन करें, और सामान्य शुरुआत और बंद करें। 2 में से 1 स्कैन करने के बाद ब्लीचिंग शुरू करें और 30 पुनरावृत्तियों के लिए दोहराएं। जब तीव्रता 50% तक गिर जाए तो ब्लीचिंग बंद कर दें।
  5. एक स्नैप छवि पर कब्जा करने के लिए रूपांतरण के लिए अधिग्रहण/पिक्सेल की गति को तेज (उदाहरण के लिए, अधिकतम = 12) और मध्यम गति (जैसे, मध्यम = 5) के रूप में परिभाषित करें ।
    नोट: यहां परिभाषित ब्लीचिंग पैरामीटर दिशानिर्देश हैं। अन्य Dendra2 टैग POIs के लिए लेजर पावर सेटिंग्स और ब्लीचिंग पुनरावृत्तियों और मूल्यों को अनुभवजन्य रूप से स्थापित किया जाना चाहिए।

5. माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर सी एलिगेंस के बढ़ते

नोट: यदि संभव हो, तो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप सेटअप के करीब एक बढ़ते स्टीरियोमाइक्रोस्कोप रखें और इमेजिंग से ठीक पहले नेमाटोड माउंट करें।

  1. एग्राजिंग पैड के विपरीत दिशा में ग्लास कवर स्लाइड पर, स्थायी मार्कर के साथ चार वर्गों के साथ एक खिड़की खींचें और उन्हें संख्या दें।
  2. एग्राजिंग पैड के बीच में लेविमिसोल के पिपेट 15 माइक्रोन। लेविमिसोल की एकाग्रता सूत्रकृमि की उम्र के अनुसार भिन्न होगी: जब इमेजिंग दिन 4 सूत्रकृमि 2 एमएल लेविमिसोल का उपयोग करते हैं; जब इमेजिंग दिन 10 सूत्रकृमि 0.5 m M levamisole का उपयोग करें।
  3. तार लेने का उपयोग करके तरल में चार सूत्रकृमि स्थानांतरित करें। एक बरौनी लेने की मदद से, धीरे-धीरे प्रत्येक व्यक्ति निमाटोड को खिड़की के वर्ग में ले जाएं। बरौनी कुंडा ताकि ई. कोलाई OP50 के किसी भी निशान पतला है और इसकी फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि संकेत अधिग्रहण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है ।
  4. नेमाटोड को लगभग आगे बढ़ने से रोकने के लिए प्रतीक्षा करें और धीरे-धीरे तरल के शीर्ष पर एक कवर स्लिप रखें ताकि एगरग्रेड पैड और कवर स्लिप के बीच लेविमियोल की परत में निमाटोड को स्थिर किया जा सके।
  5. नेमाटोड की छवि के लिए कॉन्फोकल स्टेज पर उल्टे स्लाइड रखें।

6. ग्रीन Dendra2 का रूपांतरण: समय शून्य पर डेटा अधिग्रहण

नोट: पल्स-चेस प्रयोग अपरिवर्तनीय रूप से Dendrasibly एक हरे उत्सर्जक फ्लोरोफोर से एक लाल एक को परिवर्तित करने से शुरू करते हैं ।

  1. माइक्रोस्कोप के आईपीस का उपयोग करके, ग्रीन फ्लोरेसेंस के तहत 20x उद्देश्य के साथ पहले सूत्रकृमि का पता लगाएं। सिर या पूंछ पर ध्यान केंद्रित करें और कॉन्फोकल मोड पर स्विच करें।
  2. ईजीएफपी ग्रीन चैनल (एक्स/एम = 486-553 एनएम) में हरे रंग की Dendra2 कल्पना करने के लिए 488 एनएम ब्लू लेजर के साथ लाइव लेजर स्कैनिंग शुरू करें। एक ही न्यूरॉन का चयन करें और इसे ध्यान में लाएं। 3x में ज़ूम करें और लेजर बीम4के लक्ष्य को बढ़ाएं।
    नोट: नेमाटोड प्रति एक न्यूरॉन का चयन करें। प्रत्येक न्यूरॉन एक नमूना या डेटा बिंदु का गठन करेगा।
  3. अधिकतम प्रक्षेपण विमान का पता लगाएं और, फ्लोरोफोर की चमक के अनुसार, रंग रेंज संकेतक द्वारा पहचाने जाने योग्य संतृप्त लेकिन अतिउपाणित छवि प्राप्त करने के लिए लाभ या लेजर शक्ति को बढ़ाएं या कम करें। एक बार यह परिभाषित हो जाने के बाद, स्कैनिंग बंद कर दें।
    नोट: बहुत लंबे समय के लिए या बहुत अधिक शक्ति के साथ नमूना विकिरण नहीं है, के रूप में दिखाई नीले ४८८ एनएम प्रकाश के साथ उत्तेजन भी Dendra2 परिवर्तित कर सकते हैं, हालांकि धीरे और कम कुशलता से4
  4. सॉफ्टवेयर में, ब्याज (आरओआई) के क्षेत्रों का चयन करने के लिए टैब खोलें और चयनित न्यूरॉन के चारों ओर पहला आरओआई आकर्षित करें। नेमाटोड के सिर को शामिल करते हुए और पहले आरओआई सहित ब्याज के एक बड़े दूसरे क्षेत्र को परिभाषित करें।
  5. ब्लीचिंग सेटिंग्स में, पहले आरओआई का अधिग्रहण, ब्लीच और विश्लेषण करने के लिए चुनें। दूसरे आरओआई का अधिग्रहण और विश्लेषण करने के लिए चुनें लेकिन प्रक्षालित नहीं।
  6. स्कैनिंग की गति को अधिकतम (यानी, फास्ट पिक्सल निवास) में सेट करें और चयनित Dendra2 न्यूरॉन्स को बदलने के लिए प्रयोग शुरू करें।
    नोट: एक बार प्रयोग हो जाने के बाद अधिग्रहीत चित्र के परिणामस्वरूप दो चित्र होंगे: रूपांतरण से पहले और एक के बाद एक। ग्रीन चैनल के लिए, पहली छवि में एक उच्च हरी संकेत होना चाहिए जो हरे रंग के Dendra2 के रूपांतरण के कारण दूसरी छवि में कम हो जाता है। रेड चैनल के लिए, पहली छवि नकारात्मक होनी चाहिए और कोई संकेत नहीं दिखाना चाहिए, जिसमें रूपांतरण के बाद की छवि में लाल संकेत दिखाई दे रहा है। यदि हरी झंडी कम नहीं होती है, तो रूपांतरण नहीं हुआ, और 405 लेजर पावर या पुनरावृत्तियों की संख्या जैसे सेटिंग्स को संशोधित किया जाना चाहिए। यदि पहले छवि में एक लाल संकेत है, तो 488 एनएम लेजर शक्ति का उपयोग बहुत अधिक था और हरे रंग की Dendra2 का एक हिस्सा पहले से ही लाल रंग में बदल गया था। इस मामले में, एक नए न्यूरॉन/सूत्रकृमि का चयन किया जाना चाहिए।
  7. रूपांतरण के तुरंत बाद, लाल चैनल (पूर्व/em = 580-740 एनएम) में Dendra2 कल्पना करने के लिए हरे रंग की 561 एनएम लेजर के साथ लाइव स्कैनिंग शुरू करें। ओवरएक्सपोजर से बचने के लिए रेंज कलर इंडिकेटर का उपयोग करके परिवर्तित न्यूरॉन का फोकस और संबंधित अधिकतम प्रक्षेपण का पता लगाएं।
  8. जल्दी से एक कम पिक्सेल निवास गति (जैसे, 5x) के लिए स्कैन दर निर्धारित करते हैं और एक उच्च संकल्प पर दोनों चैनलों की एक स्नैपशॉट छवि प्राप्त करते हैं । इस छवि को रूपांतरण के बाद टाइमपॉइंट शून्य (T0) के रूप में परिभाषित किया गया है।
    नोट: परिवर्तित छवि के लिए अधिग्रहण की गति विविध किया जा सकता है। हालांकि, एक बार चुने जाने के बाद, इस गति को पूरे डेटा संग्रह में स्थिर रहने की आवश्यकता है।
  9. एक पहचान योग्य नाम और/या संख्या के साथ स्कैन सहेजें, समय शूंय लेबल (T0) के बाद ।
    नोट: रूपांतरण से पहले लाल संकेत की कमी और बाद में इसकी उपस्थिति को समझाने के लिए रूपांतरण प्रयोग (चरण 6.6) की छवि को भी सहेजने की सलाह दी जाती है।

7. एक चयनित दूसरी बार बिंदु पर डेटा अधिग्रहण के लिए परिवर्तित लाल Dendra2 की इमेजिंग

  1. समय के साथ Dendra2 गिरावट को ट्रैक करने के लिए, एक ही सूत्रकृमि/न्यूरॉन को फिर से लागू करने के लिए एक दूसरे समय बिंदु को परिभाषित करें । किसी भी प्रासंगिक जैविक प्रश्न को संबोधित करने के लिए प्रायोगिक रूप से दूसरी बार बिंदु का चयन करें। यहां वर्णित प्रोटोकॉल के लिए, Dendra2 दोनों 2 घंटे (T2) और 24 घंटे (T24) के बाद रूपांतरण पर छवि है ।
    1. चयनित समय बिंदु पर, आईपीस और लाल फ्लोरेसेंस के उपयोग के साथ एक ही सूत्रकृमि/न्यूरॉन का पता लगाएं।
    2. संबंधित सूत्रकृमि/न्यूरॉन की टी0 इमेज खोलें और इमेज सेटिंग्स को रीलोड/रीयूज करें । सुनिश्चित करें कि टी0, टी-2 और टी-24 एच छवियों को प्राप्त करते समय स्नैपशॉट की अधिग्रहण सेटिंग्स ठीक वैसी ही हैं।
    3. रेड चैनल में लाइव स्कैनिंग करें, परिवर्तित लाल न्यूरॉन को ध्यान में लाएं। क्योंकि लाल Dendra2 समय के साथ नीचा दिखाता है रेंज संकेतक कम तीव्र अधिकतम प्रक्षेपण दिखाएगा। किसी भी अधिग्रहण मापदंडों को न बदलें और पहली छवि के रूप में एक ही गति (जैसे, 5x) पर एक स्नैपशॉट प्राप्त न करें।
  2. 4 घंटे या उससे अधिक समय के बाद Dendra2 के क्षरण को ट्रैक करने के लिए, रूपांतरण के बाद सूत्रकृमि को बचाएं।
    1. चार नेमाटोड को बदलने और इमेजिंग करने के तुरंत बाद माइक्रोस्कोप से स्लाइड निकालें। धीरे-धीरे कवरस्लिप को हटा दें और तार लेने के उपयोग के साथ, प्रत्येक सूत्रकृमि को एगर उठे पैड से उठाएं।
    2. प्रत्येक सूत्रकृमि को उचित लेबल और पहचाने जाने योग्य एनजीएम प्लेट पर व्यक्तिगत रूप से रखें।
    3. दूसरी बार बिंदु के लिए, नेमाटोड को फिर से एक ताजा एगर उठे पैड पर माउंट करें और धारा 6 में निर्देशों का पालन करते हुए परिवर्तित लाल Dendra2 की इमेजिंग के साथ आगे बढ़ें।

8. परिवर्तित Dendra2 की छवि विश्लेषण

नोट: Dendra2 के क्षरण का विश्लेषण फिजी/ImageJ सॉफ्टवेयर20के साथ किया जाता है ।

  1. फिजी खोलें और फिजी बार में .lsm फ़ाइल को खींचें और छोड़ दें। रूपांतरण के ठीक बाद ली गई टी0 छवि और रूपांतरण (टी-24 एच) के बाद चयनित टाइम पॉइंट पर ली गई उसी सूत्रकृमि की छवि खोलें।
    नोट: Dendra2 के लिए जुड़े ब्याज के प्रोटीन के क्षरण को ट्रैक करने के लिए केवल लाल चैनल का विश्लेषण करने की जरूरत है ।
  2. मेनू से माप मापदंडों को स्थापित करें: विश्लेषण करें । माप निर्धारित करेंक्षेत्र और एकीकृत घनत्व कार्यों का चयन करें।
  3. लाल चैनल के साथ प्राप्त छवि का चयन करें। फिजी बार से बहुभुज चयन उपकरण का चयन करें।
  4. टी0 छवि पर परिवर्तित न्यूरॉन की पहचान करें और चयन उपकरण का उपयोग करके इसके चारों ओर एक आरओआई आकर्षित करें।
    1. न्यूरॉन की रूपरेखा को ठीक से पहचानने के लिए, बार इमेज से चुनकर तीव्रता की सीमाओं को उजागर करें। समायोजित करें । दहलीज। बहुभुज उपकरण के साथ इस क्षेत्र के चारों ओर सीमा को चित्रित करने और ट्रैक करने के लिए बार कर्सर खींचें। एक सटीक आरओआई उत्पन्न करने के लिए, ग्रीन चैनल से चयनित न्यूरॉन के समोच्च का उपयोग करना भी संभव है।
  5. एक बार चयन लाल चैनल खिड़की में किया गया है, प्रेस विश्लेषण । उपायपरिणाम नाम की एक पॉप-अप विंडो दिखाई देगी और इसमें क्षेत्र, इंटडेनऔर राविंटडेनके लिए आरओआई मूल्य शामिल होंगे।
  6. दूसरी बार बिंदु (टी-24 एच) की छवि के लिए चयन और माप की एक ही प्रक्रिया को अंजाम दें।
  7. प्राप्त मूल्यों को स्प्रेडशीट सॉफ़्टवेयर में कॉपी करें, रूपांतरण के बाद टी0 पर मूल्यों को उचित रूप से रिकॉर्ड करने का ध्यान रखें, और रूपांतरण के बाद टी-2 या टी-24 एच पर।

9. Dendra2 गिरावट के अनुपात की गणना

  1. गिरावट के अनुपात की गणना करने के लिए, पहले 1 का मूल्य आवंटित (या 100%) समय बिंदु शून्य से गिरावट का समय (यानी, रूपांतरण के ठीक बाद, जब सभी लाल Dendra2 परिवर्तित अभी भी मौजूद है)। यह अपने आप में T0 के IntRawDen के मूल्य को विभाजित करने से परिणाम है ।
  2. समय के साथ लाल Dendra2 तीव्रता संकेत की कमी की गणना करने के लिए, और गिरावट, दूसरी बार बिंदु (जैसे, टी 2 या T24 h) के RawIntDen के मूल्य को T0 के RawIntDen के मूल्य से विभाजित करें । परिणामी संख्या 1 से कम होनी चाहिए। इन मूल्यों को प्रतिशत के रूप में भी व्यक्त किया जा सकता है, T0 को १००% के रूप में परिभाषित करता है ।
  3. प्रत्येक सूत्रकृमि परिवर्तित के लिए धारा 7 दोहराएं। Dendra2 के क्षरण के एक चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए, वाई धुरी में प्राप्त फ्लोरेसेंस कम होने के प्रतिशत या अनुपात मूल्यों के साथ एक तितर-बितर भूखंड या बार ग्राफ चार्ट करें। किसी भी वांछित सांख्यिकीय विश्लेषण लागू करें और इसे ग्राफ पर चित्रित करें।

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Representative Results

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फोटोवर्टिबल प्रोटीन Dendra2 के साथ फ्रेम में हंटिंगटिन एक्सॉन-1 प्रोटीन टुकड़ा व्यक्त करने वाले दो सूत्रकृमि उपभेदों को माइक्रोइंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया गया था और प्लाज्मिड को एक एक्स्ट्राक्रोमोमोमल सरणी के रूप में रखा गया था। संलयन निर्माण पूरे सी एलिगेंस तंत्रिका तंत्र में विकास से पूरे उम्र बढ़ने तक व्यक्त किया गया था। यहां, एचटीटी-डी 2 में या तो शारीरिक 25 पॉलीग्लुटामाइन खिंचाव (एचटीक्यू25-डी2, चित्रा 1ए)या 97 ग्लूटामाइंस (एचटीक्यू97-डी 2, फिगर 1बी)के साथ पूरी तरह से प्रवेशात्मक और रोगजनक दोहराने शामिल थे। शुरू में संलयन प्रोटीन को यह सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण किया गया था कि यह अपने हरे स्पेक्ट्रम से यूवी विकिरण पर अपने लाल स्पेक्ट्रम में बदल गया है । HTT-D2 सफलतापूर्वक प्रबुद्ध क्षेत्र के भीतर विशेष रूप से हरे रंग से लाल करने के लिए बंद कर दिया । यूवी पल्स की शक्ति और पुनरावृत्तियों के अनुसार, और नेमाटोड के क्यूटिकल के माध्यम से लेजर बीम के जेड-प्लेन और पेनेट्रानेस के आधार पर, एचटीटी-डी 2 का एक परिभाषित हिस्सा परिवर्तित किया गया था, लेकिन सभी नहीं। फोटोकनवर्टेड न्यूरॉन्स के भीतर एक रेड सिग्नल दिखाई दिया, जो हरे रंग के गैर-अपरिवर्तित एचटीटी-डी 2(चित्रा 1सी, डी)के साथ कोलोकैलाइज किया गया था। लेजर स्कैनिंग फोटॉन बीम की सटीकता के कारण एक ही न्यूरॉन के अनुरूप सटीक आरओआई को परिवर्तित करना संभव था। रूपांतरण से पहले, कोई रेड सिग्नल दिखाई नहीं दे रहा था जब नमूना लाल चैनल(चित्रा 2ए)में उत्साहित था। यूवी विकिरण पर, ग्रीन सिग्नल कम हो गया क्योंकि एचटीटी-डी 2 को बदल दिया गया था और अंत में एक लाल संकेत दिखाई दिया(चित्रा 2बी)। इसके बाद एचटीटी-डी 2 को समय के साथ अपमानित किया गया, जिसके परिणामस्वरूप लाल एचटीटी-डी2(चित्रा 2सी)के स्तर में कमी आई और ग्रीन एचटीटी-डी2 सिग्नल की संभावित वृद्धि हुई, क्योंकि अधिक संलयन प्रोटीन नए संश्लेषित किए गए थे । क्योंकि रूपांतरण के बाद 2 घंटे में एक महत्वपूर्ण कमी पहले से ही प्रमुख थी, एचटीटी-डी 2 के क्षरण का पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने के लिए इस अंतराल को बनाए रखा गया था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एचटीटी-डी2 के रूपांतरण के बाद क्षरण एकमात्र प्रक्रिया नहीं है। परिवर्तित एचटीटी-डी 2 की तस्करी की जा सकती है और एक्सोन के साथ ले जाया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप मंजूरी के कारण रेड सिग्नल में कमी नहीं आई है । हालांकि, यहां और 2 घंटे की कम समय अवधि में नियोजित सेटिंग्स के साथ, लाल संकेत का कोई प्रसार नहीं देखा गया था, संभवतः इस तथ्य के कारण कि लिटिल एचटीटी-डी 2 को सोमा से अक्षति में ले जाया गया था। इसके अलावा, एक पूरे न्यूरोनल सोमा को बदलने और इमेजिंग करने से एक ही न्यूरॉन के भीतर एचटीटी-डी 2 प्रसार के प्रभाव को बाहर करने में मदद मिली, क्योंकि सभी सेलुलर डिब्बों का एक साथ विश्लेषण किया जा रहा था। प्रसार या परिवहन/तस्करी दोनों का अध्ययन करने के लिए तेज और उच्च आवर्धन छवियों को प्राप्त करने और ब्याज के प्रोटीन के एक छोटे और संभवतः अधिक गतिशील अंश को ट्रैक करने की सलाह दी जाती है । यह भी ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रयोगों के एक सेट के भीतर, प्रत्येक जानवर एक जैविक दोहराने का प्रतिनिधित्व करता है। केवल एक न्यूरॉन प्रति सूत्रकृमि को चित्रित किया गया था, प्रत्येक जानवर को प्रति सत्र एक बार चित्रित किया गया था, और इमेजिंग तीन सत्रों में हुई, जिसने तकनीकी दोहराया। तीन सत्रों की आवश्यकता है कि जानवरों को या तो दिन 4 या 10 दिन पर प्रत्येक प्रयोग से पहले ताजा प्लेटों पर सिंक्रोनाइज्ड किया जाए, जो कुछ भी पर्यावरणीय परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देता है निमाटोड पर लगाया जाता है । तीन सत्र इमेजिंग सेट अप से उत्पन्न होने वाली किसी भी परिवर्तनशीलता के लिए भी खाते हैं (उदाहरण के लिए, प्रयोगों के बीच एक अलग तापमान के कारण लेजर शक्ति बदलती है)। तीन सत्रों (न्यूनतम 20 जानवरों) के दौरान प्राप्त सभी जैविक प्रतिकृति को व्यक्तिगत नमूनों पर विचार किया गया था और सांख्यिकीय महत्व स्थापित करने के लिए उपयोग किया गया था।

इस बात की पुष्टि करने के बाद कि दोनों सी एलिगेंस एचटीटी-डी 2 उपभेद प्रभावी थे और इष्टतम रूपांतरण मापदंडों की स्थापना कर रहे थे, एक रोग के कारोबार के बीच मतभेदों के कारण एचटीटी-डी2 प्रोटीन (यानी, HTTQ97-D2) की तुलना में इसके शारीरिक रूप से प्रासंगिक नियंत्रण (HTTQ25-D2) की जांच की गई । सबसे पहले, विभिन्न न्यूरॉन्स में एचटीटी-डी2 का क्षरण देखा गया(चित्र 3)। यह ज्ञात है कि नेमाटोड के तंत्रिका तंत्र के भीतर न्यूरॉन्स के उपप्रकार उनकी मेटाबोलिक गतिविधि और आकृति विज्ञान21में भिन्न होते हैं, संभवतः प्रोटेम के क्षरण और पुनर्संतुलन में अंतर करते हैं। पूंछ क्षेत्र के न्यूरॉन्स की तुलना सिर के उन लोगों से की गई थी और यह काफी अधिक सक्रिय पाया गया(चित्र 3ए)। यह निष्कर्ष केवल HTTQ25-D2 के लिए मान्य था और रोगजनक HTTQ97-D2 के लिए नहीं, यह सुझाव देता है कि पीएन एचटीटी-डी 2 को हटाने में असमर्थ था जिसमें तंत्रिका तंत्र(चित्रा 3बी)में लंबे समय तक ग्लूटामाइन फैला हुआ था।

आगे पुष्टि करने के लिए कि मॉडल प्रणाली ने अपेक्षा के अनुसार व्यवहार किया, रूपांतरण प्रयोग लंबी अवधि में किए गए थे, जिससे कोशिकाओं के क्षरण के रास्ते लगभग पूरी तरह से(चित्रा 4)ब्याज के प्रोटीन को खत्म करने की अनुमति देते थे। दरअसल, सिर न्यूरॉन्स में 2 घंटे के बाद रूपांतरण के बाद नियंत्रण HTTQ25-D2 24 h का काफी अधिक क्षरण था, और पूंछ न्यूरॉन्स(चित्रा 4ए)में बड़े पैमाने पर अधिक था। फिर, पीछे की पूंछ न्यूरॉन्स अधिक सक्रिय रूप से लाल HTT-D2 हटा दिया, यहां तक कि एक वृद्धि हुई समय पर । इसी तरह की प्रवृत्ति रोग पैदा करने वाले HTTQ97-D2 के लिए पता चला था, 24 घंटे से अधिक लाल HTT-D2 संकेत की एक बहुत ही मामूली कमी के साथ । हालांकि, HTTQ97-D2 के रूप में आसानी से HTTQ25-D2 के रूप में नहीं हटाया गया था, विशेष रूप से 24 घंटे के बाद । यह हो सकता है कि केवल घुलनशील HTTQ97-D2 अंश कुशलता से अपमानित किया जाता है, लाल संकेत के प्रारंभिक ह्रासमान और समय के साथ इसके आगे हल्के कमी के लिए लेखांकन । महत्वपूर्ण बात, वहां 24 घंटे के बाद न्यूरॉन्स की दो आबादी थे: एक उच्च गिरावट दर के साथ एक और एक जहां लाल HTT-D2 संकेत बिल्कुल अपमानित नहीं किया गया था, या संभवतः भी वृद्धि हुई(चित्रा 4बी)। बढ़ी हुई और स्थिर संकेत संभवतः पहले से ही एकत्रित या लगातार एकत्रित प्रजातियों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो उनके कसकर पैक एमिलॉयड प्रकृति के कारण कोशिकाओं से स्पष्ट करना काफी कठिन था। ये समावेशन, विशेष रूप से मौजूद हैं जब ग्लूटामीन का हिस्सा 40 दोहराने की सीमा से अधिक था, और जो सूक्ष्म रूप से फोसी के रूप में दिखाई दिया, को जमा के रूप में जमा करने के लिए परिकल्पना की गई है जिसे आसानी से22नहीं हटाया जा सकता है। यह भी संभव है कि लाल फ्लोरोसेंट सिग्नल में वृद्धि तकनीकी मुद्दों (उदाहरण के लिए, गलत अधिग्रहण मापदंडों का उपयोग, माइक्रोस्कोपी सेटअप का उप-बराबर प्रदर्शन, या एक गलत वसूली/बढ़ती प्रक्रिया) के परिणामस्वरूप एक विरूपण साक्ष्य था। समय की लंबी अवधि में छवियों को प्राप्त करते समय इन चरों को ध्यान में रखा जाना चाहिए।

अंत में, क्योंकि वयस्क जीवन में एचडी प्रकट जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकार, एचटीटी-डी 2 गिरावट की दर पर उम्र बढ़ने का प्रभाव देखा गया था। परिवर्तन प्रयोगों सिर और युवा (दिन 4) बनाम पुराने (दिन 10) दोनों HTT-D2 उपभेदों(चित्रा 5)में सूत्रकृमि के पूंछ क्षेत्रों में प्रदर्शन किया गया । सिर न्यूरॉन्स के लिए, दोनों HTTQ25-D2 और HTTQ97-D2 के जीवनकाल के भीतर उम्र बढ़ने के कारण गिरावट की दर में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं था, संभवतः क्योंकि HTT-D2 समान रूप से प्रत्येक सूत्रकृमि के जीवन भर में हटा दिया गया था । हालांकि, एक बहुत ही महत्वपूर्ण परिवर्तन दर्ज किया गया था जब पुराने सूत्रकृमि या तो एक रोग या एक शारीरिक ग्लूटामीन खिंचाव युक्त की तुलना । HTTQ97-D2 को HTTQ25-D2 के रूप में कुशलता से अपमानित नहीं किया गया था, जो पुराने सूत्रकृमि(चित्रा 5ए)में हंटिंगटिन की एकत्रित और संभवतः विषाक्त प्रजातियों को हटाने में पीएन की असमर्थता को रेखांकित करता है। फिर, पूंछ न्यूरॉन्स में एक अधिक सक्रिय और महत्वपूर्ण कारोबार देखा गया था। सिर न्यूरॉन्स के रूप में, पुराने पलटन की तुलना में युवा सूत्रकृमि के पूंछ न्यूरॉन्स में HTTQ25-D2 का अधिक मजबूत कारोबार नहीं देखा गया था, और गिरावट 4 और दिन 10 में बराबर थी। इसके विपरीत, नियंत्रण और रोगजनक एचटीटी-डी 2 उपभेदों के बीच क्षरण दरों में महत्वपूर्ण परिवर्तन युवा दिन 4 सूत्रकृमि में दिखाई दिए, जो 10 दिन में और भी महत्वपूर्ण हो गए। महत्वपूर्ण बात यह है कि टेल न्यूरॉन्स युवा सूत्रकृमि में विषाक्त HTTQ97-D2 से निपटने में सक्षम थे, यह दर्शाते हुए कि एचटीटी-डी 2(चित्रा 5बी)को हटाने के लिए विभिन्न सहवर्ती पीएन तंत्र काम पर हो सकते हैं। कुल मिलाकर, पीएन गतिविधि समय के साथ कम हो गई, संभवतः उम्र बढ़ने और समुच्चय की उपस्थिति दोनों के कारण हानिकारक प्रभावों के कारण।

Figure 1
चित्रा 1: सी एलिगेंस ने नर्वस सिस्टम में Dendra2 को कंफ्यूज्ड हंटिंगटिन एक्सॉन-1 व्यक्त किया । (A)युवा, दिन 4 सी एलिगेंस पैन-न्यूरोनली ने 25 ग्लूटामाइंस युक्त हंटिंगटिन एक्सन-1 को व्यक्त किया, जो अपने अपरिवर्तित हरे रंग की उमंग/उत्सर्जन राज्य में Dendra2 को मिलाया गया । स्केल बार = 100 माइक्रोन इनसेट सिर (ऊपर) और पूंछ (नीचे) न्यूरॉन्स की एक बढ़ाया छवि दिखाते हैं। इनसेट स्केल बार = 10 माइक्रोन(ख)युवा, दिन 4 सी एलिगेंस पैन-न्यूरोनली ने 97 ग्लूटामाइंस युक्त हंटिंगटिन एक्सोन-1 को व्यक्त किया, जो अपने अपरिवर्तित हरे रंग की एक्सिटेशन/उत्सर्जन राज्य में Dendra2 को मिलाया गया । स्केल बार = 100 माइक्रोन. इनसेट पूंछ (ऊपर) और सिर (नीचे) न्यूरॉन्स, और एक दिन के सिर 7 सूत्रकृमि (अभी तक सही) की एक बढ़ाया छवि दिखाते हैं। इनसेट स्केल बार = 10 माइक्रोन. व्हाइट एरोहेड एचटीटीक्यू97-डी 2 फोसी को इंगित करते हैं, जो हंटिंगटिन समुच्चय का चित्रण करते हैं। (ग)चैनल हेड क्षेत्र के रूपांतरण के साथ HTTQ25-D2 की छवि विलय । बॉक्स पूरे सी एलिगेंस के हिस्से का प्रतिनिधित्व करता है जिसे यूवी विकिरणित किया गया है। स्केल बार = 100 माइक्रोन इनसेट 488 एनएम (ऊपर, हरे) पर Dendra2 उत्सर्जन और 561 एनएम (नीचे, लाल) पर दिखाता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन(डी)चैनल हेड क्षेत्र के रूपांतरण के साथ HTTQ97-D2 की छवि विलय । स्केल बार = 100 माइक्रोन बॉक्स पूरे सी एलिगेंस के हिस्से का प्रतिनिधित्व करता है जिसे यूवी विकिरणित किया गया है। इनसेट 488 एनएम (ऊपर, हरा) और 561 एनएम (नीचे, लाल) पर Dendra2 उत्सर्जन से पता चलता है। स्केल बार = 10 माइक्रोन करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: परिवर्तित लाल एचटीटी-डी 2 एकल न्यूरॉन्स में समय के साथ कमी आई। HTTQ25-D2 के पूंछ न्यूरॉन्स। दो न्यूरॉन्स एक साथ और स्वतंत्र रूप से फोटोकंवर्ट दिखाए जाते हैं। छवियां क्रमिक रूप से तीन बार अंक दर्शाती हैं:(ए)विकिरण से पहले (पहले),(बी)विकिरण (रूपांतरण) के तुरंत बाद, और विकिरण के तुरंत बाद(सी)2 घंटे (बाद) । शीर्ष पैनल (ग्रीन चैनल) 486-553 एनएम उत्तेजन/उत्सर्जन पर एकत्र किए गए एचटीटी-डी2 सिग्नल का प्रतिनिधित्व करता है। ब्याज का सफेद क्षेत्र उन न्यूरॉन्स को चित्रित करता है जिन्हें विकिरणित किया गया है। मध्य पैनल (रेड चैनल) 580-740 एनएम उत्तेजन/उत्सर्जन पर एकत्र किए गए परिवर्तित एचटीटी-डी2 सिग्नल को दिखाता है । नीचे पैनल दो चैनलों का एक विलय है। स्केल बार = सभी छवियों के लिए 5 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सिर और पूंछ न्यूरॉन्स अलग गिरावट दरों का प्रदर्शन किया । कॉलम बार ग्राफ रूपांतरण के समय प्रारंभिक मूल्य के सापेक्ष लाल तीव्रता का प्रतिशत दिखाते हैं (यानी, 100%)। परिवर्तित लाल Dendra2 संकेत 2 घंटे के अंतराल पर कुल मिलाकर कमी के रूप में HTT-D2 सी elegansके न्यूरॉन्स के भीतर अपमानित किया गया था । नेमाटोड के तंत्रिका तंत्र के भीतर न्यूरोनल उपप्रकारों ने विभिन्न गिरावट दरों का प्रदर्शन किया, जिसमें पूंछ न्यूरॉन्स अधिक सक्रिय कारोबार दिखाते हैं, लेकिन केवल एक गैर-पैथोजेनिक पॉलीग्लूटामाइन खिंचाव ले जाने वाले सूत्रकृमि में। (A)HTTQ25-D2 सिर बनाम पूंछ न्यूरॉन्स में गिरावट का परिमाणीकरण । मतलब ± एसडी, बिना पूंछ वाले दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट। N = 23-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति क्षेत्र इमेज्ड, * पी एंड एलटी; 0.05। (ख)HTTQ97-D2 सिर बनाम पूंछ न्यूरॉन्स में गिरावट का परिमाणीकरण । मतलब ± एसडी, बिना पूंछ वाले दो पूंछ वाले छात्र का टी-टेस्ट। N = 23-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति क्षेत्र इमेज्ड, एनएस = गैर महत्वपूर्ण । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: HTTQ97-D2 काफी 24 घंटे के बाद मंजूरी दे दी थी । कॉलम बार ग्राफ रूपांतरण के समय प्रारंभिक मूल्य के सापेक्ष लाल तीव्रता का प्रतिशत दिखाते हैं (यानी, 100%)। परिवर्तित लाल Dendra2 संकेत के रूप में HTT-D2 सी elegansके न्यूरॉन्स के भीतर अपमानित किया गया था में कमी आई । एचटीटी-डी 2 ने गिरावट की विभिन्न दरों का प्रदर्शन किया । यहां तक कि रूपांतरण के बाद समय की लंबी अवधि में, रोगजनक HTT-D2 अपने स्वस्थ नियंत्रण की तुलना में नहीं हटाया जा सकता है । (क)हेड और टेल न्यूरॉन्स दोनों में रूपांतरण (2 एच और 24 एच) के बाद दो बार के बिंदुओं पर एचटीटीक्यू25-डी2 में गिरावट की दर का परिमाणीकरण । मतलब ± एसडी, विचरण का एक तरफा विश्लेषण (ANOVA) । N = 21-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति बार/क्षेत्र, * पी एंड एलटी; ०.०५, *****P< 0.0001 । (ख)हेड और टेल न्यूरॉन्स दोनों में रूपांतरण (2 एच और 24 एच) के बाद दो बार बिंदुओं पर एचटीटीक्यू97-डी2 में गिरावट की दर का परिमाणीकरण । मतलब ± एसडी, विचरण का एक तरफा विश्लेषण (ANOVA) Tukey के कई तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद ।  N = 21-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति समय/क्षेत्र, एनएस = गैर महत्वपूर्ण इमेज्ड । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: रोगजनक एचटीटी-डी 2 को व्यक्त करने वाले पुराने और युवा सूत्रकृमि ने इसे कुशलतापूर्वक नीचा नहीं दिखाया। कॉलम बार ग्राफ रूपांतरण के समय प्रारंभिक मूल्य के सापेक्ष लाल तीव्रता का प्रतिशत दिखाते हैं (यानी, 100%)। परिवर्तित लाल Dendra2 संकेत के रूप में HTT-D2 न्यूरॉन्स के भीतर अपमानित किया गया था कम हो गया । जैसा कि नेमाटोड वृद्ध है, रोगजनक एचटीटी-डी 2 को नीचा दिखाने की इसकी क्षमता अतिरिक्त रूप से अपने तंत्रिका तंत्र में बिगड़ा हुआ था। (ए)उम्र से मेल एचटीक्यू97-डी 2 नेमाटोड की तुलना में युवा (दिन 4) और पुराने (दिन 10) एचटीक्यू25-डी2 सूत्रकृमि के सिर न्यूरॉन्स में गिरावट की दर का मात्राकरण । मतलब ± एसडी, विचरण का एक तरफा विश्लेषण (ANOVA) । N = 23-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति तनाव/दिन इमेज्ड, *****P< 0.0001। (ख)उम्र से मेल एचटीक्यू97-डी2 सूत्रकृमि की तुलना में युवा (दिन 4) और पुराने (दिन 10) एचटीटीक्यू25-डी2 सूत्रकृमि के पूंछ न्यूरॉन्स में रूपांतरण के बाद गिरावट की दर 2 घंटे । मतलब ± एसडी, विचरण का एक तरफा विश्लेषण (ANOVA) Tukey के कई तुलना पोस्ट हॉक परीक्षण के बाद । N = 23-28 नमूने/सूत्रकृमि प्रति तनाव/दिन, * पी एंड एलटी; ०.०५, ***पी & 0.001, *****P< 0.0001 । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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प्रोटीन के कार्य को समझने के लिए इसके संश्लेषण, स्थान और गिरावट को समझना महत्वपूर्ण है। उपन्यास, स्थिर और उज्ज्वल एफपीएस के विकास के साथ, पीओआई की कल्पना और निगरानी करना आसान और अधिक कुशल हो गया है। आनुवंशिक रूप से व्यक्त संलयन PAFPs जैसे Dendra2 विशिष्ट रूप से एक पीओआई की स्थिरता का अध्ययन करने के लिए तैनात हैं । बैंगनी-नीली रोशनी के संपर्क में आने पर, Dendra2 संरक्षित अमीनो एसिड के एक त्रय के भीतर एक सटीक स्थान पर टूटता है। फ्लोरोफोर एक छोटे से संरचनात्मक परिवर्तन से गुजरता है, जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा को हरे से लाल23में पूरी तरह से स्थानांतरित कर दिया जाता है। यह बदलाव Dendra2 से जुड़े किसी भी पीओआई का पता लगाने और निगरानी के लिए अनुमति देता है। दरअसल, इन फ्यूजन संरचनाओं का उपयोग सबसे पहले वीवो16में सर्वव्यापी-प्रोटेसोम प्रणाली का अध्ययन करने के लिए सी एलिगेंस रिपोर्टर तनाव बनाने के लिए किया गया था। Dendra2 को चुनिंदा न्यूरोनल उपप्रकारों की संवेदनशीलता और विस्तारित पॉलीग्लूटामाइन प्रोटीन24से निपटने की उनकी क्षमता को समझने या मोटर न्यूरॉन रोग के मॉडलों में ऑटोफैगी के शामिल होने की निगरानी करने के लिए भीनियोजितकिया गया था ।

विवो में हंटिंगटिन के क्षरण की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है, जो एक गैर-विकासात्मक तरीके से रोग से संबंधित एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन है। एचडी के एक न्यूरोनल सी एलिगेंस मॉडल को सफलतापूर्वक उत्पन्न करने के बाद, एचटीटी-डी 2 पैन-न्यूरोनली को व्यक्त करते हुए, इसके शारीरिक समकक्ष की तुलना में विस्तारित और रोगजनक एचटीटी के क्षरण की दरों की मात्रा निर्धारित की गई थी। समय के साथ विषाक्त ग्लूटामीन भार से निपटने के लिए न्यूरोनल उपप्रकारों के बीच, युवा और वृद्ध सूत्रकृमि के बीच और पीएन की क्षमता के बीच हड़ताली मतभेद देखे गए। पीएन के लिए क्षोभ शुरू किए जाने पर इस तकनीक को हंटिंगटिन के स्थान और आंदोलन के साथ-साथ इसके भाग्य का पालन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। प्रमुख चैपरोन्स या यौगिकों के प्रशासन के सिर्ना नॉकआउट जो प्रोटीसोम गतिविधि को रोकते हैं, एकत्रीकरण-प्रवण प्रोटीन में इन घटकों के कार्य और महत्व को उजागर कर सकते हैं: उदाहरण के लिए, क्या पीएन कमियों की भरपाई के लिए विशिष्ट नोड्स को सक्रिय करता है26। यह सामान्य उम्र बढ़ने की तुलना में किसी बीमारी के कारण होने वाले हानिकारक प्रभावों को भी समझा सकता है।

यद्यपि इस तकनीक का उपयोग करके कई अलग-अलग प्रश्नों को संबोधित किया जा सकता है, एक बार वांछित मॉडल उत्पन्न हो जाने के बाद, विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए सही रूपांतरण और पता लगाने के मापदंड स्थापित किए जाने चाहिए। इसके अलावा महत्वपूर्ण रूपांतरण सेटिंग्स निर्धारित करना है जो फोटोब्लैचिंग या फोटोटोक्सीसिटी के बिना और अवांछित रूपांतरण के बिना सक्रिय प्रोटीन की पर्याप्त उपज की अनुमति देते हैं। इसके अलावा, एक विशिष्ट मॉडल प्रणाली के भीतर हर अध्ययन प्रोटीन के लिए, या तो पूर्व वीवो या वीवो में, यह प्रयोगात्मक रूप से एक समय अवधि पर्याप्त रूप से बड़ी स्थापना के लिए आवश्यक है ताकि क्षरण दर के सटीक मात्राकरण के लिए अनुमति दी जा सके ।

Dendra2 अन्य PAFPs पर लाभ की एक श्रृंखला प्रदान करता है: 1) यह मोनोमेरिक और बहुत उज्ज्वल है; 2) इसमें एक उच्च विपरीत फोटोकन्वर्जन और एक स्थिर फोटोकनवर्ट संकेत है; 3) इसे नीले 488 एनएम लेजर द्वारा कम फोटोटॉक्सीसिटी के साथ सक्रिय किया जा सकता है, जो अधिकांश कॉन्फोकल हार्डवेयर सेटअप का हिस्सा है; 4) यह स्तनधारी कोशिकाओं में आवेदन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कुशलतापूर्वक परिपक्व होता है; 5)23,27के समय की विस्तारित अवधि के लिए व्यक्त किए जाने पर इसका कोई विषाक्त दुष्प्रभाव नहीं होता है ; और 6) प्रणाली के बीच या एक जीव या कोशिका के भीतर अभिव्यक्ति के स्तर में बदलाव से प्रभावित नहीं है, के रूप में केवल Dendra2 संकेत के अनुपात से पहले और बाद में रूपांतरण की मात्रा निर्धारित है । सभी सूचीबद्ध गुण Dendra2 वास्तविक समय और निगरानी सेल भाग्य में प्रोटीन गतिशीलता पर नज़र रखने के लिए एक आदर्श फ्लोरोफोर बनाते हैं।

दुर्भाग्य से, Dendra2 संलयन प्रोटीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग की कुछ आम सीमाओं से पीड़ित हैं । निर्माण एक चिमेरिक प्रजाति है जो अक्सर जैविक प्रणालियों में प्रयोगात्मक रूप से अतिव्यक्त होती है, हालांकि जीनोमिक इंजीनियरिंग के माध्यम से अंतर्जात अभिव्यक्ति स्थापित की जा सकती है। Dendra2 के क्षरण की दर ही संभावित रूप से लक्ष्य प्रोटीन के क्षरण को प्रभावित करती है, हालांकि इसे एक अत्यधिक स्थिर, लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन27के रूप में वर्णित किया गया है। इसके अलावा, Dendra2 बहुत तेजी से कारोबार के साथ प्रोटीन को ट्रैक करने के लिए उपयुक्त नहीं है क्योंकि यह अपनी उचित परिपक्वता के लिए समय नहीं हो सकता है । अंत में, 405 एनएम लेजर, जो असामान्य हैं, कुशल फोटोस्विचिंग के लिए पसंद किए जाते हैं, हालांकि वे नमूने के लिए अधिक जहरीले होते हैं। दरअसल, कम फोटोटॉक्सिक नीली रोशनी का उपयोग हरे रंग की Dendra2 कल्पना करने और लेजर शक्ति उच्च तीव्रता पर होने पर इसे परिवर्तित करने के लिए किया जा सकता है। इस विशेष सुविधा को हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए, क्योंकि लंबे समय तक एक्सपोजर अवांछित रूपांतरण और संभावित रूप से गलत माप का उत्पादन करेगा। अंत में, हरे या लाल फ्लोरोफोरस के संयोजन में Dendra2 का उपयोग करना समस्याग्रस्त हो सकता है। हालांकि, कई अलग-अलग पीएएफपी एक साथ कई प्रोटीन की गतिशीलता की जांच करने के लिए उपलब्ध हैं।

Dendra2 और अन्य PAFPs का उपयोग प्रयोग फोटोब्लैचिंग (FRAP) और रेडियोधर्मी पल्स चेस लेबलिंग तकनीकों के बाद फ्लोरेसेंस वसूली से जोड़ा गया है । एक एफआरएपी सेटिंग में प्रोटीन को नवगठित फ्लोरोसेंट प्रोटीन से फिर से आरओआई में प्रवेश करना असंभव है, और नमूने की निरंतर निगरानी और दृश्य आवश्यक है। Dendra2 के साथ, दो स्पष्ट रूप से अलग आबादी उत्पन्न होती है जिन्हें समय के साथ स्वतंत्र रूप से देखा जा सकता है, इसलिए हरे रंग के Dendra2 के प्रतिस्थापित और नए संश्लेषित "निष्क्रिय" रूप को ट्रैक और मात्रात्मक16किया जा सकता है। Dendra2 सुपर रिप्रॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी में भी एक उपयोगी जांच है जैसे कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (टीआईआरएफ)28 और फोटोएक्टिवेशन लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम)29। निकट भविष्य में इस तरह की प्रगति बेहतर स्थानीयकरण और संभावित रूप से किसी भी पीओआई के एकल अणु ट्रैकिंग के लिए अनुमति देगी, जिससे नमूनों के भीतर और बीच में अधिक सूक्ष्म मतभेदों को उजागर करने की अनुमति मिलेगी और अंततः जैविक प्रणाली के भीतर किसी भी पीओआई के जीवन और भाग्य के बारे में नई जानकारी प्राप्त होगी।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम वित्तपोषण के लिए एमएलपी को उत्कृष्टता के न्यूरोक्योर क्लस्टर द्वारा जेके, न्यूरोक्योर पीएचडी फैलोशिप को डीएफजी (KI-1988/5-1) स्वीकार करते हैं। हम इमेजिंग सेट अप प्रदान करने के लिए लीबनिज रिसर्च इंस्टीट्यूट फॉर मॉलिक्यूलर फार्माकोलॉजी बर्लिन (एफएमपी) की इमेजिंग कोर सुविधा को भी स्वीकार करते हैं। इसके अलावा, हम डायोगो फेलेसियानो का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं जिन्होंने लैब में Dendra2 सिस्टम की स्थापना की और निर्देश दिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

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References

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फोटोवर्टिबल Dendra2 का उपयोग कर एजिंग <em>सी Elegans</em> में प्रोटीन कारोबार के वीवो क्वांटिफिकेशन में
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Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

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