В Vivo Квантификация оборота белка в старении C. Elegans с помощью фотоотвержима Dendra2
Summary
Представлено здесь протокол для мониторинга деградации белка hunttin сливается с фотоконвертируемой фторфор Dendra2.
Abstract
Белки синтезируются и деградируют постоянно в клетке для поддержания гомеостаза. Возможность контролировать деградацию интересующего белка является ключом к пониманию не только его жизненного цикла, но и выявлению дисбалансов в протеостазной сети. Этот метод показывает, как отслеживать деградацию болезнетворного белка хантитина. В нервной системе C. elegans выражены две версии хантингтина, слитого с Dendra2: физиологическая версия или версия с расширенным и патогенным участком глутамина. Dendra2 является фотоконвертируемым флуоресцентным белком; при коротком ультрафиолетовом (УФ) импульсе облучения, Dendra2 переключает свои спектры возбуждения/излучения с зеленого на красный. Подобно эксперименту пульс-погони, оборот преобразованного красно-dendra2 можно контролировать и количественно, независимо от вмешательства от вновь синтезированных зеленый-Dendra2. Используя конфокальную микроскопию и благодаря оптической прозрачности C. elegans,можно отслеживать и количественно оценить деградацию хантитина-Дендры2 в живом стареющем организме. Нейронная охота-дендра2 частично деградирует вскоре после преобразования и очищается дальше с течением времени. Системы, контролирующие деградацию, испытывают дефицит в присутствии мутантов-хантитинов и еще больше нарушаются со старением. Нейронные подтипы в одной и той же нервной системе обладают различными оборотными возможностями для охоты-дендры2. В целом, мониторинг любого интересующего протеина, слитого с Dendra2, может предоставить важную информацию не только о его деградации и игроках сети протеостаза, но и о ее местонахождении, торговле людьми и транспорте.
Introduction
Протеом живого организма постоянно обновляется. Белки постоянно деградируют и синтезируются в соответствии с физиологическим спросом клетки. Некоторые белки быстро устраняются, в то время как другие дольше живут. Мониторинг динамики белка является более простой, более точной и менее инвазивной задачей при использовании генетически закодированных флуоресцентных белков (FPs). FPs образуют аутокаталитически и могут быть слиты с любым интересующим белком (POI), но не требуют ферментов, чтобы сложить или нужно кофакторы за исключением кислорода1. Новое поколение FPs недавно было разработано, чтобы переключить цвет при облучении с легким импульсом определенной длины волны. Эти фотоактивируемые FPs (PAFPs) позволяют маркировать и отслеживать POI, или органеллы или клетки они reside в, и рассмотреть их количественные и/или качественные параметры2. FPs позволяют отслеживать любое движение POI, направленность, скорость передвижения, коэффициент диффузии, мобильные и неподвижные фракции, время, которое он находится в одном сотовом отсеке, а также скорость его оборота. Для конкретных органелл, передвижения и транспорта, или деления и слияния события могут быть определены. Для определенного типа ячейки может быть установлено положение ячейки, скорость деления, объема и формы. Важно, что использование PAFPs позволяет отслеживать без непрерывной визуализации и без вмешательства со стороны любого недавно синтезированного зонда. Исследования как в клетках, так и в целом организмов успешно использовали PAFPs для решения биологических вопросов in vivo, таких как развитие рака и метастазов, сборка или разборка цитоскелета, и РНК-ДНК / белковых взаимодействий3. В этой рукописи, свет микроскопии и PAFPs используются для выявления оборота скорости агрегации подверженных белка hunttin (HTT) in vivo в C. elegans модели нейродегенеративных заболеваний.
Протокол, описанный здесь, количественно определяет стабильность и деградацию синтеза белка Hunttin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 является вторым поколением мономерных PAFP4, что необратимо переключает его выбросов / возбуждения спектра от зеленого до красного в ответ на уф или видимый синий свет, с увеличением его интенсивности до 4000 раз5,6. Хантингтин является белок, ответственный за причинение болезни Гентингтона (HD), смертельное наследственное нейродегенеративное расстройство. Huntingtin exon-1 содержит участок глутаминов (CAG, No). Когда белок выражается с более чем 39 “, он misfolds в мутант, токсичных и патогенных белков. Мутант HTT склонен к агрегации и приводит к смерти нейронных клеток и дегенерации, либо как короткие олигомерные виды или как большие высоко структурированные амилоиды7.
Нематод является модельной системой для изучения старения и нейродегенерации благодаря своей легкости манипуляции, изогенный характер, короткий срок службы, и его оптической прозрачности8. Для изучения стабильности HTT in vivo, конструкция синтеза была выражена в нервной системе C. elegans. HTT-D2 трансген, содержащий либо физиологический участок 25 “s (HTT-25-D2) или патологический участок 97″(HTT-97-D2) является overexpressed пан-нейронально на протяжении всей жизни нематода9. Путем подвергать в реальном маштабе времени C. elegans к краткой и сфокусированной точке света, одиночный нейрон photoswitched и преобразованный HTT-D2 отслеживается над временем. Чтобы установить, сколько HTT-D2 деградировало, разница между красным сигналом недавно преобразованного HTT-D2 сопоставлена с оставшимся красным сигналом HTT-D2 после определенного периода времени. Таким образом, становится возможным исследовать, как хантин деградирует, когда находится в его расширенной и токсичной форме по сравнению с его физиологической формой; как передние или задние нейроны по-разному реагируют на наличие No97 против 25 евро, особенно в течение длительных периодов времени; и как крах протеостазной сети (PN) во время старения способствует различиям в темпах деградации. Эти результаты описывают лишь небольшой набор наблюдений по обороту HTT-D2. Тем не менее, многие другие биологические вопросы, имеющие отношение как к области агрегации белка и протеостаза могут быть решены с этим in vivo применения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы понять функцию белка, важно понимать его синтез, расположение и деградацию. С развитием новых, стабильных и ярких FPs, визуализация и мониторинг POI стала проще и эффективнее. Генетически выраженный фьюжн PAFPs, такие как Dendra2, имеют уникальную возможность изучить стабильность POI. При во…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признаем DFG (KI-1988/5-1 для JK, NeuroCure PhD стипендий по NeuroCure кластера передового опыта в MLP) для финансирования. Мы также признаем, Imaging Core фонда Лейбниц научно-исследовательский институт молекулярной фармакологии Берлина (FMP) для обеспечения изображения создан. Кроме того, мы хотели бы поблагодарить Диого Фелечиано, который создал систему Dendra2 в лаборатории и дал инструкции.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
References
- Tsien, R. Y. The Green Fluorescent Protein. Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 509-544 (1998).
- Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. Fluorescent Proteins for Photoactivation Experiments. Methods in Cell Biology. 85 (08), 45-61 (2008).
- Lukyanov, K. A., Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Verkhusha, V. V. Photoactivatable fluorescent proteins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 885-890 (2005).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2 (8), 2024-2032 (2007).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. BioTechniques. 42 (5), 553-565 (2007).
- Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nature Reviews Disease Primers. 1 (1), 15005 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Morimoto, R. I. Caenorhabditis elegans as a model system for studying non-cellautonomous mechanisms in protein-misfolding diseases. DMM Disease Models and Mechanisms. 7 (1), 31-39 (2014).
- Chen, L., Fu, Y., Ren, M., Xiao, B., Rubin, C. S. A RasGRP, C. elegans RGEF-1b, Couples External Stimuli to Behavior by Activating LET-60 (Ras) in Sensory Neurons. Neuron. 70 (1), 51-65 (2011).
- . Plasmids 101: A Desktop Resource Available from: https://info.addgene.org/download-addgenes-ebook-plasmids-101-3rd-edition (2020)
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO Journal. 10 (12), 3959-3970 (1991).
- Mariol, M. C., Walter, L., Bellemin, S., Gieseler, K. A rapid protocol for integrating extrachromosomal arrays with high transmission rate into the C. elegans genome. Journal of Visualized Experiments. (82), e50773 (2013).
- Kreis, P., et al. ATM phosphorylation of the actin-binding protein drebrin controls oxidation stress-resistance in mammalian neurons and C. elegans. Nature Communications. 10 (1), 1-13 (2019).
- Juenemann, K., Wiemhoefer, A., Reits, E. A. Detection of ubiquitinated huntingtin species in intracellular aggregates. Frontiers in Molecular Neuroscience. 8, 1-8 (2015).
- Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nature Methods. 7 (6), 473-478 (2010).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. 1999, 1-11 (2006).
- Collins, J. J., Huang, C., Hughes, S., Kornfeld, K. The measurement and analysis of age-related changes in Caenorhabditis elegans. WormBook: the online review of C. elegans biology. , 1-21 (2008).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Hobert, O. Specification of the nervous system. WormBook. , 1-19 (2005).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. What is the role of protein aggregation in neurodegeneration?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 891-898 (2005).
- Adam, V., Nienhaus, K., Bourgeois, D., Nienhaus, G. U. Structural basis of enhanced photoconversion yield in green fluorescent protein-like protein Dendra2. Biochemistry. 48 (22), 4905-4915 (2009).
- Tsvetkov, A. S., et al. Proteostasis of polyglutamine varies among neurons and predicts neurodegeneration. Nature Chemical Biology. 9 (9), 586-594 (2013).
- Barmada, S. J., et al. Autophagy induction enhances TDP43 turnover and survival in neuronal ALS models. Nature Chemical Biology. 10 (8), 677-685 (2014).
- Feleciano, D. R., et al. Crosstalk Between Chaperone-Mediated Protein Disaggregation and Proteolytic Pathways in Aging and Disease. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, (2019).
- Zhang, L., et al. Method for real-time monitoring of protein degradation at the single cell level. BioTechniques. 42 (4), 446-450 (2007).
- Zhang, Z., Heidary, D. K., Richards, C. I. High resolution measurement of membrane receptor endocytosis. Journal of Biological Methods. 5 (4), 105 (2018).
- Gunewardene, M. S., et al. Superresolution imaging of multiple fluorescent proteins with highly overlapping emission spectra in living cells. Biophysical Journal. 101 (6), 1522-1528 (2011).
