Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

В Vivo Квантификация оборота белка в старении C. Elegans с помощью фотоотвержима Dendra2

doi: 10.3791/61196 Published: June 13, 2020

Summary

Представлено здесь протокол для мониторинга деградации белка hunttin сливается с фотоконвертируемой фторфор Dendra2.

Abstract

Белки синтезируются и деградируют постоянно в клетке для поддержания гомеостаза. Возможность контролировать деградацию интересующего белка является ключом к пониманию не только его жизненного цикла, но и выявлению дисбалансов в протеостазной сети. Этот метод показывает, как отслеживать деградацию болезнетворного белка хантитина. В нервной системе C. elegans выражены две версии хантингтина, слитого с Dendra2: физиологическая версия или версия с расширенным и патогенным участком глутамина. Dendra2 является фотоконвертируемым флуоресцентным белком; при коротком ультрафиолетовом (УФ) импульсе облучения, Dendra2 переключает свои спектры возбуждения/излучения с зеленого на красный. Подобно эксперименту пульс-погони, оборот преобразованного красно-dendra2 можно контролировать и количественно, независимо от вмешательства от вновь синтезированных зеленый-Dendra2. Используя конфокальную микроскопию и благодаря оптической прозрачности C. elegans,можно отслеживать и количественно оценить деградацию хантитина-Дендры2 в живом стареющем организме. Нейронная охота-дендра2 частично деградирует вскоре после преобразования и очищается дальше с течением времени. Системы, контролирующие деградацию, испытывают дефицит в присутствии мутантов-хантитинов и еще больше нарушаются со старением. Нейронные подтипы в одной и той же нервной системе обладают различными оборотными возможностями для охоты-дендры2. В целом, мониторинг любого интересующего протеина, слитого с Dendra2, может предоставить важную информацию не только о его деградации и игроках сети протеостаза, но и о ее местонахождении, торговле людьми и транспорте.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Протеом живого организма постоянно обновляется. Белки постоянно деградируют и синтезируются в соответствии с физиологическим спросом клетки. Некоторые белки быстро устраняются, в то время как другие дольше живут. Мониторинг динамики белка является более простой, более точной и менее инвазивной задачей при использовании генетически закодированных флуоресцентных белков (FPs). FPs образуют аутокаталитически и могут быть слиты с любым интересующим белком (POI), но не требуют ферментов, чтобы сложить или нужно кофакторы за исключением кислорода1. Новое поколение FPs недавно было разработано, чтобы переключить цвет при облучении с легким импульсом определенной длины волны. Эти фотоактивируемые FPs (PAFPs) позволяют маркировать и отслеживать POI, или органеллы или клетки они reside в, и рассмотреть их количественные и/или качественные параметры2. FPs позволяют отслеживать любое движение POI, направленность, скорость передвижения, коэффициент диффузии, мобильные и неподвижные фракции, время, которое он находится в одном сотовом отсеке, а также скорость его оборота. Для конкретных органелл, передвижения и транспорта, или деления и слияния события могут быть определены. Для определенного типа ячейки может быть установлено положение ячейки, скорость деления, объема и формы. Важно, что использование PAFPs позволяет отслеживать без непрерывной визуализации и без вмешательства со стороны любого недавно синтезированного зонда. Исследования как в клетках, так и в целом организмов успешно использовали PAFPs для решения биологических вопросов in vivo, таких как развитие рака и метастазов, сборка или разборка цитоскелета, и РНК-ДНК / белковых взаимодействий3. В этой рукописи, свет микроскопии и PAFPs используются для выявления оборота скорости агрегации подверженных белка hunttin (HTT) in vivo в C. elegans модели нейродегенеративных заболеваний.

Протокол, описанный здесь, количественно определяет стабильность и деградацию синтеза белка Hunttin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 является вторым поколением мономерных PAFP4, что необратимо переключает его выбросов / возбуждения спектра от зеленого до красного в ответ на уф или видимый синий свет, с увеличением его интенсивности до 4000 раз5,6. Хантингтин является белок, ответственный за причинение болезни Гентингтона (HD), смертельное наследственное нейродегенеративное расстройство. Huntingtin exon-1 содержит участок глутаминов (CAG, No). Когда белок выражается с более чем 39 ", он misfolds в мутант, токсичных и патогенных белков. Мутант HTT склонен к агрегации и приводит к смерти нейронных клеток и дегенерации, либо как короткие олигомерные виды или как большие высоко структурированные амилоиды7.

Нематод является модельной системой для изучения старения и нейродегенерации благодаря своей легкости манипуляции, изогенный характер, короткий срок службы, и его оптической прозрачности8. Для изучения стабильности HTT in vivo, конструкция синтеза была выражена в нервной системе C. elegans. HTT-D2 трансген, содержащий либо физиологический участок 25 "s (HTT-25-D2) или патологический участок 97"(HTT-97-D2) является overexpressed пан-нейронально на протяжении всей жизни нематода9. Путем подвергать в реальном маштабе времени C. elegans к краткой и сфокусированной точке света, одиночный нейрон photoswitched и преобразованный HTT-D2 отслеживается над временем. Чтобы установить, сколько HTT-D2 деградировало, разница между красным сигналом недавно преобразованного HTT-D2 сопоставлена с оставшимся красным сигналом HTT-D2 после определенного периода времени. Таким образом, становится возможным исследовать, как хантин деградирует, когда находится в его расширенной и токсичной форме по сравнению с его физиологической формой; как передние или задние нейроны по-разному реагируют на наличие No97 против 25 евро, особенно в течение длительных периодов времени; и как крах протеостазной сети (PN) во время старения способствует различиям в темпах деградации. Эти результаты описывают лишь небольшой набор наблюдений по обороту HTT-D2. Тем не менее, многие другие биологические вопросы, имеющие отношение как к области агрегации белка и протеостаза могут быть решены с этим in vivo применения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Поколение C. elegans, выражающих нейрональный синтез Ханттин-Дендра2

  1. Клон гена кодирования POI в векторе нематодного выражения (т.е., pPD95_75, Addgene #1494), традиционным ферментом ограничения дайджест10, Гибсон сборки11, или любой метод выбора. Вставьте промоутер, чтобы управлять выражением в желаемой ткани или на желаемой стадии развития. Вставьте флюорофор Dendra2 либо N- или C-терминально в кадре с POI.
  2. Генерировать трансгенные C. elegans, выражаюющие конструкцию синтеза (например, с помощью микроинъекционной конструкции)12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида, несущая трансгена, останется экстрахромомальным массивом. Интеграция конструкции не является необходимой, но может быть выполнена при желании13. В этом протоколе, C. elegans были микроиндукционные с плазмидой проведения синтеза построить huntingtin exon 1-Dendra2 (HTT-D2) под контролем пан-нейрональных промоутер Prgef-1. Костяк выражения C. elegans был получен от Kreis et al.14, huntingtin exon 1 с 25 или 97 евро был получен от Juenemann et al.15, и Dendra2 был получен от Hamer et al.16.

2. Возраст соответствия и поддержания C. elegans

  1. Возраст сопоставивал всех нематод путем синхронизации либо с щелочным гипохлоритным раствором17, либо с помощью откладывания яиц на 4 ч при 20 градусах Цельсия. Для откладывания яиц, место 10 gravid взрослых на свежесеянных нематод роста средств массовой информации (NGM) пластины и оставить на 4 ч до удаления. Яйца, отложенные в это время, придадут синхронных нематод.
  2. Держите экспериментальные C. elegans на нематоде роста средств массовой информации (NGM) пластин посеяны с бактериальным источником пищи E. coli OP50, после стандартных нематод мужства18.
  3. Выращивайте нематод при 20 градусах Цельсия до нужной стадии. Для этого протокола, необходимые возраст дни 4 и 10.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые взрослые в день 4 могут быть определены по наличию яиц в их гонады и их высокой подвижности. В возрасте день 10 нематод пост-плодородных, и пройти ухудшение ткани и локомотив снижение19.
  4. В течение дня 10 нематод, проход ежедневно после L4 этапе в день 3, как только нематоды плодородны, чтобы избежать смешанного населения.

3. Подготовка слайдов микроскопии для визуализации

  1. Подготовьте слайды микроскопии в день визуализации. В микроволновой печи, расплава общего сорта агарозы в концентрации 3% (w/v) в ddH2O. Оставьте немного остыть.
  2. Отрежьте кончик наконечник пипетки 1 мл и аспирировать примерно 400 мл расплавленной агарозы. Аккуратно поместите несколько капель агарозы на чистую стеклянную горку и сразу же поместите еще один слайд сверху, убедившись, что тонкая подушечка агарозы создается между ними. Дайте высохнуть, прежде чем аккуратно скольжения или подъема верхней соскальзыва.
  3. Поместите слайды агарозной площадки в увлажненный контейнер, чтобы предотвратить их высыхание. Они могут быть использованы в пределах 2-3 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования небольших пузырьков в агарозе, так как нематоды могут оказаться в ловушке внутри.

4. Определение параметров конфокального микроскопа

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем устанавливать нематоды и получение данных, определите все настройки программного обеспечения для приобретения confocal. Настройки могут быть адаптированы к аппаратному обеспечению и программному обеспечению для визуализации.

  1. Откройте конфокальное программное обеспечение и определите настройки лазерной визуализации. Установите световой путь для возбуждения/выбросов для зеленого Dendra2 на 486-553 нм и для красного Dendra2 на 580-740 нм. Отрегулируйте мощность и увеличение обоих каналов/ лазеров в зависимости от интенсивности фторфора. Не изменяйте цифровой выигрыш или смещения и установите пинхол как полностью открытый.
  2. Определите настройку приобретения: выберите последовательный режим канала и переключите трек каждого кадра. Установите режим сканирования в виде кадра, а размер кадра как 1024 x 1024, с ступенькой 1. Установите усреднение до 2, и среднее по среднему методу и режиму однонаправленной линии. Установите глубину бита до 8 битов.
  3. Определите параметры многомерных приобретений для преобразования Dendra2. Для преобразования и отбеливания используйте 405-нм диодный лазер, установленный на 60% энергии. При наличии, активировать безопасное отбеливание GaAsP для защиты детекторов.
  4. Выберите временные ряды из двух циклов, с интервалом 0,0 мс между ними, и нормальным запуском и остановкой. Начните отбеливание после сканирования 1 из 2 и повторите в течение 30 итераций. Остановить отбеливание, когда интенсивность падает до 50%.
  5. Определите скорость захвата/пиксельного жилища так быстро (например, максимальная 12 евро) для преобразования и среднюю скорость (например, средний 5) для захвата изображения привязки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры отбеливания, определенные здесь, являются руководящими принципами. Для других Dendra2 помеченных POI настройки мощности лазера и отбеливания итераций и значений должны быть установлены эмпирически.

5. Установка C. elegans на слайды микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Если это возможно, поместите монтаж стереомикроскоп близко к установке конфокального микроскопа и смонтировать нематоды непосредственно перед изображением.

  1. На стеклянной крышке слайд на противоположной стороне агарозной площадки, нарисуйте окно с четырьмя квадратами с постоянным маркером и номер их.
  2. Pipette 15 мл левамизола в середине агарозной площадки. Концентрация левамизола будет варьироваться в зависимости от возраста нематода: при визуализации день 4 нематод использовать 2 мМ левамизол; при визуализации день 10 нематод использовать 0,5 мМ левамизола.
  3. Передача четырех нематод в жидкость с помощью проволоки забрать. С помощью ресниц, осторожно переместить каждого отдельного нематода на оконный квадрат. Сворачивайте ресницы так, чтобы любой след E. coli OP50 разбавлялся и ее флуоресцентный фон не мешал получению сигнала.
  4. Подождите, пока нематоды почти перестанут двигаться и аккуратно поместите крышку скольжения поверх жидкости, чтобы обездвижить нематод в слое левамизола между агарозной площадкой и крышкой скольжения.
  5. Поместите перевернутый слайд на конфокальной сцене, чтобы с изображением нематод.

6. Преобразование зеленого Dendra2: Приобретение данных на нулевом времени

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты по пульс-погоне начинаются с необратимого преобразования белка синтеза Dendra2 из зеленого испускающего фторфора в красный.

  1. Используя окуляр микроскопа, найдите первый нематод с 20-й целью под зеленой флуоресценцией. Сосредоточьтесь на голове или хвосте и переключитесь в конфокальный режим.
  2. Начните живое лазерное сканирование с помощью 488 нм синего лазера, чтобы визуализировать зеленый Dendra2 в зеленом канале EGFP (ex/em 486-553 nm). Выберите один нейрон и привести его в фокус. Увеличьте масштаб в 3x и увеличьте цель лазерного луча4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите один нейрон на нематод. Каждый нейрон будет представлять собой один образец или точку данных.
  3. Найти максимальную проекционную плоскость и, в зависимости от яркости фторфора, увеличить или уменьшить усиления или лазерной мощности для получения насыщенных, но не переэкспонированных изображений, идентифицируемых по индикатору цветового диапазона. Как только это определено, прекратите сканирование.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не облучайте образец слишком долго или слишком много энергии, как возбуждение с видимым синим 488 нм свет может также преобразовать Dendra2, хотя медленно и менее эффективно4.
  4. В программном обеспечении откройте вкладку, чтобы выбрать интересующие регионы (ROI) и нарисуйте первый рентабельность инвестиций вокруг выбранного нейрона. Определите большую вторую область интересов, охватывающую голову нематода и включая первую рентабельность инвестиций.
  5. В условиях отбеливания выберите первый рентабельность инвестиций, который будет приобретен, обесцвечен и проанализирован. Выберите второй рентабельность инвестиций, который будет приобретен и проанализирован, но не обесцвечен.
  6. Установите скорость сканирования до максимума (т.е. быстрое пиксельное жилище) и начните эксперимент по преобразованию выбранных нейронов Dendra2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только эксперимент будет завершен, приобретенная картинка приведет к двум изображениям: одному до и одному после преобразования. Для зеленого канала, первое изображение должно иметь более высокий зеленый сигнал, который уменьшается во втором изображении из-за преобразования зеленого Dendra2. Для красного канала первое изображение должно быть отрицательным и не показывать сигнала, а красный сигнал отображается на изображении после преобразования. Если зеленый сигнал не уменьшается, преобразование не произошло, и настройки, такие как 405 лазерной мощности или количество итераций, должны быть изменены. Если есть красный сигнал на первом изображении, то 488 нм лазерная мощность используется была слишком высока, и часть зеленого Dendra2 уже преобразуется в красный. В этом случае следует выбрать новый нейрон/нематод.
  7. Сразу же после преобразования, начать живое сканирование с зеленым 561 нм лазера для визуализации Dendra2 в красном канале (ex/em 580-740 нм). Найти фокус и соответствующую максимальную проекцию преобразованного нейрона с помощью индикатора цвета диапазона, чтобы избежать передержки.
  8. Быстро установите скорость сканирования до более низкой скорости пиксельного жилища (например, 5x) и приобретите моментальное изображение обоих каналов с более высоким разрешением. Это изображение определяется как точка времени ноль (T0) после преобразования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость приобретения для переделанного изображения может быть различной. Однако, как только выбрано, эта скорость должна оставаться постоянной на протяжении всего сбора данных.
  9. Сохранить сканирование с идентифицируемым именем и/или номером, за которым следует метка времени нулевой (T0).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется также сохранить изображение эксперимента преобразования (шаг 6.6), чтобы проиллюстрировать отсутствие красного сигнала перед преобразованием и его появление впоследствии.

7. Изображение преобразованного красного Dendra2 для получения данных в выбранной точке второго времени

  1. Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 с течением времени, определите второй пункт времени, чтобы обрамить того же нематода/нейрона. Выберите вторую точку времени экспериментально для решения любого соответствующего биологического вопроса. Для протокола, описанного здесь, Dendra2 изображен как на 2 ч (T2) и 24 ч (T24) после преобразования.
    1. В выбранной точке времени, найти тот же нематод / нейрон с использованием окуляра и красной флуоресценции.
    2. Откройте изображение T0 соответствующего нематода/нейрона и перезагрузите/повторное использование настроек изображения. Убедитесь, что параметры приобретения снимка точно такие же при получении изображений T0, T2 и T24 h.
    3. Сканирование жить в красном канале, принести преобразованный красный нейрон в фокус. Поскольку красный Dendra2 деградирует с течением времени, индикатор диапазона покажет менее интенсивную максимальную проекцию. Не меняйте параметры приобретения и получите снимок с той же скоростью (например, 5x), что и первое изображение.
  2. Чтобы отслеживать деградацию Dendra2 после 4 ч или дольше, спасти нематод после преобразования.
    1. Удалите слайд из микроскопа сразу после преобразования и изображения четырех нематод. Аккуратно снимите крышку и с помощью проволочного кирки поднимите каждый нематод с агарозной площадки.
    2. Поместите каждый нематод индивидуально на соответствующую маркированную и идентифицируемую пластину NGM.
    3. Во второй раз, смонтировать нематод снова на свежий агарозной площадке и приступить к изображению преобразованы красный Dendra2 следующие инструкции в разделе 6.

8. Анализ изображений преобразованных Dendra2

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ деградации Dendra2 осуществляется с помощью программного обеспечения Фиджи/ImageJ20.

  1. Откройте Фиджи и перетащите и падение файла .lsm в бар Фиджи. Откройте изображение T0, сделанное сразу после преобразования, и изображение того же нематода, сделанное в выбранной точке времени после преобразования (T2 или T24 h).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для отслеживания деградации интересующего протеина, слитого с Dendra2, необходимо проанализировать только красный канал.
  2. Установить параметры измерения из меню: Анализ Набор измерений. Выберите функции области и интегрированной плотности.
  3. Выберите изображение, полученное с помощью красного канала. Выберите инструмент выбора полигона из бара Фиджи.
  4. Определите преобразованный нейрон на изображении T0 и нарисуйте рентабельность инвестиций вокруг него с помощью инструмента выбора.
    1. Чтобы правильно определить контуры нейрона, выделите пороговые значения интенсивности, выбрав из бара Изображение Отрегулируйте Порог. Перетащите курсор бара, чтобы разграничить порог и отслеживать вокруг этой области с помощью инструмента полигона. Для генерации точной рентабельности инвестиций можно также использовать контур выбранного нейрона из зеленого канала.
  5. После того, как выбор был сделан в окне красного канала, нажмите Анализ Мера. Появится всплывающее окно с именем Результаты, включанное значения рентабельности инвестицийдля Area, IntDenи RawIntDen.
  6. Выполните тот же процесс отбора и измерения для изображения второй точки времени (T2 или T24 h).
  7. Копировать полученные значения в программное обеспечение электронной таблицы, заботясь, чтобы надлежащим образом записывать значения на T0 после преобразования, и на T2 или T24 ч после преобразования.

9. Расчет соотношения деградации Dendra2

  1. Для расчета соотношения деградации сначала назначить значение 1 (или 100%) время деградации от момента до нуля (т.е. сразу после преобразования, когда все красные Dendra2 преобразованы все еще присутствует). Это является результатом деления значения IntRawDen T0 само по себе.
  2. Для расчета уменьшения красного сигнала интенсивности Dendra2 с течением времени и деградации разделите значение RawIntDen второй точки времени (например, T2 или T24 h) по значению RawIntDen T0. Полученное число должно быть меньше 1. Эти значения также могут быть выражены в процентах, определяя T0 как 100%.
  3. Повторите раздел 7 для каждого нематода преобразуется. Для графического представления деградации Dendra2 наметьте участок рассеяния или штрих-график с процентными или коэффициентными значениями уменьшения флуоресценции, полученными в оси y. Примените любой желаемый статистический анализ и проиллюстрируйте его на графике.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Два штамма нематод, выражающих фрагмент белка охотничьих экзон-1 в кадре с фотоопровержимым белком Dendra2, были получены с помощью микроинъекции, а плазмиды хранились как экстрахромосомный массив. Конструкция синтеза была выражена во всей нервной системе C. elegans от развития на протяжении всего старения. Здесь, HTT-D2 содержал либо физиологические 25 полиглутамин стрейч (HTT-25-D2, Рисунок 1)или полностью проницаемый и патогенный повтор с 97 глутаминами (HTT-97-D2, Рисунок 1B). Первоначально синтез белка была протестирована, чтобы убедиться, что он изменился от зеленого спектра к его красный спектр на УФ-облучения. HTT-D2 успешно переключился с зеленого на красный исключительно в освещенном регионе. В зависимости от мощности и итераций УФ-импульса, и в зависимости от z-плоскости и проницаемности лазерного луча через кутикулу нематода, определенная часть HTT-D2 была преобразована, но не все. Красный сигнал появился в фотоконвертированных нейронов, колокализации с зеленым неконвертированный HTT-D2 (Рисунок 1C,D). Благодаря точности лазерного сканирования фотоных лучей удалось преобразовать точный рентабельность инвестиций, соответствующий одному нейрону. До преобразования, не красный сигнал был виден, когда образец был возбужден в красный канал(Рисунок 2A). После УФ-облучения, зеленый сигнал уменьшился, как HTT-D2 был преобразован и красный сигнал, наконец, появился (Рисунок 2B). HTT-D2 затем деградировал с течением времени, в результате чего снижение уровня красного HTT-D2(Рисунок 2C) и возможное увеличение зеленого сигнала HTT-D2, как больше синтезированного белка был недавно синтезирован. Поскольку значительное снижение уже было заметным на 2 ч после преобразования, этот интервал для обнаружения и количественной оценки деградации HTT-D2 был сохранен. Важно отметить, что деградация не является единственным процессом, который может произойти после преобразования HTT-D2. Преобразованный HTT-D2 может быть продан и транспортирован по аксонам, что приводит к уменьшению красного сигнала не из-за зазора. Однако, с настройками, используемыми здесь и в течение короткого промежутка времени 2 ч, не наблюдалось распространения красного сигнала, возможно, из-за того, что маленький HTT-D2 был перемещен из сомы в аксон. Кроме того, преобразование и визуализация единой целой нейрональной сомы помогли исключить эффекты диффузии HTT-D2 в пределах одного нейрона, поскольку все клеточные отсеки анализировались одновременно. Для изучения как диффузии, так и транспорта/торговли рекомендуется получать быстрые и более высокие изображения увеличения и отслеживать меньшую и, возможно, более подвижную часть интересующего белка. Важно также отметить, что в рамках набора экспериментов каждое животное представляло собой одно биологическое повторение. Только один нейрон на нематод был изображен, каждое животное было изображено один раз за сеанс, и визуализация произошла в течение трех сессий, которые составили технические повторы. Три сеанса требовали синхронизации животных на свежих тарелках перед каждым экспериментом либо в 4-й, либо в 10-й день, что позволило налагать на нематод любую экологическую изменчивость. Три сеанса также учитывают любую изменчивость, возникающую в результате создания изображения (например, мощность лазера, изменяемая из-за разной температуры между экспериментами). Все биологические репликации, полученные в течение трех сессий (минимум 20 животных), были рассмотрены в отдельных образцах и использованы для установления статистической значимости.

После подтверждения того, что оба штамма C. elegans HTT-D2 были эффективными и устанавливали оптимальные параметры преобразования, были исследованы различия между оборотом вызывающего болезнь белка HTT-D2 (т.е. HTT-97-D2) по сравнению с его физиологически соответствующим контролем (HTT-25-D2). Во-первых, наблюдалась деградация HTT-D2 в различных нейронах(рисунок 3). Известно, что подтипы нейронов в нервной системе нематода различаются по своей метаболической активности иморфологии 21,возможно, что делает разницу в деградации и ребалансировке протеома. Нейроны хвостовой области были сравнена с нейронами головы и оказались значительно более активными(рисунок 3A). Этот вывод был действителен только для HTT-25-D2, а не для патогенных HTT-97-D2, предполагая, что PN был не в состоянии удалить HTT-D2, содержащий более длинные глутамин тянется по всей нервной системы (Рисунок 3B).

Чтобы еще больше подтвердить, что модельная система вела себя так, как ожидалось, эксперименты по преобразованию проводились в течение более длительного периода, что позволило путям деградации клеток устранить белок интереса почти полностью(Рисунок 4). Действительно, было значительно больше деградации контроля HTT-25-D2 24 ч после преобразования, чем после 2 ч в голове нейронов, и значительно больше в хвостовых нейронов (Рисунок 4A). Опять же, задний хвост нейронов более активно удаляется красный HTT-D2, даже в течение увеличенного интервала времени. Аналогичная тенденция была обнаружена в случае заболевания HTT-97-D2, с очень небольшим снижением красного сигнала HTT-D2 более чем на 24 ч. Тем не менее, HTT-97-D2 не был удален так же легко, как HTT-25-D2, особенно после 24 ч. Вполне возможно, что только растворимая фракция HTT-97-D2 эффективно деградирует, что объясняет первоначальное уменьшение красного сигнала и его дальнейшее мягкое уменьшение с течением времени. Важно отметить, что было две популяции нейронов после 24 ч: один с более высокой скоростью деградации и один, где красный сигнал HTT-D2 не деградировал вообще, или потенциально даже увеличилось (Рисунок 4B). Увеличенный и стабильный сигнал по возможности представляет уже агрегированные или непрерывно агрегируя виды которые существенн более трудно освободить от клеток из-за их плотно упакованного амилоидного характера. Эти включения, присутствующие исключительно тогда, когда глутамин тянется превысил 40 порог повторить, и которые появились микроскопически, как очаги, были предположили, чтобы накопить как отложения, которые не могут быть легко удалены22. Возможно также, что увеличение красного флуоресцентного сигнала было артефактом в результате технических проблем (например, использование неправильных параметров приобретения, к югу от номинальной производительности установки микроскопии или ошибочный процесс восстановления/монтажа). При получении изображений в течение более длительных периодов времени эти переменные должны быть приняты во внимание.

Наконец, поскольку нейродегенеративные расстройства, такие как БГ проявляются во взрослой жизни, влияние старения на скорость деградации HTT-D2 наблюдалось. Преобразование эксперименты были выполнены в голове и хвосте области молодых (день 4) по сравнению со старыми (день 10) нематод в обоих штаммов HTT-D2 (Рисунок 5). Для головных нейронов, не было никаких существенных изменений в скорости деградации из-за старения в течение всего срока службы как HTT-25-D2 и HTT-97-D2, возможно, потому, что HTT-D2 был удален в равной степени на протяжении всей жизни каждого нематода. Тем не менее, очень значительные изменения были зарегистрированы при сравнении старых нематод, содержащих либо патологические или физиологические глутамин стрейч. HTT-97-D2 не деградировал так же эффективно, как HTT-25-D2, подчеркивая неспособность PN удалить агрегированные и, возможно, токсичные виды хантитин в старых нематод(Рисунок 5). Опять же, наблюдалась более активная и значительная текучесть в хвостовых нейронах. Как и в головных нейронах, более надежный оборот HTT-25-D2 не наблюдался в хвостовых нейронах молодых нематод по сравнению со старшей когортой, и деградация была равна в день 4 и день 10. И наоборот, значительные изменения в темпах деградации между контролем и патогенными штаммами HTT-D2 появились в молодом 4 день нематод, став еще более значительным в день 10. Важно отметить, что хвостовые нейроны смогли справиться с токсичными HTT-97-D2 у молодых нематод, иллюстрируя, что различные сопутствующие механизмы PN могут быть на работе, чтобы удалить HTT-D2(рисунок. 5B). В целом активность PN со временем уменьшилась, возможно, из-за пагубных последствий, вызванных как старением, так и наличием агрегатов.

Figure 1
Рисунок 1: C. elegans выразил huntingtin exon-1 сливается с Dendra2 в нервной системе. (A) Молодые, день 4 C. elegans пан-нейронально выражая huntingtin exon-1, содержащий 25 глутаминов, сливается с Dendra2 в его непреобразованном зеленом возбуждении / эмиссии государства. Шкала бар No 100 мкм. Insets показывают увеличенное изображение головы (вверху) и хвоста (внизу) нейронов. Вставка шкала бар No 10 м . (B) Молодые, день 4 C. elegans пан-нейронально выражения huntingtin exon-1, содержащий 97 глутаминов, слитых в Dendra2 в его непреклонный зеленый возбуждение / эмиссии государства. Шкала бар No 100 мкм Insets показать увеличенное изображение хвоста (вверху) и головы (внизу) нейронов, и голова день 7 нематод (крайний справа). Вставка шкалы бар No 10 мкм Белые наконечники стрел указывают на HTT-97-D2 foci, изображая huntingtin агрегаты. (C) Канал слияние изображения HTT-25-D2 с преобразованием головного региона. Коробка представляет собой часть всего C. elegans, который был облучен УФ-излучением. Шкала штриха No 100 мкм. Inset показывает выброс Dendra2 на уровне 488 нм (вверху, зеленый) и на 561 нм (внизу, красный). Шкала бар No 10 м. (D) Канал слияние изображения HTT-97-D2 с преобразованием головного области. Шкала бар No 100 мкм Box представляет собой часть всего C. elegans, который был ОБлучен УФ-излучения. Inset показывает выброс Dendra2 на 488 нм (вверху, зеленый) и на 561 нм (внизу, красный). Масштабная панель No 10 м. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Преобразованный красный HTT-D2 уменьшается с течением времени в одиночных нейронов. Хвостовые нейроны HTT-25-D2. Два нейрона показаны одновременно и независимо фотоконвертированы. Изображения последовательно изображают три точки времени: (A) Перед облучением (до), (B) сразу после облучения (преобразование), и(C) 2 ч после облучения (после). Верхняя панель (зеленый канал) представляет сигнал HTT-D2, собранный на 486-553 нм возбуждения / выбросов. Белая область интереса разграничивает нейроны, которые были облучены. Средняя панель (красный канал) показывает преобразованный сигнал HTT-D2, собранный при возбуждении/излучении 580-740 нм. Нижняя панель представляет собой слияние двух каналов. Масштабная панель 5 мкм для всех изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Нейроны головы и хвоста продемонстрировали различные темпы деградации. Графики столбцов показывают процент красной интенсивности относительно начального значения на момент преобразования (т.е. 100%). Преобразованный красный сигнал Dendra2 уменьшился в целом в течение 2 ч интервал, как HTT-D2 был деградирован в нейронах C. elegans. В нервной системе нематода нейронов подтипов выставлены различные темпы деградации, с хвостовыми нейронами, показывающими более активный оборот, но только в нематодах, несущих непатогенный полиглутамин стрейч. (A) Количественная оценка деградации в головке HTT-25-D2 по сравнению с хвостовыми нейронами. Средний SD, неокрашенный двуххвостый тест студента. N No 23-28 образцов/нематод, изображенных на область, 0,05. (B) Количественная оценка деградации в головке HTT-97-D2 по сравнению с хвостовыми нейронами. Средний SD, неокрашенный двуххвостый тест студента. N 23-28 образцов/нематод, изображенных на область, нс и несущественных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: HTT-97-D2 не был значительно очищен после 24 ч. Графики столбцов показывают процент красной интенсивности относительно начального значения на момент преобразования (т.е. 100%). Преобразованный красный сигнал Dendra2 уменьшился, как HTT-D2 был деградирован в нейронах C. elegans. HTT-D2 проявлял различные темпы деградации. Даже в течение более длительных периодов времени после преобразования, патогенные HTT-D2 не могут быть удалены по сравнению с его здоровым контролем. (A) Количественная оценка скорости деградации в HTT-25-D2 в двух точках времени после преобразования (2 ч и 24 ч) в головах и хвостовых нейронах. Средний SD, односторонний анализ дисперсии (ANOVA). N No 21-28 образцов/нематод, изображенных за время/регион, 0,05, 0,0001. (B) Количественная оценка скорости деградации в HTT-97-D2 в двух точках времени после преобразования (2 ч и 24 ч) в головах и хвостовых нейронах. Средний SD, односторонний анализ дисперсии (ANOVA), а затем Tukey's Multiple Comparison пост-специальный тест.  N No 21-28 образцов/нематод, изображенных за время/регион, ns и несущественных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5: Старые и молодые нематоды, выражаюющие патогенный HTT-D2, не деградируют его эффективно. Графики столбцов показывают процент красной интенсивности относительно начального значения на момент преобразования (т.е. 100%). Преобразованный красный сигнал Dendra2 уменьшился, так как HTT-D2 деградировал в нейронах. По мере того как нематод стареет, своя способность ухудшить патогенный HTT-D2 дополнительн была повреждена повсеместно в своя нервная система. (A) Количественная оценка скорости деградации в головных нейронах молодых (день 4) и старых (день 10) нематод HTT-25-D2 по сравнению с возрастной HTT-97-D2 нематод. Средний SD, односторонний анализ дисперсии (ANOVA). N 23-28 образцов/нематод, изображенных на штамм/день, 0,0001. (B) Скорость деградации 2 ч после преобразования в хвостовых нейронов молодых (день 4) и старых (день 10) HTT-25-D2 нематод, по сравнению с возрастной HTT-97-D2 нематод. Средний SD, односторонний анализ дисперсии (ANOVA), а затем Tukey's Multiple Comparison пост-специальный тест. N 23-28 образцов/нематод, изображенных на штамм/день, 0,05, 0,001, 0,001, 0,001, 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы понять функцию белка, важно понимать его синтез, расположение и деградацию. С развитием новых, стабильных и ярких FPs, визуализация и мониторинг POI стала проще и эффективнее. Генетически выраженный фьюжн PAFPs, такие как Dendra2, имеют уникальную возможность изучить стабильность POI. При воздействии фиолетово-голубого света, Dendra2 ломается в точном месте в триаде сохраненных аминокислот. Флюорофор претерпевает небольшие структурные изменения, в результате чего полный сдвиг спектра с зеленого на красный23. Этот сдвиг позволяет обнаруживать и контролировать любой POI, связанный с Dendra2. Действительно, эти конструкции синтеза были впервые использованы для создания C. elegans репортер штамм для изучения убиквитин-протеасомной системы в vivo16. Dendra2 был также использован, чтобы понять уязвимость селективных нейронных подтипов и их способность иметь дело с расширенной полиглутамин белков24, или контролировать индукцию аутофагии в моделях болезни моторных нейронов25.

Протокол представлен здесь для мониторинга in vivo деградации хантитина, связанных с болезнью агрегации подверженных белка в неинвазивной образом. После успешного создания нейрональной C. elegans модели HD, выражая HTT-D2 пан-нейронально, темпы деградации расширенной и патогенной HTT по сравнению с его физиологическим аналогом были количественно оценены. Поразительные различия наблюдались между нейронными подтипами, между молодыми и престарелыми нематодами, а также между способностью PN бороться с токсичными нагрузками глутамина с течением времени. Этот метод также может быть применен для отслеживания местоположения и движения хантитина, а также его судьбы при введении возмущений к PN. siRNA нокдаун ключевых сопровождающих или администрации соединений, которые подавляют протеасомной деятельности может раскрыть функцию и важность этих компонентов в агрегации подверженных белков: например, ли PN активирует конкретные узлы, чтобы компенсировать недостатки26. Он также может объяснить пагубные последствия, вызванные болезнью по сравнению с нормальным старением.

Хотя с помощью этого метода можно решить множество различных вопросов, как только будет создана желаемая модель, для получения надежных данных необходимо установить правильные параметры преобразования и обнаружения. Также решающее значение имеет определение параметров преобразования, которые позволяют достаточный выход активированного белка без фотоблегодирования или фототоксичности и без нежелательного преобразования. Кроме того, для каждого изученного белка в рамках конкретной модельной системы, как ex vivo, так и in vivo, необходимо экспериментально установить период времени, достаточно большой, чтобы обеспечить точную количественную оценку скорости деградации.

Dendra2 предлагает ряд преимуществ по сравнению с другими PAFPs: 1) это мономерный и очень яркий; 2) он имеет высококонтрастную фотоконверсию и стабильный фотоконвертированный сигнал; 3) он может быть активирован с низкой фототоксичностью синим лазером 488 нм, который является частью большинства конфокальных аппаратных установок; 4) он эффективно созревает при 37 градусах Цельсия для применения в клетках млекопитающих; 5) он не имеет токсичных побочных эффектов, когда выражается в течение длительных периодоввремени 23,,27; и 6) система не зависит от изменений в уровнях экспрессии между или внутри организма или клетки, так как количественно оценивается только соотношение сигнала Dendra2 до и после преобразования. Все перечисленные свойства делают Dendra2 идеальным фторфором для отслеживания динамики белка в режиме реального времени и мониторинга судьбы клеток.

К сожалению, белки синтеза Dendra2 страдают от некоторых распространенных ограничений флуоресцентной маркировки белка. Конструкция химерных видов часто экспериментально переэкспрессии в биологических системах, хотя эндогенное выражение может быть установлено с помощью геномной инженерии. Скорость деградации Dendra2 сама потенциально влияет на деградацию целевого белка, хотя он был описан как очень стабильный, долгоживущий белок27. Кроме того, Dendra2 не подходит для отслеживания белков с очень быстрыми оборотами, поскольку он не может иметь время для собственного правильного созревания. Наконец, 405 нм лазеров, которые являются редкостью, являются предпочтительными для эффективного фотосвека, хотя они являются более токсичными для образца. Действительно, меньше фототоксичный синий свет может быть использован как визуализировать зеленый Dendra2 и преобразовать его, когда лазерная мощность на высокой интенсивности. Эта особенность всегда следует иметь в виду, как длительное воздействие приведет к нежелательной конверсии и потенциально неправильные измерения. Наконец, может быть проблематично использовать Dendra2 в сочетании с зелеными или красными фторфорами. Тем не менее, много различных PAFPs доступны для исследования динамики нескольких белков одновременно.

Эксперименты с использованием Dendra2 и других PAFPs были связаны с восстановлением флуоресценции после фотоблечи (FRAP) и радиоактивных методов маркировки пульс-погони. В условиях FRAP невозможно отличить белки, повторно поступающие в рентабельность инвестиций, от вновь сформированного флуоресцентного белка, и необходим постоянный мониторинг и визуализация образца. С Dendra2, два четко различимых популяций генерируются, которые могут независимо наблюдаться с течением времени так заменить и вновь синтезированных "неактивных" форма зеленого Dendra2 можно отслеживать и количественно16. Dendra2 также полезный зонд в микроскопии супер разрешение, такие как общее внутреннее отражение флуоресцентной микроскопии (TIRF)28 и фотоактивации локализации микроскопии (PALM)29. В ближайшем будущем такие достижения позволят лучше локализовать и потенциально одну молекулу отслеживания любого POI, что позволяет выявить более тонкие различия внутри и между образцами и в конечном итоге дает новую информацию о жизни и судьбе любого POI в рамках биологической системы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 для JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP) для финансирования. Мы также признаем, Imaging Core фонда Лейбниц научно-исследовательский институт молекулярной фармакологии Берлина (FMP) для обеспечения изображения создан. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Диого Фелечиано, который создал систему Dendra2 в лаборатории и дал инструкции.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar-Agar Kobe I Carl Roth GmbH + Co. KG 5210.2 NGM component
Agarose, Universal Grade Bio & Sell GmbH BS20.46.500 Mounting slide component
BD Bacto Peptone BD-Bionsciences 211677 NGM component
Deckgläser-18x18mm Carl Roth GmbH + Co. KG 0657.2 Cover slips
EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 Carl Zeiss AG Objective
Fiji/ImageJ 1.52p NIH Analysis Software
Levamisole Hydrochloride AppliChem GmbH A4341 Anesthetic
LSM710-ConfoCor3 Carl Zeiss AG Laser Scanning Confocal Micoscope
Mounting stereomicroscope Leica Camera AG Mounting microscope
neuronal-HTTQ25-Dendra2 this paper C. elegans strain
neuronal-HTTQ97-Dendra2 this paper C. elegans strain
OP50 Escherichia coli CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) OP50 Nematode food source
Sodium Chloride Carl Roth GmbH + Co. KG 3957.2 NGM component
Standard-Objektträger Carl Roth GmbH + Co. KG 0656.1 Glass slides
ZEN2010 B SP1 Carl Zeiss AG Confocal acquisition software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67, (1), 509-544 (1998).
  2. Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85, (08), 45-61 (2008).
  3. Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 885-890 (2005).
  4. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, (8), 2024-2032 (2007).
  5. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24, (4), 461-465 (2006).
  6. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42, (5), 553-565 (2007).
  7. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1, (1), 15005 (2015).
  8. Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7, (1), 31-39 (2014).
  9. Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70, (1), 51-65 (2011).
  10. Addgene. Plasmids 101: A Desktop Resource. 3rd Edition, https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition 45-50 (2020).
  11. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6, (5), 343-345 (2009).
  12. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10, (12), 3959-3970 (1991).
  13. Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
  14. Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10, (1), 1-13 (2019).
  15. Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
  16. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7, (6), 473-478 (2010).
  17. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  18. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
  19. Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1-21 (2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (7), 676-682 (2012).
  21. Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. 1-19 (2005).
  22. Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration? Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, (11), 891-898 (2005).
  23. Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48, (22), 4905-4915 (2009).
  24. Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9, (9), 586-594 (2013).
  25. Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10, (8), 677-685 (2014).
  26. Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
  27. Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42, (4), 446-450 (2007).
  28. Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5, (4), 105 (2018).
  29. Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101, (6), 1522-1528 (2011).
В Vivo Квантификация оборота белка в старении <em>C. Elegans</em> с помощью фотоотвержима Dendra2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).More

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. In Vivo Quantification of Protein Turnover in Aging C. Elegans using Photoconvertible Dendra2. J. Vis. Exp. (160), e61196, doi:10.3791/61196 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter